KR20010050827A

KR20010050827A - ｌｒｐ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20010050827A
Application number: KR1020000058120A
Authority: KR
Inventors: 바테브리기테; 칼리노브스키외른; 퓌흘러알프레트; 뫼켈베티나; 페페를레발터
Original assignee: 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 2000-10-04
Publication date: 2001-06-25
Also published as: MXPA00009770A; JP2001128692A; SK14592000A3; DE19947792A1; CA2319722A1; PL342985A1; AU6245100A; ZA200005412B; CN1290746A; HU0003894D0; EP1090993A1; BR0004642A; HUP0003894A2; ID28131A

Abstract

본 발명은

a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

c) 상기 a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보성인 폴리뉴클레오타이드 및

d) 상기 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 및 증폭되거나 약화된 lrp 유전자를 사용한 L-아미노산의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

Description

ｌｒｐ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열{Novel nucleotide sequences coding for the lrp gene}

〈110〉 Degussa-Huls AG

〈120〉 Novel nucleotide sequences coding for the lrp gene

〈130〉 5-1999-024333-4

〈150〉 DE 199 47 792.2

〈151〉 1999-10-05

〈160〉 2

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 715

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 -35_signal

〈222〉 (62)..(67)

〈220〉

〈221〉 -10_signal

〈222〉 (88)..(93)

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (151)..(612)

〈400〉 1

gccgataacc tttatcatct ggttccaggg ctgccttgga tggcgacacc tccaggcttg 60

aatgaatctc ttgcgttttt tgcacactac aatcatcaca caattgccgg gtagttttgt 120

tgccagtttg cgcacctcaa ctaggctatt gtg caa tat atg aag cta gat tcc 174

Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser

1 5

att gat cgc gca att att gcg gag ctt agc gcg aat gcg cgc atc tca 222

Ile Asp Arg Ala Ile Ile Ala Glu Leu Ser Ala Asn Ala Arg Ile Ser

10 15 20

aat ctc gca ctg gct gac aag gtg cat ctc act ccg gga cct tgc ttg 270

Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val His Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu

25 30 35 40

agg agg gtg cag cgt ttg gaa gcc gaa gga atc att ttg ggc tac agc 318

Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser

45 50 55

gcg gac att cac cct gcg gtg atg aat cgt gga ttt gag gtg acc gtg 366

Ala Asp Ile His Pro Ala Val Met Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val

60 65 70

gat gtc act ctc agc aac ttc gac cgc tcc act gta gac aat ttt gaa 414

Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu

75 80 85

agc tcc gtt gcg cag cat gat gaa gta ctg gag ttg cac agg ctt ttt 462

Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe

90 95 100

ggt tcg cca gat tat ttt gtc cgc atc ggc gtt gct gat ttg gag gcg 510

Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala

105 110 115 120

tat gag caa ttt tta tcc agt cac att caa acc gtg cca gga att gca 558

Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His Ile Gln Thr Val Pro Gly Ile Ala

125 130 135

aag atc tca tca cgt ttt gct atg aaa gtg gtg aaa cca gct cgc ccc 606

Lys Ile Ser Ser Arg Phe Ala Met Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro

140 145 150

cag gtg tgaagcatgc attttgaagc atgaatcttt ttcatctagt gaaggactga 662

Gln Val

tcccatgcgt atgaaatcaa tcgcagcaat tgcaatcgct accgccgccc tgg 715

〈210〉 2

〈211〉 154

〈212〉 PRT

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈400〉 2

Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser Ile Asp Arg Ala Ile Ile Ala Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ala Asn Ala Arg Ile Ser Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val

20 25 30

His Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala

35 40 45

Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Ile His Pro Ala Val Met

50 55 60

Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp

65 70 75 80

Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu

85 90 95

Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg

100 105 110

Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His

115 120 125

Ile Gln Thr Val Pro Gly Ile Ala Lys Ile Ser Ser Arg Phe Ala Met

130 135 140

Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro Gln Val

145 150

본 발명은 lrp 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, lrp 유전자의 발현이 변형되어 있는 코리네포름 세균을 사용한, 아미노산, 특히 라이신 및 이소루이신의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 동물 영양, 식품 산업, 사람 의약 및 약제 산업에서 사용된다.

