SK15732000A3 - Nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxb a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín - Google Patents
Nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxb a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín Download PDFInfo
- Publication number
- SK15732000A3 SK15732000A3 SK1573-2000A SK15732000A SK15732000A3 SK 15732000 A3 SK15732000 A3 SK 15732000A3 SK 15732000 A SK15732000 A SK 15732000A SK 15732000 A3 SK15732000 A3 SK 15732000A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- sequence
- polynucleotide
- gene
- amino acid
- bacteria
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 claims 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims 1
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 claims 1
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 claims 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 5
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- -1 Aromatic Amino Acids Chemical class 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 3
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- UWOCFOFVIBZJGH-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrodipicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1CC=CC(C(O)=O)=N1 UWOCFOFVIBZJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000133018 Corynebacterium melassecola Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710155796 Malate:quinone oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000008848 allosteric regulation Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxB a fermentativnej výroby L-aminokyselin spôsoby
Oblasť techniky
Vynález popisuje nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxB z korynefórmnych baktérií. Ďalej vynález popisuje spôsob fermentativnej výroby L-aminokyselín, zvlášť pak L-lyzínu tým, že sa zoslabí gén poxB.
Doterajší stav techniky
L-aminokyseliny, zvlášť pak L-lyzín, sú významnými surovinami, ktoré nachádzajú uplanenie vo výžive ludí i zvierat, tiež aj v humánnej medicíne a farmaceutickom priemysle.
Je známe, že tieto aminokyseliny môžu byť vyrobené fermentáciou vhodných kmeňou korynefórmnych baktérií, zvlášť baktérií druhu Corynebacterium glutamicum. Na zlepšenie spôsobu výroby sa sústavne pracuje vďaka významu, ktorý tieto aminokyseliny majú.
Zlepšenie spôsobu výroby týchto aminokyselín môže byť dosiahnuté prostredníctvom zmeny techniky fermentá ako napríklad zmenou miešania a prevzdušňovania kyslíkom, alebo zmenou zloženia živného média ako napríklad zmenou koncentrácie cukru v priebehu fermentácie, alebo zmenou v spôsobu spracovania na výslednú formu napríklad dodatočným čistením pomocou chromatografie na iónovom vymieňači, alebo zmenou produkčných vlastností samostatného fermentujúceho mikroorganizmu.
K zlepšeniu výkonnosti produkčných mikroorganizmov boli použité spôsoby mutagenézie, selekcie a vyhledávania mutantných klonov. Týmto spôsobom boli získané kmene, ktoré sú odolné k antimetabolitom alebo sú auxotrofné vzhľadom ·· · ·· ···· ·· ···· ·· · ··· ·· ··· ·· ·· ·· · k regulačné dôležitým metabolitom a produkujú požadované Laminokyseliny.
Už niekoľko rokov sa používajú k zlepšeniu kmeňov Corynebacterium sp. produkujúcich L-aminokyseliny tiež spôsobmi rekombinantnej DNA.
Vynález popisuje nové spôsoby fermentatívnej výroby aminokyselín, zvlášť potom L-Lysinu.
Podstata vynálezu
Aminokyseliny, hlavne L-lyzín, predstavujú komerečne významný produkt s výužitím v ľudskej a zvieracej výžive tiež aj vo farmaceutickom priemysle a v medicíne. Z toho vyplýva všeobecný zájom o vylepšený spôsob výroby pantoténovej kyseliny.
I. Predmetom vynálezu je polynukleotid izolovaný z koryneformných baktérií, ktorý obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny tvorenej:
a) polynukleotidy, ktoré sú aspoň zo 70% identické s polynukleotidom kódujúcim peptid ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencií id.č.:2,
b) polynukleotidy, kódujúcimi peptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň zo 70% identická so sekvenciou aminokyselín podľa Sekvencie id.č.:2
c) polynukleotidy komplementárnymi k polynukleotidu podlá
a)alebo b)
d) polynukleotidy, obsahujúcimi aspoň 15 za sebou idúcich báz z polynukleotidovej sekvencie podľa bodov a), b) alebo c) ·· · ·· ···· ·· ···· ·· · ··· ·· ··· ·· ·· ·· ···
II. Predmetom vynálezu je ďalej polynukleotid podlá bodu 1.,pričom vo výhodnom prevedení ide o replikovatelnú DNA obsahujúcu:
(i) nukleotidovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č.:l, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencií podľa bodu (i) vzhľadom k degenerácii genetického kódu alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybrizuje so sekvenciou podľa bidu (i), (ii) alebo s komplementárnymi sekvenciami, a poprípade (iv) funkčné neutrálne mutácie v sekvencií podľa bodu (i)
Vynález ďalej popisuje polynukleotid podľa bodu II., obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu Sekvencií id.č.:l, polynukleotid podľa bodu II. kódujúci polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia obsahuje Sekvenciu id.č.:2, vektor, obsahujúci polynukleotid podlá bodu I(d), výhodne vektor pCR2.lpoxBint, uložený v buňkách E.coli DSM 13114 koryneformné baktérie slúžiace ako hostitelské bunky obsahujúce inzerciu alebo deleciu v génu pox
Predmetom vynálezu sú tiež polynukleotidy, ktoré sa podstatným spôsobom pozostávajú zo sekvencie, ktorú ide získať pomocou hybridizačného skríningu odpovedajúcej knižnici ·· ···· ·· • · · · · · ·· • · · • β ·· · · · • · · · · · · ·· ·· ·· ··· obsahujúcej úplný gén so sekvenciou podlá Sekvencie id.č.:l,za použitia hybridizačnej sondy, ktorá má sekvenciu podlá Sekvencie id.č.:l alebo aspoň jej fragment, ako aj izolácia uvedenej sekvencie DNA z knižnice.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, v prípade cDNA pre izoláciu sekvencie o úplnej dĺžke (full-length) kódujúcej pyruvát oxidázu a pre izoláciu takýchto c DNA alebo génov, ktoré vykazujú vysokú sekvenčnú homologiu s génom pre pyruvát oxidasu.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú ďalej vhodné ako prímery prípravy DNA z génov kódujúcich pyruvát oxidázu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).
Oligonukletidy slúžiace ako sondy alebo prímery obsahujúce aspoň 30, vo výhodnom prevedení aspoň 20, v osobitne zvláštnom výhodnom prevedení aspoň 15 po sebe idúcich báz. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy o dĺžke aspoň 40 alebo 50 báz.
V ďalšom texte sa pod následujúcimi termínami rozumie:
Izolovaný znamená oddelený od svojho prirodzeného pozadia, resp. okolia.
Polynukleotid sa vzťahuje obecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikovanú RNA alebo DNA alebo modifikovanú RNA alebo DNA.
·· · ·· ···· ·· ···· ·· · ··· • · · ······· ·· ··· ·· ·· ·· ···
Pod pojmom plypeptid sa rozumie peptid alebo proteín, ktorý obsahuje dve alebo viacej aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.
