PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN POR FERMENTACIÓN DE L-LISINA EMPLEANDO BACTERIAS CORINEFORMES
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención es un proceso para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular L-lisina, empleando bacterias corineformes en las cuales se encuentra debilitado el gen cspl. ESTADO DE LA TÉCNICA Los L-aminoácidos, en particular la L-lisina se emplean en alimentación de los animales, en la medicina humana y en la industria farmacéutica. Se sabe que estos aminoácidos se pueden producir mediante la fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia se trabaja constantemente en la mejora de los procesos de producción. Las mejoras de los procesos de producción pueden referirse a las medidas en lo referente a técnicas de fermentación, como por ejemplo la agitación y el suministro de oxígeno, o a la composición de los medios de cultivo, como por ejemplo la concentración del azúcar durante la fermentación, o a la elaboración a la forma de producto mediante, p.e., cromatografía de intercambio de iones, o a las propiedades de rendimiento intrínsecas del microorganismo mismo.
Ref. 124412 Para mejorar las características de rendimiento de estos microorganismos se emplean métodos de la mutagenesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra antimetabolitos como, por ejemplo, el análogo de la lisina S- (2-aminoetil) -cisteina, o auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora, y que producen aminoácidos. Desde hace algunos años se aplican asimismo métodos de la técnica de DNA recombinante para mejorar las cepas de las cepas de Corynebacteriun glutamicum que producen L-aminoácido, procediendo a amplificar genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigar el efecto sobre la producción de L-aminoácido. Los artículos que proporcionan una orientación a este respecto se encuentran entre otros en Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", en: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994)), Jetten and Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sah et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)). TAREA DE LA INVENCIÓN Los inventores se abocaron a la tarea de proporcionar nuevos fundamentos para mejores procesos en la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular L-lisina, con bacterias corineformes. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los L-aminoácidos, en particular la L-lisina se emplean en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimenticia y muy particularmente en alimentación de animales. Por consiguiente existe un interés general en proporcionar nuevos procesos mejorados para la producción de aminoácidos, en particular L-lisina. Cuando a continuación se mencionan L-lisina o lisina, no solo nos referimos a la base, sino que también nos referimos a las sales, como p.e. lisina-monoclorhidrato o lisina sulfato. El objeto de la invención es un proceso para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular L-lisina, caracterizado porque se emplean bacterias corineformes en las que al menos la secuencia de nucleótido (gen cspl) que codifica para el producto génico Cspl se debilita, en particular se expresa a bajo nivel, se acumula el producto deseado en el medio o en las células y se aisla el aminoácido. Las cepas aplicadas de preferencia producen aminoácidos, en particular L-lisina, ya antes del debil tamiento del gen cspl.
Las modalidades preferidas se encuentran en las reivindicaciones . El concepto "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o supresión de la actividad intracelular de una o varias enzimas (proteinas) en un microorganismo que son codificadas por el DNA correspondiente (en este caso el gen cspl), utilizando por ejemplo un promotor débil o un gen o alelo que codifica para una enzima correspondiente de baja actividad o bien desactiva al gen o a la enzima (proteina) correspondiente y eventualmente combina estas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir aminoácidos, en particular L-lisina, a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, fécula, celulosa o a partir de glicerina y etanol. Se puede tratar de representantes de bacterias corineformes, en particular de la especie Corynebacterium. En la especie Corynebacterium hay que mencionar en particular la clase Corynebacterium glutamicum, la cual es conocida en el ámbito especializado por su capacidad de producir L-aminoácidos. Las cepas adecuadas de la especie Corynebacterium, en particular de la clase Corynebacterium glutanicum son en particular las cepas conocidas de tipo salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetocidophilum ATCC13870 CDrynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 B evibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas que producen L-aminoácidos, producidos a partir de aquellas, como, por ejemplo, las cepas que producen L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM 5714. Se descubrió que las bacterias corineformes producen de manera mejorada los L-aminoácidos, en particular la L-lisina, después del debilitamiento del gen cspl. El gen cspl codifica para la proteina PS1, para la cual hasta la fecha no se habia podido comprobar una actividad enzimática. La secuencia de nucleótido del