이들 아미노산은 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 발효시킴에 의해 생산된다. 이들의 큰 중요성으로 인하여, 생산 방법을 개선시키기 위한 노력이 지속적으로 이루어져 왔다. 이러한 방법의 개선은 발효 기술에 대한 수단, 예를 들면, 교반 및 산소 공급, 또는 영양 배지의 조성, 예를 들면, 발효 동안의 당 농도, 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 수행 특성에 관한 것일 수 있다.

이들 미생물의 수행 특성은 돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이 선별법을 사용하여 개선시킨다. 이러한 방식으로, 예를 들면, 라이신 동족체 S-(2-아미노에틸)시스테인와 같은 항대사물질에 대해 내성이거나 중요한 조절 아미노산에 대한 영양요구주 및 L-아미노산을 생산하는 균주를 수득한다. 몇년동안, 재조합 DNA 기술법이 또한 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움의 균주 개선을 위해 사용되어 왔다.

LRP(루이신-반응성 단백질)는 일련의 유전자의 전사, 아미노산의 수송, 생합성 및 분해에 관여하는 유전자 산물에 영향을 미치는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 처음으로 기술된 세계적인 조절인자이다(참조: Calvo and Matthews, Microbiological Reviews 58, 466-490, 1994).

최근 몇년동안, 유사한 유전자가 다른 유기체, 예를 들면, 브래디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum)(참조: King and O'Brian, Journal of Bacteriology, 179, 1828-1831, 1997), 크렙시엘라 아에로게네스(Klebsiella aerogenes)(참조: Janes and Bender, Journal of Bacteriology, 181, 1054-1058, 1999), 설폴로부스 악시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)(참조: Charlier et al., Gene, 201, 63-68, 1997) 및 그람 양성 세균 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(참조: Belitsky et al., Journal of Bacteriology, 179, 5448-5457, 1997)에서 또한 확인되었다.

이. 콜라이에서 lrp 단백질은 자체의 발현을 조절한다. Lrp는 또한 이. 콜라이의 많은 유전자에 네가티브 또는 포지티브로 영향을 미친다. 일반적으로, 이는 자극되는 생합성 경로에서 활성인 유전자 산물의 발현물이다. 이화작용을 지닌 유전자 산물은 일반적으로 상응하게 네가티브적으로 조절된다. 일부 경우에, lrp 의 작용은 L-루이신의 첨가로 효능화되지만, L-루이신의 첨가는 또한 네가티브 효과를 지닌다(참조: Newman et al., In: Neidhardt et al. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D.C., 1513-1525, 1996). 이. 콜라이에서, lrp는 아미노산 생합성 및 아미노산 이화작용에 있어 중심적 역활을 하는 다수의 유전자 및 오페론들을 조절한다. 이. 콜라이에서는 하기 오페론이 예를 들면, 네가티브적으로 조절된다: 측쇄 아미노산에 대해 고도로 정교한 흡수 시스템에서 결합 단백질을 암호화하는 livJ(참조: Haney et al., Journal of Bacteriology, 174, 108-115, 1992) 및 라이신 tRNA 신테나제를 암호화하는 lysU(참조: Gazeau et al., FEBS Letters, 300, 254-258, 1994)이다. 지금까지 이. 콜라이내에서 포지티브적으로 영향을 받는 것으로 알려진 유전자는 특히 ilvIH, gltBDF 및 leuABCD를 포함한다(참조: Lin et al., Journal of Bacteriology, 174, 1948-1955, 1992).