Polypeptídy podía vynálezu zahŕňajú polypeptid podľa Sekvencie id.č.: 2, a ďalej potom polypeptídy s biologickou aktivitou pyruvát oxidázy a tiež také, ktoré sú aspoň z 70% identické s polypeptidom podía Sekvencie id.č.: 2, vo výhodnom prevedení aspoň z 80% identické a vo vzlášť výhodnom prevedení aspoň 90% až 95% identickej s polypeptidom podía Sekvencie id.č.:. 2a ktoré vykazujú uvedenú aktivitu.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob výroby aminokyselín, zvlášť L-lyzínu, za použitia koryneformných baktérií, zvlášť potom takých, ktoré požadované aminokyseliny už produkujú, a v ktorých zoslabený gén poxB, zvlášť potom tým, že je znížená jeho expresia.
Výrazom zoslabenie sa v tomto prípade rozumie zníženie alebo úplné zastavenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekolkých enzýmov (proteínov) v mikroorganisme, ktoré sú kódované príslušným DNA, napríklad tým, že sa použije slabý promotor, alebo sa použije gén poprípade alela, ktorá kóduje príslušný enzým s nižšou aktivitou alebo sa príslušný enzým (proteín) inaktivuje a poprípade kombinácia týchto účinkov.
Mikroorganismy podía vynálezu môžu vytvárať aminokyseliny, zvlášť potom lyzín, z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcu koryneformných baktérií zvlášť z rodu Corynebacterium.Z rodu Corynebacterium je treba menovať hlavne druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je · · ·· ···· ·· • · ·· ·· · ··· • · · ······· ·· ··· ·· ·· ·· ··· odborníkom známy pre svoju schopnosť produkovať Laminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi baktérií rodu Corynebacterium, zvlášť druh Corynebacterium glutamicum, sú napríklad tieto prirodzene sa vyskytujúce kmene:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a od nich odvodené mutantné kmene produkujúce aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-lyzín:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a
Corynebacterium glutamicum DSM 5714
Autorom vynálezu sa podarilo izolovať nový gén z baktérie C. glutamicum, ktorý kódoje pyruvát oxidázu (EC 1.2.2.2) - gén poxB.
Pre izoláciu tohto génu poxB respektíve pre izoláciu ľubovoľného iného génu z baktérií C. glutamicum je treba ·· • · • · ···· • · · · · • ·· • · · · ··· ·· ·· najprv vytvoriť génovú knižnicu tohto mikroorganizmu v baktériách E. coli. Vytvorenie takej knižnice je popisané v obecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu Winnacker: Gény a klony: Úvod do genetických technológií (nakladateľstvo Chémie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku Sambrook a ďalší Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Príkladom jednej veľmi známej knižnice je E.coli K-12 kmene W3110 v λvektoroch vytvorená a popísaná Koharou a ďalšími (viz Celí 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe a ďalší popisujú ( viz
Molecular and General Genetics, 252:strana 255 až 265, 1996)DNA knižnicu baktériu C. glutamicum ATCC13032, vytvorenú pomocou kozmidu SuperCos I (Wahl a ďalší 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 84: strana 2160 až 2164) v baktériách E. coli K-12 kmene NM554 (viz Raleigh a ďalší 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575). Bôrmann a ďalší. (Molecular Microbiology 6(3), strana 317 až 326) ďalej popisujú knižnicu baktérií C. glutamicum ATCC13032 vytvorenú za použitia kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, strana 291 až 298 (1980)). O'Donohue vo svojej dizertačnej práci (Klonovanie a molekulárna analýza štyroch génov podielajúcich sa na biosyntéze bežných aromatických aminokyselín v Corynebacterium glutamicum - The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic amino Acid Biosynthetic Genes in Corynebacterium glutamicum, írska národná univerzita, Galway, 1997) popisuje klonovanie génov baktérie C. glutamicum za použitia expresného systému λ-Zap popísaného Shortom a ďalšími (Nucleic Acids Research, 16: strana 7583).
K príprave DNA knižnice baktérie C. glutamicum v E. coli môžu byť použité tiež plazmidy ako napríklad pBR322 (Bolivar,
Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979) alebo pUC9 (Norrander a ďalší 1983, Gene 26: strana 101 až 106).
·· • · • · • · ·· ·· ···· • · · • e e ·· • · · • · • · · ·· ···
Ako hostiteľské sú vhodné zvlášť také kmene E.coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne deficientné.
Dlhé DNA fragmenty naklonované do kozmidov alebo iných λvektorov, môžu byť potom opätovne preklonované do bežných vektorov vhodných pre sekvenovanie DNA.
Spôsoby sekvenovania DNA boli medzi iným popísané Sangerom a ďalšími (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74: strana 5463 až 5467, 1977). Získané sekvencie DNA sa môžu potom spracovať známymi algoritmy respektíve programy pre analýzu sekvencií - ako je napríklad Stadenov balík programov (Nucleic Acids Research 14, strana 217 až 232 (1986)), balík GCG (Butler, Methods of
Biochemical Analysis 39, strana 74 až 97 (1998)), algoritmus
FASTA (Pearson a Lipman, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, strana 2444 až algoritmus BLAST ( Altschul a ďalší, strana 119 až 129 (1994)). Ďalej môžu byť získané sekvencie porovnané s verejne prístupnými databázami. Verejne prístupnou nukleotidových sekvencií je napríklad databáza laboratóriá pre molekulárnu biológiu (EMBL,
Heidelberg, Nemecko) alebo databáza Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI, Bethesda, MD, USA) .
Týmto spôsobom bola získaná nová sekvencia génu poxB Táto sekvencia je ako Sekvencia Ďalej bola od tejto sekvencie DNA vyššie popísaným spôsobom odvodená sekvencia aminokyselín odpovedajúceho proteínu. Táto sekvencia je uvedená ako :2.
sekvencie DNA, ktoré v dôsledku degenerácie genetického kódu odpovedajú Sekvencii id.č.:l sú taktiež súčasťou vynálezu. Taktiež sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré so Sekvenciou id.č.:l hybridizujú. Konečne sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré vzniknú polymerázovou reťazcovou
2448 (1988)) alebo (Náture Genetics 6, databázou
Evrópske z baktérií C. glutamicum. id.č.:l súčasťou vynálezu.
Sekvencia id.č. Kódujúce ·· · ·· ···· ·· • · · · ·· · ··· • · · ······· ·· ··· ·· ·· ·· ··· reakciou (PCR) za použitia primérov odvodených zo Sekvencie id.č.:1.
