SK14592000A3 - Nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín - Google Patents
Nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín Download PDFInfo
- Publication number
- SK14592000A3 SK14592000A3 SK1459-2000A SK14592000A SK14592000A3 SK 14592000 A3 SK14592000 A3 SK 14592000A3 SK 14592000 A SK14592000 A SK 14592000A SK 14592000 A3 SK14592000 A3 SK 14592000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- sequence
- polynucleotide
- amino acid
- seq
- gene
- Prior art date
Links
- 101150000411 lrp gene Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 32
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 32
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 7
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 abstract description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 22
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 3
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710155796 Malate:quinone oxidoreductase Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000052866 Amino Acyl-tRNA Synthetases Human genes 0.000 description 1
- 108700028939 Amino Acyl-tRNA Synthetases Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000133018 Corynebacterium melassecola Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 101100123420 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) hacB gene Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150087199 leuA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150104150 livJ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150110767 lysS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112482 lysU gene Proteins 0.000 description 1
- 101150029821 lysX gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález popisuje nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp. Ďalej vynález popisuje spôsoby fermentatívnej výroby aminokyselín, najmä potom lyzínu a izoleucínu za použitia koryneformných baktérií, v ktorých je ovplyvnená expresia génu lrp.
Dotera-iši stav techniky
L-aminokyseliny sú významné suroviny, ktoré nachádzajú uplatnenie vo výžive ľudí aj zvierat, ako aj v humánnej medicíne a farmaceutickom priemysle.
Je známe, že tieto aminokyseliny môžu byť vyrobené fermentáciou vhodných kmeňov baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Na zlepšení spôsobu výroby sa sústavne pracuje vďaka významu, ktorý tieto aminokyseliny majú.
Zlepšenie spôsobu výroby týchto aminokyselín môže byť dosiahnuté prostredníctvom zmeny techniky fermentácie ako napríklad zmenou miešania a prevzdušňovania kyslíkom, či zmenou zloženia živného média ako napríklad zmenou koncentrácie cukru v priebehu fermentácie, či zmenou v spôsobe spracovania na výslednú formu napríklad chromatografickým čistením na iontomeniči, či zmenou výkonných vlastností samotného produkčného mikroorganizmu.
Ku zlepšeniu výkonnosti produkčných mikroorganizmov boli použité spôsoby mutagenézie, selekcie a vyhľadávania mutantných • · • ··· ·· · • · · · · • · · · · · t *< * * ( I a* · · í ·· ·· ·· ···» ·· ··· klonov. Týmto spôsobom boli získané kmene, ktoré sú odolné voči antimetabolitom ako napríklad voči analógu lyzínu S-(2-aminoetyl)-cysteinu alebo sú auxotrofné vzhľadom k regulačné dôležitým aminokyselinám a produkujú požadované L-aminokyseliny. Už niekoľko rokov sa používajú ku zlepšeniu kmeňov Corynebacterium sp. produkujúcich L-aminokyseliny rovnako spôsoby rekombinantnej DNA.
Protein LRP (leucín-responzívny protein) bol najprv popísaný u baktérie Escherichia coli ako globálny regulátor, ktorý ovplyvňuje transkripciu celého radu génov, ktorých produkty sa zúčastňujú transportu, biosyntézy a odbúravania aminokyselín (Calvo a Matthews, Microbiological Reviews 58, strana 466 až 490, 1994).
V súčasnosti boli identifikované podobné gény tiež u ďaľších organizmov ako napríklad u Bradyrhizobium japonicum (King a 0' Brian, Journal of Bacteriology, 179, strana 1828 až 1831, 1997), Klebsiella aerogenes (Janes a Bender, Journal of Bacteriology, 181, strana 1054 až 1058, 1999), Sulfolobus acidocaldarius (Charlier a ďaľší, Gene 201, strana 63 až 68, 1997) a u Gram-pozitivnej baktérie Bacillus subtilis (Belitsky a ďaľší, Journal of Bacteriology, 179, strana 5448 až 5457, 1997).
V baktériách E. coli reguluje protein LRP svoju vlastnú expresiu. Okrem toho ovplyvňuje LRP protein v E. coli expresiu mnohých gémov, a to buď negatívne alebo pozitívne. Obecne je pritom stimulovaná expresia produktov génov, ktoré sa zúčastňujú na úlohe biosyntetických pochodov.