최종 단계의 오페론은 루이신 생합성시 근본적으로 관심이 집중되고 있으며 특히 코리네박테리움 글루타미쿰에서 라이신 생합성에 대해 관심이 집중되어 있다. 루이신 영양요구주 및 증가된 라이신 생산성 값간에는 연관성이 있는 것으로 예견되고 있다(참조: Schrumpf et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 37, 566-571, 1992). 파텍(Patek) 등은 문헌(참조: Applied and Environmental Microbiology, 60, 133-140, 1994)에서 일부 라이신 생산자인 씨. 글루타미쿰에서 leuA를 불활성화시킴으로써 라이신 수율이 증가됨을 입증하였다. 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 돌연변이체에서는 도사카(Tosaka) 등이 L-루이신을 첨가함으로써 트레오닌 형성시 동시에 증가하는 라이신 형성을 감소시킬 수 있었다(참조: Agricultural Biological Chemistry, 43, 265-270, 1979).

본 발명의 목적은 코리네포름 세균을 사용하여 L-아미노산, 특히 L-라이신 및 L-이소루이신의 개선된 발효적 생산의 신규 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은

d) 상기 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 코리네포름 세균으로부터의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한

(i) 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는

(ii) 유전 코드의 변성 범위내에서 상기 (i)에서 정의한 서열과 매치하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) (i)에서 정의한 서열 또는 (ii)에서 정의한 서열에 상보성인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열 및 임으로

(iv) (i)에서 정의한 서열내 작용적으로 중성인 센스 돌연변이(sense mutation)를 함유하는 복제가능한 DNA를 바람직하게 포함하는, 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 1에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 제2항에 따른 폴리뉴클레오타이드 및

서열 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 제2항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 실질적으로 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지며 서열 1에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지닌 완전한 유전자와 서열 1에 따른 기술된 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 이의 단편을 함유하는 프로브를 함유하는 적절한 유전자 라이브러리를 하이브리드화 스크리닝하고 기술된 DNA 서열을 분리함으로써 수득할 수 있다.

lrp 유전자와 고 수준의 유사성을 나타내는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 lrp 단백질을 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하고 이러한 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 RNA, cDNA 및 DNA용 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 lrp 단백질을 암호화하는 유전자의 DNA 생산용 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 매우 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 프로브 또는 프라이머로서 작용한다. 40개 또는 50개 이상의 염기쌍 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또한 적합하다.

"분리된"은 천연 환경으로 부터 분리됨을 의미한다. "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 RNA 또는 DNA가 변형되지 않거나 변형된 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열 2에 따른 폴리펩타이드, 특히 lrp 단백질의 생물학적 활성을 갖는 것 및 또한 서열 2에 따른 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 동일한 것 및 특히 서열 2에 따른 폴리펩타이드와 90 내지 95% 동일하고 기술된 활성을 나타내는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 표적 물질의 작용으로 신규한 lrp 유전자를 증폭시키거나 약화시킴에 의한, 이미 아미노산을 생산하는 코리네포름 세균을 사용한 아미노산, 특히, L-라이신 및 L-이소루이신의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

이와 관련하여, 용어 "증폭"은 미생물내에서 상응하는 DNA에 의해 암호화된 하나 이상의 효소의 세포내 활성이 예를 들면, 유전자(들)의 카피 수를 증가시킴에 의해, 활성이 증가된 상응하는 효소를 암호화하는 강력한 프로모터 또는 유전자를 사용함에 의해 및 임의로 이들 측정법을 합함에 의해 증가됨을 말한다.

이와 관련하여, 용어 "약화"는 미생물내에서 상응하는 DNA에 의해 암호화된 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성이 예를 들면, 약한 프로모터 또는 유전자 또는 활성이 낮거나 상응하는 효소(단백질)을 불활성화시키는 상응하는 효소를 암호화하는 대립형질 유전자를 사용함에 의해 및 임의로 이들 측정법을 합함에 의해 저하되거나 억제됨을 의미한다.

본 발명에 의해 제공된 미생물은 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 몰라세스, 전분, 셀룰로즈 또는 글리세롤 및 에탄올로 부터 L-라이신을 생산할 수 있다. 이들은 대표적인 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 속을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속중에서, 전문가 모임에서 L-아미노산을 생산하는 능력에 대해 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속의 적합한 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주는 예를 들면, 공지된 야생형 균주이다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ACTT15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ACTT13870

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ACTT17965

코리네박테리움 테르모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ACTT14067,

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ACTT13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ACTT14020, 및 예를 들면, 하기로 부터 생산된 아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주:

L-라이신 생산 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715

또는 L-이소루이신 생산 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14309,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14310,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14311,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC15168 및

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6871.