Návody na identifikáciu DNA pomocou hybridizácie môžu odborníci nájsť napríklad v príručke The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (Príručka užívateľa systému DIG pre hybridizáciu) od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a ďalej v článku Liebl a ďalší. (International Journal of Systematic Bacteroligy (1991) 41:strana 255 až 260). Návody na amplifikáciu DNA pomocou polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR) nájde odborník napríklad v príručke Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (Syntéza oligonukleotidov: praktický prístup, IRL Press, Oxford, Spojené kráľovstvo 1984) a v knihe Newton a Graham: PCR (Akademické nakladateľstvo Spektrum, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Pôvodcovia vynálezu odhalili,že korynefórmne baktérie po zoslabení génz poxB produkujú väčšie množstvo L-aminokyselín, osobitne L-lyzínu.
Zoslabenie génu poxB môže byť docielené alebo znížením expresie tohto génu alebo tým, že sa zhorší poprípade zcela inhibujú katalytické vlastnosti tohto enzýmu. Poprípade možno oba prístupy kombinovať.
Zníženie génovej expresie možno dosiahnúť pomocou vhodného spôsobu kultivácie alebo pomocou genetickej zmeny (mutácie) v signálnych oblastiach tohto génu. Signálnymi oblasťami génovej expresie sú mienené napríklad represory, aktivátory, operátory, promotory, atenuátory, väzebné miesta pre ribozómy, štart kodón a terminátory. Odborník nájde bližšie údaje napríklad v patentovej prihláške WO 96/15246, v publikáciách Boyd a Murphy (Journal of Bacteriology 170: strana 5949 (1988)), Voskuil a Chambliss (Nucleic Acids Research 26: strana 3548 (1998), Jensen a Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)), Patek a ďalší (Mikrobiology 142: strana 1297 (1996) a v známych učebniciach ·· · ·· ···· ·· ···· ·· · ··· ··· ι · · e · ··· ······· ·· ··· ·· ·· ·· ··· genetiky a molekulárnej biológie ako napríklad v učebnici Knippers: Molekulárna genetika, 6 vydanie, nakladateľstvo Georg Tieme, Stuttgart, Nemecko, 1995) alebo v učebnici Winnacker: Gene und Klone: Eine Einftihrung in die Gentechnologie (Gény a Klony : Ovod do génového inžinierstva, nakladateľstvo Chémia, Weinheim, Nemecko, 1990).
Mutácie, ktoré vedú ku zmene respektíve ku zníženiu katalytických schopností enzýmu, sú známe zo stavu techniky; ako príklady ide uviesť práce Qiu a Goodmana ( Journal of Biological Chemistry 272: strana 8611 až 8617 (1997)), Sugimota a ďalších (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: strana 1760 až 1762 (1997) a Môckela Threonindehydratasa z baktérie Corynebacterium glutamicum: zrušenie allosterickej regulácie a štruktúra tohto enzýmu( Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms)uvedené vo správe Výskumného centra v Julichu (Jul-2906, ISSNO9442952, Julich, Nemecko, 1994). Vyčerpávajúce informácie k tejto téme ide tiež nájsť vo známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie ako napríklad v učebnici Hagemann Obecná genetika (Allgemeine Genetik,nakladateľstvo Gustáv Fisher, Stuttgart,1986).
Medzi mutácie, ktoré pripadajú v úvahu patrí transícia, trasverzia, inzercia a delécia. V závislosti na účinku zámeny aminokyselín na enzymatická aktivitu ide uvažovať o mutáciách s pozmeneným zmyslom (missensia), alebo o mutáciách bez zmyslu (nonsensia). Izercia alebo delécia aspoň jedného z páru baží v génu vedie k mutácii so zmenou čítacieho rámca (fráme shoft), čo znamená, že sa do proteínu zastavujú chybné aminokyseliny, alebo je translácia predčasne ukončená. Delécia niekoľkých kodónov vedie väčšinou k úplnému zmiznutiu enzymatickej aktivity. Návody na vloženie vhodnej mutácie sú ·· · ·· ···· ·· • · · · ·· · ··· • · · ······· ·· ··· ·· ·· ·· ··· známe zo stavu techniky a ide sa o nich dočítať vo známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie ako napríklad v učebnici Knippers: Molekulárna genetika, 6. vydanie, nakladateľstvo Georg Thieme, Stuttgart, Nemecko, 1955) alebo v učebnici Winnacker: Gene und Klone: Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Gény a Klony :Úvod do génového inžinierstva, nakladateľstvo Chemie, Weinheim, Nemecko 1990),alebo v učebnici Hagemann Obecná genetika(Allgemeine Genetik, nakladateľstvo Gustáv Fisher, Stuttgart, 1986).
Príkladom plazmidu, pomocou ktorého ide previesť inzerčnú mutagenéziu je plazmid pCR2.lpoxBint (viď obrázok 1).
Plazmid pCR2.lpoxBint pozostáva z plazmidu pCR2.1-TOPO viď Mead a ďalší Bio/Technology 9: strana 657 až 663 (1991) a z vloženého fragmentu génu poxB so sekvenciou podľa Sekvencie Id.č.3. Tento plazmid bol použitý k transformácii a homológnej rekombinácii do chromozomálneho génu poxB (k inzercii) za účelom úplnej straty enzymatickej funkcie. Týmto spôsobom boli napríklad vytvorené baktérie kmene DSM5715::PCR2.lpoxBint, ktoré nemajú funkčný pyruvát oxidázu. Ďalšie návody a bližšie vysvetlenie inzerčnej mutagenézie možno nájsť napríklad v článku Schwarzera a Púhlera (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991) alebo v článku Fitzpatricka a ďalších (Applied Microbiology and Biotechnology 42, strana 575 až 580 5 (1994).
Ďalej môže byť výhodné pre produkciu L-aminokyselín, zvlášť potom L-lyzínu, okrem zoslabení génu poxB ješte zosíliť jeden alebo niekoľko enzýmov príslušných biosyntetických dráh, glykolýzy, dopĺňacích (anaplerotických) biochemických pochodov,cyklu kyseliny citrónovej alebo exportu aminokyselín a to zvlášť zvýšením ich expresie.
Tak možno napríklad zvýšiť produkciu L-lyzínuD ·· • ·· ···· ·· · · · ·· • · · · ·· ·· •súčasným zosílením expresie génu dapA kódujúceho dihydrodipikolinát syntézu (EP-B 0 197 335), alebo •súčasným zosílením expresie génu dapD kódujúceho tetradihydrodipikolinát sukcinylázu (Wehrmann a ďalší, Journal of Bacteriology 180, strana 3159 až 3165 (1998)), alebo •súčasným zosílením expresie génu dapE kódujúceho sukcinyldiaminopimelát desukcinylázu (Wehrmann a ďalší, Journal of Bacteriology 177: strana 5991 až 5993 (1995)), alebo •súčasným zosílením expresie génu gap kódujúceho glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086), alebo •súčasným zosílením expresie génu pyc kódujúceho pyruvát karboxylázu (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086), alebo •súčasným zosílením expresie génu mqo kódujúceho malát: chinón oxidoreduktázu (Molenaar a ďalší European Journal of Biochemistry 254, strana 395 až 403 (1998)), aleboD •súčasným zosílením expresie génu lysE kódujúceho protein pre export lyzínu (DE-A-195 48 222) .
