CN114630896A - 由于yeeo基因失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的菌株 - Google Patents
由于yeeo基因失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的菌株 Download PDFInfo
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Abstract
公开了突变体菌株，其由于由yeeO基因表达的FMN/FAD输出蛋白的活性减弱或失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力。
Description
技术领域
本发明涉及由于yeeO基因失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的菌株。
背景技术
芳香族氨基酸，特别是L-色氨酸和L-苯丙氨酸，是用于饲料的重要氨基酸，并且是高增值的产业，其每年全世界市场规模为3000亿美元。
使用重组菌株来产生芳香族氨基酸，并且已经积极进行了提高其产生的研究。分支酸盐是芳香族氨基酸生物合成途径中所需的前体，并且为了产生分支酸盐，则需要磷酸烯醇丙酮酸盐(phosphoenolpyruvate，PEP)、赤藓糖-4-磷酸(erythrose-4-phosphate，E4P)、亚底物磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)、丝氨酸、谷氨酰胺等。因此，在常规技术中，已经进行了关于增强E4P、PEP或PRPP的生物合成途径的研究以提高L-色氨酸的产生。
然而，尚未报道通过抑制菌株中黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)的输出来提高菌株对芳香族氨基酸的产生。
[现有技术文献]
[专利文献]
(专利文献0001)韩国专利No.10-1830002(2018年2月9日)
发明内容
技术问题
根据一个实施方案，提供了由于抑制yeeO基因表达而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的菌株。
技术方案
一个方面提供了由于由yeeO(FMN/FAD输出因子)基因表达的FMN/FAD输出蛋白的活性减弱或失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的突变体菌株。
yeeO基因可由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
yeeO蛋白是输出黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的输出蛋白。yeeO基因与芳香族氨基酸产生途径例如色氨酸途径的关系，或yeeO基因对芳香族氨基酸产生途径的作用尚不清楚。然而，本发明人已发现，当通过在菌株中抑制yeeO蛋白的表达来抑制FMN和FAD的输出时，用于FMN和FAD产生的D-核酮糖5-磷酸的比例可降低，并且D-核酮糖-5-磷酸可集中于增强赤藓糖-4-磷酸(E4P)库，从而提高菌株的芳香族氨基酸生产力。
本文中使用的术语“活性减弱”意指与目的基因的原始表达水平相比，其表达水平降低。这种活性减弱包括：其中通过编码酶的基因的核苷酸序列中的一个或更多个核苷酸的替换、插入或缺失或其组合，酶本身的活性与由微生物最初具有的酶活性相比降低的情况；其中由于对编码酶的基因的表达或翻译的抑制，细胞中酶的总体活性低于天然菌株或修饰之前菌株中的总体活性的情况；及其组合。
本文中使用的术语“失活”是指其中与天然菌株或修饰之前菌株中的相比，编码蛋白质例如酶的基因完全不表达，并且即使其表达了也没有活性的情况。
本文中使用的术语“提高的表达”意指与目的基因的原始表达水平相比，该基因的表达水平提高。如果待提高表达的基因在突变之前不存在于菌株中，则可以通过将一种或更多种基因引入到菌株的染色体中来提高表达，以及如果待提高表达的基因在突变之前存在于菌株中，则可以将一种或更多种基因另外引入到菌株中，或者可以对菌株进行遗传改造以提高现有基因的表达水平。
在本发明中，修饰表达调节序列的方法可以通过在表达调节序列的核酸序列中一个或更多个核苷酸的缺失、插入或非保守性或保守性替换或其组合而在表达调节序列中诱导修饰来进行，或者可以通过用较弱的启动子替换该序列来进行。表达调节序列的一些实例包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列以及用于调节转录和翻译的终止的序列。
另外，修饰染色体上的基因序列的方法可以通过在基因序列中缺失、插入、非保守性或保守性替换或其组合而在序列中诱导修饰来进行，以便进一步弱化酶活性，或者可以通过用被改进为具有较弱活性的基因序列或用被改进为没有活性的基因序列替换该序列来进行。
根据一个实施方案，芳香族氨基酸可以是L-酪氨酸、L-色氨酸和L-苯丙氨酸中的至少一种。
