RU2006102024A - Мутанты синтетазы ацетооксикислот, устойчивые к обратной связи - Google Patents

Claims (11)

1. Выделенная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, который обладает активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS), выбранная из ряда, включающего

а) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ. ID No: 1 или SEQ. ID NO:3;

б) нуклеотидную последовательность, которая содержит в положениях 21 и 22 триплет оснований, кодирующий Asp и Phe, соответственно;

в) нуклеотидную последовательность, гибридизирующуюся в строгих условиях с нуклеотидными последовательностями, указанными в а) или б);

г) нуклеотидную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 70% нуклеотидной последовательности, указанной в а) или б);

д) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, гомологичный на аминокислотном уровне по меньшей мере на 80% полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, указанной в а) или б);

е) нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который обладает улучшенной активностью и/или селективностью, и/или стабильностью по сравнению с полипептидом, кодируемом нуклеотидной последовательностью, указанной в а) или б), которую получают путем

I) мутагенеза нуклеиновой кислоты, указанной в а) или б),

II) встраивания путем лигирования нуклеотидной последовательности, которую можно получать как указано в I), в пригодный вектор с последующей трансформацией пригодной экспрессионной системы, и

III) экспрессии и обнаружения имеющего решающее значение полипептида, который обладает улучшенной активностью и/или селективностью, и/или стабильностью;

ж) полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 15 последовательных оснований нуклеотидных последовательностей, указанных в а)-е).

2. Полипептид, выбранный из группы, включающей

а) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью по п.1;

б) полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 2 или SEQ. ID NO: 4;

в) полипептид, гомологичный по меньшей мере на 84% полипептиду, который имеет последовательность SEQ. ID NO: 2 или SEQ: ID NO. 4, и у которого активность и/или селективность, и/или стабильность не является существенно более низкой по сравнению с полипептидом, имеющим последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 2 или SEQ. ID NO: 4.

3. Плазмиды, векторы, микроорганизмы, содержащие одну или несколько нуклеотидных последовательностей по п.1.

4. Праймеры для получения с помощью ПЦР или гибридизационные зонды для обнаружения нуклеотидных последовательностей по п.1.

5. Способ создания улучшенных рекомбинантных полипептидов, обладающих активностью синтетазы ацетооксикислот (AHAS), на основе нуклеотидных последовательностей по п.1, заключающийся в том, что

а) нуклеотидные последовательности подвергают мутагенезу;

б) нуклеотидные последовательности, полученные согласно а), клонируют в пригодном векторе и переносят в пригодную экспрессионную систему; и

в) обнаруживают и выделяют образовавшиеся полипептиды, обладающие улучшенной активностью и/или селективностью, и/или стабильностью.

6. Рекомбинантные полипептиды или кодирующие их нуклеотидные последовательности, которые можно получать согласно способу по п.5.

7. Применение полипептидов по п.2 или 6 для получения энантиомерно обогащенных аминокислот с разветвленной цепью.

8. Применение нуклеотидных последовательностей по п.1 или 6 для получения микроорганизма, продуцирующего аминокислоты с разветвленной цепью.

9. Способ получения аминокислоты с разветвленной цепью с использованием полипептида по п.2.

10. Вектор рЕСКА или pECKA/ilvBNC.

11. Микроорганизмы DSM15652, DSM15651, DSM15650.