JP2001128692A - ｌｒｐ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｌｒｐ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ｌｒｐ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド
配列、及びコリネフォルム細菌を用いるＬ−アミノ酸、
殊にＬ−リシン及びＬ−イソロイシンの改善された発酵
的製造方法の提供。 【解決手段】 ａ）コリネバクテリウムグルタミクム由
来の特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であるポ
リヌクレオチド、ｂ）上記アミノ酸配列と少なくとも７
０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、ｃ）ａ又はｂのポリヌクレ
オチドに対して相補的であるポリヌクレオチド及びｄ）
ａ、ｂ又はｃのポリヌクレオチド配列の少なくとも１５
の連続的塩基を有するポリヌクレオチドから選択された
ポリヌクレオチド配列を含有する、コリネフォルム細菌
から単離されたポリヌクレオチド、及びｌｒｐ遺伝子の
増幅及び減衰を用いるＬ−アミノ酸の発酵的製法。
配列、及びコリネフォルム細菌を用いるＬ−アミノ酸、
殊にＬ−リシン及びＬ−イソロイシンの改善された発酵
的製造方法の提供。 【解決手段】 ａ）コリネバクテリウムグルタミクム由
来の特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であるポ
リヌクレオチド、ｂ）上記アミノ酸配列と少なくとも７
０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、ｃ）ａ又はｂのポリヌクレ
オチドに対して相補的であるポリヌクレオチド及びｄ）
ａ、ｂ又はｃのポリヌクレオチド配列の少なくとも１５
の連続的塩基を有するポリヌクレオチドから選択された
ポリヌクレオチド配列を含有する、コリネフォルム細菌
から単離されたポリヌクレオチド、及びｌｒｐ遺伝子の
増幅及び減衰を用いるＬ−アミノ酸の発酵的製法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の目的は、ｌｒｐ−遺
伝子をコードするヌクレオチド配列及びその中でｌｒｐ
−遺伝子の発現が影響されるコリネフォルム細菌の使用
下に、アミノ酸、殊にリシン及びイソロイシンを発酵的
に製造する方法である。
伝子をコードするヌクレオチド配列及びその中でｌｒｐ
−遺伝子の発現が影響されるコリネフォルム細菌の使用
下に、アミノ酸、殊にリシン及びイソロイシンを発酵的
に製造する方法である。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸は動物飼料中で、食料品工
業で、ヒト医療で及び医薬品工業で使用されている。
業で、ヒト医療で及び医薬品工業で使用されている。
【０００３】このアミノ酸は、コリネフォルム細菌の菌
株、殊にコリネバクテリウム グルタミクムの発酵によ
り製造されることは公知である。その重要性の故に、こ
の製造法の改善が常に研究されている。この方法の改善
は、発酵技術的手段、例えば撹拌及び酸素での処理又は
栄養培地の組成、例えば発酵の間の糖濃度又は例えばイ
オン交換クロマトグラフィによる製品形への後処理又は
微生物自体の固有の能力特性に関連しうる。
株、殊にコリネバクテリウム グルタミクムの発酵によ
り製造されることは公知である。その重要性の故に、こ
の製造法の改善が常に研究されている。この方法の改善
は、発酵技術的手段、例えば撹拌及び酸素での処理又は
栄養培地の組成、例えば発酵の間の糖濃度又は例えばイ
オン交換クロマトグラフィによる製品形への後処理又は
微生物自体の固有の能力特性に関連しうる。
【０００４】この微生物の能力特性の改善のために、突
然変異、選択及び突然変異選択の方法が使用される。こ
れらの方法では、抗代謝物、例えばリシン−類縁体Ｓ−
（２−アミノエチル）−システインに対して抵抗性であ
るか又はコントロールのために重要なアミノ酸の栄養要
求性であり、Ｌ−アミノ酸を産生する菌株が得られる。
数年前から、同様に、菌株改善のための組み換えＤＮＡ
−技術の方法が、Ｌ−アミノ酸産生性のコリネバクテリ
ウムの菌株の改善のために使用されている。
然変異、選択及び突然変異選択の方法が使用される。こ
れらの方法では、抗代謝物、例えばリシン−類縁体Ｓ−
（２−アミノエチル）−システインに対して抵抗性であ
るか又はコントロールのために重要なアミノ酸の栄養要
求性であり、Ｌ−アミノ酸を産生する菌株が得られる。
数年前から、同様に、菌株改善のための組み換えＤＮＡ
−技術の方法が、Ｌ−アミノ酸産生性のコリネバクテリ
ウムの菌株の改善のために使用されている。
【０００５】ｌｒｐ（ロイシン−応答性蛋白質）は、最
初にエセリキア コリー中に存在することが記載され
た、その遺伝子産物がアミノ酸の移送、生合成及び減成
に関与する一連の遺伝子の転写に影響するグローバルな
調節剤（globaler Regulator)である（Calvo und Matth
ews,Microbiological Reviews 58, 466-490, 1994)。
初にエセリキア コリー中に存在することが記載され
た、その遺伝子産物がアミノ酸の移送、生合成及び減成
に関与する一連の遺伝子の転写に影響するグローバルな
調節剤（globaler Regulator)である（Calvo und Matth
ews,Microbiological Reviews 58, 466-490, 1994)。
【０００６】近年、類似の遺伝子が他の生体、例えば、
ブラデイリゾビウム ヤポニクム（Bradyrhizobium jap
onicum: King und O'Brian, Journal of Bacteriology,
179, 1828-1831, 1997 )、クレブシエラ アエロゲネ
ス（Klebsiella aerogenes :Janes und Bender, Journa
l of Bacteriology, 181, 1054-1058, 1999)、スルフォ
ロブス アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldar
ius : Charlier et al., Gene, 201, 63-68, 1997)及び
グラム陽性菌 バシルス スブチリス（Bacillus subti
llis :Belitsky et al., Journal of Bacteriology, 17
9, 5448-5457,1997)中でも同定されている。
ブラデイリゾビウム ヤポニクム（Bradyrhizobium jap
onicum: King und O'Brian, Journal of Bacteriology,
179, 1828-1831, 1997 )、クレブシエラ アエロゲネ
ス（Klebsiella aerogenes :Janes und Bender, Journa
l of Bacteriology, 181, 1054-1058, 1999)、スルフォ
ロブス アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldar
ius : Charlier et al., Gene, 201, 63-68, 1997)及び
グラム陽性菌 バシルス スブチリス（Bacillus subti
llis :Belitsky et al., Journal of Bacteriology, 17
9, 5448-5457,1997)中でも同定されている。
【０００７】Ｅ・コリー中でｌｒｐ蛋白質はその特有の
発現を調節する。ｌｒｐは、更に、Ｅ・コリー中での多
くの遺伝子の発現に負又は正に影響する。この場合に
は、一般に、生合成経路で有効である遺伝子産物の発現
が刺激される。異化作用を有する遺伝子産物は、通常は
相応して負に調節される。いくつかの場合に、ｌｒｐの
作用はＬ−ロイシンの添加により増加されるが、他方、
Ｌ−ロイシン添加は負にも作用することもありうる（Ne
wman et al., In: Neidhardt et al. Escherichia col
i and Salmonella typhimurium: Cellular and molecul
ar biology . American Society for Microbiology, Wa
shington D. C., 1513-1525, 1996)。ｌｒｐにより、Ｅ
・コリー中で、アミノ酸生合成及びアミノ酸異化に中心
的役割を演じる多くの遺伝子及びオペロンが調節され
る。Ｅ・コリー中では、例えば次のオペロンがｌｒｐに
より負に調節される：分枝鎖アミノ酸の高親和性吸収系
の結合蛋白質をコードするｌｉｖＪ（Haney et al., Jo
urnal of Bacteriology ,174,108-115, 1992) 及びリシ
ンｔＲＮＡシンテターゼをコードするｌｙｓＵ（Gazeau
et al., FEBS Letters, 300, 254-258, 1994) 。従来
公知のＥ・コリー中で正に影響される遺伝子には、特に
ｉｌｖＩＨ、ｇｌｔＢＤＦ及びｌｅｕＡＢＣＤが包含さ
れる（Lin et al., Journal of Bacteriology ,174, 19
48-1955, 1992)。
発現を調節する。ｌｒｐは、更に、Ｅ・コリー中での多
くの遺伝子の発現に負又は正に影響する。この場合に
は、一般に、生合成経路で有効である遺伝子産物の発現
が刺激される。異化作用を有する遺伝子産物は、通常は
相応して負に調節される。いくつかの場合に、ｌｒｐの
作用はＬ−ロイシンの添加により増加されるが、他方、
Ｌ−ロイシン添加は負にも作用することもありうる（Ne
wman et al., In: Neidhardt et al. Escherichia col
i and Salmonella typhimurium: Cellular and molecul
ar biology . American Society for Microbiology, Wa
shington D. C., 1513-1525, 1996)。ｌｒｐにより、Ｅ
・コリー中で、アミノ酸生合成及びアミノ酸異化に中心
的役割を演じる多くの遺伝子及びオペロンが調節され
る。Ｅ・コリー中では、例えば次のオペロンがｌｒｐに
より負に調節される：分枝鎖アミノ酸の高親和性吸収系
の結合蛋白質をコードするｌｉｖＪ（Haney et al., Jo
urnal of Bacteriology ,174,108-115, 1992) 及びリシ
ンｔＲＮＡシンテターゼをコードするｌｙｓＵ（Gazeau