根据一个实施方案，突变体菌株可以通过在yeeO基因的核苷酸序列中插入、替换或缺失一个或更多个核苷酸来获得。
根据一个实施方案，突变体菌株可来源于埃希氏杆菌(Escherichia)属的菌株。
根据一个实施方案，埃希氏杆菌属的菌株可以是大肠杆菌(Escherichia coli)，例如，在登记号KFCC11660P或KCCM10016下保藏的菌株。
另一个方面提供了用于产生芳香族氨基酸的方法，其包括以下步骤：在培养基中培养突变体菌株；以及从所培养的菌株和培养基中回收芳香族氨基酸。
根据本发明的菌株可以通过本领域已知的培养方法来培养。作为培养基，可以使用天然培养基或合成培养基。培养基的碳源的一些实例包括葡萄糖、蔗糖、糊精、甘油、淀粉等，培养基的氮源的一些实例包括蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、干酵母、豆饼、尿素、硫脲、铵盐、硝酸盐和其他有机或无机含氮化合物，但碳源和氮源不限于这些组分。
作为培养基中所含的无机盐，可以使用镁、锰、钾、钙、铁等的磷酸盐、硝酸盐、碳酸盐、氯化物等，但不限于此。除了碳源、氮源和无机盐的组分之外，还可以向培养基添加氨基酸、维生素、核酸和相关化合物。
培养基的温度通常可以为27℃至40℃，更优选30℃至37℃，但不限于此。可以继续培养直至产生期望量的有用物质。培养时间可优选地为10至100小时，但不限于此。
在回收芳香族氨基酸的步骤中，可以使用本领域已知的合适方法从培养基中回收期望的氨基酸，这取决于用于培养本发明微生物的方法，例如，分批、连续或补料分批培养方法。回收的步骤可包括纯化过程。
根据一个实施方案，芳香族氨基酸可以是L-色氨酸和L-苯丙氨酸中的至少一种。
有益效果
根据一个实施方案，可以通过使由菌株的yeeO基因表达的FMN/FAD输出蛋白的活性减弱或失活来提高芳香族氨基酸的产生。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述一个或更多个具体的实施方案。然而，这些实施例是用于举例说明一个或更多个实施方案，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：yeeO基因缺失菌株的构建
yeeO基因失活的突变体菌株由亲本菌株(登记号：KFCC11660P和KCCM10016)通过一步失活方法(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products，Datsenko KA，Wanner BL.，Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun 6；97(12)：6640-5)来构建。
KFCC11660P菌株和KCCM10016菌株是大肠杆菌菌株。对于第四片段的同源重组，将Red重组酶质粒pKD46(GenBank登记号AY048746)引入每个菌株中，并在引入pCP20之前去除pKD46。
通过在yeeO基因和含有抗生素抗性基因的DNA片段之间的同源重组来缺失yeeO基因，并随后通过从重组的DNA片段中去除抗生素抗性基因使yeeO基因失活。具体过程如下。
(1)第一片段的构建
使用pKD13质粒(Genbank登记号：AY048744)和具有一部分的下表1中所示的yeeO基因序列的引物对yeeO_PF和yeeO_PR和一部分的pKD13质粒序列在以下条件下进行PCR反应(总体积：50μl)，从而获得长度为约1.4kb的第一扩增片段：在95℃下5分钟的一个循环，并随后30个循环，每个循环由以下组成：在95℃下30秒，在58℃下30秒，和在72℃下2分钟，随后在72℃下5分钟，以及在12℃下10分钟。第一片段含有来源于pKD13质粒的卡那霉素抗性基因。
[表1]
(2)第二片段的构建
为了获得yeeO基因的上游片段，使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板和上表1中所示的引物yeeO_HF1和yeeO_HR1在以下条件下进行PCR反应(总体积：50μl)，从而获得长度为约0.3kb的第二扩增片段：在95℃下5分钟的一个循环，并随后30个循环，每个循环由以下组成：在95℃下30秒，在58℃下30秒，和在72℃下30秒，随后在72℃下5分钟，以及在12℃下10分钟。
(3)第三片段的构建
为了获得yeeO基因的下游片段，使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板，以及上表1中所示的引物yeeO_HF2和yeeO_HR2在以下条件下进行PCR反应(总体积：50μl)，从而获得长度为约0.3kb的第三扩增片段：在95℃下5分钟的一个循环，并随后30个循环，每个循环由以下组成：在95℃下30秒，在58℃下30秒，和在72℃下30秒，随后在72℃下分钟，以及在12℃下10分钟。
(4)第四片段的构建