본 발명자들은 씨. 글루타미쿰으로 부터 lrp 단백질을 암호화하는 신규한 lrp 유전자를 분리하는데 성공하였다.

lrp 유전자 또는 기타 유전자는 이. 콜라이내 이러한 미생물의 유전자 라이브러리를 우선 작제함에 의해 씨. 글루타미쿰으로부터 분리된다. 유전자 라이브러리의 작제는 일반적으로 공지된 교과서 및 매뉴얼에 기술되어 있다. 언급될 수 있는 예에는 윈나커(Winnacker)의 교과서[참조: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie: Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)] 또는 삼브룩(Sambrook) 등의 매뉴얼[참조: Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]이 있다. 가장 잘 공지된 유전자 라이브러리중 하나는 λ-벡터내에서 코하라(Kohara) 등에 의해 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 유전자 라이브러리이다[참조: Cell 50, 495-508(1987)]. 바쓰(Bathe) 등은 문헌(참조: Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996)에서 이. 콜라이 K-12 균주 NM554(참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575)내에서 코스미드 벡터 SuperCos I(참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164)를 사용하여 작제한 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 바쓰 등은 문헌(참조: Molecular and General Genetics, 6:3-317, 326)에서 또한 코스미드 pHC79[참조: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298(1980)]를 사용하는 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. pBR322[참조: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818(1979)] 또는 pUC9(참조: Viera et al., 1982, Gene, 19:259-268)과 같은 플라스미드는 또한 이. 콜라이내에서 씨. 글루타미쿰의 유전자 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 특히 적합한 숙주는 제한 및 재조합과 관련하여 결함을 보이는 이. 콜라이의 균주이다. 이러한 균주의 한가지 예는 그란트(Grant) 등에 의해 기술된 균주 DH5αmcr[참조: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87(1990) 4645-4649]이다. 코스미드의 보조로 클로닝된 장쇄 DNA 단편은 결국 서열분석에 적합한 벡터내로 아클로닝한 후 문헌[참조: Sanger et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977)에 기술된 바와 같이 서열분석할 수 있다.

lrp 유전자를 암호화하고 서열 1과 같이 본 발명에 의해 제공된 씨. 글루타미쿰으로 부터의 신규 DNA 서열은 이러한 방법으로 수득된다. 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 또한 상기 기술된 방법을 사용하여 상기 DNA 서열로 부터 유추된다. lrp 유전자 산물의 수득되는 아미노산 서열은 서열 2에 나타낸다.

유전 코드의 축퇴성으로 부터 발생된 DNA 서열 암호화가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 서열 1과 하이브리드화하거나 서열 1의 일부분과 하이브리드화하는 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 유사하게 제공된다. 단백질내 아미노산의 보존된 치환, 예를 들어, 알라닌의 글라이신으로의 치환 또는 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환은 전문가 모임에서 "센스 돌연변이"로 알려져 있으며, 이는 단백질의 활성에 있어 근본적인 변화를 유발하지 않는데, 즉, 이들은 작용적으로 중성이다. 또한 단백질의 N 및/또는 C 말단에 대한 변화는 실질적으로 손상되지 않거나 심지어 이의 작용을 안정화시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 당해 분야의 숙련가들은 특히 벤-바셋(Ben-Bassat) 등[참조: Journal of Bacteriology 169:751-757(1987)], 오레간(O'Regan) 등[참조: Gene 77:237-251(1989)], 사힌-토쓰(Sahin-Toth) 등[참조: Protein Sciences 3:240-247(1994)], 호쿨리(Hochuli) 등[참조: Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 이와 관련된 정보를 발견할 것이다. 서열 2로 부터 상응하는 방식으로 발생된 아미노산 서열 또한 본 발명에 의해 제공된다.

서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 최종적으로, 서열 1로 부터 수득된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 DNA 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 15개 이상의 염기쌍 길이를 지닌다.