et al., FEBS Letters, 300, 254-258, 1994) 。従来
公知のＥ・コリー中で正に影響される遺伝子には、特に
ｉｌｖＩＨ、ｇｌｔＢＤＦ及びｌｅｕＡＢＣＤが包含さ
れる（Lin et al., Journal of Bacteriology ,174, 19
48-1955, 1992)。
【０００８】最後に記載のオペロンは、基本的にロイシ
ン生合成のために重要であり、特にコリネバクテリウム
グルタミクムによるリシン生合成のために重要であ
る。ロイシン−栄養要求性及び高いリシン−産生性との
間に関連があると推測されている（Schrumpf et al., A
pplied Microbiology and Biotechnology, 37, 566-57
1, 1992) 。パテック等（Patek et al.）は Applied an
d Environmental Microbiology, 60, 133-140, 1994)
にＣ・グルタミクムによるいくつかのリシン生産体中の
ｌｅｕＡの失活がリシン収率を高めることを示してい
る。トサカ等（Tosaket al., : Agricultural Biplogic
al Chemistry , 43, 265-270, 1979)は、ブレビバクテ
リウム ラクトフェルメンツムの突然変異の際に、Ｌ−
ロイシンの添加によりスレオニン形成の同時増加と共に
リシン形成の低下を達成できた。
ン生合成のために重要であり、特にコリネバクテリウム
グルタミクムによるリシン生合成のために重要であ
る。ロイシン−栄養要求性及び高いリシン−産生性との
間に関連があると推測されている（Schrumpf et al., A
pplied Microbiology and Biotechnology, 37, 566-57
1, 1992) 。パテック等（Patek et al.）は Applied an
d Environmental Microbiology, 60, 133-140, 1994)
にＣ・グルタミクムによるいくつかのリシン生産体中の
ｌｅｕＡの失活がリシン収率を高めることを示してい
る。トサカ等（Tosaket al., : Agricultural Biplogic
al Chemistry , 43, 265-270, 1979)は、ブレビバクテ
リウム ラクトフェルメンツムの突然変異の際に、Ｌ−
ロイシンの添加によりスレオニン形成の同時増加と共に
リシン形成の低下を達成できた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネフォ
ルム細菌を用いるＬ−アミノ酸、殊にＬ−リシン及びＬ
−イソロイシンの改善された発酵的製造のための新規手
段を提供することを課題としている。
ルム細菌を用いるＬ−アミノ酸、殊にＬ−リシン及びＬ
−イソロイシンの改善された発酵的製造のための新規手
段を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の目的物は、次の
群： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一で
あるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、 ｃ） ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的
であるポリヌクレオチド及び ｄ） ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５の連続的塩基を有するポリヌクレオチド から選択されたポリヌクレオチド配列を含有する、コリ
ネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドであ
る。
群： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一で
あるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、 ｃ） ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的
であるポリヌクレオチド及び ｄ） ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５の連続的塩基を有するポリヌクレオチド から選択されたポリヌクレオチド配列を含有する、コリ
ネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドであ
る。
【００１１】同様に、本発明の目的物は、請求項１に記
載のポリヌクレオチドであり、この際、これは、有利
に、（ｉ）配列番号１に示されているヌクレオチド配列
又は（ｉｉ）遺伝コードの縮重の範囲内の配列（ｉ）に
相当する配列少なくとも１つ又は（iii) 配列（ｉ）又
は（ｉｉ）に対して相補的である配列とハイブリダイズ
する配列少なくとも１つ及び場合により（ｉｖ）
（ｉ）中の機能的中性のセンス突然変異を有する複製可
能なＤＮＡである。
載のポリヌクレオチドであり、この際、これは、有利
に、（ｉ）配列番号１に示されているヌクレオチド配列
又は（ｉｉ）遺伝コードの縮重の範囲内の配列（ｉ）に
相当する配列少なくとも１つ又は（iii) 配列（ｉ）又
は（ｉｉ）に対して相補的である配列とハイブリダイズ
する配列少なくとも１つ及び場合により（ｉｖ）
（ｉ）中の機能的中性のセンス突然変異を有する複製可
能なＤＮＡである。
【００１２】更に、本発明は、配列番号１に示されてい
るようなヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のポ
リヌクレオチド、配列番号２に示されているようなアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２
に記載のポリヌクレオチドをも提供する。
るようなヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のポ
リヌクレオチド、配列番号２に示されているようなアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２
に記載のポリヌクレオチドをも提供する。
【００１３】本発明の目的物は、同様に、実質的に、配
列番号１に相当するポリヌクレオチド配列を有する完全
遺伝子を含有する適当な遺伝子ライブラリーと配列番号
１に記載のポリヌクレオチドの配列又はそのフラグメン
トを有するプローブとのハイブリダイゼーシヨンを用い
るスクリーニング及び記載のＤＮＡ−配列の単離により
得られるポリヌクレオチド配列より成るポリヌクレオチ
ドである。
列番号１に相当するポリヌクレオチド配列を有する完全
遺伝子を含有する適当な遺伝子ライブラリーと配列番号
１に記載のポリヌクレオチドの配列又はそのフラグメン
トを有するプローブとのハイブリダイゼーシヨンを用い
るスクリーニング及び記載のＤＮＡ−配列の単離により
得られるポリヌクレオチド配列より成るポリヌクレオチ
ドである。
【００１４】本発明によるポリヌクレオチド配列は、ｌ
ｒｐ−蛋白質をコードするｃＤＮＡを完全な長さで単離
し、かつその配列がｌｒｐのそれとの高いレベルの類似
性を示すようなｃＤＮＡ又は遺伝子を単離するために、
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡのハイブリダイゼーシヨン
−プローブとして好適である。
ｒｐ−蛋白質をコードするｃＤＮＡを完全な長さで単離
し、かつその配列がｌｒｐのそれとの高いレベルの類似
性を示すようなｃＤＮＡ又は遺伝子を単離するために、
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡのハイブリダイゼーシヨン
−プローブとして好適である。
【００１５】本発明によるポリヌクレオチド配列は、更
に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｌｒｐ−蛋
白質をコードする遺伝子のＤＮＡを製造するためのプラ
イマーとして好適である。
に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｌｒｐ−蛋
白質をコードする遺伝子のＤＮＡを製造するためのプラ
イマーとして好適である。
【００１６】プローブ又はプライマーとして役に立つこ
のようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０、有利
には少なくとも２０、全く特別に有利には少なくとも１
５の連続している塩基を含有する。同様に、少なくとも
４０又は５０の塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチ
ドも好適である。
のようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０、有利
には少なくとも２０、全く特別に有利には少なくとも１
５の連続している塩基を含有する。同様に、少なくとも
４０又は５０の塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチ
ドも好適である。
【００１７】「単離された」とは、その天然の環境から
分離されたことを意味する。
分離されたことを意味する。
【００１８】「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリ
リボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを
意味し、この際、修飾されていないＲＮＡ又はＤＮＡも
しくは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。
リボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを
意味し、この際、修飾されていないＲＮＡ又はＤＮＡも
しくは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。
【００１９】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介
して結合した２個以上のアミノ酸を含有するペプチド又
は蛋白質を意味する。
して結合した２個以上のアミノ酸を含有するペプチド又
は蛋白質を意味する。
【００２０】本発明によるポリペプチドには、配列番号
２によるポリペプチド、殊にｌｒｐ−蛋白質の生物学的
活性を有するもの及び配列番号２によるポリペプチドと
少なくとも７０％、有利に少なくとも８０％同一である
もの、特に配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０