Naopak produkty génov, ktoré sa podieľajú na katabolizme sú spravidla regulované negatívne. V niektorých prípadoch sa dá zvýšiť účinok proteínu LRP prídavkom L-leucínu, pričom prídavok L-leucínu môže účinkovať tiež negatívne (Newman a ďaľší v knihe :
• · · · • · a · ·
- 3 • · • ··· • a a a a aa · á • a ·· aa aaaa ·· ·
Neidhardt a ďaľší. Escherichia coli and Salmonella typhimurium : Cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D.C., strana 1513 až 1525, 1996). Cez proteín LRP je v E. coli regulované veľké množstvo génov a operónov, ktoré hrajú centrálnu úlohu pri syntéze aminokyselín a ich katabolizme. V baktériách E. coli sú napríklad pomocou LRP negatívne regulované nasledujúce operóny : operón livJ, ktorý kóduje väzobný proteín z vysoko afinného komplexu pre príjem aminokyselín s rozvetveným reťazcom (Haney a ďaľší Journal of Bacteriology, 174, strana 108 až 115, 1992) a operón lysU, ktorý kóduje lyzín tRNA-syntetázu (Gazeau a ďaľší FEBS Letters, 300, strana 254 až 258, 1994).
Medzi doposiaľ známe gény pozitívne ovplyvňované proteínom Lrp u E. coli patria okrem iných : ilvIH, gltBDF a leuABCD (Lin a ďalší Journal of Bacteriology, 174, strana 1948 až 1955, 1992).
Posledný menovaný operón má zásadný význam pre biosyntézu leucínu a veľmi významný je aj pre biosyntézu lyzínu v Corynebacterium glutamicum. Dá sa predpokladať, že je určitý vzťah medzi auxotrofiou ohľadne leucínu a vysokou produkčnou schopnosťou lyzínu (Schrumpf a ďalší, Applied Microbiology and Biotechnology, 37, strana 566 až 571, 1992). Patek a ďaľší (Applied and Environmental Microbiology, 60, strana 133 až 140, 1994) dokázali, že inaktivácia operónu leuA v lyzín-produkujúcom kmeni C. glutamicum viedla ku zvýšeniu spotreby lyzínu. Tosaka a ďaľší (Agricultural Biological Chemistry, 43, strana 265 až 270, 1979) dokázali na jednom mutantnom kmeni Brevibacterium lactofermentum, že po prídavku od L-leucínu došlo ku zníženiu tvorby lyzínu pri súčasnom zvýšení tvorby treonínu.
- 4 ··
| • · • ··· | • · · · 9 9 9 | 9 9 9 9 | • · |
| ·· | 99 9999 | • · | • · |
Podstata vynálezu
Vynález popisuje nový spôsob zlepšenej fermentatívnej výroby L-aminokyselín, najmä potom L-lyzínu, L-izoleucínu pomocou koryneformných baktérií.
I. Predmet vynálezu je polynukleotíd izolovaný z koryneformných baktérií, ktorý obsahuje polynukleotídovú sekvenciu, vybratú zo skupiny tvorenej :
a) polynukleotídy, ktoré sú aspoň zo 70 % identické s polynukleotídom kódujúcim peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencii id. č. : 2.
b) polynukleotid, kódujúci peptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň zo 70 % identická so sekvenciou aminokyselín podľa Sekvencie id. č. : 2.
c) polynukleotíd, komplementárny k polynukleotídu podľa a) alebo b) a
d) polynukleotíd, obsahujúci aspoň 15 za sebou idúcich bází z polynukleotídovej sekvencie podľa bodov a), b) alebo c).
II. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je predmet vynálezu rovnako polynukleotíd podľa bodov a), b), c) alebo d), pričom sa jedná o replikovateľnú DNA obsahujúcu :
(i) nukleotidovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č.: 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii podľa bodu (i) vzhľadom k degenerácii genetického kódu alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybriduje so sekvenciou podľa bodu (i) alebo (ii) alebo s komplementárnymi sekvenciami, • · • ··· rt · * ··· · · ·· · • · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···· ·· ·
- 5 a poprípade (iv) funkčne neutrálna mutácia v sekvencii podľa bodu (i).
Vynález ďalej popisuje polynukleotid podľa bodu II, obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu Sekvencii id.č. : 1, polynukleotid podľa bodu II, kódujúci polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia obsahuje Sekvenciu id.č. : 2.
Predmetom vynálezu sú rovnako polynukleotidy, ktoré podstatným spôsobom pozostávajú z polynukleotidovej sekvencie, ktorá sa dá získať hybridizačným skríningom zodpovedajúcej knižnice obsahujúcej celkový gén so sekvenciou podľa Sekvencie id.č. 1, za použitia hybridizačnej sondy, ktorá má sekvenciu podľa Sekvencie id.č.: 1 alebo aspoň jej fragment, ako aj izolácie uvedenej sekvencie DNA z knižnice.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, v prípade cDNA pre izolačné sekvencie o celkovej dĺžke (full-length) kódujúce proteín Lrp a pre izoláciu takých cDNA alebo génov, ktoré vykazujú vysokú sekvenčnú homológiu s génom lrp.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú ďalej vhodné ako priméry prípravy DNA z génov kódujúcich proteín Lrp, pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).