以上实验中扩增的第一片段、第二片段和第三片段由于在扩增期间引物的互补序列可以连接成单个片段。使这些片段在没有引物的情况下在以下条件下进行PCR(总体积：50μl)，从而获得尺寸为约2kb的第四扩增的单个片段：在95℃下5分钟的一个循环，并随后30个循环，每个循环由以下组成：在95℃下30秒，在58℃下30秒，和在72℃下2分钟30秒，随后在72℃下5分钟，以及在12℃下10分钟。第四片段含有一部分yeeO基因和卡那霉素抗生素抗性基因。具体地，其由yeeO基因5’片段的一部分、卡那霉素抗生素抗性基因和yeeO基因3’片段的一部分组成。
(5)第四片段的引入和yeeO的缺失
通过电穿孔将获得的第四片段引入到KFCC11660P和KCCM10016菌株中的每一种中，其是含有Red重组酶质粒pKD46(GenBank登记号：AY048746)的大肠杆菌菌株。将第四片段替换为yeeO，通过使用LambdaRed重组系统的同源重组，从而缺失了yeeO。
此后，对显示出卡那霉素抗性的细胞系进行PCR反应以确定yeeO基因是否缺失。使用上表1中所示的yeeO_CF和yeeO_CR引物在以下条件下进行PCR反应(总体积：20μl)：在95℃下5分钟的一个循环，并随后30个循环，每个循环由以下组成：在95℃下30秒，在55℃下30秒，和在72℃下3分钟，随后在72℃下5分钟，以及在12℃下10分钟。确定了，当存在原始的yeeO基因时，产生了约2.5kb(在缺失之前)，而在将片段插入到染色体中时，产生了约2.2kb，其长度减少。
(6)抗生素抗性基因的去除和选择
为了从其中确定缺失了yeeO基因的菌株中去除抗生素抗性标志物基因，通过将pCP20质粒引入到菌株中来诱导FLP重组。此后，将yeeO缺失菌株在含有或不含有抗生素的LB平板培养基中培养，以确定抗生素抗性标志物基因已被去除。
实施例2：yeeO缺失菌株的培养和芳香族氨基酸产生的评价
将通过实施例1的方法获得的大肠杆菌菌株KFCC11660PΔyeeO和KFCC11660P中的每一种在下表2中所示的色氨酸产生培养基中进行培养。
另外，将通过实施例1的方法获得的大肠杆菌菌株KCCM10016PΔyeeO和KCCM10016中的每一种在下表2中所示的苯丙氨酸产生培养基中进行培养。
对于培养，将KFCC11660PAyeeO、KFCC11660P、KCCM10016AyeeO和KCCM10016菌株中的每一种的1vol％接种到含有10mL的具有下表2中所示组合物的色氨酸产生培养基或苯丙氨酸产生培养基的瓶中，并在37℃下以200rpm摇动培养70小时。然后，对从菌株中获得的L-氨基酸的浓度进行比较。
[表2]
作为以上实验的结果，如下表3和表4中所示，确定了在其中yeeO基因失活的菌株的情况下色氨酸和苯丙氨酸的产生提高。
参考下表3和表4，确定了当KFCC11660P菌株中的yeeO基因失活时，L-色氨酸的产生提高了10％或更多，并且当KCCM10016菌株中的yeeO基因失活时，L-苯丙氨酸的产生提高了15％或更多。
[表3]
| 菌株 | L-色氨酸(g/L) |
| KFCC11660P | 4.18 |
| KFCC11660PΔyeeO | 4.65 |
[表4]
| 菌株 | L-苯丙氨酸(g/L) |
| KCCM10016 | 3.48 |
| KCCM10016ΔyeeO | 4.14 |
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<210> 1
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> yeeO "YEEO-单体" (补体(2058203..2059846))大肠杆菌（Escherichiacoli）
K-12 substr. MG1655
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Claims (8)
1.突变体菌株，其由于由yeeO基因表达的FMN/FAD输出蛋白的活性减弱或失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力。
2.权利要求1所述的突变体菌株，其中所述yeeO基因由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。
3.权利要求1所述的突变体菌株，其中所述芳香族氨基酸是L-色氨酸和L-苯丙氨酸中的至少一种。
4.权利要求1所述的突变体菌株，其通过在所述yeeO基因的核苷酸序列中插入、替换或缺失一个或更多个核苷酸来获得。
5.权利要求1所述的突变体菌株，其来源于埃希氏杆菌(Escherichia)属的菌株。
6.权利要求5所述的突变体菌株，其中所述埃希氏杆菌属的所述菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)。
7.用于产生芳香族氨基酸的方法，其包括以下步骤：
在培养基中培养权利要求1所述的突变体菌株；以及
从所培养的突变体菌株和所述培养基中回收芳香族氨基酸。
8.利要求7所述的方法，其中所述芳香族氨基酸是L-色氨酸和L-苯丙氨酸中的至少一种。
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