〜９５％同一性を示し、記載の活性を有するものも包含
される。
２によるポリペプチド、殊にｌｒｐ−蛋白質の生物学的
活性を有するもの及び配列番号２によるポリペプチドと
少なくとも７０％、有利に少なくとも８０％同一である
もの、特に配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０
〜９５％同一性を示し、記載の活性を有するものも包含
される。
【００２１】更に本発明は、殊に既にアミノ酸を産生す
るコリネフォルム細菌を用いるアミノ酸、殊にＬ−リシ
ン及びＬ−イソロイシンの製法に関し、ここで、新規ｌ
ｒｐ−遺伝子を目標物質に依存して増幅又は減衰させ
る。
るコリネフォルム細菌を用いるアミノ酸、殊にＬ−リシ
ン及びＬ−イソロイシンの製法に関し、ここで、新規ｌ
ｒｐ−遺伝子を目標物質に依存して増幅又は減衰させ
る。
【００２２】この関係で、用語「増幅（Verstaerkun
g)」は、例えば遺伝子のコピー数を高め、強いプロモー
タを用いるか又は高い活性を有する適当な酵素をコード
する遺伝子を用い、場合によってはこれらの手段を組み
合わせることにより、相応するＤＮＡによりコードされ
る微生物中の１種以上の酵素の細胞内活性の増加を意味
する。
g)」は、例えば遺伝子のコピー数を高め、強いプロモー
タを用いるか又は高い活性を有する適当な酵素をコード
する遺伝子を用い、場合によってはこれらの手段を組み
合わせることにより、相応するＤＮＡによりコードされ
る微生物中の１種以上の酵素の細胞内活性の増加を意味
する。
【００２３】この関係で、用語「減衰（Abschwaechun
g)」は、例えば弱いプロモータを用いるか又は低い活性
を有する適当な酵素をコードする又は相応する酵素（蛋
白質）を失活させる遺伝子もしくは対立遺伝子（Allel
e)を用い、場合によってはこれらの手段を組み合わせる
ことによる、相応するＤＮＡによりコードされる微生物
中の１種以上の酵素（蛋白質）の細胞内活性の減少また
は抑制を意味する。
g)」は、例えば弱いプロモータを用いるか又は低い活性
を有する適当な酵素をコードする又は相応する酵素（蛋
白質）を失活させる遺伝子もしくは対立遺伝子（Allel
e)を用い、場合によってはこれらの手段を組み合わせる
ことによる、相応するＤＮＡによりコードされる微生物
中の１種以上の酵素（蛋白質）の細胞内活性の減少また
は抑制を意味する。
【００２４】本発明の目的物である微生物は、グルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
及びエタノールからＬ−リシンを製造することができ
る。コリネフォルム細菌の代表は、殊にコリネバクテリ
ウム属のものである。コリネバクテリウム属では、殊
に、当業者間ではＬ−アミノ酸を産生するその可能性が
公知であるコリネバクテリウム グルタミクム種が挙げ
られる。
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
及びエタノールからＬ−リシンを製造することができ
る。コリネフォルム細菌の代表は、殊にコリネバクテリ
ウム属のものである。コリネバクテリウム属では、殊
に、当業者間ではＬ−アミノ酸を産生するその可能性が
公知であるコリネバクテリウム グルタミクム種が挙げ
られる。
【００２５】コリネバクテリウム属、殊にコリネバクテ
リウム グルタミクム種の好適な菌株は、例えば公知の
野生型菌株である： コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム(acetoglutam
icum) ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（acetoaci
dphilum) ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム メラセコラ（melassecola) ＡＴ
ＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム テルモアミノゲネス（thermoamin
ogenes) FERM BP-１５３９ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m) ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（lactofer
mentum) ATCC 13869および ブレビバクテリウム デイバリカツム（divaricatum)
ＡＴＣＣ１４０２０ 及びこれらから製造されたアミノ酸産生性突然変異体又
は菌株、例えばＬ−リシン産生性の菌株： コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４及び コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ ５７１５ 又はＬ−イソロイシン産生性菌株： コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４３
０９ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４３
１０ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４３
１１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １５１
６８及び コリネバクテリウム アンモニアゲネス（ammoniagene
s) ＡＴＣＣ ６８７１。
リウム グルタミクム種の好適な菌株は、例えば公知の
野生型菌株である： コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム(acetoglutam
icum) ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（acetoaci
dphilum) ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム メラセコラ（melassecola) ＡＴ
ＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム テルモアミノゲネス（thermoamin
ogenes) FERM BP-１５３９ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m) ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（lactofer
mentum) ATCC 13869および ブレビバクテリウム デイバリカツム（divaricatum)
ＡＴＣＣ１４０２０ 及びこれらから製造されたアミノ酸産生性突然変異体又
は菌株、例えばＬ−リシン産生性の菌株： コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４及び コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ ５７１５ 又はＬ−イソロイシン産生性菌株： コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４３
０９ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４３
１０ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４３
１１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １５１
６８及び コリネバクテリウム アンモニアゲネス（ammoniagene
s) ＡＴＣＣ ６８７１。
【００２６】本発明者は、Ｃ・グルタミクムから新規の
ｌｒｐ−蛋白質をコードする新規ｌｒｐ−遺伝子を単離
することに成功した。
ｌｒｐ−蛋白質をコードする新規ｌｒｐ−遺伝子を単離
することに成功した。
【００２７】Ｃ・グルタミクムからｌｒｐ−遺伝子又は
他の遺伝子をも単離するために、先ず、この微生物の遺
伝子ライブラリーをＥ・コリー中に構築させる。遺伝子
ライブラリーの構築は、一般に公知の教科書及びハンド
ブック中に記載されている。例として、ウイナッカー
（Winnacker）の教科書：Gene und Klone, Eine Einfue
hrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie,Weinhei
m,Deutschland, 1990)又はサンブロック等（Sambrook e
t al.)のハンドブック；Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19
89) に記載されている。非常に周知されている遺伝子ラ
イブラリーは、コハラ（Kohara）等のCell５０、４９５
−５０８（１９８７）によりλ−ベクター中に構築され
たＥ・コリー Ｋ−１２菌株Ｗ３１１０である。バース
（Bathe）等は、Molecular and General Genetics , 25
2:255-265,1996 に、Ｃ・グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２の遺伝子ライブラリーを記載しており、これは、コ
スミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（Wahl et al., 1
987, Proceedings of the National Academy of Scien
ces USA, 84:2160-2164) を用いて、Ｅ・コリーＫ−１
２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Ac
ids Research 16: 1563-1575) 中に構築された。ベルマ
ン（Boermann) 等は、Molecular Mocrobkiology 6(3),
317-326 に、再度Ｃ・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
の遺伝子ライブラリーを、コスミドｐＨＣ７９（Hohn u
nd Collins, Gene 11, 291-298( 1980) ) の使用下に記
載している。Ｅ・コリー中でのＣ・グルタミクムの遺伝
子ライブラリーの製造のために、プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２（Boliver, Life Sciences, 25, 807-818(19