Oligonukleotídy, ktorú slúžia ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, vo výhodnom uskutočnení aspoň 20, v celkom osobitne výhodnom uskutočnení aspoň 15 po sebe idúcich bází. Vhodné sú rovnako oligonukleotídy o dĺžke aspoň 40 alebo 50 párov bází.
• · • ·· · · ·« ·· ·· ···· ·· ·
- 6 V ďaľšom texte sa pod nasledujúcimi termínami chápe :
Izolovaný značí oddelený od svojho prirodzeného pozadia, respektíve okolia.
Polynukleotíd sa vzťahuje obecne na polyribonukleotídy a polydeoxyribonukleotídy, pričom môže ísť o nemodifikovanú RNA alebo DNA alebo modifikovanú RNA alebo DNA.
Pod pojmom polypeptíd sa chápe peptid alebo proteín, ktorý obsahuje dve alebo viacej aminokyselín viazaných peptídovými väzbami.
Polypeptídy podľa vynálezu zahŕňajú polypeptíd podľa Sekvencie id.č. : 2, a ďalej potom polypeptídy s biologickou aktivitou proteínu Lrp a rovnako také, ktoré sú aspoň zo 70 % identické s polypeptídom podľa Sekvencie id.č. : 2, vo výhodnom uskutočnení aspoň z 80 % identické a v najmä výhodnom uskutočnení aspoň z 90 % až 95 % identické s polypeptídom podľa Sekvencie id.č.: 2 a ktoré vykazujú uvedenú aktivitu.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu a L-izoleucínu, za použitia koryneformných baktérií, najmä potom takých, ktoré požadované aminokyseliny už produkujú, a v ktorých je nový gén lrp zosilnený alebo zoslabený v závislosti na požadovanej cieľovej substancii.
Výrazom zosilnenie sa v tomto prípade chápe zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekoľkých enzýmov, ktoré sú v mikroorganizme kódované príslušnými DNA, napríklad tým, že sa zvýši počet kópií génu ( génov) na bunku, použije sa silný promotor, alebo sa použije gén kódujúci enzým so zvýšenou aktivitou, poprípade kombinácia týchto účinkov.
·· ·· ·· β· • · · · · · 9 9 9 9 • 9 999 99 999
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9999 99 9
Výrazom zoslabenie” sa v tomto prípade chápe zníženie alebo celkové zastavenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekoľkých enzýmov (proteínov) v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnými DNA, napríklad tým, že sa použije slabý promotor, alebo sa použije gén poprípade alela, ktorá kóduje príslušný enzým s nižšou aktivitou alebo sa príslušný enzým (proteín) inaktivuje a poprípade kombinácie týchto účinkov.
Mikroorganizmy podľa vynálezu môžu vytvárať L-lyzín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu. Môže ísť o zástupcov koryneformných baktérií osobitne z rodu Corynebacterium. Z rodu Corynebacterium je potrebné menovať predovšetkým druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je odborníkom známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi baktérií rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad tieto prirodzene sa vyskytujúce kmene :
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a od nich odvodené mutantné kmene produkujúce aminokyseliny, ako napríklad :
kmene produkujúce L-lyzín
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 • · · ···· ··· • · ··· · · « t v
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a
Corynebacterium glutamicum DSM5715 alebo kmene produkujúce L-izoleucín :
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168 a
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871
Autorom vynálezu sa podarilo izolovať nový gén z baktérie C. glutamicum, ktorý kóduje proteín Lrp.
Na izoláciu tohto lrp-génu respektíve na izoláciu ľubovoľného iného génu z baktérií C. glutamicum je treba najprv vytvoriť génovú knižnicu tohto mikroorganizmu v baktériách E. coli. Vytvorenie takejto knižnice je popísané v obecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu Winnacker : Gény a Klony : Úvod do genetických technológií (vydateľstvo Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku Sambrook a ďal’ší Nolecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Príkladom jednej veľmi známej knižnice je E. coli K-12 kmeňa W3110 v X - vektoroch vytvorená a popísaná Koharom a ďalšími (viď Celí 50, strana 495 až 508 (1987). Bathe a ďaľší popisujú (viď Molecular and General Genetics, 252 : strana 255 až 265, 1996) DNA knižnicu baktérie C. glutamicum ATCC13032, vytvorenú za pomoci kosmidu SuperCos I (Wahl a ďal’ší 1987, Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 84 : strana 2160 až 2164) v baktériách E. coli K-12 kmeňa NM554 (viď • · • ··· • · · ··· · · ·· · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···· ·· « _ 9 Raleigh a ďalší 1988, Nucleic Acids Research 16 : strana 1563 až 1575). Bormann a ďalší (Molecular Microbiology 6(3), strana 317 až 326)) ďalej popisujú knižnicu baktérií C. glutamicum ATCC13032 vytvorenú za použitia kosmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, strana 291 až 298 (1980)). K príprave DNA knižnice baktérie C. glutamicum v E. coli môžu byť použité tiež plazmidy ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) alebo pUC9 (Norrander a ďaľší 1983, Gene 26 : strana 101 až 106). Ako hostiteľské sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne deficientné. Príklad takého kmeňa sú bunky kmeňa DHSeČMCR, viď Grant a ďaľší, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) strana 4645 až 4649.
Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kosmidov môžu byť nasledovne použité pre subklonovanie do vektorov vhodných pre sekvenáciu a inzerty nasledovne sekvenované napríklad spôsobom podľa Sangera a ďaľších (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74 : strana 5463 až
5467, 1977).
Týmto spôsobom bola získaná nová sekvencia DNA kódujúca gén lrp z baktérií C. glutamicum. Táto sekvencia je súčasťou vynálezu a je uvedená ako Sekvencia id.č. sl. Ďalej bola od tejto sekvencie DNA vyššie popísanými spôsobmi odvodená sekvencia aminokyselín zodpovedajúceho proteínu. V sekvencii id.č.: 2 podľa vynálezu je uvedená práve sekvencia aminokyselín proteínu LRP.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré v dôsledku degenerácie genetického kódu zodpovedajú Sekvencii id.č.: 1 sú rovnako súčasťou vynálezu. Rovnako sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa Sekvenciou id.č.: 1 hybridizujú. Odborníkom sú ďalej známe konzervatívne zámeny aminokyselín ako je napríklad zámena glycínu za alanín alebo zámena kyseliny aspargovej za kyselinu • · • · ·· ·· • · · • · ··· ·· ·· • · · · • · · ·· ···· • · ·· · glutámovú. Tieto zámeny aminokyselín sa mutations a vzhľadom k tomu, že nevedú aktivity proteínu nazývajú sa rovnako funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny v N- alebo C-konci proteínu nemajú zásadný negatívny vplyv na funkciu proteínu, dokonca v niektorých prípadoch môže dôjst aj k jej stabilizácii.
nazývajú sense k zásadnej zmene
Odborník môže nájsť údaje, ktoré to potvrdzujú okrem iného v práci Ben-Bassata a ďaľších v časopise Journal of Bacteriology 169 : strana 751 až 757 (1987), O' Regana a ďaľších v časopise Gene 77 : strana 237 až 251 (1989), Sahin-Totha a ďaľších v časopise Proteín Sciences 3 : strana 240 až 247 (1994), Hochuliho a ďaľších v Bio/Technology 6 : strana 1321 až 1325 (1988) a v známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré sú v tomto zmysle analogické Sekvencií id.č.: 2 sú rovnako predmetom vynálezu.
Rovnakým spôsobom sú predmetom vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa Sekvenciou id.č.: 1 alebo jej časťou hybridizujú.
A konečne sú predmetom vynálezu sekvencie DNA amplifikované zo Sekvencie id.č.: možno za pomoci polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a špecifických primérov. Takéto oligonukleotídové priméry majú typickú dĺžku aspoň 15 párov bází.
Návody na identifikáciu DNA za pomoci hybridizácie môžu odborníci nájsť napríklad v príručke The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” (Príručka užívateľa systému DIG pre hybridizáciu) od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a ďalej v článku Liebl a ďal’ší (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41 : strana 255 až 260). Návody na amplifikáciu DNA za pomoci polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník napríklad v príručke • · • ·
- 11 • · ··· • · 9 9 9 9
9 9 9 9
99
9 9 9
9999 99 999
Gait : Oligonucleotide synthesis : a practical approach (Syntéza oligonukleotidov : praktický prístup, IRL Press,
Oxford, Spojené kráľovstvo 1984) a v knihe Newton a Graham: PCR (Akademické vydavateľstvo Spektrum, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Pôvodci vynálezu odhalili dôležitosť génu lrp pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu a L-izoleucínu. Vynález ďalej popisuje skutočnosť, že dodatočne zvýšená expresia jedného alebo niekolkých enzýmov stávajúcich biosyntetických dráh, glykolýzy, cyklu kyseliny citrónovej, anaplerotickej (doplňovacej) látkovej výmeny alebo exportu aminokyselín, či už jednotlivo alebo v kombinácii, poskytujú ďaľšie výhody pre produkciu aminokyselín, osobitne L-lyzínu a L-izoleucínu.
Produkcia L-lyzínu môže byť podľa vynálezu zvýšená napríklad takto :
- súčasným zvýšením expresie génu dapA (EP-B 0 197 335) kódujúceho dihydrodipikolinát syntázu, alebo
- súčasným zvýšením expresie génu gap (Schwinde a ďal’ší, Journal of Bacteriology 175 : strana 3905 až 3908 (1993), kódujúceho glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu, alebo
- súčasným zvýšením expresie génu mgo (Molenaar a ďalší European Journal of Biochemistry 254, strana 395 až 403 (1998), kódujúceho malát : chinón oxidoreduktázu, alebo
- súčasným zvýšením expresie génu pyc (DE-A-19 831 609), kódujúceho pyruvát karboxylázu alebo
- súčasným zvýšením expresie génu LysE (DE-A-195 48 222), ktorý kóduje proteín podieľajúci sa na exporte lyzínu.