gen cspl fué descrita por Joliff et al. (Molecular Microbiology 1992 Aug; 6 (16) :2349-62) . Esta disponible al público en el banco de datos de secuencias de nucleótidos del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) bajo el número de acceso g40486. El gen cspl descrito en las partes del texto indicadas se puede emplear de acuerdo a la invención. Se pueden emplear además, alelos del gen cspl que resultan de la degeneración del código genético o por mutaciones de orientación (sense mutations) neutrales con respecto a la función. Para lograr un debilitamiento se pueden disminuir o suprimir, ya sea la expresión del gen cspl o bien las propiedades catalíticas del producto génico. En dado caso se combinan ambas medidas. La expresión del gen se puede disminuir mediante una forma adecuada de llevar el cultivo o median.te modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica. Las estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión de ribsomas, el codón de iniciación y los terminadores. Los datos con respecto a esto los encuentra en experto, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 ¡1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) y en libros de texto conocidos de la genética y biología molecular, como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Moleculare 5 Genetik", 6. edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) . Las mutaciones que conducen a una modificación o bién disminución de las propiedades catalíticas de las
proteinas enzimáticas son conocidas por el estado de la técnica; como ejemplos mencionaremos los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) y M?ckel ("Die
Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebundg der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994). Las exposiciones sumari zadas se pueden recabar de libros de texto conocidos
de la genética y la biología molecular, como por ejemplo el de Hage ann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) . Como mutaciones entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y deleciones. En
función del efecto del intercambio de aminoácido sobre la
MMÜiilBttilíiiÉtt actividad enzimática se habla de mutaciones de orientación contraria (missense mutations) o mutaciones sin orientación (nonsense mutations) . Las inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones por cambio en el marco de lectura (frame shift mutations), en cuya secuencia se insertan aminoácidos erróneos o se trunca prematuramente la traslación. Las deleciones de varios codones típicamente conducen a una pérdida total de la actividad enzimática. Las instrucciones para producir este tipo de mutaciones pertenecen al estado de la técnica y se pueden recabar de libros de texto conocidos de la genética y la biología molecular, como por ejemplo el libro de texto de Kníppers ("Moleculare Genetik", 6. edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) . Un ejemplo de un gen cspl mutado es el alelo ?cspl contenido en el plásmido pKldmobsacB?cspl (figura 1) . El alelo ?cspl únicamente contiene las secuencias del flanco 5' y 3' del gen cspl; falta una sección de 1690 bp de longitud de la región de codificación (deleción) . Este alelo ?cspl se puede insertar en bacterias corineformes mediante mutagenésis de integración. Para este propósito se recurre al plásmido pKldmobsacB?cspl previamente indicado, el cual no se puede replicar en C. glutamicum. Después de la transformación y la recombinación homologa mediante un primer evento de "entrecruzamiento" que produce la integración, y de un segundo evento de "entrecruzamiento" que produce la escisión en el gen cspl se obtiene la inserción de la deleción ?cspl y se logra una pérdida total de la función en la cepa respectiva. Las instrucciones y explicaciones con respecto a la mutagénesis por integración se encuentran, por ejemplo en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9,84-87 (1991)) o Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)). Un ejemplo de una cepa de bacterias corineformes con gen cspl debilitado que producen aminoácido es el productor de lisina Corynebacterium glutamicum R167?cspl. Para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina puede ser adicionalmente conveniente, además de debilitar el gen cspl, reforzar una o varias ensimas de la respectiva ruta de la biosíntesis, de la glicólisis, de la anaplerótica, del ciclo de ácido cítrico o de la exportación del aminoácido. Así, por ejemplo, para la producción de L-lisina se puede sobreexpresar • simultáneamente el gen dapA que codifica para la síntesis de dihidrodipicolinato (EP-B 0 197 335), y/o • simultáneamente el gen gap que codifica para la gliceraldehid-3-fosfato dehidrogenasa (Eik anns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), o
• simultáneamente el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992), Journal of