79) )又はｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene, 19:25
9-268) を使用することもできる。宿主としては、特に
制限−及び組み換え欠失を示すようなＥ・コリー菌株が
好適である。この例は、グランド（Grant) 等により記
載された菌株ＤＨ５αｍｃｒである（Proceedings of t
he National Academy of Sciences USA,87(1990) 4645-
4649) 。コスミドを用いてクローニングされた長いＤＮ
Ａ−フラグメントは、引き続き慣用のシーケンシングの
ために好適なベクターにサブクローニングすることがで
き、引き続き、例えばサンガー（Sanger) 等により、Pr
oceedings of the National Acedemy of Sciences of t
he United States of America, 74: 5463-5467,1977 に
記載されているようにシーケーシングされる。
他の遺伝子をも単離するために、先ず、この微生物の遺
伝子ライブラリーをＥ・コリー中に構築させる。遺伝子
ライブラリーの構築は、一般に公知の教科書及びハンド
ブック中に記載されている。例として、ウイナッカー
（Winnacker）の教科書：Gene und Klone, Eine Einfue
hrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie,Weinhei
m,Deutschland, 1990)又はサンブロック等（Sambrook e
t al.)のハンドブック；Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19
89) に記載されている。非常に周知されている遺伝子ラ
イブラリーは、コハラ（Kohara）等のCell５０、４９５
−５０８（１９８７）によりλ−ベクター中に構築され
たＥ・コリー Ｋ−１２菌株Ｗ３１１０である。バース
（Bathe）等は、Molecular and General Genetics , 25
2:255-265,1996 に、Ｃ・グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２の遺伝子ライブラリーを記載しており、これは、コ
スミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（Wahl et al., 1
987, Proceedings of the National Academy of Scien
ces USA, 84:2160-2164) を用いて、Ｅ・コリーＫ−１
２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Ac
ids Research 16: 1563-1575) 中に構築された。ベルマ
ン（Boermann) 等は、Molecular Mocrobkiology 6(3),
317-326 に、再度Ｃ・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
の遺伝子ライブラリーを、コスミドｐＨＣ７９（Hohn u
nd Collins, Gene 11, 291-298( 1980) ) の使用下に記
載している。Ｅ・コリー中でのＣ・グルタミクムの遺伝
子ライブラリーの製造のために、プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２（Boliver, Life Sciences, 25, 807-818(19
79) )又はｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene, 19:25
9-268) を使用することもできる。宿主としては、特に
制限−及び組み換え欠失を示すようなＥ・コリー菌株が
好適である。この例は、グランド（Grant) 等により記
載された菌株ＤＨ５αｍｃｒである（Proceedings of t
he National Academy of Sciences USA,87(1990) 4645-
4649) 。コスミドを用いてクローニングされた長いＤＮ
Ａ−フラグメントは、引き続き慣用のシーケンシングの
ために好適なベクターにサブクローニングすることがで
き、引き続き、例えばサンガー（Sanger) 等により、Pr
oceedings of the National Acedemy of Sciences of t
he United States of America, 74: 5463-5467,1977 に
記載されているようにシーケーシングされる。
【００２８】こうして、Ｃ・グルタミクムから遺伝子ｌ
ｒｐをコードする新規ＤＮＡ−配列が得られ、これは、
配列番号１として本発明の目的物である。更に、本発明
のＤＮＡ−配列から、前記の方法で相応する蛋白質のア
ミノ酸配列が引き出された。配列番号２に、得られたｌ
ｒｐ−遺伝子産物のアミノ酸配列が記載されている。
ｒｐをコードする新規ＤＮＡ−配列が得られ、これは、
配列番号１として本発明の目的物である。更に、本発明
のＤＮＡ−配列から、前記の方法で相応する蛋白質のア
ミノ酸配列が引き出された。配列番号２に、得られたｌ
ｒｐ−遺伝子産物のアミノ酸配列が記載されている。
【００２９】配列番号１から遺伝子コードの縮重により
得られるコード性ＤＮＡ−配列は、同様に本発明の目的
物である。同様に、配列番号１と又は配列番号１の一部
分とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の目的物
である。更に、当業者には、アミノ酸の保存性置換、例
えば蛋白質中のグリシンのアラニンでの又はアスパラギ
ン酸のグルタミン酸での置換は、蛋白質の活性の原則的
な変更をもたらさない、即ち機能的に中性である「セン
ス突然変異（sese mutations) 」として公知である。更
に、蛋白質のＮ−及び／又はＣ−末端での変更がその機
能を実質的に影響しないか又はむしろ安定化することが
できることは公知である。この関連の記載は、当業者に
は、特にベン−バサット等（Ben-Bassat et al .）のJo
urnal ofBacteriology 169:751-757 (1987)、オレガン
等（O'regan et al.）の Gene 77:237-251(1989) 、サ
ヒン−トス等（Sahin-Toth et al.）のProtein Sciense
s 3: 240-247(1994)、ホチュリ等（Hochulli et al.）
の :Bio/Technology 6: 1321-1325(1988)及び遺伝子学
及び分子生物学の公知教科書中に見いだされる。相応す
る方法で、配列番号２から得られるアミノ酸配列は、同
様に本発明の目的物である。
得られるコード性ＤＮＡ−配列は、同様に本発明の目的
物である。同様に、配列番号１と又は配列番号１の一部
分とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の目的物
である。更に、当業者には、アミノ酸の保存性置換、例
えば蛋白質中のグリシンのアラニンでの又はアスパラギ
ン酸のグルタミン酸での置換は、蛋白質の活性の原則的
な変更をもたらさない、即ち機能的に中性である「セン
ス突然変異（sese mutations) 」として公知である。更
に、蛋白質のＮ−及び／又はＣ−末端での変更がその機
能を実質的に影響しないか又はむしろ安定化することが
できることは公知である。この関連の記載は、当業者に
は、特にベン−バサット等（Ben-Bassat et al .）のJo
urnal ofBacteriology 169:751-757 (1987)、オレガン
等（O'regan et al.）の Gene 77:237-251(1989) 、サ
ヒン−トス等（Sahin-Toth et al.）のProtein Sciense
s 3: 240-247(1994)、ホチュリ等（Hochulli et al.）
の :Bio/Technology 6: 1321-1325(1988)及び遺伝子学
及び分子生物学の公知教科書中に見いだされる。相応す
る方法で、配列番号２から得られるアミノ酸配列は、同
様に本発明の目的物である。
【００３０】同様に、配列番号１と又は配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ−配列は、本発明の目
的物である。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
により配列番号１から得られるプライマーの使用下に製
造されるＤＮＡ−配列も本発明の目的物である。このよ
うなオリゴヌクレオチドは、典型的に少なくとも１５塩
基対の長さを有する。
部分とハイブリダイズするＤＮＡ−配列は、本発明の目
的物である。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
により配列番号１から得られるプライマーの使用下に製
造されるＤＮＡ−配列も本発明の目的物である。このよ
うなオリゴヌクレオチドは、典型的に少なくとも１５塩
基対の長さを有する。
【００３１】ハイブリダイゼーシヨンを用いてＤＮＡ−
配列を同定するための概要は、当業者は、特に、Beohri
nger Mannheim GmbH社 (Mannheim, Deutschland, 199
3)からのハンドブック”The DIG System Users Guide f
or Filter Hybridization"及リーブル等（Lieble et a
l.,）の :International Journal of Systematic Bact
eriology (1991) 41: 255-260)中 に見いだすことがで
きる。当業者は、ポリメラーゼ−連鎖反応（ＰＣＲ）を
用いるＤＮＡ−配列の増幅のための概要を、特に、ガイ
ト（Gait) のハンドブック：Oligonukuleotidoe synthe
sis: a practicalapproach (IRL Press, Oxford,UK,198
4) 及びニュートン及びグラハム（Newtonund Graham）
の PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland ,1994) 中に見いだすことができる。
配列を同定するための概要は、当業者は、特に、Beohri
nger Mannheim GmbH社 (Mannheim, Deutschland, 199
3)からのハンドブック”The DIG System Users Guide f
or Filter Hybridization"及リーブル等（Lieble et a