«·· · · · · · · ·· • · ··· · · « · · · ······· ···· · ···· ··· ··· ·· ·· ·· ···· ·· ··
- 12 Produkcia L-izoleucínu môže byť podľa vynálezu zvýšená napríklad takto :
- súčasným zvýšením expresie génu ilvA kódujúceho treoníndehydratázu (Mockel a ďalší Journal of Bacteriology (1992) strana 8065 až 8072)) alebo zvýšením expresie génu ilvA (Fbr), ktorý kóduje treonin dehydratázu odolnú proti spätneväzobnej regulácii (Mockel a ďalší (1994), Molecular Microbiology 13 : strana 833 až 842), alebo
- súčasným zvýšením expresie génu gap (Schwinde a ďalší (Journal of Bacteriology 175 : strana 3905 až 3908 (1993)), kódujúceho glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu alebo
- súčasným zvýšením expresie génu mgo (Molenaar a ďalší (European Journal of Biochemistry 254, strana 395 až 403 (1988)), kódujúceho malát : chinón oxidoreduktázu, alebo
- súčasným zvýšením expresie génu pyc (DE-A-19 831 609), kódujúceho pyruvát karboxylázu.
Ďalej môže byť výhodné pre produkciu aminokyselín podľa vynálezu, najmä potom pre produkciu L-lyzínu a L-izoleucínu, inhibovať nežiadúce vedľajšie reakcie (viď Nakayama : Breeding of amino Acid Producing Micro-organisms (Pestovanie mikroorganizmov produkujúcich aminokyseliny) v knihe : Overproduction of Microbial Products, (Produkcia mikrobiálnych produktov) editorov Krumphanzla, Sikyty a Vanka, Academic Press, Londýn, Spojené kráľovstvo, 1982.
Mikroorganizmy skonštruované podľa vynálezu môžu byť za účelom produkcie aminokyselín, najmä potom L-lyzínu a L-izoleucínu kultivované kontinuálnym spôsobom, alebo spôsobmi diskontinuálnymi, či už vsádkovou kultiváciou alebo prietokovou kultiváciou.
- 13 • · · ···· ···· • · ··· · · · · · · • · · · · · · · ·· · · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···« ·· ···
Prehľad známych spôsobov kultivácie Chmiel : Bioprozesstechnik 1.
Bioverfahrenstechnik (Úvod do Fischer, Stuttgart, 1991)
Bioreaktoren und Periphere periférne zariadenie, vydavateľstvo Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
je uvedený v učebnici Einfuhrung in die biotechník, vydavateľstvo Gustáv alebo v učebnici Storhas :
Einrichtungen (Bioreaktory a
Vieweg Verlag,
Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Popisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené v príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre obecnú bakteriológiu) vydaný Americkou bakteriologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981. Ako zdroje uhlíku môžu byť použité cukry a uhľohydráty ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, arašídový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny ako napríklad kyselina palmitová, kyselina steárová a kyselina linolová, alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byť použité buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje dusíku môžu byť použité zlúčeniny obsahujúce organický dusík ako napríklad peptón, extrakt z droždia, extrakt z mäsa, extrakt zo sladu, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako napríklad síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Tieto zdroje dusíku môžu byť použité buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu možno použiť hydrogénfosforečnan alebo dihydrogénfosforečnan draselný či zodpovedajúce sodné soli.
Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nevyhnutné pre rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A konečne môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohatené o esenciálne rastové látky ako ·· • · · • · ··· • · · • · · ·· · · ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · a • · · · · ·· ···· ·· ·
- 14 napríklad aminokyseliny a vitamíny. Pre zvýšenie tvorby aminokyselín možno kultivačné médium ešte obohatit o jej prekurzory. Uvedené zložky môžu byt pridané do média jednorázovo na začiatku, alebo vhodným spôsobom v priebehu kultivácie.
Pre kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amonika alebo kyselé zlúčeniny ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potlačujúcich tvorbu peny ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržať prostredníctvom vhodného selekčného činidla napríklad antibiotika. Vhodné aerobné podmienky možno udržovať privádzaním kyslíku alebo kyslík - obsahujúce zmesi plynov, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na pestovanie baktérií sa normálne pohybuje od 20° do 50° C a výhodne od 25° C do 45° C. Doba kultivácie by mala byť taká, aby bolo dosiahnuté maximum tvorby aminokyselín. Toto maximum je zvyčajne dosiahnuté počas 10 až 160 hodín.