Okrem zoslabenia génu poxB môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné ješte inhibovať nežiadúce vediajší reakcie (viď Nakayama : Breeding of amino Acid Producing Mikro-organismus v knihe Overproduction of ·· ···· . : · t i ·· ·· ·· · • · ·· · • · · · • · · · · v · · · »· ···
Microbial Products, editorov Krumphanzla, Sukyty, Vaneka, Academic Press, Londýn, Spojené kráľovstvo, 1982).
Mikroorganizmy obsahujúce polynukleotid podľa nároku 1 sú taktiež predmetom vynálezu a môžu byť za účelom produkcie Laminokyselín, osobitne potom L-lyzínu, kultivované kontinuálnym spôsobom, alebo spôsoby diskontinuálnymi, ať už vsádzkovou (batch) kultiváciou alebo vsádzkovou kultiváciou s prítokom živín (fed batch) alebo vsádzkovou kultiváciou s opakovaným prídavkom živín (repeated fed batch). Prehľad známych spôsobov kultivácie je uvedený v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechnik, nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periferné zariadenia, nakladateľstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného kmeňa mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené v príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre obecnú bakteriológiu) vydaný Americkou bakteriologickou společnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981. Ako zdroje uhlíka môžu byť použité cukry a uhľohydráty ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová,alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byť použité alebo jednotlivo alebo vo zmesi. Ako zdroje dusíka môžu byť použité zlúčeniny obsahujúce organický dusík ako napríklad peptón, kvasnicový extrakt, ·· ····
·· ·· ·· ·· mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múčka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako napríklad síran amónny, chlórid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka môžu byť použité alebo jednotlivo alebo vo zmesi. Ako zdroja fosforu možno použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný či odpovedajúce sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nezbytné pre rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A konečne môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohacené o esenciálne rastové látky ako napríklad aminokyseliny a vitamíny. Pre zvýšenie tvorby aminokyselín možno kultivačné médium ješte obohatiť o ich prekurzory. Uvedené zložky môžu byť pridané do média jednorázovo na počiatku, alebo vhodným spôsobom v priebehu kultivácie.
Pre kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak alebo kyslé zlúčeniny ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potláčajúcich tvorbu peny ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržať prostredníctvom vhodného selekčného činidla, napríklad antibiotika. Vhodné aerobné podmienky možno udržovať privádzaním kyslíka alebo kyslík- obsahujúci zmesi plynov, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota pre pestovanie baktérií sa normálne pohybuje od 20°C do 45°C a výhodne od 25°C do 40°C.Doba kultivácie by mala byť taká, aby bolo dosiahnuté maxima tvorby aminokyselín. Tohto maxima je obvykle dosiahnuté behom 10 až 160 hodín.
Spôsoby stanovenia produkovaných aminokyselín sú známe zo stavu techniky. Analýza sa môže prevádzať pomocou iontomeničovej chromatografie na anexe s následnou «· ···· ·· • · « • · i c · · i t » <
·· ·· derivatizáciou pomocou ninhydrínu, tak ako je opísané v práci Spackmana a ďalších (Analytical Chemistry, 30, (1958),strana
1190), alebo sa môže prevádzať pomocou HPLC s reverznou fázou, viď Lindroth a ďalší. (Analytical Chemistry (1979) 51: strana 1167 až 1174) .
Následujúce mikroorganizmy boli uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunečných kultúr (DSMZ Braunschweig, SRN) podľa ustanovenia Budapeštskej zmluvy:
•Escherichia coli kmene DH5a/PCR2.lpoxBint pod číslom DSM 13114.
Príklady prevedenia vynálezu:
Vynález bude bližšie opísaný v nasledujúcich príkladoch.
Príklad 1: Príprava kozmidovej genómovej knižnice baktérie
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozomálna DNA baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 bola najprv izolovaná a čiastočne naštiepená (viď Tauch strana 168 až 179) reštrikčným Pharmacia, Freiburg, Nemecko, DNA fragmenty boli z morských garnátov a ďalší (1995), Plasmid 33 enzýmom Sau3AI (Amersham katalógové č.:
defosforylované
27-0913-02) alkalickou
Izolované fosfatázou (shrimp alkaline phosphatase, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCos I ( viď Wahl a ďalší, (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: strana 2160 až 2164) získaného od firmy Stratagene (La Jolla, USA, SupercosI Cosmid Vector Kit, katalógové č. 251301) bola naštiepená reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia,Freiburg, Nemecko, katalógové ·· · ·· ···· ·· • · ·· · · · · · ··· «»· · · • « *··· · · * · • 4 < · · · · «4
Jg ·» ··· — ·· ·· ·
č. 27-0948-02) a taktiež defosforylovaná alkalickou fosfatázou. Potom bola kozmidová DNA naštiepená reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-086804). Takto získané fragmenty kozmidovej DNA boli zmiešané s fragmentárni genómovej DNA Corynobacterium glutamicum ATCC13032 a potom spojené pomocou T4-DNA ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-087004) .
Ligačná zmes bola potom zabalená do fágových častíc pomocou pakažovacieho extraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL Packing Extract, katalógové č. 200217) . Tieto fágové častice boli použité pre infekciu E. coli kmeňa NM554 (viď Raleigh a ďalší. 1998, Nucleic Acid Res.
16: strana 1563 až 1575) . Bunky boli resuspendované v 10 mM MgSO4 a zmiešané s alikvotom fágovej suspenzie. Infekcia a titrácia kozmidovej knižnice bola prevedená ako v knihe Sambrook a ďalší.(1989),Molecular Cloning: A laboratory
Manual, Cold Spring Habor),pričom bunky boli vysiate na LBagar (viď Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 100 pg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri teplote 37°C boli vybrané jednotlivé rekombinantné klony.
Príklad 2: Izolácia sekventovanie Génu poxB
Najprv bola vyizolovaná kosmidová DNA jednej dobre oddelenej kolónie pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kitu )kat.č.27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobcu a tá bola potom čiastočne naštiepená reštrikčným ezýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 270913-02). Získané fragmenty DNA boli defosforylované alkalickou fosfatázou (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). Po elektroforetickej separácii fl· ····
• · ·· · • · (I • · • fl následovala izolácia fragmentov kozmidu o veľkosti medzi 1500 a 200 bp pomocou kitu QiaExII Gel Extraction Kit (katalógové č. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).