l.,）の :International Journal of Systematic Bact
eriology (1991) 41: 255-260)中 に見いだすことがで
きる。当業者は、ポリメラーゼ−連鎖反応（ＰＣＲ）を
用いるＤＮＡ−配列の増幅のための概要を、特に、ガイ
ト（Gait) のハンドブック：Oligonukuleotidoe synthe
sis: a practicalapproach (IRL Press, Oxford,UK,198
4) 及びニュートン及びグラハム（Newtonund Graham）
の PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland ,1994) 中に見いだすことができる。
【００３２】本発明者は、ｌｒｐ−遺伝子がアミノ酸、
殊にＬ−リシン及びＬ−イソロイシンの製造のために重
要であることを発見した。
殊にＬ−リシン及びＬ−イソロイシンの製造のために重
要であることを発見した。
【００３３】本発明者は、更に、それぞれの生合成経路
の、糖分解の、クエン酸サイクルの、アナプレロテイッ
ク物質代謝の又はアミノ酸輸送の酵素１種以上のそれぞ
れ又は相互に組み合わせての付加的な過剰発現（Uebere
xpression)が、アミノ酸、殊にＬ−リシン及びＬ−イソ
ロイシンの製造のための更なる利点をもたらすことを発
見した。
の、糖分解の、クエン酸サイクルの、アナプレロテイッ
ク物質代謝の又はアミノ酸輸送の酵素１種以上のそれぞ
れ又は相互に組み合わせての付加的な過剰発現（Uebere
xpression)が、アミノ酸、殊にＬ−リシン及びＬ−イソ
ロイシンの製造のための更なる利点をもたらすことを発
見した。
【００３４】例えば、Ｌ−リシンの製造のために、 ・ 同時に、ジヒドロジピコリナート−シンターゼをコ
ードするｄａｐＡ−遺伝子（ＥＰ−Ｂ０１９７３３５）
又は ・ 同時に、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート
−デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐ−遺伝子（Schw
inde et al., Journal of Bacteriology 175: 3905-390
8( 1993)) 又は ・ 同時に、マレート：キノンオキシドレダクターゼを
コードするｍｑｏ−遺伝子（Molenaar et al., Europea
n Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)）又
は ・ 同時に、ピルベート−カルボキシラーゼをコードす
るｐｙｃ−遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）又は ・ 同時に、リシン−移送をコードするｌｙｓＥ−遺伝
子（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２）を過剰発現させるこ
とができる。
ードするｄａｐＡ−遺伝子（ＥＰ−Ｂ０１９７３３５）
又は ・ 同時に、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート
−デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐ−遺伝子（Schw
inde et al., Journal of Bacteriology 175: 3905-390
8( 1993)) 又は ・ 同時に、マレート：キノンオキシドレダクターゼを
コードするｍｑｏ−遺伝子（Molenaar et al., Europea
n Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)）又
は ・ 同時に、ピルベート−カルボキシラーゼをコードす
るｐｙｃ−遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）又は ・ 同時に、リシン−移送をコードするｌｙｓＥ−遺伝
子（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２）を過剰発現させるこ
とができる。
【００３５】従って、例えばＬ−ロイシンの製造のため
に、 ・ 同時に、スレオニン−デヒドロゲナーゼをコードす
るｉｌｖＡ−遺伝子（Moeckel et al., Journal of Bac
teriology (1992) 80645-8072)) 又は”フィードバック
抵抗”スレオニン−デヒドロゲナーゼをコードするｉｌ
ｖＡ（Ｆｂｒ）−アレル(Moeckel et al., (1994) Mole
cular Microbiology 13: 833-842) 又は ・ 同時に、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート
−デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐ−遺伝子（Schw
inde et al., Journal of Bacteriology 175: 3905-390
8(1993)) 又は ・ 同時に、マレート：キノンオキシドレダクターゼを
コードするｍｑｏ−遺伝子（Molenaar et al., Europea
n Journal of Biochemistry 254, 395-403( 1998)) 又
は ・ 同時に、ピルベート−カルボキシラーゼをコードす
るｐｙｃ−遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）を過
剰発現させることができる。
に、 ・ 同時に、スレオニン−デヒドロゲナーゼをコードす
るｉｌｖＡ−遺伝子（Moeckel et al., Journal of Bac
teriology (1992) 80645-8072)) 又は”フィードバック
抵抗”スレオニン−デヒドロゲナーゼをコードするｉｌ
ｖＡ（Ｆｂｒ）−アレル(Moeckel et al., (1994) Mole
cular Microbiology 13: 833-842) 又は ・ 同時に、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート
−デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐ−遺伝子（Schw
inde et al., Journal of Bacteriology 175: 3905-390
8(1993)) 又は ・ 同時に、マレート：キノンオキシドレダクターゼを
コードするｍｑｏ−遺伝子（Molenaar et al., Europea
n Journal of Biochemistry 254, 395-403( 1998)) 又
は ・ 同時に、ピルベート−カルボキシラーゼをコードす
るｐｙｃ−遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）を過
剰発現させることができる。
【００３６】更に、アミノ酸、殊にＬ−リシン及びＬ−
イソロイシンの製造のために、不所望の副反応を抑制す
ることが有利でありうる（Nakayama: "Breeding of Ami
no Acid Producing Micro-organismus" in: Overproduc
tion of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Va
nek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982) 。
イソロイシンの製造のために、不所望の副反応を抑制す
ることが有利でありうる（Nakayama: "Breeding of Ami
no Acid Producing Micro-organismus" in: Overproduc
tion of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Va
nek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982) 。
【００３７】本発明により製造された微生物は、連続的
に又は非連続的にバッチ法（Satzkultuivierung）又は
バッチ供給法（Zulaufverfahren) 又は繰り返しバッチ
供給法（repetitives Zulaufverfahren) で、アミノ
酸、殊にＬ−リシン及びＬ−イソロイシンの製造の目的
のために培養することができる。公知の培養法の概要
は、キミール（Chmiel）の教科書（Bioprozesstechnik
1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 又はストラス（S
torhas）の教科書（Bioreaktoren und periphere Ｅinr
ichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)) に記載されている。
に又は非連続的にバッチ法（Satzkultuivierung）又は
バッチ供給法（Zulaufverfahren) 又は繰り返しバッチ
供給法（repetitives Zulaufverfahren) で、アミノ
酸、殊にＬ−リシン及びＬ−イソロイシンの製造の目的
のために培養することができる。公知の培養法の概要
は、キミール（Chmiel）の教科書（Bioprozesstechnik
1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 又はストラス（S
torhas）の教科書（Bioreaktoren und periphere Ｅinr
ichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)) に記載されている。
【００３８】使用すべき培地は、適当な方法でその都度
の菌株の要求を満足すべきである。種々の微生物用の培
地の記載は、ハンドブック”Ｍanual of Methods for G
enral Bacteriology " der American Society for Bact
eriology (Washington D.C.,USA,1981)中 に包含されて
いる。炭素源としては、糖及び炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、
例えば大豆油、ひまわり油、落花生油及びココヤシ油、
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノー
ル酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール及
