CN100368545C - 编码lysR3基因的核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的一种多核苷酸序列：a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。本发明还涉及使用棒状细菌发酵生产L-氨基酸的方法，所述细菌中至少lysR3基因是弱化的，本发明还涉及所述多核苷酸序列作为杂交探针的应用。

Description

编码lysR3基因的核苷酸序列

本发明提供了来自棒状细菌(coryneform bacteria)的编码lysR3基因的核苷酸序列，和通过弱化lysR3基因发酵生产氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸的方法。lysR3基因编码LysR3蛋白，其是LysR家族的一种转录调节物。

现有技术

L-氨基酸特别是L-赖氨酸和L-缬氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工方法，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物缺陷的并产生氨基酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良棒杆菌菌株生产L-氨基酸的能力。

发明目的

本发明人的目的是为发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸提供改良的新方法。

发明描述

本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含编码lysR3基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：

a)与编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，

b)编码包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)多核苷酸互补的多核苷酸，及

d)包含a)，b)或c)多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，

所述多肽优选具有转录调节物LysR3活性。

本发明还提供了上述多核苷酸，其优选是一种能复制的DNA，

包含：

(i)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或

(iii)与(i)或(ii)序列的互补序列杂交的至少一个序列，及任选地，

(iv)(i)中中性功能的有义突变。

本发明还提供了：

一种DNA，其是能复制的并包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

一种多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；

一种载体，其含有本发明第d点的多核苷酸，尤其是pCR2.1lysR3int，保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，德国不伦瑞克)；及

棒状细菌，其中lysR3基因中含有尤其是使用载体pCR2.1lysR3int进行的插入或缺失。

本发明还提供了多核苷酸，其基本上包含一种多核苷酸序列，所述多核苷酸可通过用具有相应于SEQ ID NO：1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包括具有相应于SEQ ID NO：1所述多核苷酸序列的完整基因。

本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码LysR3蛋白的全长核酸或多核苷酸或基因，或分离与lysR3基因的序列具有高度序列相似性的核酸、多核苷酸或基因。

另外，含有本发明序列的多核苷酸还适用作引物，借助于其通过聚合酶链反应(PCR)，可以制备编码LysR3蛋白的基因的DNA。

作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。

“分离的”是指从其天然环境中分离出来。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。

“多肽”应理解为包含经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有LysR3蛋白生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：2的多肽至少70％，优选至少80％，特别优选至少90-95％相同并具有所述活性的多肽。

本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸的方法，在该棒状细菌中编码lysR3基因的核苷酸序列被弱化，尤其是被消除或低水平表达。

文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或消除，例如通过使用弱启动子或编码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及如果需要组合使用这些方法。

本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸特别是L-赖氨酸和L-缬氨酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。

适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

醋谷棒杆菌ATCC 15806

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539

黄色短杆菌ATCC 14067

乳发酵短杆菌ATCC 13869和

扩展短杆菌ATCC 14020

或从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株，例如生产L-赖氨酸的菌株：

谷氨酸棒杆菌FERM-P1709

黄色短杆菌FERM-P 1708

乳发酵短杆菌FERM-P 1712

谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463

谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464

谷氨酸棒杆菌DM58-1

谷氨酸棒杆菌DG52-5

谷氨酸棒杆菌DSM 5714和

谷氨酸棒杆菌DSM 12866

或例如生产L-缬氨酸的菌株：

谷氨酸棒杆菌DSM 12455

谷氨酸棒杆菌FERM-P 9325

乳发酵短杆菌FERM-P 9324

乳发酵短杆菌FERM-BP 1763。

本发明人已成功地从谷氨酸棒杆菌中分离编码LysR3蛋白的新lysR3基因，该蛋白是LysR家族的一种转录调节物。

为了分离谷氨酸棒杆菌的lysR3基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在入载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252：255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，84：2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。

为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19：259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5α(Jeffrey H.Miller：“细菌遗传学短期教材，针对大肠杆菌和相关细菌的实验指导和手册”，冷泉港实验室出版社，1992)。