Potom bol reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č.: 27-0868-04) naštiepený sekvenčný vektor pZero-1 od firmy Invitrogen (Groningen, Nizozemsko, katalógové č. K2500-01).Ligácia fragmentov kozmidu do sekvenčného vektoru pZero-1 bola prevedená podľa príručky Sambrook a ďalšie (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor),pričom bola zmes DNA s T4-ligasou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) inkubovaná cez noc. Ligančnou zmesou boli potom elektroporáciou (Tauch a ďalší 1994,FEMS Microbiol Letters, 123: strana 343 až 347) transformované baktérie E. coli kmeňa DH5aMCR ( Grant , 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: strana 4645 až 4649).Transformované baktérie boli vysiaté a LB-agar (Lennox, 1995, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 50 gg/ml zeocínu. Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov bola prevádzaná pomocou zariadenia Biorobot 9600 (katalógové číslo 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Dideoxy-terminačné sekvenovanie plazmidov (Sanger a ďalší. 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: strana 5463 až 5467) s modifikáciami podľa Zimmermanna a ďalších (1990, Nucleic Acids Research, 18: strana 1067) bolo prevedené s využitím sekvenčného kitu RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od firmy PE Applied Biosystems (katalógové č. 403044, Weiterstadt, Nemecko). Elektroforetická separácia a analýza sekvenčnej reakcie bola prevedená na gélu Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) ( kataógové č. A124.1, Roth, Karlsruhe, Nemecko) v prístroji ABI Prism 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
·· ····
·· • ·
·. 1 ·· ·· ·
Získané hrubé sekvenčné dáta boli spracované pomocou programového balíku Staden ( 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231) verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov plazmidu pZerol boli zostavéné v súvislý kontig. Počítačová analýza kódujúcich oblastí bola prevedená programom XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231). Ďalšie analýzy boli prevedené programom BLAST (Altschul a ďalší 1997, Nucleic Acids Research, 25: strana 3389 až 3402), proti nie-redundantnej databázi NCBI uložené v Národnej lekárskej knižnici USA (National Libarz of Medicíne).
Takto bola získaná nukleotidová sekvencia, ktorá je uvedená vo vynálezu ako Sekvencia id.č:l. Analýza tejto nukleotidovej sekvencie odhalila jeden otvorený čítací rámec o veľkosti 1737 párov báz, ktorý bol označený ako gén poxB. Tento gén kóduje polypeptid o velkosti 579 aminokyselín.
Príklad 3: príprava integračného plazmidu pre inzerčnú mutagenéziu génu poxB
Spôsobom podía Eikmannse a ďalších (Microbiology 140: strana 1817 až 1828 (1994)) bola z kmeňa ATCC 13032 izolovaná chromozomálna DNA. Na základe sekvencie génu poxB baktérie C. glutamicum známe z príkladu 2 boli vybrané následujúce oligonukleotídy pre polymerázovú reťazovú reakciu (PCR):
poxBintl: 5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3' poxBint2: 5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'
Uvedené prímery syntetizované firmou MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko). Bola prevedená Štandartná PCR podía Innise a ďalších. (PCR protocols: A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) s Pwo polymerázou od ·· ···· ·· ·· · ·· • · : i • · ·· • c
I ··» • · · • · · • · 4 · • · · · ·· ·· firmy Boehringer. S pomocou polymerázovej reťazovej reakcie bol izolovaný asi 0,9 kb dlhý fragment DNA, obsahujúci vnútornú časť génu poxB, viď Sekvencia id.č.3.
Amplifikovaný DNA fragment bol vložený ligáciou pomocou kitu TOPO TA Cloning Kit firmy Invitrogen (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K4500-01) do vektoru pCR2.1-TOPO (Mead a ďalší (1991) Bio/Technology 9: strana 657 až 663).
Potom boli ligačnou zmesou elektroporované bunky E. coli kmeňa DH5a (viď Hanahan, V knihe DNA cloning: A practical approach (Praktický prístup ku klonovaniu), zväzok I. IRLPress, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia plazmidu nosiacich buniek bola prevedená vysiatím transformačnej reakcie na LB agar (Sambrook a ďalší Molecular cloning: a laboratory manual 2. vydanie Cold Spring Harbor, New York, 1989), s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová DNA bola izolovaná z transformovaných baktérií pomocou súpravy QIAPREP Spin-Miniprep Kit od firmy Qiagen. Izolovaná plazmidová DNA bola štiepená reštrikčným enzýmom EcoRI a potom elektroforeticky rozdelená na agarózovom gélu (0,8%). Získaný plazmid bol označený pCR2.lpoxBint.
Príklad 4: Integračné mutagenézie génu poxB v lyzín produkujúcich baktériách DSM5715
Vektor pCR2.lpoxBint uvedený v príklade 2 bol elektroporovaný (viď Tauch a ďalší, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347 (1994)) do baktérií Corynebacterim glutamicum DSM 5715. Kmeň DSM5715je lyzín produkujúcim a AEC rezistentným kmeňom C. glutamicum. Vektor pCR2.lpoxBint sa nedokáže v baktériách DSM 5715 samostatne replikovať a zostane teda v tých bunkách, v ktorých došlo k jeho integrácii do chromozómu DSM5715. Selekcia klonov s vektorom pCR2.lpoxBint integrovaným do chromozómu bola prevedená na LB agaru
| • | • B B | B • · | BB 9 | B | BBBB B | BB • | B B |
| • | • | B | B | B | B | B | t |
| • | • | • | B | • | B B | • | B |
| • B | BBB | BB | B B | B B | B |
(Sambrook a ďalší: Molecular cloning: a laboratory manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), s prídavkom 15 mg/1 kanamycínu. Integrácia vektoru bola dokázaná hybridizáciou s fragmentom poxBint podlá príručky The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (Príručka užívateľa systému DIG pre hybridizáciu) od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko 1993) a za pomoci súpravy pre značenie DIG od firmy Boehringer Mannheim.
Chromozomálna DNA jedného potenciálne pozitívneho klonu bola izolovaná spôsobom podľa Eikmannse a ďalších , Microbiology 140 (1994) strana 1817 až 1828 a naštiepená reštrikčnými enzýmami Sali, Sací a HindlII. Vzniknuté fragmenty boli elektroforeticky rozdelené na agarózovom gélu a potom pri teplote 68 °C hybridizované podľa DIG hybridizačného kitu (Boehringer). Plazmid pCR2.lpoxBint podľa príkladu 3 sa integroval do homologného miesta s génom poxB do chromozómu baktérií DSM5715.Tieto baktérie boli označené ako DSM5715::pCR2.lpoxBint.
Príklad 5: Produkcia lyzínu
Kmeň C. glutamicum DSM5715::PCR2.lpoxBint získaný v príkladu 4 bol kultivovaný vo vhodnom živnom médiu a po tejto kultivácii bol stanovený obsah lyzínu v kultivačnom médiu.
Baktérie tohto kmeňa boli najprv vysiate na agarovú platňu s odpovedajúcim antibiotikom (agar s vývarom z mozgu a srdca (Brain-Heart agar) s prídavkom kanamycínu (25 mg/1 a inkubované 24 hodín pri 33°C. Z tejto agarózovej platne bolo naočkované inokulum (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre toto inokulum bolo použité komplexné médium CglII s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu. Inokulum bolo ·· ·· · «
B · · « ·· ·· inkubované 48 hodín pri teplote 33°C pri 240 otáčkach za minútu na trepačke.