び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。これら
の物質は単独でも、混合物としても使用できる。窒素源
としては、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母
エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープリカ
ー、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができ
る。これらの窒素源は、単独で又は混合物として使用す
ることができる。燐源としては、燐酸、燐酸二水素カリ
ウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム
含有塩を使用することができる。培地は、更に金属の
塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄（これらは成長
のために必要である）を含有すべきである。最後に、必
須の成長促進物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記
の物質に加えて使用することができる。更に、この培地
に適当な前駆物質を添加することもできる。記載の使用
物質は、培養液に１バッチの形で加えるか又は適当な方
法で培養の間に供給することができる。
の菌株の要求を満足すべきである。種々の微生物用の培
地の記載は、ハンドブック”Ｍanual of Methods for G
enral Bacteriology " der American Society for Bact
eriology (Washington D.C.,USA,1981)中 に包含されて
いる。炭素源としては、糖及び炭水化物、例えばグルコ
ース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、
例えば大豆油、ひまわり油、落花生油及びココヤシ油、
脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノー
ル酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール及
び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。これら
の物質は単独でも、混合物としても使用できる。窒素源
としては、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母
エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープリカ
ー、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができ
る。これらの窒素源は、単独で又は混合物として使用す
ることができる。燐源としては、燐酸、燐酸二水素カリ
ウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム
含有塩を使用することができる。培地は、更に金属の
塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄（これらは成長
のために必要である）を含有すべきである。最後に、必
須の成長促進物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記
の物質に加えて使用することができる。更に、この培地
に適当な前駆物質を添加することもできる。記載の使用
物質は、培養液に１バッチの形で加えるか又は適当な方
法で培養の間に供給することができる。
【００３９】培養液のｐＨ調整のために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニア又はアンモニア水又は酸性化合物、例えば燐酸又は
硫酸が適当な方法で使用される。気泡発生のコントロー
ルのために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエス
テルを使用することができる。プラスミド安定性の保持
のために、培地に適当な選択作用をする物質、例えば抗
生物質を添加することができる。好気性条件を保持する
ために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培
養液中に導入する。培養液の温度は、通常は２０℃〜４
５℃、有利に２５℃〜４０℃である。培養は、所望のア
ミノ酸の最大量が形成されるまで継続する。この目的
は、通常は、１０時間〜１６０時間で達成される。
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニア又はアンモニア水又は酸性化合物、例えば燐酸又は
硫酸が適当な方法で使用される。気泡発生のコントロー
ルのために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエス
テルを使用することができる。プラスミド安定性の保持
のために、培地に適当な選択作用をする物質、例えば抗
生物質を添加することができる。好気性条件を保持する
ために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培
養液中に導入する。培養液の温度は、通常は２０℃〜４
５℃、有利に２５℃〜４０℃である。培養は、所望のア
ミノ酸の最大量が形成されるまで継続する。この目的
は、通常は、１０時間〜１６０時間で達成される。
【００４０】アミノ酸の分析は、スパックマン等（Spac
hkman et al., Analytical Chemistry , 30, (1958), 1
190)により記載されているように、アニオン交換クロマ
トグラフィに引き続くニンヒドリン誘導体化により行う
ことができるか、又はリンドロス等（Lindroth et al.,
Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) により
記載されているように逆相ＨＰＬＣにより行うことがで
きる。
hkman et al., Analytical Chemistry , 30, (1958), 1
190)により記載されているように、アニオン交換クロマ
トグラフィに引き続くニンヒドリン誘導体化により行う
ことができるか、又はリンドロス等（Lindroth et al.,
Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) により
記載されているように逆相ＨＰＬＣにより行うことがで
きる。
【００４１】本発明の方法は、アミノ酸、殊にＬ−リシ
ン及びＬ−イソロイシンの発酵的製造のために使用され
る。
ン及びＬ−イソロイシンの発酵的製造のために使用され
る。
【００４２】
【実施例】次の実施例を用いて本発明を詳述する。
【００４３】例１ コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からのゲノムコスミド−遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡを、タウフ等（Tauch et al.,）に
よる記載（1995, Plasmid 33: 168-179)のように単離
し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia,Freib
urg,Deutschland,Produktbeschreibung Sau3AI, Code n
o. 27-0913-02) を用いて部分的に切断した。このＤＮ
Ａ−フラグメントを、ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファタ
ーゼ（Roche Molecular Biochemicals,Mannheim, Deuts
chland, Produktbeschreibung SAP,Code no. 1758250)
を用いて脱リン酸化した。ストラテジェン社（Firma St
rategene :La Jolla,USA, Producktbeschreibung Super
Cos1 cosmid Vektor Kit, Cide no. 251301) から購入
されたコスミド−ベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ
（Wahl et al., (1987) Proceedings of the National
Academy of SciencesUSA 84:2160-2164) を、制限酵素
ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
を用いて切断し、同様に、ｓｈｒｉｍｐアルカリホスフ
ァターゼで脱リン酸化した。引き続き、コスミド−ＤＮ
Ａを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia ,Frei
burg,Deutschland, Produktobeschreibung BamHI,Code
no. 27-0868-04) を用いて切断した。このように処理さ
れたコスミド−ＤＮＡを、処理されたＡＴＣＣ１３０３
２−ＤＮＡと混合させ、バッチをＴ４−ＤＮＡ−リガー
ゼ（Amersham Pharmacia ,Freiburg, Deutschland, Pro
duktobeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-0
4) で処理した。リゲーシヨン混合物を、引き続き、ギ
ガパックII XLパッキング エクストラクツ（Gigapack
IIXL Packing Extracts）（Strategene,La Jolla,USA,
Producktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extrac
t, code no. 200217) を用いてファージ中にパッキング
した。Ｅ・コリー菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al. 198
8, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) の感染のため
に、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ4中に懸濁させ、ファー
ジ懸濁液のアリコートと混合した。感染及びコスミドラ
イブラリーの滴定をサンブロック等（Sambrook etal.)
の記載（１９８９，Molecular Cloning :A laboratory
Manual ,Cold Spring Harbor) のように実施し、この
際、細胞をＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology, 1: 1
90)＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ 上で平板培養し
た。３７℃で一晩にわたる恒温保持の後に、個々の組み
換えクローンを選択した。
からのゲノムコスミド−遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
からの染色体ＤＮＡを、タウフ等（Tauch et al.,）に
よる記載（1995, Plasmid 33: 168-179)のように単離
し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia,Freib
urg,Deutschland,Produktbeschreibung Sau3AI, Code n
o. 27-0913-02) を用いて部分的に切断した。このＤＮ
Ａ−フラグメントを、ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファタ
ーゼ（Roche Molecular Biochemicals,Mannheim, Deuts
chland, Produktbeschreibung SAP,Code no. 1758250)
を用いて脱リン酸化した。ストラテジェン社（Firma St
rategene :La Jolla,USA, Producktbeschreibung Super
Cos1 cosmid Vektor Kit, Cide no. 251301) から購入
されたコスミド−ベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ
（Wahl et al., (1987) Proceedings of the National
Academy of SciencesUSA 84:2160-2164) を、制限酵素
ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschlan
d, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
を用いて切断し、同様に、ｓｈｒｉｍｐアルカリホスフ
ァターゼで脱リン酸化した。引き続き、コスミド−ＤＮ
Ａを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia ,Frei
burg,Deutschland, Produktobeschreibung BamHI,Code
no. 27-0868-04) を用いて切断した。このように処理さ
れたコスミド−ＤＮＡを、処理されたＡＴＣＣ１３０３
２−ＤＮＡと混合させ、バッチをＴ４−ＤＮＡ−リガー
ゼ（Amersham Pharmacia ,Freiburg, Deutschland, Pro
duktobeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-0
4) で処理した。リゲーシヨン混合物を、引き続き、ギ
ガパックII XLパッキング エクストラクツ（Gigapack
IIXL Packing Extracts）（Strategene,La Jolla,USA,
Producktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extrac
t, code no. 200217) を用いてファージ中にパッキング
した。Ｅ・コリー菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al. 198
8, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) の感染のため
に、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ4中に懸濁させ、ファー
ジ懸濁液のアリコートと混合した。感染及びコスミドラ
イブラリーの滴定をサンブロック等（Sambrook etal.)
の記載（１９８９，Molecular Cloning :A laboratory
Manual ,Cold Spring Harbor) のように実施し、この
際、細胞をＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology, 1: 1
90)＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ 上で平板培養し
た。３７℃で一晩にわたる恒温保持の後に、個々の組み
換えクローンを選択した。
【００４４】例２ ｌｒｐ−遺伝子の単離及びシーケンシング 個々のコロニーのコスミド−ＤＮＡを、製造者指示に従
がい、キアプレプ スピン ミニプレプ キット（Qiap
rep Spin Miniprep Kit：Product no. 27106,Qiagen, H
ilden, Germany) を用いて単離し、制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉ（AmershamPharmacia ,Freiburg, Deutschland, Prod
uktobeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
を用いて部分的に切断した。ＤＮＡ−フラグメントを、
ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼ（Roche Molecula
r Biochemicals,Mannheim, Deutschland, Produktbesch
reibung SAP, Product No. 1758250) を用いて脱リン酸
化した。ゲル電気泳動による分離の後に、１５００〜２
０００ｂｐの寸法範囲内のコスミドフラグメントの単離
を、Qia ExII ゲルエクストラクツ キット（Product
No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany) を用いて行っ
た。インビトロゲン社（Invitrogen)から購入したシー
ケンシングベクターｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡ（Groninge
n, Niederlands , Produktbeschreibung Zero Backgrou
nd Cloning Kit, Product No. K 2500-01) を、制限酵
素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia ,Freiburg, Deutsc
hland, Produktobeschreibung BamHI, Product No. 27-
0868-04) を用いて切断した。シ-ケンシングベクターｐ
Ｚｅｒｏ−１へのコスミドフラグメントのリゲーシヨン
を、サンブロック等の記載（Sambrook et al.:1989, Mo
lecular Cloning: A laboratory Manual ,Cold Spring
Harbor ) のように実施し、この際、このＤＮＡ−混合
物をＴ４−リガーゼ（Pharmacia, Biotech, Freiburg,
Deutschland ) と一緒に一晩にわたり恒温保持した。こ
のリゲーシヨン混合物を、引き続きＥ・コリー菌株ＤＨ
５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of the Nation
al Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) 中に
電気穿孔し（Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Lett
ers, 123:343-7) 、かつＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Vi
rology, 1:190)+ゼオシン（Zeocin)50 μg/ml上で平板
培養した。組み換えられたクローンのプラスミドプレパ
レーシヨンは、バイオロボット（Biorobot）9600（Prod
uct No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany) を用いて
行った。シーケンシングは、サンガー等のジデオキシ連
鎖終端法（Dideoxy-Kettenabbruch -Methode von Sange
r et al. (1977): Proceedings of the National Acade
mies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) に従って、
チンマーマン等の変法（Zimmermann et al., (1990) ,N
ucleic Acids Reseach, 18:1067) を用いて行った。Ｐ
Ｅ アプライド ビオシステムズ（PE Applied Biosyst
ems )からの”RR dRhodamin Terminator Cycle Sequenc
ing Kit" （Product No. 403044, Weiterstadt，German
y) を用いた。ゲル電気泳動での分離及びシーケンシン
グ反応の分析は、”ロチフォレーゼＮＦアクリルアミド
／ビスアクリルアミド”ゲル（２９：１）（”Rotiphor
ese NF "Acrylamid/Bisacrylamid Gel（２９：１）: Pr
oduct No. A124.1,Roth,Karlsruhe,Germany) 中で、PE
Applied Biosystems(Weiterstadt,Germany) からの”Ａ
ＢＩプリズム３７７シーケンサー”を用いて行った。
がい、キアプレプ スピン ミニプレプ キット（Qiap
rep Spin Miniprep Kit：Product no. 27106,Qiagen, H
ilden, Germany) を用いて単離し、制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉ（AmershamPharmacia ,Freiburg, Deutschland, Prod
uktobeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
を用いて部分的に切断した。ＤＮＡ−フラグメントを、
ｓｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼ（Roche Molecula
r Biochemicals,Mannheim, Deutschland, Produktbesch
reibung SAP, Product No. 1758250) を用いて脱リン酸
化した。ゲル電気泳動による分離の後に、１５００〜２
０００ｂｐの寸法範囲内のコスミドフラグメントの単離
を、Qia ExII ゲルエクストラクツ キット（Product