당해 분야의 숙련가들은 특히 매뉴얼[참조: 베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH: Mannheim, Germany, 1993)의 "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"] 및 리에블(Liebl) 등의 문헌[참조: International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 하이브리드화에 의해 DNA 서열을 확인하기 위한 장치를 발견할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 특히 가이트(Gait)의 교과서[참조: Gait, Oligonucleotide synthesis: a practical approach(IRL Press, Oxford, UK, 1984)], 및 뉴톤(Newton) 및 그라함(Graham)의 문헌(참조: Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)에서 폴리머라제 쇄 반응에 의해 DNA 서열을 증폭하기 위한 장치를 발견할 것이다.

본 발명자들은 lrp 유전자가 아미노산, 특히 L-라이신 및 L- 이소루이신의 생산에 중요함을 발견하였다.

본 발명자들은 또한 특수한 생합성 경로, 해당작용, 시트르산 주기, 육아 발생 대사 또는 아미노산 배출중의 하나 이상의 효소의 추가의 과발현이 단독으로 또는 조합하여 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-이소루이신의 생산에 유리함을 발견하였다.

즉, 예를 들어, L-라이신을 생산하기 위해서는

·디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(참조: EP-B 0 197 335)를 동시에 과발현시키거나,

·글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 갭 유전자(gap gene)[참조: Schwinde et al., Journal of Bacteriology 175: 3905-3908 (1993)]를 동시에 과발현시키거나,

·말레이트:퀴논 옥시도레덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)]를 동시에 과발현시키거나,

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(참조: DE-A-19 831 609)를 동시에 과발현시키거나, 또는

·라이신 배출을 암호화하는 lysE 유전자(참조; DE-A-195 48 222)를 동시에 과발현시킬 수 있다.

즉, 예를 들어, L-이소루이신을 생산하기 위해서는,

·트레오닌 데하이드라타제를 암호화하는 ilvA 유전자[참조: Mockel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072] 또는 "피이드 백 내성(feed back resistant)" ilvA(Fbr) 대립형질 유전자[참조: Mockel et al., (1994) Molecular Microbiology 13; 833-842]를 동시에 과발현시키거나,

·글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Schwinde et al., Journal of Bacteriology 175: 3905-3908 (1993)]를 동시에 과발현시키거나,

·말레이트:퀴논 옥시도레덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403(1998)]를 동시에 과발현시키거나, 또는

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(참조: DE-A-19 831 609)를 동시에 과발현시킬 수 있다.

아미노산, 특히 L-라이신 및 L-이소루이신을 생산하기 위해서는 원하지 않는 2차 반응을 억제하는 것이 또한 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

아미노산 생산, 특히 L-라이신 및 L-이소루이신의 생산 목적을 위해, 본 발명에 따라 제조된 미생물을 배취 공정 또는 공급 배취 공정 또는 반복된 공급 배취 공정을 사용하여 연속적으로 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 화학 교과서[참조: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 스토하스(Storhas)의 교과서[참조: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 제공되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균주의 요구도를 충분히 만족하여야 한다. 각종 미생물용 배양 배지는 문헌[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 예를 들면, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 몰라세스, 전분 및 셀룰로즈과 같은 당 및 탄수화물, 예를 들면, 대두 오일, 해바라기 씨 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 오일과 같은 오일 및 지방, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들면, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예를 들면, 아세트산과 같은 유기산을 포함한다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수대 액, 대두 분말 및 우레아와 같은 질소 함유 유기 화합물 또는 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트와 같은 무기 화합물을 포함한다. 이들 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 나트륨을 함유하는 상응하는 염을 포함한다. 배양 배지는 또한 예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철과 같이 성장에 요구되는 금속의 염을 함유하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 성장-촉진 물질이 또한 상술한 물질외에 사용될 수 있다. 또한, 적합한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 기술된 물질은 단일 배취의 형태로 배양물에 가해지거나 배양동안 적합한 방식으로 공급될 수 있다.