Týmto inokulom bola naočkovaná hlavná produkčná kultúra. Počiatočné OD(660nm) hlavnej produkčnej kultúry činila 0/1. Ako živné médium bolo použité médium MM.
| Médium MM | |
| CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/1 |
| MOPS | 20 g/1 |
| Glukóza (klávovaná oddelene Soli: | 50 g/1 |
| (NH4)2 so4 | 25 g/1 |
| kh2po4 | 0,1 g/1 |
| MgSO4 .7 H2O | 1,0 g/1 |
| CaCl2 . 2 H2O | 10 mg/1 |
| FeSO4 . 7 H2O | 10 mg/1 |
| MnSO4 . H2O | 5,0 mg/1 |
| Biotín (sterilné filtrovaný) | 0,3 mg/1 |
| Thiamín . HCI (sterilné filtrovaný) | 0,2 mg/1 |
| Leucín (sterilné filtrovaný) | 0,1 g/1 |
| CaCO3 | 25 g/1 |
CSL, MOPS a roztok solí bol upravený vhodným roztokom amoniaku na pH=7 a autoklavovaný. Potom boli pridané sterilné roztoky substrátov a vitamínov/ ako aj suchý autoklávovaný CaCO3.
Kultivácia prebiehala v 10ml média vo 100 ml Erlenmeyerovej banke s retardérom. K médiu bolo pridané 25 mg/1 kanamycínu.
V priebehu kultivácie bola udržovaná teplota 33°C a 80% vzdušná vlhkosť.
·· · ·· ···· ·· ···· · · · · · • · · ··· ·· ·· · · · · · · · · ··· · · · · · · «· 999 99 99 ··
Po 48 hodinách bola zmeraná OD pri vlnovej dĺžke 660 nm na spektrofometru Biomek 1000 (Beckmann GmbH, Mníchov).
Množstvo vyprodukovaného lyzínu bolo stanovené na aminokyselinovom analyzátoru firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) pomocou chromatografie na iontovom vymieňači a s následnou ninhydrínovou detekciou.
Výsledok tohto pokusu je uvedený v tabuľke 1. Tabuľka 1
| Kmeň | OD (660) | lyzín-HCL g/1 |
| DSM5715 | 13,1 | 9,5 |
| DSM5715::PCR2.lpoxBint | 12,5 | 12,9 |
Príklad 6:Intergračná mutagenézia génu poxB vo valín produkujúcich baktériách FERM-BP 1763
Vektor pCR2.lpoxBint uvedený v príklade 2 bol elektroporovaný (viď Tauch a ďalší, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347 (1994)) do baktérií Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763. Kmeň FERM-BP 1763 je valín produkujúci kmeňom baktérií Brevibacterium lactofermentum, ktorý je naviac rezistentný ku kyseline mykofenolovej. Vektor pCR2.lpoxBint sa nedokáže v baktériách FERM-BP 1763 samostatne replikovať a tak zostane v tých bunkách, v ktorých došlo k jeho intergrácii do chromozómu FERM-BP 1763. Selekcia klonov s vektorom pCR2.lpoxBint integrovaným do chromozómu bola prevedená na LB agaru (Sambrook a ďalšie: Molecular cloning: a laboratory manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), s prídavkom 15 mg/1 kanamycínu. Integrácia vektoru bola dokázaná hybridizáciou s fragmentom poxBint podľa príručky The DIG Systém Users Guide for Filter Hybridization (Príručka užívateľa systému DIG pre «· · ·· ···· ·· ···· · · · · · · ·«· ······· ·· ··· ·· ♦· ·· ··· hybridizáciu) od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a pomocou súpravy pre označenie DIG od firmy Boehringer Mannheim.
Chromozomálna DNA jedného potenciálne pozitívneho klonu bola izolovaná spôsobom podľa Eikmannse a ďalších, Microbiology 140 (1994) strana 1817 až 1828 a naštiepená reštrikčnými enzýmy Sali, Sací a HindlII. Vzniknuté fragmenty boli elektroforeticky rozdelené na agarózovém gele a potom pri teplote 68 °C hybridizované podľa DIG hybridizačného kitu (Boehringer). Plazmid pCR2.lpoxBint podlá príkladu 3 sa intergroval do homológneho miesta s génom poxB do chromozómu baktérií FERM-BP 1763. Tieto baktérie boli označené ako FERMBP 1763::pCR2.lpoxBint.
Príklad 7: Produkcia valínu
Kmeň B. lactofermentum FERM-BP 1763::pCR2.lpoxBint získaný v príklade 6 bol kultivovaný vo vhodnom živnom médiu a po tejto kultivácii bol stanovený obsah valínu v kultivačnom médiu.
Baktérie tohoto kmeňa boli najprv vysiaté na agarovú platňu s odpovedajúcim antibiotikom (agar s vývarom z mozgu a srdca (Brain-Heart agar) s prídavkom kanamycínu (25 mg/1) a inkubované 24 hodín pri 33°C. Z tejto agarózovej platne bolo naočkované inokulum (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerove banke). Ako médium pre toto inokulum bolo použité komplexné médium CglII s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu. Inikulum bolo inkubované 48 hodín pri teplote 33°C a pri 240 otáčkach za minútu na trepačke.
·· ···· • · · • · · • · · · · >· · · · • · ·· ·· • · · • · • « • ·
Týmto inokulom bola naočkovaná hlavná produkčná kultúra. Počiatočná OD (660 nm) hlavné produkčné kultúry činidla 0,1. Ako živé médium bolo použité médium MM.
Médium MM
| CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/1 |
| MOPS | 20 g/1 |
| Glukóza (klávovaná oddelene) | 50 g/1 |
| Soli: | |
| (NH4)2 so4 | 25 g/1 |
| kh2po4 | 0,1 g/1 |
| MgSO4 .7 H2O | 1,0 g/1 |
| Cacl2 . 2 H2O | 10 mg/1 |
| FeSO4 . 7 H2O | 10 mg/1 |
| MnSO4 . H2O | 5,0 mg/1 |
| Isoleucín (sterilné filtrovaný) | 0,1 mg/1 |
| Methionín (sterilné filtrovaný) | 0,1 mg/1 |
| Thiamín . HCI (sterilné filtrovaný) | 0,2 mg/1 |
| Leucín (sterilné filtrovaný) | 0,1 g/1 |
| CaCO3 | 25 g/1 |
CSL, MOPS a roztok soli bol upravený vodným roztokom amoniaku na pH=7 a autoklávovaný. Potom boli pridané sterílne roztoky substrátov a vitamínov, ako aj suchý autoklávovaný CaCO3Kultivácia prebiehala v 10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke s retardérom. K médiu bolo pridané 25 mg/1 kanamycínu.
V priebehu kultivácie bola udržovaná teplota 33°C a 80% vzdušná vlhkosť.