Bacteriology 174: 6076-6086), o • simultáneamente el gen mqo que codifica para la malato: quinona oxidorreductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395 - 403 (1998)), o • simultáneamente el gen lysE que codifica para la exportación de lisina (DE-A-195 48 222). Para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina, puede ser además conveniente debilitar simultáneamente • el gen pck que codifica para la fosfoenolpiruvato- carboxicinasa (DE 199 50 409.1, DSM 13047) y/o • el gen pgi que codifica para la glucosa-6-fosfato isomerasa (US 09/396,478, DSM 12969). Para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina puede ser finalmente conveniente, además de debilitar el gen cspl, suprimir reacciones secundarias indesea.bles (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982) . El medio de cultivo que se emplea debe satisfacer de manera adecuada a los requisitos de las cepas respectivas. Las descripciones de medios de cultivo de diversos organismos se encuentran contenidas en el manual "Manual of Methode for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., E.U.A., 1981). Como fuente de carbono se pueden emplear azúcar y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, fécula y celulosa, aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linólico, alcoholes como, por ejemplo, glicerina y etanol, y ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias se pueden usar en forma individual o como mezcla. Como fuente de nitrógeno se pueden emplear compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maíz empapado, harina de frijol de soya y urea, o compuestos inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden emplear en forma individual o como mezclas. Como fuente de fósforo se pueden emplear ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato dipotásico, o las sales correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener además, sales de metales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, las cuales son- necesarias para el crecimiento. Finalmente es posible, adicionalmente a las sustancias precedentemente mencionadas, aplicar sustancias esenciales para el crecimiento como aminoácidos y vitaminas. Al medio de cultivo se le pueden agregar además etapas preliminares adecuadas. Las sustancias de aplicación mencionadas se pueden adicionar al cultivo en forma de una preparación única o ser alimentadas en forma adecuada durante el cultivo. Para el control del pH del cultivo se aplican en forma adecuada compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para el control de la espumación se pueden aplicar agentes antiespumantes como por ejemplo éster poliglicólico de ácido graso. Para mantener la estabilidad de los plásmidos se le pueden adicionar al medio sustancias adecuadas que actúan selectivamente como, por ejemplo, los antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo normalmente es de 20°C a 45°C, y de preferencia de 25°C a 40°C. Se prosigue durante tanto tiempo con el cultivo hasta que se forma un máximo del producto deseado. Esta meta se alcanza normalmente dentro de 10 horas a 160 horas. Los métodos para determinar los L-aminoácidos son conocidos por el estado de la técnica. El análisis se puede efectuar como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), mediante cromatografía de intercambio de aniones con subsecuente derivación de ninhidrina, o se puede efectuar mediante HPLC de fase invertida, tal como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). El siguiente microorganismo se depositó en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de conformidad con el tratado de Budapest: • Escherichia coli cepa S17-1 /pK18mobsacB?cspl como DSM 1304d Ejemplos La presente invención se explica con mas detalle a continuación en base a los siguientes ejemplos de realización. Ejemplo 1 Producción de un vector de deleción para la mutagénesis de deleción del gen cspl A partir de la cepa ATCC 13032 se aisló DNA cromosómico según el método de Eikmann et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). La secuencia de nucleótido del gen cspl para C. glutamicum esta disponible en el banco de datos de secuencias de nucleótidos del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, E.U.A.) bajo el número de acceso g40486. En base a la secuencia conocida se eligieron los oligonucleótidos siguientes para la reacción en cadena de polimerasa: cspl-10: 5' GAT CTA G(GA TC)C CGA TGA GCG CGT CCA TGT GT 3' cspl-11 : 5' GAT CTA G(GA TC)C TCG ACC TTG CGG TGC TGC TT 3' cspl-del: 5' GGA ATA CGT AGC CAC CTT CGG TCC CGA AAG TTC CCC GCT T 3' Los cebadores descritos fueron sintetizados por la compañía MWG Biotech (Ebersberg, Alemania), y la reacción PCR se llevó a cabo según el método de PCR de Karreman (BioTechniques 24: 736-742, 1998) con polimerasa Pwo de la compañía Boehringer. Los cebadores cspl-10 y cspl-11 contienen insertado en cada caso un sitio de corte para la enzima de restricción BamHl, los cuales en la descripción se indican entre paréntesis. Con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa se amplificó y aisló un fragmento con tamaño de aproximadamente 0.9 kb, el cual soporta una deleción con tamaño de 1690 bp del gen cspl. El fragmento de DNA amplificado se cortó con la enzima de restricción BamHl y se purificó con un gel de agarosa (0,8%). Asimismo se cortó el plásmido pKldmobsacB (Jáger et al., Journal of Bacteriology, 1: 784-791 (1992)) con la enzima de restricción BamHl. El plésmido pKldmobsacB y el fjragmento de la PCR se ligaron. A continuación la cepa S17-1 de E. coli (Simón et al., 1993, Bio/Technology 1: 784-791) se electroporó con la preparación de ligamiento
(Hanahan, en: DNA cloning. A practical approach. Vol. I.