No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany) を用いて行っ
た。インビトロゲン社（Invitrogen)から購入したシー
ケンシングベクターｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡ（Groninge
n, Niederlands , Produktbeschreibung Zero Backgrou
nd Cloning Kit, Product No. K 2500-01) を、制限酵
素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia ,Freiburg, Deutsc
hland, Produktobeschreibung BamHI, Product No. 27-
0868-04) を用いて切断した。シ-ケンシングベクターｐ
Ｚｅｒｏ−１へのコスミドフラグメントのリゲーシヨン
を、サンブロック等の記載（Sambrook et al.:1989, Mo
lecular Cloning: A laboratory Manual ,Cold Spring
Harbor ) のように実施し、この際、このＤＮＡ−混合
物をＴ４−リガーゼ（Pharmacia, Biotech, Freiburg,
Deutschland ) と一緒に一晩にわたり恒温保持した。こ
のリゲーシヨン混合物を、引き続きＥ・コリー菌株ＤＨ
５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of the Nation
al Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) 中に
電気穿孔し（Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Lett
ers, 123:343-7) 、かつＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Vi
rology, 1:190)+ゼオシン（Zeocin)50 μg/ml上で平板
培養した。組み換えられたクローンのプラスミドプレパ
レーシヨンは、バイオロボット（Biorobot）9600（Prod
uct No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany) を用いて
行った。シーケンシングは、サンガー等のジデオキシ連
鎖終端法（Dideoxy-Kettenabbruch -Methode von Sange
r et al. (1977): Proceedings of the National Acade
mies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) に従って、
チンマーマン等の変法（Zimmermann et al., (1990) ,N
ucleic Acids Reseach, 18:1067) を用いて行った。Ｐ
Ｅ アプライド ビオシステムズ（PE Applied Biosyst
ems )からの”RR dRhodamin Terminator Cycle Sequenc
ing Kit" （Product No. 403044, Weiterstadt，German
y) を用いた。ゲル電気泳動での分離及びシーケンシン
グ反応の分析は、”ロチフォレーゼＮＦアクリルアミド
／ビスアクリルアミド”ゲル（２９：１）（”Rotiphor
ese NF "Acrylamid/Bisacrylamid Gel（２９：１）: Pr
oduct No. A124.1,Roth,Karlsruhe,Germany) 中で、PE
Applied Biosystems(Weiterstadt,Germany) からの”Ａ
ＢＩプリズム３７７シーケンサー”を用いて行った。
【００４５】得られた粗−シーケンシングデータを、引
き続きＳｔａｄｅｎ−プログラムパッケージ（1986, Nu
cleic Acids Reseach, 14: 217-231) 、バージヨン９７
−０の使用下に処理した。ｐＺｅｒｏｌ−誘導体の個々
の配列を集合させて連続コンテイグ（coherent contig)
にした。コンピュータ補助コーデイング領域分析をソフ
トウエアＸＮＩＰ（Staden, 1986, Nucleic Acids Rese
arch, 14:217-231) を用いて実施した。更なる分析
は、”ＢＬＡＳＴサーチプログラム”（Altschul et a
l.,1997, Nucleic Acids Research，25:3389-3402) を
用いて、”NationalLibrary of Medicine" (USA)の非レ
デウンダント（non-redundant)ＮＣＢＩ−データライブ
ラリーに対して実施した。
き続きＳｔａｄｅｎ−プログラムパッケージ（1986, Nu
cleic Acids Reseach, 14: 217-231) 、バージヨン９７
−０の使用下に処理した。ｐＺｅｒｏｌ−誘導体の個々
の配列を集合させて連続コンテイグ（coherent contig)
にした。コンピュータ補助コーデイング領域分析をソフ
トウエアＸＮＩＰ（Staden, 1986, Nucleic Acids Rese
arch, 14:217-231) を用いて実施した。更なる分析
は、”ＢＬＡＳＴサーチプログラム”（Altschul et a
l.,1997, Nucleic Acids Research，25:3389-3402) を
用いて、”NationalLibrary of Medicine" (USA)の非レ
デウンダント（non-redundant)ＮＣＢＩ−データライブ
ラリーに対して実施した。
【００４６】得られたヌクレオチド配列を、配列番号１
に記載する。このヌクレオチド配列の分析は、ｌｒｐ−
遺伝子と称される４６２塩基対のオープンリーデイング
フレームを示した。このｌｒｐ−遺伝子は、１５４アミ
ノ酸のポリペプチドをコードする。 配列表
に記載する。このヌクレオチド配列の分析は、ｌｒｐ−
遺伝子と称される４６２塩基対のオープンリーデイング
フレームを示した。このｌｒｐ−遺伝子は、１５４アミ
ノ酸のポリペプチドをコードする。 配列表
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 イェルン カリノウスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 デュッセルドルフ ベ ンローデシュトラーセ 35 (72)発明者 ヴァルター プフェッフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33
Claims (12)
- 【請求項１】 群： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一で
あるポリヌクレオチド ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド ｃ） ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的
であるポリヌクレオチド及び ｄ） ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少
なくとも１５の連続的塩基を有するポリヌクレオチド から選択されたポリヌクレオチド配列を含有する、コリ
ネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドは、コリネフォルム細
菌中で複製可能な、有利には、組み換えＤＮＡである、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである、請
求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１のように記載される核酸配列
を含有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】（ｉ）配列番号１に記載されているヌクレ
オチド配列又は（ii）遺伝コードの縮重範囲内の配列
（ｉ）に相当する配列少なくとも１つ又は（iii) 配列
（ｉ）又は（ｉｉ）に対して相補的である配列とハイブ
リダイズする配列少なくとも１つ及び場合により（iv）
（ｉ）中の機能的に中性のセンス突然変異を有する、
請求項２に記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌ
クレオチド配列。 - 【請求項７】 次の工程： ａ）その中で少なくとも１ｒｐ遺伝子を減衰又は増幅さ
せる所望のL-アミノ酸産生性細菌の発酵 ｂ）培地中又は細菌の細胞中での所望の産生物の富化
及び ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離 を実施することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項８】 その中で付加的に所望のＬ−アミノ酸の
生合成経路の他の遺伝子を増幅させる細菌を使用する、
請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 その中で所望のＬ−アミノ酸の形成を減
少させる物質代謝経路が少なくとも部分的に抑制されて
いる細菌を使用する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 プラスミドベクターで形質転換された
菌株を使用し、このプラスミドベクターは、１ｒｐ−遺
伝子をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項７
に記載の方法。 - 【請求項１１】 減衰のために細菌の１ｒｐ−遺伝子中
に欠失又は挿入を導入する、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｌ−アミノ酸を製造するコリネフォル
ム細菌を使用する、請求項８から１１までのいずれか１
項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19947792.2 | 1999-10-05 | ||
| DE19947792A DE19947792A1 (de) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000303892A Pending JP2001128692A (ja) | 1999-10-05 | 2000-10-03 | ｌｒｐ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 |
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| AU2002345038A1 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-21 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1999018228A2 (de) * | 1997-10-04 | 1999-04-15 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel |
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