Po 48 hodinách bola zmeraná OD pri vlnovej dĺžke 660 nm na spektrofotometru Biomek 1000 (Beckmann, GmbH, Mníchov). Množstvo vyprodukovaného valínu bolo stanovené na amynokyselinovom analyzátoru firmy Eppendorf-BioTronik ···« » <
w · c
··* (Hamburg, Nemecko) pomocou chromatografie na iontovom vymieňači a s následnou ninhydrínovou detekciou.
Výsledok tohoto pokusu je uvedený v tabuľke 2.
Tabulka 2
| Kmeň | OD(660) | valxn-HCL g/1 |
| FERM-BP 1763 | 8,6 | 12,1 |
| FERM_BP 1763::PCR2.lpoxBint | 9,5 | 13,0 |
Popis obrázkov
Obrázok 1: Reštrikčná mapa plazmidu pCR2.lpoxBint. Použité skratky a označenie majú následujúci význam:
Claims (16)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaný polynukleotid, ktorý obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny tvorenej:a) polynukleutidy, ktoré sú aspoň zo 70% identické s polynukleotidom kódujúcim peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencii id.č.: 2.b) polynukleotidy, kódujúcimi peptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň zo 70% identická so sekvenciou aminokyselín podía Sekvencie id.č.:2,c) polynukleotidy komplementárnymi k polynukleotidu podía a) alebo b)d) polynukleotidy, obsahujúcimi aspoň 15 za sebou idúcich báz z polynukleotidovej sekvencie podía bodov a), b) alebo c).
- 2. Polynukleotid podía nároku 1, ktorý je tvorený replikovateínou DNA, výhodne rekombinantnej povahy.
- 3. Polynukleotid podía nároku 1, ktorý je tvorený RNA.
- 4. Polynukleotid podía nároku 2, obsahujúca nukleotidovú sekvenciu podía Sekvencie id.č.: 1.·· · ·· ···· ·· ···· ·· · ··· ··· ··· · · ··· '···· ·· ·· ··· ·· ·· ·· ·
- 5. Polynukleotidová sekvencia podľa nároku 2, ktorá kóduje polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu podlá Sekvencie id.č.: 2.
- 6. Replikovatelná DNA podlá nároku 2, ktorá obsahuje B (i) nukleotidovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č.: 1, alebo ’ (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá odpovedá sekvencií podlá bodu (i) vzhladom k degenerácii genetického kódu alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciou podľa bodu (i) alebo (ii) alebo s komplementárnymi sekvenciami, a poprípade (iv) funkčne neutrálna mutácia v sekvencií podľa bodu (i) ·
- 7. Vektor, ktorý obsahuje polynukleotid podlá nároku 1, zvlášť podlá bodu d), uložený v bunkách E. coli DSM13114.
- 8. Korynefórmne baktérie slúžiaci ako hostiteľské bunky, ktoré obsahujú deleciu alebo inzerciu v génu poxB.
- 9. Sposob výroby L-aminokyselín, zvlášť L-lyzínu, v y i Značujúci sa tým, že sa prevedú následujúce kroky:* a) fermentácia baktérií, ktoré produkujú požadovanúL-aminokyselinu, a v ktorých je aspoň zoslabený gén poxBb) obohacenie kultivačného média o požadovaný produkt ac) izolácie L-aminokyseliny
- 10. Spôsob podlá nároku 9 vyznačujú sa tým, ·· ·· · ·· ···· ·· • · ·· · · · · • · · · · · · • · ···· ···· • · · '···· · · ·· ··· ·· ·· ·· · že sa použijú baktérie, v ktorých sú dodatočne zosílené ešte ďalšie gény z biosyntetickej dráhy požadované L-aminokyseliny.
- 11. Spôsob podľa nároku 9 vyznačujúci sa tým, Že sa použijú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne inhibujú metabolické dráhy, ktoré znižujú produkciu požadované L-aminokyseliny.
- 12. Spôsob podlá nároku 9 vyznačujúci sa tým, že sa inhibuje expresia polynukleotidu podľa nároku 1, zvlášť podľa bodov la až lc.
- 13. Spôsob podľa nároku 9 vyznačujúci sa tým, že sa znížia katalytické schopnosti polypeptidu (enzymatického proteínu) kódovaného polynukleotidom podľa nároku 1, zvlášť podľa bodov la až lc.
- 14. Spôsob podlá nároku 9 vyznačujúca sa t ý m, že sa použijú baktérie, v ktorých bolo zoslabenie dosiahnuté integračnou mutagenéziou pomocou plazmidu pCR2.lpoxBint podlá obrázku 1, uloženého v bunkách DSM13114, alebo pomocou jeho podstatnej časti.
- 15. Spôsob podľa nároku 9 vyznačujúci sa t ý m , že sa pro produkciu L-lyzínu použije fermentácia s baktériami, v ktorých je súčasne zosílená expresia jedného alebo viacej génov, vybraného zo skupiny tvorené:génom dapA kódujúcim dihydrodipikolinát syntázu ·· · • · ·· • · · • · · • · · ·· ··· ·· ··· • · · • e · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · ·· · • DNA fragmentom kódujúcim rezistenciu k S-(2aminoetyl)-cysteinu
• • génom pyc k'dujúcim pyruvát karboxylázu t • génom desukcinylázu dapE kódujúcim sukcinyldiaminopimelát • génom dehydrogenázu gap kódujúcim glyceraldehyd-3-fosfát • génom mqo kódujúcim malát: chinón oxireduktázu • génom lysE kódujúcim proteín pre export lysinu - 16. Spôsob podľa jedného alebo viacej z predošlých nárokov vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy druhu Corynebacterium glutamicum.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19951975A DE19951975A1 (de) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | Neue für das poxB-Gen codierende Nuleotidsequenzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK15732000A3 true SK15732000A3 (sk) | 2001-11-06 |
Family
ID=7927192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1573-2000A SK15732000A3 (sk) | 1999-10-28 | 2000-10-20 | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxb a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050196848A1 (sk) |
| EP (1) | EP1096013A3 (sk) |
| JP (1) | JP2001161386A (sk) |
| KR (1) | KR20010051289A (sk) |
| CN (1) | CN1304997A (sk) |
| AU (1) | AU6807500A (sk) |
| BR (1) | BR0005091A (sk) |
| CA (1) | CA2322553A1 (sk) |
| DE (1) | DE19951975A1 (sk) |
| HU (1) | HUP0004188A2 (sk) |
| ID (1) | ID27958A (sk) |
| MX (1) | MXPA00010419A (sk) |
| SK (1) | SK15732000A3 (sk) |
| ZA (1) | ZA200006039B (sk) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060014259A9 (en) * | 1999-07-09 | 2006-01-19 | Kevin Burke | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| US6797509B1 (en) | 1999-07-09 | 2004-09-28 | Degussa-Huls Ag | Nucleotide sequences which code for the tal gene |
| US20050112733A1 (en) * | 2000-03-20 | 2005-05-26 | Degussa Ag | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| US20030175911A1 (en) * | 2000-03-20 | 2003-09-18 | Stephen Hans | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| US6825030B2 (en) | 2000-08-31 | 2004-11-30 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from corynebacterium glutamicum |
| DE10109690A1 (de) | 2000-09-02 | 2002-03-14 | Degussa | Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| WO2002022669A1 (en) * | 2000-09-14 | 2002-03-21 | Degussa Ag | Nucleotide sequences coding for the suga gene |
| US6946271B2 (en) * | 2000-09-20 | 2005-09-20 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the menE gene |
| DE10047865A1 (de) * | 2000-09-27 | 2002-04-18 | Degussa | Neue für das deaD-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| WO2002036797A2 (en) * | 2000-11-04 | 2002-05-10 | Degussa Ag | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| US20030017554A1 (en) * | 2000-11-15 | 2003-01-23 | Mechthild Rieping | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| JP4469568B2 (ja) | 2003-07-09 | 2010-05-26 | 三菱化学株式会社 | 有機酸の製造方法 |
| WO2005021770A1 (ja) | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | コハク酸の製造方法 |
| EP1672067B1 (en) | 2003-09-17 | 2015-11-11 | Mitsubishi Chemical Corporation | Process for producing non-amino organic acid |
| JP4631706B2 (ja) * | 2003-09-30 | 2011-02-16 | 味の素株式会社 | 発酵液からのコハク酸の精製方法 |
| EP1748062B1 (en) * | 2004-05-20 | 2012-06-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
| EP1760143B1 (en) | 2004-05-20 | 2012-05-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
| JP4595506B2 (ja) | 2004-11-25 | 2010-12-08 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法 |
| US20070092951A1 (en) | 2005-03-24 | 2007-04-26 | Degussa Ag | Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria |
| DE102005048818A1 (de) | 2005-10-10 | 2007-04-12 | Degussa Ag | Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure |
| EP1947190B1 (en) | 2005-10-18 | 2017-11-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of succinic acid |
| KR100733928B1 (ko) * | 2005-11-30 | 2007-07-02 | 씨제이 주식회사 | 카나마이신 내성을 갖고 ｌ-라이신 생산능이 향상된코리네형 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는방법 |
| US7993888B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-08-09 | Mitsubishi Chemical Corporation | Bacterium having enhanced 2-oxoglutarate dehydrogenase activity |
| CN101177686B (zh) * | 2006-11-10 | 2011-05-18 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株 |
| KR101431084B1 (ko) * | 2011-11-18 | 2014-09-23 | 한국생명공학연구원 | ＰｏｘＢ 유전자를 이용한 활성 인클루젼 바디 생산방법 |
| CA3007635A1 (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum |
| JP2020524492A (ja) | 2017-06-07 | 2020-08-20 | ザイマージェン インコーポレイテッド | Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のプロモーターおよび補助遺伝子発現の制御におけるその使用 |
| EP3456833A1 (en) * | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
| RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20070087090A (ko) * | 1999-06-25 | 2007-08-27 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 탄소 대사 및 에너지 생산과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 |
-
1999
- 1999-10-28 DE DE19951975A patent/DE19951975A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-10-14 EP EP00122505A patent/EP1096013A3/de not_active Withdrawn
- 2000-10-19 ID IDP20000899A patent/ID27958A/id unknown
- 2000-10-20 SK SK1573-2000A patent/SK15732000A3/sk unknown
- 2000-10-24 MX MXPA00010419A patent/MXPA00010419A/es unknown
- 2000-10-25 AU AU68075/00A patent/AU6807500A/en not_active Abandoned
- 2000-10-25 JP JP2000325437A patent/JP2001161386A/ja active Pending
- 2000-10-25 CA CA002322553A patent/CA2322553A1/en not_active Abandoned
- 2000-10-26 ZA ZA200006039A patent/ZA200006039B/xx unknown
- 2000-10-27 HU HU0004188A patent/HUP0004188A2/hu unknown
- 2000-10-27 KR KR1020000063500A patent/KR20010051289A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-10-27 CN CN00133779A patent/CN1304997A/zh active Pending
- 2000-10-27 BR BR0005091-1A patent/BR0005091A/pt not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-22 US US11/111,831 patent/US20050196848A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001161386A (ja) | 2001-06-19 |
| MXPA00010419A (es) | 2002-07-22 |
| DE19951975A1 (de) | 2001-05-03 |
| ZA200006039B (en) | 2001-05-03 |
| BR0005091A (pt) | 2001-06-19 |
| EP1096013A3 (de) | 2005-06-01 |
| CA2322553A1 (en) | 2001-04-28 |
| US20050196848A1 (en) | 2005-09-08 |
| KR20010051289A (ko) | 2001-06-25 |
| AU6807500A (en) | 2001-05-03 |
| ID27958A (id) | 2001-05-03 |
| HUP0004188A2 (hu) | 2003-03-28 |
| EP1096013A2 (de) | 2001-05-02 |
| HU0004188D0 (sk) | 2001-01-29 |
| CN1304997A (zh) | 2001-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK15732000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén poxb a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín | |
| SK15292000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pck a spôsoby fermentačnej výroby l-aminokyselín | |
| US20040063180A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene | |
| SK18352000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 | |
| SK17352000A3 (sk) | Nukleotidov sekvencie kdujce gn succ a sucd | |
| US6921651B2 (en) | Process for the preparation of amino acids by using coryneform bacteria with attenuated 1-phosphofructokinase activity | |
| US7416863B2 (en) | Nucleotide sequences for encoding of the lysR2-gene | |
| SK18572000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gény sdha, sdhb a sdhc | |
| EP1313856B1 (en) | Citb gene from corynebacteria and use thereof in snythesis of l-amino acids | |
| US20070122832A1 (en) | Process for Preparing L-amino Acids | |
| US7129066B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the citE gene | |
| US20020102669A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the clpC gene | |
| US6924134B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the gorA gene | |
| EP1319077B1 (en) | Nucleotide sequences which code for the tmk gene | |
| EP1307478B1 (en) | Luxr gene from coryneform bacteria and a process for the production of l-amino acids | |
| US7029904B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the dep34 gene | |
| US7101690B2 (en) | Attenuated CCPA1 modified bacterial cell and its use for the preparation of L-amino acids | |
| ES2233665T3 (es) | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr3. | |
| US20020168732A1 (en) | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria | |
| US7202061B2 (en) | Process for the preparation of L-amino acids by attenuating the mikE17 gene | |
| EP1311685B1 (en) | Nucleotide sequences which code for the ccpa1 gene | |
| SK14592000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén lrp a spôsoby fermentatívnej výroby l-aminokyselín | |
| SK17952000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén gpm a spôsob fermentatívnej výroby L-aminokyselín | |
| US20030148476A1 (en) | Nucleotide sequences that code for the rplK gene and methods of use thereof | |
| SK4252001A3 (en) | Nucleotide sequences which code for the rp1k gene |