Analýza produkovaných aminokyselín sa môže uskutočňovať za pomoci iontomeničovej chromatografie na anexu s nasledovnou derivatizáciou za pomoci ninhydrínu, tak ako je popísané v práci Spackmana a ďalších (Analytical Chemistry, 30, (1958), strana 1190), alebo sa môže uskutočňovať za pomoci HPLC s reverznou fázou, viď Lindroth a ďaľší. (Analytical Chemistry (1979) 51 : strana 1167 až 1174).
Spôsoby podľa vynálezu slúžia k ferementatívnej produkcii aminokyselín, osobitne L-lyzínu a L-izoleucínu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález bude bližšie popísaný v nasledujúcich príkladoch.
·· ·· • · · • · ··· • · · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · · • · · ·· ···· • · · ·· ···
Príklad 1 :
Príprava kosmidovej génomovej knižnice baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozomálna DNA baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 bola najprv izolovaná a čiastočne naštiepená (viď Tauch a ďalší (1995), Plasmid 33 : strana 168 až 179) reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0913-02). Izolované DNA fragmenty boli defosforylované alkalickou fosfatázou z morských garnátov (shrimp alkaline phosphatase, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). DNA kosmidového vektoru SuperCos I (viď Wahl a ďalší, (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84 :strana 2160 až 2164) získaného od firmy Stratagene (La Jolla, USA, SuperCos I Cosmid Vector Kit, katalógové č. 251301) bola naštiepená reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0948-02) a rovnako defosforylovaná alkalickou fosfatázou. Potom bola kosmidová DNA naštiepená reštrikčným enzýmom BamHI Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. Takto získané fragmenty kosmidovej DNA boli zmiešané s fragmentárni génomovej DNA Corynebacterium glutamicum ATCC13032 a potom spojené pomocou T4-DNA-ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0870-04).
(Amersham 27-086804).
Ligačná zmes bola potom zabalená do fágových častíc za pomoci pakážovacieho extraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL Packing Extract, katalógové č. 200217). Tieto fágové častice boli použité pre infekciu E. coli kmeňa NM554 (viď Raleigh a ďalší, 1988, Nucleic Acid Res. 16 : strana 1563 až 1575). Bunky boli resuspendované v 10 mM MgSO^ a zmiešané s alikvótom fágovej suspenzie. Infekcia a titrácia kosmidovej knižnice bola uskutočnená ako v knihe Sambrook a ďalší (1989), Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bunky boli vysiate na LB-agar (viď ·· ·· ·· ·» • · · · · · · • · ··· · · · • · · · · · · · · ·· ·· ·· ···· ·· ·· ·
Lennox, 1955, Virology, 1 : strana 190) s prídavkom 100 ;ug/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri teplote 37° C boli vybraté jednotlivé rekombinantné klony.
Príklad 2 :
Izolácia a sekvenovanie génu lrp
Najprv bola vyizolovaná kosmidová DNA jednej dobre oddelenej kolónie za pomoci Qiaprep Spin Miniprep Kitu (kat.č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu a tá bola potom čiastočne (Amersham Pharmacia, 270913-02). Získané reštrikčným enzýmom Sau3AI Nemecko, katalógové č.
DNA boli defosforylované naštiepená Freiburg, fragmenty alkalickou fosfatázou (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). Po elektroforetickej separácii nasledovala izolácia fragmentov kosmidu o veľkosti medzi 1500 a 2000 bp za pomoci kitu QiaExII Gel Extraction Kit (katalógové č. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).
Potom bol reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. : 27-0868-04) naštiepený sekvenačný vektor pZero-1 od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, katalógové č. K2500-01). Ligácia fragmentov kosmidu do sekvenačného vektoru pZero-1 bola uskutočnená podľa príručky Sambrook a ďaľší (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bola zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) inkubovaná cez noc. Ligačnou zmesou boli potom elektroporáciou (Tauch a ďaľší 1994, FEMS Microbiol Letters, 123 : strana 343 až 347) transformované baktérie E. coli kmeňa DH5o(MCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87 : strana 4645 až 4649). Transformované baktérie boli vysiate a LB-agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : strana 190) s prídavkom 50 jug/ml zeocínu. Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov bola uskutočnená za pomoci zariadenia Biorobot 9600 (katalógové číslo 900200,
| ·· | ·· | ·· | ·· | ·· · | ||
| • · | • | • | • | • · | • · | ·· |
| • · | ··· | • | • | • | • · | |
| • · | • · | • | • | • | • · | |
| ·· | ·· | ·· | ···· | ·· | ·· |
Qiagen, Hilden, Nemecko). Dideoxy-terminačné sekvenovanie plazmidov (Sanger a ďalší, 1977, Proceeding of the National Academies of Sciences U.S.A., 74 : strana 5463 až 5467) s modifikáciami podľa Zimmermanna a ďaľších (1990, Nucleic Acids Research, 18 : strana 1067) bolo uskutočnené s využitím sekvenačného kitu RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od firmy PE Applied Biosystems (katalógové číslo 403044, Weiterstadt, Nemecko). Elektroforetická separácia a analýza sekvenačnej reakcie bola uskutočnená na gélu Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29 : 1) (katalógové číslo A124.1, Roth, Karlsruhe, Nemecko) v prístroji ABI Prism 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané hrubé sekvenačné dáta boli spracované za pomoci programového balíku Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14 : strana 217 až 231) verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov plazmidu pZerol boli zostavené do súvislého kontigu. Počítačová analýza kódujúcich oblastí bola uskutočnená programom XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14 : strana 217 až 231). Ďaľšie analýzy boli uskutočnené programom BLAST (Altschul a ďaľší 1997, Nucleic Acids Research, 25 : strana 3389 až 3402), proti ne-redundantnej databázi NCBI uloženej v Národnej lekárskej knižnici USA (National Library of Medicíne).