然后将借助于粘粒或其它λ载体克隆的长DNA片段，亚克隆入适于DNA测序的常规载体中。

DNA测序方法参见于Sanger等(美国科学院院报74：5463-5467，1977)所述。

获得的DNA序列然后可以使用已知公式或序列分析程序加以检测，如Staden(核酸研究14，217-232(1986))所述，Marck(核酸研究16，1829-1836(1988))所述，或Butler所述GCG程序(生物化学分析方法39，74-97(1998))。

以此方式可获得编码lysR3基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO：1，是本发明的一部分。另外，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得lysR3基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。

通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO：1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，本领域技术人员已知，蛋白质中的保守氨基酸置换如用丙氨酸置换甘氨酸，或用谷氨酸置换天冬氨酸，是有义突变，其不引起所述蛋白质活性的任何改变，即它们是中性的。另外，已知在蛋白质N末端和/C末端的变化基本不损害其功能而且甚至还稳定其功能。本领域技术人员可以找到关于这方面的信息，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))，O’Regan等(基因77：237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术6：1321-1325(1988))及熟知的遗传和分子生物学教材。以适当方式产生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列也是本发明的一部分。

最后，使用得自SEQ ID NO：1的引物通过聚合酶链反应(PCR)产生的DNA序列是本发明的一部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸。

通过杂交鉴别DNA序列的指导可见于Boehringer MannheimGmbH(德国曼海姆，1993)的“滤膜杂交的DIG系统使用指导”，和Liebl等(国际系统细菌学杂志41：255-260(1991))。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。

本发明人发现，在lysR3基因弱化后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸，尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸。

为获得弱化，可降低或消除lysR3基因的表达或酶蛋白的催化活性。两种措施可任选地组合。

可通过适当控制培养或通过遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构而实现降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面的信息，例如专利申请WO96/15246，Boyd&Murphy(细菌学杂志170：5949(1988))，Voskuil&Chambliss(核酸研究26：3548(1998))，Jensen&Hammer(生物技术和生物工程58：191(1998))，Patek等(微生物学142：1297(1996))，Vasicova等(细菌学杂志181：6188(1999))，以及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)。

导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知的，可提及的例如Qiu和Goodman的论文(生物化学杂志272：8611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学61：1760-1762(1997))以及Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶：酶的变构调节和结构，Berichte des Forschungszentrums Julichs，Jul-2906，ISSN09442952，Julich，德国，1994)。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(＂Allgemeine Genetik＂，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

合适的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸置换对酶活性的影响，分别为错义突变或无义突变。在基因中插入或缺失至少一个碱基对(bp)导致移码突变，其结果是插入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。缺失几个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，GeorgThieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(＂普通遗传学＂，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

在谷氨酸棒杆菌中突变基因的一般方法是基因破坏和基因置换方法，如Schwarzer和Puhler所述(生物/技术9，84-87(1991))。

在基因破坏方法中，将所述基因编码区的中心部分克隆在质粒载体中，所述载体能在宿主中复制(典型在大肠杆菌中复制)，但在谷氨酸棒杆菌中不能复制。适当的载体例如pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，细菌学杂志174：5462-65(1992))，pGEM-T(Promega公司，Madison，Wis.，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994))，生物化学杂志269：32678-84；美国专利No.5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard等，分子生物学杂志234：534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)。然后将含有所述基因编码区中心部分的质粒载体通过接合或转化移至所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等(应用和环境微生物学60，756-759(1994))所述。转化方法例如Thierbach等(应用微生物学及生物技术学29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))所述。在通过“交换”同源重组后，相应基因的编码区被载体序列间断，并获得两个不完整的等位基因，一个缺失3’末端，一个缺失5’末端。这个方法例如已经由Fitzpatrick等使用，以消除谷氨酸棒杆菌中的recA基因(应用微生物学和生物技术42，575-580(1994))。

图1示出质粒载体pCR2.1lysR3int，利用其可破坏或消除lysR3基因。

在基因置换方法中，突变例如缺失，插入或碱基置换是在体外在相应基因中产生的。然后将产生的等位基因克隆入在谷氨酸棒杆菌中不复制的载体中，然后将其通过转化或接合移至所需谷氨酸棒杆菌宿主中。在通过实现整合的第一次“交换”事件，及实现靶基因或靶序列中的切除的第二次“交换”事件的同源重组后，实现掺入突变体或等位基因。这种方法例如已经由Peters-Wendisch等使用，以通过缺失而消除谷氨酸棒杆菌中的pyc基因(微生物学144，915-927(1998))。

以此方式可以在lysR3基因中掺入缺失，插入或碱基置换。

另外，除了lysR3基因的弱化之外，特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的增强特别是过表达，对L-氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸的生产也可以是有益的。

因此，例如为生产L-赖氨酸，选自以下的一或多种基因可以同时增强尤其过表达：

·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，

·编码烯醇化酶的eno基因(DE：19947791.4)，

·编码zwf基因产物的zwf基因(JP-A-09224661)，

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144，915-927(1998)，

·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-19548222)。

为生产氨基酸尤其L-赖氨酸，除了弱化lysR3基因之外，同时弱化选自以下的一或多种基因也是有益的：

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1，DSM13047)，

·编码编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396478，DSM12969)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：19951975.7，DSM13114)。

因此，例如为生产L-缬氨酸，选自以下的一或多种基因可以同时过表达：

·编码乙酰羟酸合酶的ilvBN基因(Keilhauer等，(1993)，细菌学杂志175：5595-5603)，或

·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因(Sahm和Eggeling(1999)，应用和环境微生物学65：1973-1979)，或

·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254，395-403(1998))。

另外，除lysR3基因的弱化之外，抑制非所需的二级反应对氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。

本发明还提供了根据本发明制备的微生物，其可连续培养或在分批方法，或在补料分批法或重复补料分批法中分批培养以生产L-氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸。已知的培养法由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。

所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。

可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或混合使用。

可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。另外培养基还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。

可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。

L-氨基酸的分析方法是现有技术中已知的，分析可如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)进行。

以下微生物根据布达佩斯条约，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：

·大肠杆菌菌株TOP10F/pCR2.1lysR3int，保藏号DSM 13618。

本发明的方法用于发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸。

本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。

从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有的限制、Klenow处理和碱性磷酸酶处理方法，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.美国)。大肠杆菌的转化方法也见于这本手册。

常用的培养基如LB培养基或TY培养基的组分也得自Sambrook等所著手册。

实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库

如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编号251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报84：2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编号27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。

粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编号27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编号27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编号200217)包装进噬菌体中。

为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO₄并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1∶190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。

实施例2  lysR3基因的分离和测序

用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离一个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。

得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将这一连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123：343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)并在含有50μg/ml的zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1∶190)上铺板。

重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmeermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29：1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。

得到的原始序列资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-l衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)制备计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。

获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对该核苷酸序列的分析显示一633碱基对的开放读框，其被称为lysR3基因。lysR3基因编码210个氨基酸的多肽。

实施例3用于lysR3基因的整合诱变的整合载体的制备

用Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))从菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。基于实施例2已知的谷氨酸棒杆菌的lysR3基因的序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应：

lysR3intA：

5′GAT GTG GTG TTG ATG GAT CT-3′

lysR3intB：

5′-TCA ATT TCT CTG GCA CTG AG-3′。

所述引物由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成，根据Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指南，1990，学术出版社)，用来自曼海姆宝灵格公司的Pwo聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，分离了lysR3基因的一个323bp长的内部片段，示作SEQ ID NO：3。

用来自Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carsbad，CA，USA；目录号K4500-01)，将扩增的DNA片段连接进载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)生物/技术9：657-663)中。

然后将这一连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10F(Hanahan，DNA克隆实用方法，卷I，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美国，1985)。通过将转化混合物在补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带质粒的细胞。用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化子中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI限制消化及琼脂糖凝胶电泳(0.8％)而证实。质粒命名为pCR2.1lysR3int。

实施例4 lysR3基因在赖氨酸生产菌株DSM 5715和缬氨酸生产菌株FERM BP-1763中的整合诱变

根据Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信123：343-347(1994))，将实施例3中的载体pCR2.1lysR3int电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM 5715和乳发酵短杆菌FERM BP-1763中。菌株DSM5715是AEC抗性赖氨酸生产菌(EP-B-435132)。菌株FERM BP-1763是需要异亮氨酸和甲硫氨酸的缬氨酸生产菌(US-A-5188948)。载体pCR2.1lysR3int在DSM 5715或FERM BP-1763中不能独立复制，只有在其整合进DSM5715或FERM BP-1763的染色体中后才能在细胞中保持。通过将电穿孔混合物在补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带整合进染色体的pCR2.1lysR3int的克隆。

通过用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒，根据宝灵格曼海姆有限公司的“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)的方法标记lysR3int片段，以检测整合已经发生。根据Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))，从潜在整合子中分离染色体DNA，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII切割。经琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒在68℃杂交。实施例3中的质粒pCR2.1lysR3int已插入DSM5715和FERM BP-1763染色体中的染色体lysR3基因内。该菌株命名为DSM5715::pCR2.1lysR3int和FERM BP-1763::pCR2.1lysR3int。

实施例5  L-赖氨酸和L-缬氨酸的生产

实施例4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715::pCR2.1lysR3int和乳发酵短杆菌FERM BP-1763::pCR2.1lysR3int在适于生产L-赖氨酸和L-缬氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的L-赖氨酸和L-缬氨酸含量。

为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。

培养基CgIII

NaCl                  2.5g/l

Bacto-肽胨            10g/l

Bacto-酵母膏          10g/l

葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v)

pH调节为7.4。

向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始光密度(OD，660nm)是0.1。培养基MM用作主培养基。

培养基MM：

CSL(玉米浆)            5g/l

MOPS(吗啉代丙磺酸)     20g/l

葡萄糖  (单独高压灭菌) 50g/l

盐：

(NH₄)₂SO₄              25g/l

KH₂PO₄                 0.1g/l

MgSO₄·7H₂O            1.0g/l

CaCl₂·2H₂O            10mg/l

FeSO₄·7H₂O            10mg/l

MnSO₄·H₂O             5.0mg/l

生物素(过滤灭菌)       0.3mg/l

硫胺素·HCl(过滤灭菌)  0.2mg/l

CaCO₃                  25g/l

用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO₃。针对培养DSM5715，在培养基中额外加入0.1g/l亮氨酸。针对培养FERMBP-1763，在所述培养基中额外加入0.1g/l异亮氨酸和0.1g/l甲硫氨酸。

以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。

72小时后，用Biomek1000(Beckmann仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)，经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的L-赖氨酸和L-缬氨酸的数量。

所得结果示于表1和2。

表1

菌株	OD(660nm)	赖氨酸HClg/L
			DSM5715	7.5	13.01
DSM5715::pCR2.1lysR3int	7.6	15.04

表2

菌株	OD(660nm)	缬氨酸g/L
			FERM BP-1763	12.1	7.49
FERM BP-1763::pCR2.1lysR3int	12.5	8.67

附图简述

图1：质粒pCR2.1lysR3int图谱。

图中所采用的缩写和符号有如下含义：

KmR：卡那霉素抗性

EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点

lysR3int：lysR3基因的内部片段

ColE1 ori：质粒ColE1的复制源点

                              序列表

<110>德古萨股份公司

<120>编码lysR3基因的核苷酸序列

<130>000183  BT

<140>

<141>

<160>3

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1032

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>CDS

<222>(201)..(830)

<223>lysR3基因

<400>1

gatgatcaaa tacttctaga tgtcatcgat aatgggcagg gatttgatgt ggcagaagtg  60

atccgtaaaa aatccattgg actgcccaca gcgcaacgcc gggctgaagg gctgggcgga  120

acaataatta ttgaatctac aatcggatcg ggaactggaa tttccgcccg ttttccctat  180

ccacaaaagg accaagataa gtg atc cgt att ctg ttg gct gat gat cat ccc  233

                      Met Ile Arg Ile Leu Leu Ala Asp Asp His Pro

                        1               5                  10

gtt gtt cgc gca ggc ctt gcc tcc ttg ctg gtg agt gaa gat gat ttt    281

Val Val Arg Ala Gly Leu Ala Ser Leu Leu Val Ser Glu Asp Asp Phe

             15                  20                  25

gag ata gtg gac atg gtg ggc acc cca gat gat gcc gtt gcg cgc gcc    329

Glu Ile Val Asp Met Val Gly Thr Pro Asp Asp Ala Val Ala Arg Ala

         30                  35                  40

gcg gaa ggc ggg gtg gat gtg gtg ttg atg gat ctg cgt ttt ggt gat    377

Ala Glu Gly Gly Val Asp Val Val Leu Met Asp Leu Arg Phe Gly Asp

     45                  50                  55

caa cca ggc atc gag gtc gcc ggc ggg gta gag gca acg cgt cgc atc    425

Gln  Pro GlyIle Glu Val Ala Gly Gly Val Glu Ala Thr Arg Arg Ile

 60                  65                  70                  75

cgt gcg ctg gac aac ccg cca cag gta ctg gtg gtg acc aac tac tcc    473

Arg Ala Leu Asp Asn Pro Pro Gln Val Leu Val Val Thr Asn Tyr Ser

                 80                  85                  90

aca gac ggc gat gtg gtg ggc gca gta tct gct ggt gcc gtg ggg tat    521

Thr Asp Gly Asp Val Val Gly Ala Val Ser Ala Gly Ala Val Gly Tyr

            95                  100                 105

ttg ctc aaa gat agc tcc cca gaa gat ctc att gcc ggt gtt cgc gat    569

Leu Leu Lys Asp Ser Ser Pro Glu Asp Leu Ile Ala Gly Val Arg Asp

        110                 115                 120

gcc gcg cgg gga gaa tca gtg ctt tca aag cag gtc gcc agc aag atc    617

Ala Ala Arg Gly Glu Ser Val Leu Ser Lys Gln Val Ala Ser Lys Ile

    125                 130                  135

atg ggg cgg atg aac aac ccc atg act gct ctc agt gcc aga gaa att    665

Met Gly Arg Met Asn Asn Pro Met Thr Ala Leu Ser Ala Arg Glu Ile

140                 145                 150                 155

gaa gtg ctg tcc ttg gtg gcg caa ggg caa agc aat aga gaa atc ggc    713

Glu Val Leu Ser Leu Val Ala Gln Gly Gln Ser Asn Arg Glu Ile Gly

                160                 165                 170

aag aaa ctt ttc ctc act gag gcc acg gtg aaa agt cac atg ggg cat    761

Lys Lys Leu phe Leu Thr Glu Ala Thr Val Lys Ser His Met Gly His

            175                 180                 185

gtg ttc aac aag ctg gat gtc acc tct aga aca gct gcg gta gct gaa    809

Val Phe Asn Lys Leu Asp Val Thr Ser Arg Thr Ala Ala Val Ala Glu

        190                 195                 200

gcc aga cag cgc gga att atc tagacgcaca cgtgttggta accgatcaca       860

Ala Arg Gln Arg Gly Ile Ile

    205                 210

ccagcgcacg ctgctaatct tcactccatg aacaaggtgc agcgcaggtc actgatggcg  920

ttgtgcatga cggtggcatt tgctggagga agcctgaccg cgtgcacacc tcgtcctgat  980

accgcagacc ccatcgcaga ggaattcctt caagcttggg catcgcaaga tt          1032

<210>2

<211>210

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>2

Met Ile Arg Ile Leu Leu Ala Asp Asp His Pro Val Val Arg Ala Gly

  1               5                  10                  15

Leu Ala Ser Leu Leu Val Ser Glu Asp Asp Phe Glu Ile Val Asp Met