배양물의 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아 용액과 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 사용하여 적합한 방법으로 조절한다. 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 포지제를 사용하여 거품형성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 항생물질과 같은 적합한, 선택적 작용 물질을 배지에 가하여 플라스미드 안정성을 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 공기와 같이 산소를 함유하는 가스 혼합물 또는 산소를 배양물에 도입하여 호기 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃이고 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 목적한 아미노산의 최대량이 형성될 때까지 지속시킨다. 이 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.

아미노산은 스파크만(Spackman) 등이 기술한 바와 같이[참조: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190] 연속적으로 닌하이드린 유도체화시키면서 음이온 교환 크로마토그래피하거나, 린드로쓰(Lindroth) 등이 기술한 바와 같이[참조: Analytical Chemistry(1979) 51: 1167-1174] 역상 HPLC에 의해 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 목적은 아미노산, 특히 L-라이신 및 L-이소루이신의 발효적 생산이다.

실시예

본 발명을 하기 실질적인 실시예에서 좀 더 상세히 기술한다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 생산

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로 부터의 염색체 DNA는 다우치(Tauch) 등에 의해 기술된 바와 같이(참조: 1995, Plasmid 33:168-179) 분리하며 제한 효소 Sau3AI로 부분 분해한다(참조: Amersham pharmacia 제조원, Freiburg, Germany 소재, 제품 기술 Sau3AI, 코드 번호 27-0913-02). DNA 단편을 쉬림프(shrimp) 알칼린 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals 제조원, Mannheim, Germany 소재, 제품 기술 SAP, 코드 번호 1758250)로 탈포스포릴화시킨다. 스트라타젠(Stratagene: La Jolla, USA 소재, 제품 기술 SuperCos1 Cosmid Vector Kit, 코드 번호 250301)에서 시판하는 코스미드 벡터 SuperCos1의 DNA[참조: Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164]를 제한 효소 XbaI(Amersham Pharmacia 제조원, Freiburg, Germany 소재, 제품 기술 XbaI, 코드 번호 27-0948-02)로 분해하고 또한 쉬림프 알칼린 포스파타제로 탈포스포릴화한다. 다음 이 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia 제조원, Freiburg, Germany 소재, 제품 기술 BamHI, 코드 번호 27-0868-04)로 분해한다. 이러한 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032와 혼합하고 이 배취를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia 제조원, Freiburg Germany 소재, 제품 기술 T4 DNA 리가제, 코드 번호 27-0870-04)로 처리한다. 다음 이 리가제 혼합물을 기가팩 II XL 패킹 추출물(Gigapack II XL Packing Extracts: Stratagene 제조원, La Jolla, USA 소재, 제품 기술 Gigapack II XL Packing Extract, 코드 번호 200217)을 사용하여 파아지내로 패키징한다. 이. 콜라이 균주 NM554(참조: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575)는 10mM MgSO₄중에 세포를 현탁시키고 이들을 분취량의 파아지 현탁액과 혼합함에 의해 감염시킨다. 이 코스미드 라이브러리는, 세포를 LB 아가(참조: Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100㎍/ml의 암피실린에 플레이팅하는 삼브룩 등에 의해 기술된 바와 같이(참조: 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) 감염시키고 연마한다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 개개의 재조합 클론을 선별한다.

실시예 2

lrp 유전자의 분리 및 서열분석

개개의 콜로니로 부터의 코스미드 DNA를 Qiaprep 스핀 미니프렙 키트(제품 번호 27106, Qiagen 제조원, Hilden, Germany 소재)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 분리하고 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia 제조원, Freiburg, Germany 소재, 제품 기술 Sau3AI, 코드 번호 27-0913-02)를 사용하여 부분분해한다. DNA 단편을 쉬림프 알칼린 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals 제조원, Mannheim, Germany 소재, 제품 기술 SAP, 코드 번호 1758250)로 탈포스포릴화한다. 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 대략 1500 내지 2000bp 크기의 코스미드 단편을 QiaExII 겔 추출 키트(제품 번호 20021, Qiagen제조원, Hilden, Germany 소재)를 사용하여 분리한다. Invitrogen(Groningen, Netherlands 소재, 제품 기술 Zero Background Cloning Kit, 제품 번호 K2500-01)로 부터 시판되는 서열 분석 벡터 pZero-1의 DNA를 제한 효소 BamHI(참조: Amersham Pharmacia 제조원, Freiburg, Deutschland 소재, 제품 기술 BamHI, 제품 번호 27-0868-04)로 분해한다. 코스미드 단편의 서열분석 벡터 pZero-1내로의 연결은 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech 제조원, Freiburg, Germany 소재)와 함께 밤새 항온처리하는, 삼브룩 등이 기술한 바와 같이(참조: 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) 수행한다. 이 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5aMCR내로 일렉트로포레이션시키고(참조: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649)(참조: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) LB 아가(참조: Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 50㎍/ml의 제오신상에 플레이팅한다. 재조합 클론의 플라스미드를 바이오로보트(Biorobot) 9600(제품 번호 900200, Qiagen 제조원, Hilden, Germany 소재)를 사용하여 제조한다. 서열분석은 짐머만(Zimmermann) 등에 의해 변형된(참조: 1990, Nucleic Acids Research, 18:1067)바와 같이, 상거(Sanger) 등에 따른 디데옥시 쇄 말단 방법(참조: 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467)을 사용하여 수행한다. PE Applied Biosystems(제품 번호 403044, Weiterstadt, Germany 소재)로 부터의 "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit"를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열 분석 반응의 분석은 PE Applied Biosystems(Weiterstadt, Germany 소재)으로 부터의 "ABI Prism 377" 서열분석기를 사용하여 "로티포레스(Rotiphorese) NF" 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔(29:1)에서 수행한다.

다음 수득되는 미가공 서열 데이타를 슈타덴 소프트웨어 패키지(Staden software package: 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231), 버젼 97-0을 사용하여 프로세싱한다. pZero 1 유도체의 개개의 서열을 점착성 배열내로 조립한다. 컴퓨터 보조된 암호화 영역의 분석은 XNIP 소프트웨어(Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231)을 사용하여 수행한다. 추가의 분석은 "National Library of Medicine"(USA)의 풍부하지 않은 NCBI 데이타베이스에 대해 "BLAST 서치 프로그램"(참조: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402)을 사용하여 수행한다.

수득되는 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 기술한다. 뉴클레오타이드 서열의 분석은 lrp 유전자로 지명된 463개 염기 쌍의 개방 판독 프레임을 나타낸다. lrp 유전자는 154개의 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다.

본 발명에 의해 제공된 lrp 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 lrp 유전자의 발현이 변형된 코리네포름 세균을 사용하여, L-아미노산, 특히 L-라이신 및 L-이소루이신을 발효적으로 생산할 수 있다.

Claims

a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

c) 상기 a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보성인 폴리뉴클레오타이드 및

d) 상기 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 코리네포름 세균으로부터의 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 코리네포름 세균내에서 복제 가능한 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열 1에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서,

(i) 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는

(ii) 유전 코드의 변성 범위내에서 상기 (i)에서 정의한 서열과 매치하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) (i)에서 정의한 서열 또는 (ii)에서 정의한 서열에 상보성인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열 및 임의로

(iv) (i)에서 정의한 서열내 작용적으로 중성인 센스 돌연변이(sense mutation)를 함유하는 복제 가능한 DNA.
제2항에 있어서, 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
a) lrp 유전자가 약화되거나 증폭되어 있는, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 세균을 발효시키는 단계,

b) 배지내 또는 세균 세포내에 목적한 생성물을 축적시키는 단계 및

c) L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법.
제7항에 있어서, 목적한 L-아미노산의 생합성 경로의 추가의 유전자가 추가로 증폭된 세균이 사용되는 방법.
제7항에 있어서, 목적한 아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 억제된 세균이 사용되는 방법.
제7항에 있어서, 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주가 사용되고 플라스미드 벡터가 lrp 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지니는 방법.
제7항에 있어서, 결실 또는 삽입이 약화 목적을 위해 세균의 lrp 유전자내에서 이루어지는 방법.
제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, L-아미노산을 생산하는 코리네포름 세균이 사용되는 방법.