Takto bola získaná nukleotídová sekvencia, ktorá je uvedená vo vynáleze ako Sekvencia id.č. : 1. Analýza tejto nukleotídovej sekvencie odhalila jeden otvorený čítací rámec o velkosti 462 párov bází, ktorý bol označený ako gén lrp. Tento gén kóduje polypeptid o veľkosti 154 aminokyselín.
Claims (12)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaný polynukleotíd z koryneformných baktérií, * ktorý obsahuje polynukleotídovú sekvenciu, vybratú zo skupiny tvorenej :»a) polynukleotídy, ktoré sú aspoň zo 70 % identické s polynukleotídom kódujúcim peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencii id. č. ϊ 2b) polynukleotíd, kódujúci peptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň zo 70 % identická zo sekvenciou aminokyselín podľa Sekvencie id.č. : 2c) polynukleotíd, komplementárny k polynukleotídu podľa a) alebo b) ad) polynukleotíd, obsahujúci aspoň 15 za sebou idúcich bází z polynukleotídovej sekvencie podľa bodov a), b) alebo c).
- 2. Polynukleotíd podľa nároku 1, pričom sa replikovateľnú z koryneformných baktérií a rekombinantnej DNA.jedná o DNA výhodne o
- 3. Polynukleotíd podľa nároku polynukleotíd.1, pričom ide o RNA
- 4. Polynukleotíd podľa nároku 1, ktorý obsahuje nukleotídovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č. : 1.
- 5. Replikovateľná DNA podľa nároku 2, ktorá obsahuje (i) nukleotídovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č. : 1, alebo ·· ·· ·· ·· ·· • · · ···· ··· • · ··· · · · · · • · · ··· · · ·· · • · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···· ·· · (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii podľa bodu (i) vzhľadom k degenerácii genetického kódu alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje zo sekvenciou * podľa bodu (i) alebo (ii) alebo s komplementárnymi sekvenciami, a poprípadeČ (iv) funkčne neutrálna mutácia v sekvencii podľa bodu (i).
- 6. Polynukleotídová sekvencia podľa nároku 2, ktorá kóduje polypeptid, ktorý obsahuje peptídovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č. : 2.
- 7. Spôsob výroby L-aminokyselín vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledujúce kroky :a) fermentácia baktérií, ktoré produkujú požadovanú L-aminokyselinu, a v ktorých je aspoň gén lrp zoslabený alebo zosilnenýb) obohatenie kultivačného média alebo bakteriálnych buniek o požadovaný produkt ac) izolácia L- aminokyseliny a
- 8. Spôsob podľa nároku 7 vyznačujúci sa tým, že sa použijú baktérie, v ktorých sú dodatočne zosilnené ešte ďaľšie gény z , biosyntetickej dráhy požadovanej L- aminokyseliny.
- 9. Spôsob podľa nároku 7 vyznačujúci sa tým, že sa použijú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne inhibujú metabolické dráhy, ktoré znižujú produkciu požadovanej L- aminokyseliny.··
• · • ··· • · • · • · • • · • 9 • · ·· ·· ···· • · ·· - 20 - 10. Spôsob podľa nároku 7 vyznačujúci sa tým, že sa použije kmeň transformovaný plazmidovým vektorom, pričom tento vektor obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu gén lrp.»
- 11. Spôsob podľa nároku 7 vyznačujúci sa tým, že sa použije baktéria, ktorej gén lrp bol oslabený inzerciou alebo ’ deléciou.
- 12. Spôsob podľa jedného alebo viacej z nárokov 8 až 11 vyznačujúci sa tým, že sa použijú koryneformné baktérie, ktoré produkujú
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19947792A DE19947792A1 (de) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK14592000A3 true SK14592000A3 (sk) | 2001-06-11 |
Family
ID=7924468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1459-2000A SK14592000A3 (sk) | 1999-10-05 | 2000-09-29 | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1090993A1 (sk) |
| JP (1) | JP2001128692A (sk) |
| KR (1) | KR20010050827A (sk) |
| CN (1) | CN1290746A (sk) |
| AU (1) | AU6245100A (sk) |
| BR (1) | BR0004642A (sk) |
| CA (1) | CA2319722A1 (sk) |
| DE (1) | DE19947792A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0003894A2 (sk) |
| ID (1) | ID28131A (sk) |
| MX (1) | MXPA00009770A (sk) |
| PL (1) | PL342985A1 (sk) |
| SK (1) | SK14592000A3 (sk) |
| ZA (1) | ZA200005412B (sk) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19951708A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Degussa | Für den Export verzweigtkettiger Aminosäuren kodierende Nikleotidsequenzen, Verfahren zu deren Isolierung und ihre Verwendung |
| DE60230040D1 (de) * | 2001-07-06 | 2009-01-08 | Evonik Degussa Gmbh | Fermentationsverfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriaceae |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655149B2 (ja) * | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―リジンの製造法 |
| SK284235B6 (en) * | 1997-10-04 | 2004-11-03 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method |
-
1999
- 1999-10-05 DE DE19947792A patent/DE19947792A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-09-26 CN CN00124644A patent/CN1290746A/zh active Pending
- 2000-09-29 SK SK1459-2000A patent/SK14592000A3/sk unknown
- 2000-09-29 EP EP00121159A patent/EP1090993A1/de not_active Withdrawn
- 2000-10-03 AU AU62451/00A patent/AU6245100A/en not_active Abandoned
- 2000-10-03 ID IDP20000853A patent/ID28131A/id unknown
- 2000-10-03 JP JP2000303892A patent/JP2001128692A/ja active Pending
- 2000-10-04 BR BR0004642-6A patent/BR0004642A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-10-04 CA CA002319722A patent/CA2319722A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-04 HU HU0003894A patent/HUP0003894A2/hu unknown
- 2000-10-04 KR KR1020000058120A patent/KR20010050827A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-10-04 ZA ZA200005412A patent/ZA200005412B/xx unknown
- 2000-10-05 PL PL00342985A patent/PL342985A1/xx unknown
- 2000-10-05 MX MXPA00009770A patent/MXPA00009770A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0004642A (pt) | 2001-06-12 |
| JP2001128692A (ja) | 2001-05-15 |
| AU6245100A (en) | 2001-04-12 |
| KR20010050827A (ko) | 2001-06-25 |
| ID28131A (id) | 2001-05-03 |
| HU0003894D0 (en) | 2000-12-28 |
| CN1290746A (zh) | 2001-04-11 |
| DE19947792A1 (de) | 2001-04-12 |
| CA2319722A1 (en) | 2001-04-05 |
| PL342985A1 (en) | 2001-04-09 |
| HUP0003894A2 (en) | 2002-10-28 |
| ZA200005412B (en) | 2001-04-23 |
| EP1090993A1 (de) | 2001-04-11 |
| MXPA00009770A (es) | 2002-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK15732000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxb a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín | |
| SK15292000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pck a spôsoby fermentačnej výroby l-aminokyselín | |
| US7074607B2 (en) | Polynucleotide sequences which encode the zwa1 gene | |
| US6921651B2 (en) | Process for the preparation of amino acids by using coryneform bacteria with attenuated 1-phosphofructokinase activity | |
| SK18352000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 | |
| SK14582000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén eno | |
| WO2002086137A2 (en) | Process for the production of l-amino acids by fermentation using coryneform bacteria | |
| US20050130264A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the rpoB gene | |
| US20020086372A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the citB gene | |
| US20030044943A1 (en) | Process for the production of L-amino acids by fermentation using coryneform bacteria | |
| US20020081673A1 (en) | Novel nucleotide sequences coding for the glbO gene | |
| SK16192001A3 (sk) | Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu tkt | |
| US7205144B2 (en) | Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from Corynebacterium glutamicum | |
| EP1317546A2 (en) | Nucleotide sequences which code for the gora gene | |
| WO2002024915A1 (en) | Dcta (c4-dicarboxylate transporter) from corynebacterium glutamicum | |
| US7205131B2 (en) | Process for the preparation of L-amino acids via overexpression of the PTSH gene | |
| US20020106751A1 (en) | Nucleotide sequences coding for the pstC2 gene | |
| US7037689B2 (en) | Methods for producing amino acids in coryneform bacteria using an enhanced sigC gene | |
| US7029904B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the dep34 gene | |
| US6995000B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the sigM gene | |
| US7202061B2 (en) | Process for the preparation of L-amino acids by attenuating the mikE17 gene | |
| US20020031810A1 (en) | Nucleotide sequences coding for the lipA gene | |
| US7038034B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the Dep33 efflux protein | |
| SK14592000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín | |
| US6806068B1 (en) | Nucleotide sequences which encode the pfk gene |