             20                  25                  30

Val Gly Thr Pro Asp Asp Ala Val Ala Arg Ala Ala Glu Gly Gly Val

         35                 40                  45

Asp Val Val Leu Met Asp Leu Arg Phe Gly Asp Gln Pro Gly Ile Glu

    50                   55                  60

Val Ala Gly Gly Val Glu Ala Thr Arg Arg Ile Arg Ala Leu Asp Asn

 65                  70                  75                  80

Pro Pro Gln Val Leu Val Val Thr Asn Tyr Ser Thr Asp Gly Asp Val

                 85                  90                  95

Val Gly Ala Val Ser Ala Gly Ala Val Gly Tyr Leu Leu Lys Asp Ser

            100                 105                 110

Ser pro Glu Asp Leu Ile Ala Gly Val Arg Asp Ala Ala Arg Gly Glu

        115                 120                 125

Ser Val Leu Ser Lys Gln Val Ala Ser Lys Ile Met Gly Arg Met Asn

     130                 135         140

Asn Pro Met Thr Ala Leu Ser Ala Arg Glu Ile Glu Val Leu Ser Leu

145                 150                 155                 160

Val Ala Gln Gly Gln Ser Asn Arg Glu Ile Gly Lys Lys Leu Phe Leu

                165                 170                 175

Thr Glu Ala Thr Val Lys Ser His Met Gly His Val Phe Asn Lys Leu

            180                 185                 190

Asp Val Thr Ser Arg Thr Ala Ala Val Ala Glu Ala Arg Gln Arg Gly

        195                 200                 205

Ile Ile

    210

<210>3

<211>323

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<223>lysR3int

<400>3

gatgtggtgt tgatggatct gcgttttggt gatcaaccag gcatcgaggt cgccggcggg  60

gtagaggcaa cgcgtcgcat ccgtgcgctg gacaacccgc cacaggtact ggtggtgacc  120

aactactcca cagacggcga tgtggtgggc gcagtatctg ctggtgccgt ggggtatttg  180

ctcaaagata gctccccaga agatctcatt gccggtgttc gcgatgccgc gcggggagaa  240

tcagtgcttt caaagcaggt cgccagcaag atcatggggc ggatgaacaa ccccatgact  300

gctctcagtg ccagagaaat tga                                          323

Claims (11)

1.一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其编码lysR3基因，所述多核苷酸选自：

a)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列所组成的多肽的多核苷酸，

b)编码由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列所组成的多肽的多核苷酸，和

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，

所述多肽具有转录调节物LysR3的活性。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是在棒状细菌中能复制的重组DNA。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。

4.权利要求2的多核苷酸，其是能复制的DNA，所述多核苷酸选自：

(i)如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列。

5.权利要求2的多核苷酸，其由SEQ ID NO：1所示的核酸序列组成。

6.一种棒状细菌，其中lysR3基因被消除。

7.一种生产L-赖氨酸和L-缬氨酸的方法，该方法包括进行以下步骤：

(a)发酵生产所需L-赖氨酸和L-缬氨酸的细菌，该细菌中lysR3基因被消除，

(b)浓缩培养基或细菌细胞中的所需产物，及

(c)分离L-赖氨酸和L-缬氨酸。

8.权利要求7的方法，其中为生产L-赖氨酸，发酵的细菌中选自以下一组的一或多个基因被同时过表达：

8.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，

8.2编码烯醇化酶的eno基因，

8.3编码zwf基因产物的zwf基因，

8.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

8.5编码赖氨酸输出的lysE基因。

9.权利要求7的方法，其中选自以下一组的一或多个基因被同时弱化：

9.1编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，

9.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，

9.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因。

10.权利要求7-9中任一项权利要求的方法，其中使用的是谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)或乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的微生物。

11.一种杂交探针，其由权利要求1-4中任一项的多核苷酸序列的至少15个连续碱基组成。

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