IRL-Press, Oxford, Washington DC, E.U.A., 1985). La selección de células portadoras de plásmido se efectuó extendiendo la preparación transformada sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) complementado con 25 mg/l de canamicina. El DNA plásmido se aisló de un transformado con el auxilio del estuche (Kit) QIAprep Spin Miniprep de la compañía Qiagen, y se comprobó mediante restricción con la enzima de restricción BamHl y subsecuente electroforésis de gel de agarosa (0.8%). El plásmido se designó pKldmobsacB?cspl. La cepa se designó E. coli S17-1 /pKlßmobsacB?cspl, y se encuentra depositada con el número DSM 1304d en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) . Ejemplo 2 Mutagénesis de deleción del gen cspl en el tipo salvaje R167 de C. glutamicum El vector pKldmobsacB?cspl mencionado en el ejemplo 2 se electroporó en Corynebacterium glutamicum R167
(Liebl et al. (1989) FEMS Microbiological Letters 65: 299- 304) ce acuerdo al método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)). En el caso de la cepa R167 se trata de una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum de restricción deficiente. El vector pKldmobsacB?cspl no puede replicar de manera independíente en C. glutamicum, y solo se conserva en la célula si se ha integrado al cromosoma. La selección de clones con pKldmobsacB?cspl integrado se llevó a cabo extendiendo la preparación de la electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual.. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 19d9) complementado con 15 mg/l de canamicina. Los clones acrecidos se untaron sobre placas de agar LB con 25 ml/1 de canamicina, y se incubaron durante 16 horas a 33°C. Para lograr la excisión del plásmido conjuntamente con la copia cromosómica completa del gen cspl, a continuación los clones se cultivaron sobre agar LB con 10 de sacarosa. El plásmido pKldmobsacB contiene una copia del gen sacB, el cual convierte la sacarosa en la levancsacarosa tóxica para C. glutamicum. Por consiguiente, sobre agar LB con sacarosa únicamente crecen aquellos clones en los cuales el pKldmobsacB?cspl integrado se ha escindido nuevamente. Con la escisión se puede escindir conjuntamente con el plásmido, ya sea la copia cromosómica completa del gen cspl, o la copia incompleta con la deleción interna. Para comprobar que en el cromosoma permaneció la copia incompleta de cspl, el fragmento pKldmobsacB?cspl de plásmido se marcó con el estuche (Kit) de hibridación Dig de la compañía Boehringer según el método "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" de la compañía Boehringer Mannheim GmbH
(Mannhaim, Alemania, 1993). El DNA cromosómico de un mutante de deleción potencial se aisló según el método de Eikman s et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) y se cortó an cada caso con la enzima de restricción EcoRI . Los fragmentos resultantes se separaron mediante electroforésis de gel de agarosa, y se hibridaron a 68°C con el estuche (Kit) de hibridación Dig de la compañía Boehringer. En la cepa de control se obtuvieron dos fragmentos hibridizantes de aproximadamente 6500 bp y aproximadamente 4000 bp, en tanto que en el mutante se obtuvieron dos fragmentos hibridizantes de aproximadamente 6500 bp y aproximadamente 3200 bp. Con ello se pudo demostrar que la cepa R167 ha perdido su copia completa del gen cspl y que en lugar de ello ya únicamente dispone de la copia incompleta con la deleción de aproximadamente 1690 bp. La cepa se designó como C. glutamicum R167?cspl. Ejemplo 3 Producción de lisina La cepa R167?cspl de C. glutamicum obtenida en el ejemplo 2 se cultivó en un medio de cultivo adecuado para la producción de lisina, y el contenido de lisina se determinó en el sobrenadante del cultivo. Para este propósito primero se incubó la cepa durante 24 horas a 33°C sobre placa de agar. A partir de este cultivo sobre placa de agar se inoculó un cultivo inicial (10 ml de medio en el matraz de Erlenmeyer de 100 ml) . Como medio para el precultivo se empleó el medio puro CglII . El cultivo inicial se incubó durante 4d horas a 33°C a 240 rpm en el agitador. Con este cultivo inicial se inoculó un cultivo principal, de manera que la OD inicial (660 nm) del cultivo principal fué de 0.1 OD. Para el cultivo principal se empleó el medio MM. Medio MM CSL (licor de maiz empapado) 5 g/1
MOPS 20 g/1
Glucosa (tratada en autoclave por separado) 50 g/1 Sales: (NH4)2S04) 25 g/1
KH2P04 0.1 g/1
MgS04 * 7 H20 1.0 g/1
CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 • 10 mg/l
MnS04 * H20 5.0 mg/l
Biotina (filtrada a esterilidad) 0.3 mg/l
Tiami a * HCl (filtrada a esterilidad) 0.2 mg/l
CaC03 25 g/1 CSL, MOPS y la solución salina se ajustaron a pH
7 con agua amoniacal y se trataron en autoclave. Seguicamente se adicionaron las soluciones de sustrato y vitaminas, así como el CaC03 tratado en seco en autoclave. El cultivo se efectuó en 10 ml de volumen en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con serpentines. El cultivo se efectuó a 33°C y d0% de humedad ambiente. Después de 48 horas se determinó la OD a una longitud de medición de onda de 660 nm con el Biomek 1000 (de la compañía Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos de la compañía Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) mediante cromatografía de intercambio de iones y derivación postcolumnar con detección por ninhidrina. En la tabla 1 se representa el resultado de la prueba, Tabla 1
Se anexan las siguientes figuras: Figura 1: Mapa del plásmido pKldmobsacB?cspl Las abreviaciones y designaciones que se emplean tienen el significado siguiente. Las indicaciones de longitud dberán considerarse como valores aproximados. sacB: gen sacB oriV: Origen V de replicación KmR: Resistencia a la canamicina BamHl: Sitio de corte de la enzima de restricción BamHl cspl' : Fragmento incompleto del gen cspl con deleción interna de 1690 bp Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: