CN1836044A

CN1836044A - 头孢菌素c酰基转移酶突变体及用其制备7－aca的方法

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Publication number: CN1836044A
Application number: CNA2004800232056A
Authority: CN
Inventors: Y·C·辛; J·Yj·曾; K·H·容; M·R·帕克; Y·金
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 2003-08-11
Filing date: 2004-08-10
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2024-08-10
Also published as: ES2338118T3; EP1656450B1; KR100530299B1; SI1656450T2; CN1836044B; PL1656450T5; PL1656450T3; WO2005014821A1; EP1656450A1; JP2007502108A; KR20050017832A; ATE452186T1; EP1656450A4; US20070207519A1; ES2338118T5; DE602004024686D1; US7592168B2; EP1656450B2; SI1656450T1

Abstract

本发明的CPC酰基转移酶突变体对CPC的反应性和比活性均有提高，其能够有效用于由CPC经一步酶法直接制备7－ACA。

Description

头孢菌素C酰基转移酶突变体及用其制备7-ACA的方法

发明领域

本发明涉及假单胞菌属(Pseudomonas sp.)SE83来源的头孢菌素C(CPC)酰基转移酶突变体多肽；编码该多肽的基因；含有该基因的表达载体；转染该表达载体的微生物；制备所述CPC酰基转移酶突变体的方法；以及利用该CPC酰基转移酶突变体制备7-ACA的方法。

发明背景

头孢菌素C(下文称为“CPC”)是由丝状真菌(如产黄头孢(Acremonium chrysogenum))产生的β-内酰胺类抗生素中的一员℃PC能够阻断细胞壁的合成，具有抗革兰氏阴性菌的抗生素活性；但其活性不足以抑制革兰氏阴性菌的生长。因此，CPC主要用于制备生产半合成头孢菌素类抗生素的中间产物。特别是，去除CPC上的D-α-氨基己二酰侧链而制备的7-氨基头孢烷酸(7-aminoacephalosporanic，下文称为“7-ACA”)，已被用于生产大部分半合成头孢菌素类抗生素，后者占据了全世界抗生素市场超过40％的份额。

有两种已知的由CPC制备7-ACA的方法，化学和酶方法。由CPC合成7-ACA的化学法使用甲硅烷基保护基团保护氨基和羧基，得率可达90％以上。然而，这一方法复杂、不经济且不利于环境。因而，化学法已被酶法合成7-ACA所取代，后者是一种环境可接受的方法。

目前市场上广泛采用的两步酶合成法包括以下两步：通过D-氨基酸氧化酶(下文称为“DAO”)将CPC转变为戊二基-7-氨基头孢烷酸(下文称为“GL-7-ACA”)(第一步)以及通过GL-7-ACA酰基转移酶将GL-7-ACA转变为7-ACA(第二步)(见图1)。但是，由于第一步产生的过氧化氢与DAO底物或反应产物发生反应，产生了大量的副产物，这一方法得到的7-ACA得率低于化学法。因此，需要发展一种有效的一步酶合成法，通过使用改良的CPC酰基转移酶(该酶能够破坏CPC第7位上的酰胺键，并去除其氨基己二酰侧链)，直接将CPC转化为7-ACA。

已在若干微生物中发现了对于CPC有活性的CPC酰基转移酶(亦可与CPC酰胺酶或CPC酰胺水解酶合称)，这些微生物例如假单胞菌属、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)、粘性节杆菌(Arthrobacter viscous)等。而有些CPC酰基转移酶的基因已经被克隆并测序：假单胞菌属SE83来源的acyII基因(Matsuda等，J.Bacteriol.169：5821-5829，1987)；假单胞菌属N176来源的CPC酰基转移酶基因(USP5,192,678)；假单胞菌属V22来源的CPC酰基转移酶基因(Aramori等，J.Ferment.Bioeng.72：232-243，1991)；泡囊假单胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965来源的CPC酰胺水解酶基因(USP 6,297,032)；巨大芽胞杆菌来源的CPC酰胺酶基因(USP 5,229,274)；；以及假单胞菌属130来源的CPC酰基转移酶基因(Li等，Eur.J.Biochem.262：713-719，1999)。然而，这些CPC酰基转移酶基因不具备足够的水解活性以裂解CPC第7位上的酰胺键，因此，不适用于由CPC制备7-ACA的一步酶法。

一些基因工程研究已尝试提高CPC酰基转移酶对CPC的酶活性。例如，Fujisawa Pharmaceutical Co.(Japan)从假单胞菌属N176中获得了一种CPC酰基转移酶突变体，具有比野生型高约2.5倍的CPC比活性(USP 5,804,429；USP 5,336,613，日本专利出版号No.1995-222587；日本专利出版号No.1996-098686；以及日本专利出版号No.1996-205864)。然而，这样的突变体对CPC仍然不具备从CPC直接生产7-ACA的足够比活性，其还受到7-ACA的终产物抑制。因此，它不能实际应用于将CPC直接转化为7-ACA。

为了研制出能用于一步酶法制备7-ACA的CPC酰基转移酶突变体，本发明的发明者们研究了GL-7-ACA酰基转移酶的三级结构，他不曾首次鉴定了脱辅基酶(Kim等，Structure 8：1059-1068，2000)和与假单胞菌属KAC-1来源的GL-7-ACA酰基转移酶(Kim等，Biotech.Lett.23：1067-1071，2001；此下称为“CAD”)相关的CAD-GL-7-ACA复合物(Kim等，Chem.Biol.8：1253-1264，2001；Kim等，J.Biol.Chem.276：48376-48381，2001)的三级结构(见图2)。这两种CAD二元复合物的结构提示，GL-7-ACA酰基转移酶和底物间最广泛的相互作用发生在GL-7-ACA的戊二酰部分。因此，提示底物侧链及其结合口袋间发生的亲水与疏水反应是GL-7-ACA酰基转移酶识别底物的决定因素。当把结合底物亲和力特别低的CPC化学结构与GL-7-ACA进行比较时，它们具有相同的β-内酰胺结构，但在侧链上有所差异(见图3)。即与戊二酸组成的GL-7-ACA的侧链不同，CPC的侧链为D-α-氨基己二酸。因而CAD-CPC复合物的结构模拟提示，与D-α-氨基己二酸的侧链末端的羧基和D-型氨基基团相比，GL-7-ACA的戊二酸侧链及与结合相关的CAD关键残基在空间上更拥挤(见图4)。因此，认为若能保证CAD的底物结合位点上有可容纳CPC侧链(内含比GL-7-ACA侧链和D-氨基基团更大的碳主链)的足够空间，那么就可以提高GL-7-ACA对CPC的比活性。据此，对CAD的“酶-底物”复合物的结构分析，可能提供开发CPC酰基转移酶突变体的重要信息，该突变体通过在假单胞菌属来源的底物结合亲和力相对较低的GL-7-ACA酰基转移酶的活性位点引入突变，增强CPC比活性。

因此，本发明发明者致力于开发一种CPC酰基转移酶突变体，该突变体对CPC的反应性增强，可以用于由CPC制备7-ACA的一步酶法。

发明概述

据此，本发明的目的之一在于，提供CPC酰基转移酶突变体，该突变体对CPC的反应性增强，可以方便地用于将CPC转化7-ACA或其功能等效的衍生物。

本发明的另一目的在于提供编码所述CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物的核苷酸序列。

本发明的又一目的在于提供含有所述核苷酸序列的表达载体，以及转染该核苷酸序列或该表达载体的微生物。

本发明的又一目的在于提供利用所述转染微生物制备CPC酰基转移酶突变体的方法。

本发明的又一目的在于提供利用所述CPC酰基转移酶突变体、含有该CPC酰基转移酶突变体或经加工的CPC酰基转移酶突变体的组合物，从CPC制备7-ACA或其盐的方法。

根据本发明的一方面，提供CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于选自以下的至少一个氨基酸被另一氨基酸所取代，包括SEQ ID NO：4的CPC酰基转移酶α-亚基中的Val121α、Gly139α和Phe169α，以及SEQ ID NO：5的CPC酰基转移酶β-亚基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β。

在本发明的CPC酰基转移酶突变体中，优选下列突变体，其中：

Val121α为丙氨酸所取代；

Gly139α为丝氨酸所取代；

Phe169α为酪氨酸所取代；

Met31β为亮氨酸所取代；

Phe58β为丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代；

His70β为丝氨酸或亮氨酸所取代；

Ile75β为苏氨酸所取代；

Ile176β为缬氨酸所取代；或

Ser471β为半胱氨酸所取代。

附图简述

本发明的上述及其他目的及特征，在下面结合附图对该发明的描述中显而易见，这些附图分别显示了：

图1：由CPC制备7-ACA的一步及两步酶合成法的图示程序；

图2：假单胞菌属KAC-1来源的CAD-GL-7-ACA复合物的三级结构(A)，以及邻近其活性位点的结合残基的概要图解(B)；

图3：假单胞菌属KAC-1来源的CAD与GL-7-ACA的结合模式；

图4：假单胞菌属KAC-1来源的CAD-CPC复合物的模型；

图5：本发明CPC酰基转移酶突变体制备程序的图示表示；

图6：比较野生型CPC酰基转移酶(-●-，Sem)、F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重CPC酰基转移酶突变体(H70)，以及F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(-○-，mI176)中7-ACA的终产物抑制作用；

图7：比较F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重CPC酰基转移酶突变体(-◇-，H70)、V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(-○-，#213)、G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(-■-，#120)，以及V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体(-●-，TnS5)的CPC反应性；

图8：比较V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(--，mF58)、V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(-■-)、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体(-○-，TnS5αβ)、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体(--)，及V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体(-●-，TnS5)的CPC反应性；

图9：比较V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重CPC酰基转移酶突变体(--，F169)、V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(--，#59)、V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC五重CPC酰基转移酶突变体(-■-，#76)、V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体(-○-，mF58)，以及V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体(-●-，TnS5αβ)的CPC反应性；

图10a和10b：比较下列突变体中观察到的CPC反应性(A)和7-ACA的终产物抑制作用(B)：V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC酰基转移酶突变体(--，S12)、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体(-●-，TnS5αβ)，以及V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC六重CPC酰基转移酶突变体(-○-，#76)；

图11a至11c：假单胞菌属SE83来源的野生型CPC酰基转移酶分子量；

11a：SDS-PAGE(M：分子大小标记物；1：无细胞提取物；2：纯化酶)

11b：非变性PAGE(M：分子大小标记物；1：纯化酶)

11c：MALDI-TOF质谱分析；

图12：从含有pE729-TnS5质粒的E.coli BL21(DE3)培养物溶液中分离的粗制酶的凝胶电泳和考马斯亮蓝染色结果；

M：标准大小标记物， 1：0％乳糖，培养48小时；

2：0.02％乳糖，培养48小时； 3：0.2％乳糖，培养48小时；

4：2％乳糖，培养4 8小时； 5：2％乳糖，培养72小时。

图13：观察的野生型CPC酰基转移酶、TnS5及S12酰基转移酶突变体将CPC转化为7-ACA的转化率比较；

图14：测定通过本发明S12 CPC酰基转移酶突变体的作用下从CPC产生的7-ACA的HPLC分析结果。

发明详述

此处使用的术语“对CPC的反应性增强”是指，对CPC的比活性增强和/或7-ACA的终产物抑制作用减弱。

此处使用的术语“功能等效衍生物”是指保留与本发明CPC酰基转移酶突变体相同功能特性的CPC酰基转移酶衍生物。即功能等效衍生物包括所有可能的变体，如天然、合成或重组多肽，其可能经过修饰(即通过序列突变、缺失、插入、替代、一个或几个核苷酸的倒置或其组合)并能够行使CPC酰基转移酶突变体的功能。

此处使用的术语“经加工的CPC酰基转移酶突变体”是指，固定化而不仅仅是游离的CPC酰基转移酶突变体。可以通过常规方法(如共价键、离子键、亲水键、物理键以及微囊化等)将CPC酰基转移酶突变体固定在本领域中通常使用的常规载体中。此外，可以通过固定化整个细胞的方法固定生产CPC酰基转移酶突变体的微生物，从而制备经加工的CPC酰基转移酶突变体而不需进一步纯化。

此处使用的术语“GL-7-ACA酰基转移酶”一般是指能够将GL-7-ACA转化为7-ACA的酶。此处使用的术语“CPC酰基转移酶”是指在GL-7-ACA酰基转移酶中对CPC具有比活性的酶，其能够通过裂解CPC第7位上的酰胺键去除氨基己二酰侧链而直接从CPC产生7-ACA。此处使用的术语“CAD”是指假单胞菌属KAC-1来源的GL-7-ACA酰基转移酶。

本发明提供了CPC酰基转移酶突变体的氨基酸序列、编码该CPC酰基转移酶突变体及其功能等效衍生物的核苷酸序列，该突变体具有对假单胞菌属SE83来源的CPC及其功能等效衍生物增强的反应性。

假单胞菌属SE83来源的CPC酰基转移酶基因(“acyII基因”)已被用于开发本发明CPC酰基转移酶突变体的起始基因，其中acyII基因是使用DNA合成仪根据Matsuda等鉴定的CPC酰基转移酶的核苷酸序列(J.Bacteriol.169：5821-5826，1987；GenBank M18278)新合成的。为了提高使用E.coli进行蛋白质合成的效率，对已知的AcyII氨基酸序列加以修饰，使之与E.coli介导的蛋白质合成中优选使用的密码子相容。例如，已知的acyII基因编码的氨基酸序列中，苯丙氨酸的唯一密码子为TTC，而精氨酸的密码子主要是CGC或CGG，因此，本发明中合成的由acyII基因编码的氨基酸序列中，苯丙氨酸及精氨酸分别使用TTT和CGT密码子。本发明中合成的acyII基因由具有SEQ ID NO：1核苷酸序列的2,325个碱基对组成。在SEQ ID NO：1中，对应于碱基数1至2,322(2,323-2,325：终止密码子)的开放阅读框架是一个编码全长蛋白质的区域，SEQ ID NO：2中显示了预测由其产生的氨基酸序列，其由774个氨基酸序列组成。本发明中合成的acyII基因所编码的SEQ ID NO：2氨基酸序列与已知的CPC酰基转移酶相同，但SEQ ID NO：1核苷酸序列中18％的碱基对与存在的CPC酰基转移酶基因中的不同。

大多数GL-7-ACA酰基转移酶(或CPC酰基转移酶)基因推绎的氨基酸序列依次由α-亚基、间隔肽和β-亚基组成。假单胞菌属SE83来源的野生型CPC酰基转移酶以无活性单链多肽的形式产生，该单多肽链在宿主细胞中经过转录和翻译后大小约为84kDa。随后，在SEQ ID NO：2氨基酸序列的第230位与231位氨基酸间以及第239位与240位氨基酸间进行两次自消化，从而去除9个氨基酸组成的间隔肽，并分成25kDa的α-亚基和约58kDa的β-亚基。上述分开的α-亚基之一与β-亚基之一通过疏水作用耦连，生成具有酰基转移酶活性的约83kDa的二聚体。众所周知，在原核生物的蛋白质合成中，需要甲硫氨酸作为起始密码子开始翻译，此第一个氨基酸在翻译后会被去除。因此，本发明使用的野生型CPC酰基转移酶的活性形式包含由229个氨基酸组成的α-亚基(SEQ ID NO：4)和由535个氨基酸组成的β-亚基(SEQ ID NO：5)。

如果在相应基因的转录和翻译后，宿主细胞中并未发生恰当的自消化，GL-7-ACA酰基转移酶(或CPC酰基转移酶)就会以非活性多肽的形式产生。因此，宿主细胞中的自消化效率对于获得活性蛋白质具有重要作用。也已有报道称有若干原因可能造成自消化效率的降低，如宿主细胞内过量产生酰基转移酶，或间隔肽或成熟蛋白质中某一特定氨基酸的突变导致产生无活性的蛋白质(Li等，Eur.J.Biochem.262：713-719，1999；Kim等，J.Biol.Chem.276：48376-48381，2001)。因此，希望改善CPC酰基转移酶的反应特性时，必须适当地关注为提高酶反应性在某一特定氨基酸位点引入的突变是否会影响自消化的效率的问题。即，由于CPC酰基转移酶基因转录/翻译后在宿主细胞中产生的非活性多肽自消化效率的改变与活性CPC的产率直接相关，在不清楚纯化的活性CPC酰基转移酶突变体的反应性特征的情况下，选择一种对CPC反应性提高的CPC酰基转移酶突变体是困难的。为解决这一问题，本发明的发明者设计了一种CPC酰基转移酶基因，该基因含有基于SEQ ID NO：1核苷酸序列的SEQ ID NO：3核苷酸序列，其通过在翻译中独立合成α-和β-亚基而不需经过自消化的步骤就能够产生活性的CPC酰基转移酶。除了编码对应于SEQ ID NO：2中第231位至239位区域的间隔肽的核苷酸序列有所改变外，由SEQ ID NO：3的CPC酰基转移酶基因编码的氨基酸序列与CPC酰基转移酶基因acyII编码的SEQ ID NO：2序列相同。即在编码α-亚基最后一个氨基酸的甘氨酸密码子后插入了一个翻译终止子并在编码β-亚基的第一个氨基酸的丝氨酸密码子前面插入了一段核苷酸序列，其中依次含有随机核苷酸序列(其内含一个限制性酶切位点)、编码核糖体结合位点的核苷酸序列-AGGA-、另一个随机核苷酸序列，以及翻译起始密码子(甲硫氨酸)。通过使编码α-亚基和β-亚基的核苷酸序列各自独立地保持其自身结构基因，本发明的发明者们为构建这一CPC酰基转移酶基因设计了一个操纵子结构。具有SEQID NO：3核苷酸序列，同时又独立表达α-亚基和β-亚基的CPC酰基转移酶基因被命名为sem。因此，可以预期如果发明的CPC酰基转移酶基因sem被插入合适的表达载体并转染至宿主细胞，α-亚基和β-亚基将在宿主细胞中被独立合成并相互耦连，从而得到活性CPC酰基转移酶的二聚体形式。将从含有SEQ ID NO：3的sem基因的E.coli转化体纯化的CPC酰基转移酶和从含有SEQ ID NO：1的acyII基因的E.coli转化体纯化酶的特性进行比较，显示sem来源CPC酰基转移酶的特性(如分子量、比活性、底物特异性、最适反应温度和pH)与acyII来源的CPC酰基转移酶相同。因此，分开表达α-亚基和β-亚基可以去除了影响非活性多肽自消化效率的原因，易于检测在某一特定氨基酸残基引入突变所诱导的特性改变。因此，本发明采用SEQ ID NO：3的acyII基因作为开发CPC酰基转移酶突变体的起始DNA。

本发明中使用的假单胞菌属SE83来源的CPC酰基转移酶(AcyII，SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的文献命名采用了自α-亚基N-末端的甲硫氨酸为首至β-亚基C-末端的丙氨酸为末尾的连续编号系统。然而，由于第一个氨基酸(甲硫氨酸)和间隔肽在CPC酰基转移酶基因的转录和翻译后从宿主细胞中去除，它们在成熟蛋白质的氨基酸序列中并不存在。即活性蛋白质的氨基酸序列由α-亚基的氨基酸序列和β-亚基的氨基酸序列组成。据此，本发明采用的编号系统是对成熟CPC酰基转移酶活性形式中的每一α-和β-亚基连续编号。对CPC酰基转移酶的氨基酸序列中某一特定残基的命名是通过以下的常规命名法：苏氨酸(SEQ ID NO：4氨基酸序列中α-亚基的第1位氨基酸残基)被标为Thr1α；而丝氨酸(SEQ ID NO：5氨基酸序列中β-亚基的第1位氨基酸残基)被标为Ser1β。据此，Thr1α和Ser1β分别表示SEQ ID NO：2氨基酸序列中第2位残基苏氨酸和第240位残基丝氨酸。

对于在CPC酰基转移酶的氨基酸序列突变中引入的特定残基的命名，也遵循以下常规命名法：替代α-亚基中第169位残基苯丙氨酸的酪氨酸用F169αY表示，而替代β-亚基第176位异亮基酸残基的缬氨酸用I176βV表示。

本发明的CPC酰基转移酶突变体是采用SEQ ID NO：3的CPC酰基转移酶基因sem作为起始DNA，通过常规点突变的方法和基因工程技术如下制备(见图5)。

首先，为了提高CPC酰基转移酶突变体对CPC的比活性，根据计算机程序得到的CAD-CPC复合物三级结构模型中实际诱变的结果，从AcyII的氨基酸序列中选择将突变的氨基酸残基。合成含有对应以上所选氨基酸序列的核苷酸序列的人工寡核苷酸，并对其进行PCR，以在CPC酰基转移酶基因中诱导定点诱变。用突变后的基因转化微生物并在合适的条件下培养转化体，以产生CPC酰基转移酶。接下来，测量此法产生的CPC酰基转移酶的酶活性，选择对CPC反应性有所提高的CPC酰基转移酶突变体。分析编码所选CPC酰基转移酶突变体基因的核苷酸序列。结果显示，引入突变发生在以一个或多个氨基酸残基者，增强CPC酰基转移酶对CPC的反应性，这些氨基酸残基包括SEQ ID NO：4和5的AcyII氨基酸序列中的Phe169α、Met31β、Phe58β、His70β和Ile176β。

为了进一步提高CPC酰基转移酶突变体对CPC的反应性，将所选的CPC酰基转移酶突变体基因进行易错PCR，以在随机位点上诱导点突变。用突变的基因转化宿主细胞以构建突变体文库，从中筛选出含有对CPC反应性增强的CPC酰基转移酶突变体的宿主细胞。测量由此产生的CPC酰基转移酶突变体的酶活性，选择对CPC反应性有所提高的CPC酰基转移酶突变体，并分析编码以上所选CPC酰基转移酶突变体基因的核苷酸序列。结果显示，引入突变发生在以下一个或多个氨基酸残基者，增强了CPC酰基转移酶将CPC转化为7-ACA的效率，这些氨基酸残基包括SEQID NO：4和5的AcyII氨基酸序列中的Val121α、Gly139α、Ile75β和Ser471β。

因此，本发明的CPC酰基转移酶突变体优选具有以下氨基酸序列，其特征在于选自以下的至少一个氨基酸被另一氨基酸所取代，这些氨基酸包括CPC酰基转移酶α-亚基(SEQ ID NO：4)中的Val121α、Gly139α和Phe169α，以及CPC酰基转移酶β-亚基(SEQ ID NO：5)中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β。

在上述为提高CPC酰基转移酶对CPC反应性的氨基酸替代中，优选选自下组中的另一氨基酸替代特定的氨基酸残基，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸以及精氨酸。更优选丙氨酸取代Val121α；丝氨酸取代Gly139α；酪氨酸取代Phe169α；亮氨酸取代Met31β；天冬酰氨、甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或半胱氨酸取代Phe58β；丝氨酸或亮氨酸取代His70β；苏氨酸取代Ile75β；缬氨酸取代Ile176β；以及半胱氨酸取代Ser471β。

本发明的优选实施方案制备了名为S12的CPC酰基转移酶突变体基因，其中丙氨酸取代Val121α；丝氨酸取代Gly139α；天冬酰胺取代Phe58β；苏氨酸取代Ile75β；缬氨酸取代Ile176β；以及半胱氨酸取代Ser471β。S12突变体基因对CPC的比活性增强，而7-ACA的终产物抑制作用减弱。S12突变体基因具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列，而S12突变体基因编码的活性CPC酰基转移酶突变体由SEQ ID NO：7的α-亚基和SEQ ID NO：8的β-亚基组成。

本发明也包括CPC酰基转移酶突变体的功能等效衍生物。本发明中的功能等效衍生物指保留与本发明CPC酰基转移酶基本特征的CPC酰基转移酶衍生物。即功能等效衍生物包括所有可能的变体，如天然、合成或重组多肽，其经过修饰(即如序列突变、缺失、插入、替代、一个或几个核苷酸的倒置或其组合)并能够行使CPC酰基转移酶突变体的功能。

此外，本发明包括编码所述对CPC反应性提高的CPC酰基转移酶突变体的多核苷酸或其功能等效衍生物。优选该多核苷酸具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列。本发明中的功能等效衍生物是指，保留编码CPC酰基转移酶突变体α-亚基和/或β-亚基的多核苷酸的关键功能特性的多核苷酸及其衍生物。因此，本发明范围内不仅仅包括编码CPC酰基转移酶突变体的多核苷酸(其内含有通过间隔肽与β-亚基相连的α-亚基)，也包括编码CPC酰基转移酶突变体α-亚基和β-亚基而无间隔肽的多核苷酸。此外，仅编码CPC酰基转移酶突变体α-亚基的多核苷酸和仅编码CPC酰基转移酶突变体β-亚基的多核苷酸也在本发明的范围内。

本发明范围内也包括含有下列核苷酸序列的多核苷酸，包括本发明CPC酰基转移酶突变体基因的核苷酸序列，或由CPC酰基转移酶突变体氨基酸序列推绎出的核苷酸序列，以及通过对本发明CPC酰基转移酶突变体基因的核苷酸序列的遗传密码进行简并而生成的核苷酸序列。

此外，本发明包括含有本发明CPC酰基转移酶突变体编码基因的重组表达载体。可以利用常规方法(Sambrook等，《Molecular Cloning》，ColdSpring Harbor Laboratory，1989)将含有CPC酰基转移酶突变体基因的DNA片断以及适当的转录/翻译调节序列插入合适的表达载体中，制备所述重组表达载体。本发明中可以使用任何能够在宿主细胞中表达外源基因的表达载体。例如，优选表达载体包括(但不限于)质粒、噬菌体载体以及整合载体。

上述制备的重组表达载体可以通过常规转化方法(Sambrook等，同上)导入合适的宿主细胞。细菌、放线菌、酵母、真菌、动物细胞、昆虫细胞以及植物细胞均可用作适合表达重组DNA的宿主细胞。在这些宿主细胞中，优选细菌(如E.coli或芽孢杆菌属(Bacillus sp.))、放线菌(如链霉菌属(Streptomyces sp.))、酵母(如Scaaharomyces sp.、腐质酶属(Humicola sp.)或毕赤酵母属(Pichia sp.))、真菌(如曲霉属(Aspergillus sp.)或口蘑属(Trichoderma sp.))、以及产生CPC的微生物(如头孢霉属(Cephalosporium sp.)或顶孢霉属(Acremonium sp.))。

在本发明的优选实施方案中，用含有本发明CPC酰基转移酶突变体基因S12(SEQ ID NO：6)的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)，以获得E.coli转化体，称为E.coli BL21(DE3)/pET-S12，根据关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约，将该转化体于2003年7月30日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登陆号KCTC 10503BP。

可以通过在适当的条件、合适的培养基中培养所述转化微生物(该微生物中引入含有CPC酰基转移酶突变体编码基因或其功能等效衍生物的表达载体)来制备CPC酰基转移酶突变体。

另外，也可以通过在适当的条件、合适的培养基中培养经过只含有CPC酰基转移酶突变体α-亚基编码基因或其功能等效衍生物的表达载体转化的微生物，以及经过只含有CPC酰基转移酶突变体β-亚基编码基因或其功能等效衍生物的表达载体转化的微生物，分别在各自转化微生物中产生α-亚基蛋白质及β-亚基蛋白质，并在体外混合这两种纯化的亚基蛋白质，以制备CPC酰基转移酶突变体。

可以使用由此制备的CPC酰基转移酶突变体或其纯化形式以一步酶法生产所需的7-ACA产物。可以，采用常规蛋白质纯化方法，根据CPC酰基转移酶的特点使用不同的柱层析技术(依据特定目的对该法加或不加以轻微改动)纯化CPC酰基转移酶突变体。此外，也可以利用结合亲和力(如组胺肽与镍柱间的、或纤维素结合结构域(CBD)与纤维素间的结合亲和力)，使用亲和层析纯化CPC酰基转移酶突变体。

本发明CPC酰基转移酶突变体也可以在固定化形式下使用。可以通过常规方法使用载体进行CPC酰基转移酶突变体的固定化，载体例如天然多聚物(如纤维素、淀粉、葡聚糖以及琼脂糖)、合成多聚物(如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸以及Eupergit C)，或矿物质(如硅、膨润土及金属)。可以通过常规固定化方法(如共价键、离子键、亲水键、物理吸附或微囊化)将CPC酰基转移酶突变体与上述载体耦连。此外，也可以在载体和酶之间通过戊二醛或溴化氰的作用形成共价键从而固定化CPC酰基转移酶突变体。优选地，可以通过固定化整个细胞的方法固定化产生CPC酰基转移酶突变体的微生物细胞而无需纯化CPC酰基转移酶突变体。为了提高微生物产生的CPC酰基转移酶突变体的反应性，也可以在细胞壁上穿孔或对其应用细胞表面表达技术。

此外，本发明提供了使用所述CPC酰基转移酶突变体，从式I的CPC制备式II的7-ACA或其盐的方法。

在以下的式中，R为乙酸基(-OCOCH₃)、羟基(-OH)、氢(-H)或其盐。优选地，R为乙酸基(-OCOCH₃)，而盐为碱性金属盐，如钠盐、钾盐或锂盐。

<式I>

<式II>

可以将CPC(I)与本发明CPC酰基转移酶突变体相接触来产生7-ACA(II)，其中CPC酰基转移酶可能以CPC酰基转移酶突变体产生株培养物溶液的形式或组合物(其中含有CPC酰基转移酶突变体、纯化的游离酶自身或该酶的固定化形式)的形式使用。优选地，CPC酰基转移酶突变体与CPC(I)之间的接触反应可以在液体溶液中进行。优选的CPC(I)浓度为1至500mM；加入的CPC酰基转移酶突变体量为0.1至100U/ml；反应混合物的pH值为7至10；反应时间为0.1至24小时；而反应温度为4至40℃℃。可以通过常规方法将以上酶反应制备的7-ACA(II)从反应混合物中分离和纯化出来。

此外，可以在体内将本发明CPC酰基转移酶突变体与CPC(I)相接触，以产生7-ACA(II)。具体而言，可以通过以下步骤产生7-ACA(II)：将CPC酰基转移酶突变体编码基因或其功能等效衍生物导入具有CPC生物合成活性的微生物(如Acremonium crysozenum)中；在恰当的条件下、合适的培养基中培养转化体；自发地将CPC酰基转移酶突变体与所述转化体中生物合成的CPC(I)接触。

本发明在以下的实施例中进一步定义。应当理解，这些实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅用于说明。根据以上讨论及这些实施例，本领域的技术人员能够明确本发明的基本特点，并在不背离其精神和范围的前提下对本发明进行多种修饰和改变，以适应不同的用法和条件。

实施例1：制备对CPC反应性增强的CPC酰基转移酶突变体

<1-1>根据结构信息，制备CPC酰基转移酶突变体

<1-1-1>根据结构信息，选择进行突变的AcyII氨基酸残基

最近确定了CAD-GL-7-ACA复合物的三级结构(Kim等，Chem.Biol.8：1253-1264，2001；Kim等，J.Biol.Chem.276：48376-48381，2001)。如图3所示，位于CAD底物结合位点上的Arg57β、Tyr33β、Tyr149α和Arg155α与GL-7-ACA直接形成氢键，而Phe177β、Leu24β和Val170β则通过疏水相互作用与GL-7-ACA结合。此外，尽管Gln50β与GL-7-ACA之间没有直接的相互作用，它与Arg57β和Tyr149α之间形成氢键从而使这些残基处于进行催化反应的合适位置上。同时，在CAD与GL-7-ACA的耦连中，GL-7-ACA含有乙酸基基团、六元环以及四元β-内酰胺环的β-内酰胺核，并不会显著影响与活性位点残基之间的结合。如果要算，与Arg57β、Tyr33β、Tyr149α和Phe177β的精确耦连，戊二酸区域(如GL-7-ACA侧链)对底物结合的影响最大(图2和3)。此外，有设想认为Leu24β和Val170通过使底物处于合适的位置，在激活Ser1β的催化反应中发挥作用。

同时，CAD-GL-7-ACA复合物与CAD-CPC复合物的三级结构重叠，使得与GL-7-ACA戊二酸侧链耦连有关的CAD关键残基(如Arg57β、Tyr33β、Phe177β和Tyr149α)和CPC D-α-氨基己二酰侧链末端区域的羧基和D-型氨基团相碰撞(图4)。根据这些模拟结果，如果在CAD的底物结合位点上能保证有足够的空间容纳CPC侧链(即与GL-7-ACA侧链相比，CPC侧链上还存在所述的碳主链和D-型氨基基团)，预计可提高GL-7-ACA酰基转移酶对CPC的比活性。

同时，通过比较CAD、青霉素G酰基转移酶以及假单胞菌属来源的GL-7-ACA酰基转移酶结构的结果，认为假单胞菌属来源的GL-7-ACA酰基转移酶具有与其他两种相似的底物结合和反应类型(Kim等，Chem.Biol.8：1253-1264，2001；Fritz-Wolf等，Protein Sci.11：92-103，2002)。此外有报道称，尽管CAD对CPC没有活性，与GL-7-ACA相比，假单胞菌属来源的GL-7-ACA酰基转移酶(AcyII)仍可显示对CPC约5％的酰基转移酶活性(Matsuda等，J.Bacteriol.169：5815-5820，1987)。因此，在对CPC具有恒定水平酶活性的AcyII基础上开发CPC酰基转移酶突变体，比在不具备CPC酶活性的CAD基础上开发更有优势。据此，本发明使用假单胞菌属SE83来源的CPC酰基转移酶基因(acyII)作为基础基因，研制CPC酰基转移酶突变体。

本发明致力于制备CPC酰基转移酶突变体，其对与CPC的比活性比野生型AcyII更好，所述制备是通过根据CAD-CPC复合物的三级结构以及实际的诱变信息选择AcyII活性位点，接着对在所选活性位点中与干扰CPC结合有关的AcyII残基实施定点诱变。表1显示了经受定点诱变的相应于CAD活性位点残基的AcyII残基。

<表1>

CAD残基	AcyII残基
CAD残基	AcyII残基	Tyr33β	Met31β
Phe58β	Phe58β	Tyr33β	Met31β
Phe58β	Phe58β	Val70β	His70β
Phe177β	Ile176β	Val70β	His70β
Phe177β	Ile176β	Tyr149α	Phe169α

根据CAD-CPC复合物的三级结构模拟的结果，对AcyII的Phe58β、Met31β、Ile176β以及Phe169α残基进行定点诱变(分别对应于CAD的Phe58β、Tyr33β、Phe177β和Tyr149α残基)，这些残基被认为会严重抑制CPC侧链的结合；激活Ser1β活性位点催化反应的AcyII的His70β残基(对应于CAD的Val70β)也进行了定点诱变(图5)。

<1-1-2>制备pBCPC和pBSEM质粒

如下将SEQ ID NO：1的acyII结构基因DNA片断插入pBC KS(+)载体(Stratagene，USA)的XhoI/XbaI位点中，构建pBCPC质粒。首先根据假单胞菌属SE83来源的CPC酰基转移酶基因(acyII)的DNA核苷酸序列以及由其编码的蛋白AcyII的氨基酸序列，使用DNA合成仪合成acyII结构基因(GenBank登录号M18278)。此时，acyII基因编码的氨基酸序列与文献发表的相同，但其核苷酸序列在合成中经过一些修饰，使acyII基因中可能含有一个或多个E.coli优选密码子。

进行PCR以在acyII结构基因中引入限制性内切酶识别位点以及核糖体结合位点。PCR反应溶液(100μl)含有合成的acyII基因DNA 10ng、CPC-F引物(SEQ ID NO：13)和CPC-R引物(SEQ ID NO：14)各50pmol、dNTP混合物0.2mM、Taq缓冲溶液(5mM KCl，5mM Tris-HCl，(pH 8.3)、1.5mMMgCl₂)，以及ExTaq聚合酶2.5单位(Takara，Japan)。反应起始，在95℃、程控热循环仪(Peltier Thermal Cycler PTC-200；MJResearch，USA)内预变性5分钟。PCR条件由25个循环的95℃/1分钟(变性)，58℃/30秒钟(退火)、72℃/1分30秒(聚合)，以及最后的延伸72℃/10分钟(聚合后)所组成。PCR扩增后，约2.5kb PCR产物经XbaI/XhoI消化，并通过纯化试剂盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)纯化，以获得插入DNA。此外，pBC KS(+)载体DNA经XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，从而获得载体DNA。插入DNA和载体DNA通过T4 DNA连接酶(Roche，Germany)在16℃下反应12至16小时连接起来，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以选择转化体。从选择的转化体中纯化质粒，并分析插入DNA的核苷酸序列。经此过程制备含有SEQ ID NO：1的acyII结构基因的pBCPC质粒，含有该pBCPC质粒的E.coli转化体被命名为E.coli MC1061(pBCPC)。

将SEQ ID NO：3的sem结构基因DNA片断插入pBC KS(+)载体(Stratagene，USA)的XhoI/XbaI位点中，构建pBSEM质粒。如下进行一系列PCR扩增：以pBCPC质粒为模板、M13-R引物(SEQ ID NO：11)以及αORF-R引物(SEQ ID NO：15)获得0.8kb的PCR产物；以pBCPC质粒为模板、βORF-R引物(SEQ ID NO：16)以及HindIII-R引物(SEQID NO：18)获得约0.96kb的PCR产物；及以pBCPC质粒为模板、HindIII-F引物(SEQ ID NO：17)以及M13-F引物(SEQ ID NO：12)获得0.75kb的PCR产物。将以上获得的0.8kb、0.96kb和0.75kb PCR产物混合，除不加引物外，在上述相同的PCR反应条件下进行PCR，得到将三种PCR产物连接在一起的PCR产物约2.5kb。随后，使用T3引物(SEQID NO：9)以及T7引物(SEQ ID NO：10)对该约2.5kb的PCR产物进行PCR，扩增大约为2.5kb大小的sem基因DNA片断。经PCR扩增后，约2.5kb的PCR产物经XbaI/XhoI消化，并通过纯化试剂盒(QIAEX II GelExtraction Kit；Qiagen，Germany)纯化并用获得插入DNA。此外，pBCKS(+)载体DNA经XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，从而获得载体DNA。插入DNA和载体DNA通过T4 DNA连接酶(Roche，Germany)在16℃下反应16小时连接起来，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以选择转化体。从选择的转化体中纯化质粒，并分析插入DNA的核苷酸序列。这样，制备含有sem结构基因(SEQ ID NO：3)的pBSEM质粒，含有该pBSEM质粒的E.coli转化体被命名为E.coliMC1061(pBSEM)。

为了比较E.coli转化体来源的pBCPC质粒和E.coli转化体来源的pBSEM质粒的CPC酰基转移酶产率，从各自E.coli转化体中获得的CPC酰基转移酶粗酶溶液制备如下。将每一种E.coli转化体注入含有25μg/ml氯霉素的3ml LB培养基中(1％ Bacto-Tryptone、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)，并在30℃、200rpm下剧烈振荡培养16小时。将50μl培养溶液转移到50ml含25μg/ml氯霉素的新LB培养基，并在25℃、200rpm下剧烈振荡培养48小时。将该培养溶液在4℃、8,000rpm下离心10分钟分离沉淀物，用0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)将沉淀物洗涤两次。将该沉淀物悬浮于5ml的相同缓冲溶液中，并在4℃超声波破碎10分钟。随后在4℃、15,000rpm下离心该悬浮液20分钟分离上清液，该上清液可用作CPC酰基转移酶粗酶溶液。

根据Park等描述的方法(Park等，Kor.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.23：559-564，1995)，加以轻微改动，如下测定CPC酰基转移酶突变体对CPC的酶活性。将CPC(纯度74.2％；CJ Corp.，Korea)溶解于0.1MTris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)至浓度为20mg/ml，并用1N NaOH调节pH至8，以制备底物溶液。将20μl该CPC溶液与以上制备的20μl CPC酰基转移酶粗酶溶液混合，反应混合物在37℃孵育5分钟。反应后，向其中加入50mM NaOH和20％冰醋酸(1∶2)混合物(200μl)终止反应。通过离心从反应混合物中分离出来的200μl上清液，与40μl溶解于甲醇中的0.5％(w/v)PDAB(对二甲氨基苯甲醛；Sigma，USA)混合，反应混合物在37℃孵育10分钟。反应后，在415nm处测定反应混合物的吸光度，并通过与标准材料的校准曲线相比较进行定量。这里，1单位定义为每分钟能从CPC产生1微摩尔7-ACA的酶量。同时，根据Bradford描述的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72：248-254，1976)测定酶溶液中剩下的蛋白质量，由此确定CPC酰基转移酶突变体对CPC的比活性，并将其表示为对应于1mg蛋白质的活性单位。通过下列步骤确定CPC酰基转移酶突变体对CPC的反应性：在反应混合物中加入相同量的蛋白质，在固定的时间内进行酶促反应，测量反应混合物中生成的7-ACA量并将其表示为相对值。通过以下步骤确定7-ACA的终产物抑制作用：在反应混合物中加入对应于相同活性单位的蛋白质，在固定的时间内进行酶促反应，测量反应混合物中生成的7-ACA量，并将其表示为相对值。

测定对CPC的酶活性的结果表明，E.coli转化体MC1061(pBCPC)产生CPC酰基转移酶的产率为约97单位/l，而E.coli转化体MC1061(pBSEM)的产率仅为11单位/l。

<1-1-3>制备Met31β/Phe58β双突变体

为了开发对CPC反应性增强的CPC酰基转移酶突变体，如下制备Met31β/Phe58β双突变体。如CAD-CPC复合物的三级结构模拟所示，由于与GL-7-ACA侧链相比，CPC侧链另含有碳主链和D型氨基基团，CAD与CPC结合比GL-7-ACA需要更大的空间。为了保证有足够空间与CPC结合，将AcyII底物结合位点中的两个残基进行自发突变。AcyII的His 57β(对应于CAD的Arg57β)作为结合CPC侧链最重要的残基保留下来，AcyII的Met31β因与CPC侧链末端的羧基和D型氨基发生碰撞，以亮氨酸替代之。同时，为了进一步保证通过在AcyII的His 57β侧链处诱发扭曲旋转而产生的与CPC侧链结合的空间，AcyII的Phe58β被另一种侧链相对较小的氨基酸残基所取代，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺。因此，通过重叠PCR(Ho等，Gene 15：51-59，1989)制备得M31βL/F58βM、M31βL/F58βC、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA、M31βL/F58βV以及M31βL/F58βN双突变体。制备这些双突变体的步骤将于下文详述。

用于定点诱变的PCR反应溶液(100μl)含有10ng模板DNA、正向及反向引物各50pmol、0.2mM dNTP混合物、Taq缓冲溶液(5mM KCl、5mM Tris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl₂)，以及2.5单位ExTaq聚合酶(Takara，Japan)。在95℃、程控热循环仪(Peltier Thermal CyclerPTC-200；MJ Research，USA)内预变性5分钟起始反应。PCR条件由25个循环的95℃/1分钟，58℃/30秒钟、72℃/60-90秒，以及最后72℃/10分钟的延伸组成。

特别地，为制备M31βL/F58βM双突变体而进行的一系列PCR扩增，通过使用以下模板及引物实施：以pBSEM质粒为模板、M13-R引物(SEQID NO：11)以及M31βL-R引物(SEQ ID NO：19)获得1.0kb的PCR产物；以pBSEM质粒为模板、F58βM-F引物(SEQ ID NO：20)以及M13-F引物(SEQ ID NO：12)获得1.6kb的PCR产物。

将以上获得的1.0kb和1.6kb PCR产物混合，除不加引物外，在上述相同的PCR反应条件下进行PCR，得到将两种PCR产物连接在一起的约2.5kb PCR产物。随后，使用T3引物(SEQ ID NO：9)以及T7引物(SEQID NO：10)对该约2.5kb的PCR产物进行PCR，以扩增大约为2.5kb大小的双突变体基因DNA片断。经PCR扩增后，约2.5kb的PCR产物经XbaI/XhoI消化并用通过纯化试剂盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)纯化，以获得插入DNA。此外，pBC KS(+)载体DNA经XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，从而获得载体DNA。插入DNA和载体DNA通过T4 DNA连接酶(Roche，Germany)在16℃下反应16小时连接起来，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli系涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以选择含有双重突变基因的转化体。从所选的转化体中纯化质粒，并分析插入DNA的核苷酸序列以正实突变残基。

根据与上述相同的方法制备M31βL/F58βC、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA、M31βL/F58βV以及M31βL/F58βN双突变体。此处，对于M31βL/F58βC，M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQID NO：19)，F58βC-F引物(SEQ ID NO：21)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)用于重叠PCR扩增；对于M31βL/F58βL，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO：19)，F58βL-F引物(SEQ ID NO：24)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)；对于M31βL/F58βA，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO：19)，F58βA-F引物(SEQ ID NO：22)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)；对于M31βL/F58βV，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO：19)，F58βV-F引物(SEQ ID NO：23)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)；而对于M31βL/F58βN，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQID NO：19)，F58βN-F引物(SEQ ID NO：25)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每种CPC酰基转移酶突变体的粗酶溶液测量以上获得的双突变体对CPC的比活性，结果证实，M31βL/F58βM、M31βL/F58βC、M31βL/F58βN、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA以及M31βL/F58βV双突变体的比活性分别比野生型AcyII高2.4、2.3、2.0、1.8、1.6及1.6倍。

<1-1-4>制备Met31β/Phe58β/His70β三重突变体

为了进一步提高6种双突变体中比活性增加最高的M31βL/F58βM的比活性，用丝氨酸或亮氨酸替代能刺激活性位点S1β的催化反应的AcyIIHis70β(对应于CAD的Val70β)，制备三重突变体。

遵循生产厂商的说明，使用QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，USA)，制备M31βL/F58βM/H70βS三重突变体。PCR反应溶液(50μl)含有M31βL/F58βM双突变体DNA 40ng、H70βS-F引物(SEQID NO：26)和H70βS-R引物(SEQ ID NO：27)各100pmol、dNTP混合物1μl、5μl缓冲溶液(100mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄、200mM Tris-HCl、(pH 8.8)、20mM MgSO₄、1％ Triton X-100以及1mg/ml BSA)，以及2.5单位的pfuTurbo^TM聚合酶(Stratagene，USA)。在95℃、程控热循环仪(Peltier Thermal Cycler PTC-200；MJ Research，USA)内预变性5分钟起始反应。PCR条件由16个循环的95℃/30秒钟，55℃/1分钟、68℃/12分钟组成。PCR扩增后，向PCR反应溶液中加入10单位DpnI限制性内切酶并在37℃下孵育1小时，以除去未发生任何突变的模板DNA。通过纯化试剂盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)纯化突变DNA，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以选择转化体。从所选的转化体中纯化质粒，并分析插入DNA的核苷酸序列以正实突变残基。

除了改用H70βL-F引物(SEQ ID NO：28)和H70βL-R引物(SEQ IDNO：29)以外，根据与上述相同的方法，使用QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，USA)，可制备M31βL/F58βM/H70βL三重突变体。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每种CPC酰基转移酶突变体的粗酶溶液测量三重突变体对CPC的比活性，结果证实，M31βL/F58βM/H70βS和M31βL/F58βM/H70βL三重突变体的比活性分别比M31βL/F58βM双突变体高3.2及2.4倍。

<1-1-5>制备Phe169α/Met31β/Phe58β/His70β四重突变体

为了进一步提高2种三重突变体中比活性增加最高的M31βL/F58βM/H70βS的比活性，以酪氨酸替代AcyII的Phe169α(对应于CAD的Tyr149α)而制备四重突变体，F169αY/M31βL/F58βM/H70βS，Phe169α帮助CPC定位在恰当位置，使活性位点S1β发生有效催化反应。因为酪氨酸侧链相对于苯丙氨酸侧链另有一个羟基(-OH)，它能够与CPC侧链和/或其邻近残基形成氢键，从而激活S1β的催化反应。

根据实施例<1-1-4>中描述的相同方法，使用QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，USA)制备F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体；只是改用M31βL/F58βM/H70βS三重突变体为模板，并采用F169αY-F引物(SEQ ID NO：30)和F169αY-R引物(SEQ ID NO：31)。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用四重突变体的粗酶溶液测量F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体对CPC的比活性，结果证实，F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体的比活性比M31βL/F58βM/H70βS三重突变体高2.1倍。

<1-1-6>制备Phe169α/Met31β/Phe58β/His70β/Ile176β五重突变体

为了进一步提高F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体对CPC的比活性，用缬氨酸替代与干扰CPC侧链结合有关的AcyII的Ile176β(对应于CAD的Phe177β)制备五重突变体F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/Ile176βV。在实施例<1-1-3>中，AcyII的Phe58β已经被甲硫氨酸所取代。同时，AcyII的Ile176β与AcyII的Phe58β位置十分接近，也被认为干扰了与CPC的结合。因此，为达到与CPC底物侧链更有效的结合，用缬氨酸代替Ile176β，前者的侧链与异亮氨酸结构相似但大小更小。

根据实施例<1-1-4>中描述的相同方法，使用QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，USA)制备F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体，只是改用F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体为模板，并采用I176βV-F引物(SEQ ID NO：32)和I176βV-R引物(SEQ ID NO：33)。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用五重突变体的粗酶溶液测量F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体对CPC的比活性，结果证实，F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体的比活性比F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体高2.4倍。

<1-2>制备对CPC反应性增强的CPC酰基转移酶突变体

<1-2-1>制备Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β四重突变体

难以将已有的CPC酰基转移酶大规模应用于一步酶合成法制备7-ACA的原因在于：由于7-ACA的终产物抑制作用以及CPC酰基转移酶对CPC的低比活性，将CPC转化为7-ACA的转化效率很低。同时，通过实施例<1-1>中一系列为提高CPC酰基转移酶突变体比活性而做的定点诱变可以得知，His70β的突变显著提高了CPC酰基转移酶突变体对CPC的比活性，但也严重增加了7-ACA的终产物抑制水平。因此，将实施例<1-1-6>中的F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体进行反向诱变，使H70βS变为野生型残基组氨酸，制备F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体(图5)。根据实施例<1-1-4>中描述的相同方法，使用QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，USA)制备F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体，只是改用F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体为模板，并采用H70βS-F引物(SEQ ID NO：34)和H70βS-R引物(SEQ ID NO：35)。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，在制备每种野生型、F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体和F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体各自的粗酶溶液后，使用对应于相同活性单位的酶溶液测量终产物抑制。结果证实，将F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体中H70βS突变为野生型残基组氨酸的反突变将7-ACA的终产物抑制作用降至与野生型酶相同的水平(图6)。

<1-2-2>制备Gly139α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β和Val121α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β五重突变体

为了进一步提高F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体对CPC的反应性，将该四重突变体的DNA进行易错PCR，以构建一个在随机位点点突变的突变体文库。此处，调整所述易错PCR的差错发生率为平均一个四重突变体基因发生一个氨基酸残基突变。构建突变体文库的具体过程如下。

用于易错PCR的PCR反应溶液(100μl)含有5ngF169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体DNA、T3引物(SEQ IDNO：9)以及T7引物(SEQ ID NO：10)各50pmol、dATP和dGTP各0.2mM、dCTP和dTTP各1.0mM、5mM KCl、5mM Tris-HCl(pH 8.3)、3.5mM MgCl₂、0.025mM MnCl₂以及rTaq聚合酶2.5单位(Takara，Japan)。在95℃、程控热循环仪(Peltier Thermal Cycler PTC-200；MJResearch，USA)内变性3分钟起始反应。PCR条件由20个循环的95℃/1分钟，58℃/30秒钟、72℃/90秒，以及最后72℃/10分钟的延伸组成。经过易错PCR扩增，约2.5kb的PCR产物经XbaI/XhoI消化，并通过纯化试剂盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)纯化，以获得插入DNA。此外，pBSEM质粒DNA经XbaI/XhoI消化，以获得3.4kb的DNA片断作为载体DNA。插入DNA和载体DNA通过T4 DNA连接酶(Roche，Germany)在16℃下反应16小时连接起来，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以构建突变体文库。

从上述获得的突变体文库中，如下筛选出对CPC反应性增强的CPC酰基转移酶突变体。

用含有CPC酰基转移酶突变体基因(该基因通过易错PCR在随机位点上引入点突变)的E.coli MC1061转化体，接种填入200μl含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂的96孔平板，在30℃、180rpm下剧烈振荡培养60-70小时。从孔板上取每种培养溶液100μl转移到新的96孔平板上。向其中加入100μl细胞裂解溶液(含有2mg/ml溶菌酶、4mM EDTA、0.4％ TritonX-100的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0))，30℃放置两小时。随后，将50μl2.5％(w/v)CPC的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶液和5mM 7-ACA的混合物加入每一孔中，将孔板在28℃下保持14至16个小时，以诱发CPC的水解反应。此处，将7-ACA加入CPC溶液，是为了帮助筛查对CPC比活性增强，和/或7-ACA终产物抑制作用减弱的CPC酰基转移酶突变体℃PC水解反应过后，将反应混合物在4,200rpm下离心20分钟分离上清液，50μl该上清液被转移至新的96孔平板。将160μl终止溶液(醋酸：250mM NaOH，2∶1)加入每一孔中终止酶促反应后，向其中加入40μl显影剂(溶于甲醇的0.5％(w/v)PDAB溶液)，孔板在室温下放置10分钟。随后将该孔板置于酶标测定仪上，在415nm处测定反应混合物的吸光度，并通过比较测得的吸光度选择对CPC反应性增强的CPC酰基转移酶突变体。

在所述随机突变体文库中随机筛选约25,000个克隆，结果选择了2个突变体(#120和#213)，其吸光度比用作随机诱变模板的F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体更高。序列分析证实了#120突变体中Gly139α被丝氨酸所替代(G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重突变体)，而#213突变体中Val121α被丙氨酸所替代(V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重突变体)(图5)。

进一步，根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每种突变体的粗酶溶液，测量#120和#213突变体对CPC的反应性。结果证实，#120和#213突变体对CPC的反应性远高于实施例<1-2-1>中的F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体(图7)。

<1-2-3>制备Val121α/Gly139α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β六重突变体

根据实施例<1-2-2>的结果已经证实，在F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突变体中引入G139αS或V121αA提高了CPC酰基转移酶突变体对CPC的反应性。因此，为了进一步提高对CPC的反应性，通过将#120突变体中的G139αS突变引入#213突变体，制备V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体(图5)。根据实施例<1-1-4>中描述的相同方法制备发明的六重突变体，只是改用#213突变体DNA为模板，并采用G139αS-F引物(SEQ ID NO：36)和G139αS-R引物(SEQ ID NO：37)进行PCR。本发明已将编码V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的CPC酰基转移酶突变体基因命名为TnS5。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用六重突变体的粗酶溶液，测量V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体对CPC的反应性。结果证实，与#213和#120突变体相比，V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体(TnS5)对CPC的反应性有所提高(图7)。

<1-3>制备pBC-TnS5αβ质粒

编码V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的TnS5基因是设计来在宿主细胞中分别表达α-亚基和β-亚基并通过这两个亚基的自发接触而产生CPC酰基转移酶活性形式的CPC酰基转移酶突变体基因(例如sem基因)。

TnS5基因产生的活性CPC酰基转移酶突变体由α-和β-亚基各一个组成，其亚基是在宿主细胞中转录和翻译CPC酰基转移酶突变体基因(如野生型酰基转移酶基因(acyII))后，通过自消化的过程获得。为了诱发上述突变体的形成，本发明制备了编码该六重CPC酰基转移酶突变体的TnS5αβ基因，其中在V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的α-亚基和β-亚基(图5)之间，插入了野生型CPC酰基转移酶的间隔肽(AcyII)。制备TnS5αβ基因的方法详述如下。

将TnS5基因插入pBC KS(+)载体的XhoI/XbaI位点中以制备pBC-TnS5质粒。进行两次PCR扩增，以pBC-TnS5质粒为模板，M13-R引物(SEQ ID NO：11)以及αCPC-R引物(SEQ ID NO：38)获得0.8kb的PCR产物；以pBC-TnS5质粒为模板、βCPC-F引物(SEQ ID NO：39)以及M13-F引物(SEQ ID NO：12)获得约1.7kb的PCR产物。将以上获得的0.8kb和1.7kb PCR产物混合，除不加引物外，在上述相同的PCR反应条件下进行PCR，得到将两种PCR产物连接在一起的约2.5kb PCR产物。随后，使用T3引物(SEQ ID NO：9)以及T7引物(SEQ ID NO：10)对该约2.5kb的PCR产物进行PCR，扩增含有TnS5αβ基因的DNA片断。经PCR扩增后，约2.5kb的PCR产物经XbaI/XhoI消化，并通过纯化试剂盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)纯化，以获得插入DNA。此外，pBC KS(+)载体DNA经XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，从而获得载体DNA。插入DNA和载体DNA通过T4 DNA连接酶(Roche，Germany)在16℃下反应16小时连接起来，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以选择转化体。从所选的转化体中纯化质粒，并分析插入DNA的核苷酸序列。通过这一过程，制备了含有TnS5αβ基因的pBC-TnS5αβ质粒。

为了检测TnS5αβ基因CPC酰基转移酶突变体的产率，将编码V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的TnS5和TnS5αβ基因分别插入pBC KS(+)载体中，以分别制备pBC-TnS5和pBC-TnS5αβ重组质粒，而每一重组质粒均用于转化E.coli MC1061以获得E.coli转化体MC1061(pBC-TnS5)和MC1061(pBC-TnS5αβ)。将每一E.coli转化体培养在50ml含有25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，25℃、200rpm下剧烈振荡培养48小时并根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用从转化体培养溶液中制备的粗酶溶液，测量对CPC的酶活性。结果显示，E.coli转化体MC1061(pBC-TnS5)和MC1061(pBC-TnS5αβ)各自产生CPC酰基转移酶的产率，分别为约78单位/l和162单位/l。这些结果证实，在宿主细胞中转录和翻译CPC酰基转移酶突变体基因后进行自消化形成的六重CPC酰基转移酶突变体(如TnS5αβ)，与α-亚基和β-亚基在宿主细胞中分别表达后自发接触形成的六重CPC酰基转移酶突变体(如TnS5)相比，其产率高约2倍。

进一步将由E.coli转化体MC1061(pBC-TnS5αβ)的培养溶液制备的粗酶溶液进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％ SDS-PAGE)，以检测蛋白质表达类型。结果表明，不存在大小约83kDa的无活性前体条带，这表示在本发明的培养条件下，转录和翻译TnS5αβ基因生成的大部分无活性前体形式，都通过有效的自消化转化为CPC酰基转移酶突变体的活性形式(图7)。因此，以下将TnS5αβ基因作为研制CPC酰基转移酶突变体的模板DNA。

<1-4>制备对CPC具有额外增强的反应性的CPC酰基转移酶突变体<1-4-1>制备Val121α/Gly139α/Phe169α/Phe58β/Ile176β五重突变体

本发明通过实施例<1-1>至<1-3>中的一系列定点诱变和一个随机诱变，制备编码V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的CPC酰基转移酶突变体基因TnS5和TnS5αβ。在这些制备TnS5αβ六重突变体的诱变过程中，认为Met31β与CPC侧链末端的羧基和D型氨基发生碰撞，故以亮氨酸替代之；同时用甲硫氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺取代Phe58β，以在His 57β侧链处诱发扭曲旋转，从而保证有足够的空间与CPC侧链结合。因此，本发明如下优化了V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的Met31β和Phe58β残基，以进一步提高对CPC反应性。

本发明以TnS5αβ六重突变体DNA为模板，将M31βL反向诱变为野生型残基甲硫氨酸，并将F58βM替换为天冬酰胺或半胱氨酸，制备四种突变体(V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV、V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV)。这些突变体是根据实施例<1-3>中描述的制备M31βL/F58βM双突变体的相同方法制备的。此处，重叠PCR使用下列引物：对于V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO：19)，和F58βC-F引物(SEQ ID NO：21)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)；对于V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO：19)，和F58βN-F引物(SEQ ID NO：25)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)；对于V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31β-R引物(SEQ ID NO：42)，和F58βC-F引物(SEQ ID NO：21)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)；对于V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO：11)及M31β-R引物(SEQ ID NO：42)，和F58βN-F引物(SEQ ID NO：25)及M13-F引物(SEQ ID NO：12)。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每种突变体的粗酶溶液，测量其对CPC的酶反应性。结果证实，TnS5αβ六重突变体中F58βM为天冬酰胺所替代的突变体对CPC的反应性大幅度提高；而TnS5αβ六重突变体中M31βL反向诱变为甲硫氨酸的突变体，尽管其比活性有所降低，能更有效地从CPC生产7-ACA(图8)。根据这些结果，本发明选择了对CPC反应性比TnS5αβ六重突变体更高的V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重突变体(mF58)(图5)。

<1-4-2>制备Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile176β四重突变体

在实施例<1-1-5>中，本发明已用酪氨酸代替了M31βL/F58βM/H70βS三重突变体中的Phe169α，以进一步提高CPC酰基转移酶突变体对CPC的比活性。同时，在实施例<1-2-1>中，F169αY/M31βL/F58βN/H70βS/I176βV五重突变体中的H70βS残基经反向诱变为组氨酸，以降低7-ACA的终产物抑制作用。而在实施例<1-4-1>中，V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的M31βL残基也经反向诱变为野生型甲硫氨酸残基。此外，V121αA/G139αSF169αY/F58βM/I176βV五重突变体中的F58βM突变残基和I176β残基分别为天冬酰胺和缬氨酸所替代。因此，通过将F169αY突变残基反向诱变为野生型残基苯丙氨酸，制备V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体(F169)(图5)。

根据实施例<1-1-4>中描述的制备M31βL/F58βM/H70βS三重突变体DNA的相同方法制备V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体，只是改用V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重突变体DNA为模板，并采用F169αY-F引物(SEQ ID NO：45)和F169αY-R引物(SEQ ID NO：46)进行PCR。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用突变酶的粗酶溶液，测量V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体对CPC的酶反应性。结果证实，在V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重突变体中将F169αβ反问突变野生型残基苯丙氨酸，进一步提高了CPC酰基转移酶对CPC的反应性(图9)。

<1-4-3>制备Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile75β/Ile176β和Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile176β/Ser471β五重突变体

为了进一步提高V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体对CPC的反应性，对V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体进行易错PCR，以构建随机突变体文库。从上述构建的随机突变体文库中，筛选出对CPC的反应性比V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体更强的突变体。此处，易错PCR的反应条件、制备所述突变体文库以及从中筛选突变体的方法都与实施例<1-2-2>中所述相同，只是一旦从突变体文库中筛选出对CPC反应性更强的突变体，向反应混合物中加入5mM 7-ACA(终浓度)。

在所述随机突变体文库中随机筛选约15,000个克隆，结果选择了2个其吸光度比用作随机诱变模板的V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体更高的突变体(#59和#76)。序列分析证实了#59突变体中Ile75β被苏氨酸所替代(V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV五重突变体)，而#76突变体中Ser471β被半胱氨酸所替代(V121αA/F169αY/F58βN/I176βV/S471βC五重突变体)(图5)。

此外，根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每种突变体的粗酶溶液，测量#59和#76突变体对CPC的反应性。结果证实，#59和#76突变体对CPC的反应性高于V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体(F169)(图9)。

<1-4-4>制备Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile75β/Ile176β/Ser471β六重突变体

上文已经确认，通过向V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突变体中引入Ile75βT或S471βC突变，提高了其对CPC的反应性。因此，为了进一步提高对CPC的反应性，本发明将#59突变体的Ile75βT突变引入#76突变体中，制备V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突变体(图5)。根据实施例<1-1-4>中描述的相同方法制备本发明的六重突变体，只是改以#76突变体DNA为模板，使用I75βT-F引物(SEQ ID NO：43)和I75βT-R引物(SEQ ID NO：44)进行PCR扩增。本发明将编码V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突变体的CPC酰基转移酶突变体基因命名为S12。

根据实施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用六重突变体的粗酶溶液，测量V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突变体对CPC的反应性。结果证实，V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突变体(S12)对CPC的反应性高于#76突变体(V121αA/F169αY/F58βN/I176βV/SβC五重突变体)(图1 0)。

实施例2：纯化CPC酰基转移酶突变体并分析其反应特性

<2-1>纯化对CPC比活性增强的CPC酰基转移酶突变体

将含有重组质粒(其内引入野生型或本发明CPC酰基转移酶突变体基因)的E.coli MC1061转化体，在含有25μg/ml氯霉素的1l terrific液体培养基(1.2％ Bacto-Trypton、2.4％酵母提取液、0.4％甘油、0.17MKH₂PO₄、0.72M K₂HPO₄)中于30℃下培养16小时以获得培养前溶液(pre-culture)。将10ml该培养前溶液注入相同的培养基中，然后在25℃、200rpm下剧烈振荡48小时。将培养溶液在4℃、8,000rpm下离心10分钟分离沉淀物，用20mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)将沉淀洗涤物两次。将该沉淀物悬浮于100ml的相同缓冲溶液中。将该悬浮液在4℃超声波破碎20分钟以破坏其细胞壁，随后于4℃、15,000rpm下离心20分以除去不可溶的材料和细胞碎片，从而获得在以下用作粗酶溶液的上清液。

向粗酶溶液中加入硫酸铵，调节其最终饱和度为30％，将反应混合物在4℃搅拌1小时使其饱和。然后，将反应混合物在4℃、12,000rpm下离心15分钟，以除去沉淀物；向上清液中加入硫酸铵，调节其最终饱和度为60％。将反应混合物在4℃搅拌1小时使其饱和，并在4℃、12,000rpm下离心15分钟，以重新获得沉淀物。将该沉淀物悬浮于20mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中，并用含有50mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)透析过夜。

将透析得到的蛋白质溶液通过DEAE-琼脂糖阴离子交换柱层析(5×18.5cm)，后者已用含有50mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)平衡；再以三倍体积的相同缓冲溶液冲洗该柱，以除去未吸附其上的蛋白质分子。通过将NaCl的浓度逐渐从50提高至200mM，洗脱被吸附的蛋白质。收集具有CPC酰基转移酶活性的级分，并以聚乙二醇(分子量20,000)浓缩在透析袋中。用含有25％硫酸铵的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)对浓缩的蛋白质进行透析。

将上述获得的渗出液通过Phenyl-Toyoperl柱层析(2.5×6cm)，后者已用含有25％硫酸铵的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)平衡，以将蛋白质吸附上柱；通过将硫酸铵的浓度从25减少至0，洗脱被吸附的蛋白质。确定每一级分的CPC酰基转移酶活性后，再收集具有酶活性的级分，以聚乙二醇浓缩，并用20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)对之进行透析，以纯化野生型和本发明CPC酰基转移酶突变体。

酶活性根据实施例<1-1-2>中描述的相同方法测量。

<2-2>分析野生型CPC酰基转移酶的物理性质和反应特性

根据实施例<2-1>中描述的相同方法，从E.coli MC1061转化体中纯化野生型CPC酰基转移酶，该转化体中含有实施例<1-1-2>制备的pBCPC或pBSEM质粒。分别分析pBCPC质粒来源的野生型CPC酰基转移酶(AcyII)和pBSEM质粒来源的野生型CPC酰基转移酶(Sem)的物理性质及反应特性，结果表明，它们具有相同的物理性质(如分子量)以及反应特性(如，比活性、最适温度、最适pH)。

进一步将实施例<2-1>中得到的野生型CPC酰基转移酶的活性级分，进行非变性的PAGE以及考马斯亮蓝染色。结果只在对应分子量为约83kDa处检测到一个条带，说明野生型CPC酰基转移酶纯化完全(图11a至11c)。结合非变性PAGE的结果，MALDI-TOF质谱分析证实，纯化酶(即活性酰基转移酶)的分子量为约83kDa。另外，通过变性SDS-PAGE，检测到对应于α-亚基的约25kDa条带和对应于β-亚基的约58kDa条带。这些结果已经证实，本发明的CPC酰基转移酶是由约25kDa的α-亚基和一个约58kDa的β-亚基依次组成的二聚体。

分别从变性SDS-PAGE凝胶纯化α-和β-亚基，每个亚基片段的分子量则通过MALDI-TOF质谱分析测量。根据其结果已经认为，分别发生在SEQ ID NO：2氨基酸序列中第230位和231位氨基酸间，以及第239位和240位氨基酸间的两处自消化，能够去除一个由9个氨基酸组成的间隔肽，从而可将pBCPC质粒来源的野生型CPC酰基转移酶(AcyII)分为约25kDa的α-亚基和约58kDa的β-亚基。

测定野生型CPC酰基转移酶比活性的结果表明，野生型CPC酰基转移酶对GL-7-ACA具有约23.1单位/mg蛋白质的比活性，对CPC的比活性则为约0.33单位/mg蛋白质。因此，已知假单胞菌属SE83来源的AcyII对CPC的比活性仅相当于对GL-7-ACA比活性的约1.4％。

根据实施例<1-1-2>中描述的相同方法进行酶促反应后，通过Lineweaver-Burk作图法确定纯化酶的动力参数。结果野生型CPC酰基转移酶AcyII的Km、Kcat和催化效率(即Kcat/Km)分别为50mM、0.9/秒和0.02/秒/mM。

此外，测定野生型CPC酰基转移酶AcyII的最适反映温度和pH的结果表明其最适反映温度和pH分别为40℃和9.0。

<2-3>分析比活性增强的CPC酰基转移酶突变体的反应特性

根据实施例<2-1>中描述的相同方法，从质粒转化的重组E.coli中纯化各CPC酰基转移酶突变体，其中转化质粒分别含有编码M31βL/F58βM双突变体、M31βL/F58βM/H70βS三重突变体、F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突变体及F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体的各CPC酰基转移酶突变体基因。

分析每种纯化突变酶反应特性的结果表明，它们具有与野生型CPC酰基转移酶相同的反应特性(如最适温度和pH)以及物理性质(如分子量)。不过，测定各种突变酶比活性的结果提示，各种突变酶对CPC的比活性随着诱变的稳步增加而逐渐提高(表2)。在这些连续的诱变中，F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重CPC酰基转移酶突变体对CPC的比活性比野生型CPC酰基转移酶高约11.2倍。

<表2>

突变酶	对CPC的相对活性(倍)
突变酶	对CPC的相对活性(倍)	野生型	1.0
M31βL/F58βM	1.2	野生型	1.0

M31βL/F58βM/H70βS	5.2
M31βL/F58βM/H70βS	5.2	F169αY/M31βL/F58βM/H70βS	7.3
F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV	11.2	F169αY/M31βL/F58βM/H70βS	7.3

根据实施例<1-1-2>中描述的相同方法进行酶促反应后，通过Lineweaver-Burk作图法确定F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变酶的动力参数。结果其Km、Kcat和催化效率(即Kcat/Km)分别为8mM、2.4/秒和0.30/秒/mM。F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突变体与野生型酶相比，其Km值低约6.3倍、对CPC的反应效率高约15倍。这些结果证实，根据CAD三级结构信息，通过一系列定点诱变得到的本发明CPC酰基转移酶突变体对CPC的结合亲和力和比活性均有所增高。

<2-4>纯化对CPC反应性增加的CPC酰基转移酶突变体并分析其反应特征

根据实施例<2-1>中描述的相同方法，从质粒转化的重组E.coli中纯化各六重CPC酰基转移酶突变体，其转化质粒含有实施例<1-3>中编码V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突变体的CPC酰基转移酶突变体基因(TnS5αβ)，或实施例<1-4-4>中编码V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突变体的CPC酰基转移酶突变体基因(S12)。

分析纯化突变酶TnS5αβ和S12反应特性的结果表明，它们具有与野生型CPC酰基转移酶相同的反应特性(如，比活性、最适温度、最适pH)以及物理性质(如分子量)。

为了测定各种CPC酰基转移酶突变体对CPC的比活性和7-ACA的终产物抑制作用，根据实施例<1-1-2>中描述的相同方法进行酶促反应，只是将反应混合物的pH调节为8.5。结果TnS5αβ和S12突变酶对CPC的比活性分别为1.5单位/mg蛋白质和5.8单位/mg蛋白质，相当于比野生型CPC酰基转移酶高2.3和8.5倍。另外，测定S12突变酶的7-ACA抑制常数(Ki)的结果表明，野生型酶的Ki值为0.4mM，S12突变酶的Ki值为1.9mM，提示S12突变酶的7-ACA终产物抑制作用比野生型酶大为减弱。这些结果证实，本发明的S12突变酶(V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突变体)对CPC的比活性增强，而其7-ACA终产物抑制作用减弱。

实施例3：E.coli中CPC酰基转移酶突变体的产生

<3-1>使用pBC KS(+)载体产生CPC酰基转移酶突变体

将V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPC酰基转移酶突变体编码基因TnS5和TnS5αβ，以及V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC酰基转移酶突变体编码基因S12，插入pBC KS(+)载体中，以分别获得pBC-TnS5、pBC-TnS5αβ和pBC-S12重组质粒，再用各种生成的重组质粒转化E.coliMC1061。

将每一种E.coli MC1061转化体培养在50ml含有25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，25℃、200rpm下剧烈振荡48小时，并根据实施例<1-1-2>中描述的相同方法，使用从培养溶液中制备的粗酶溶液测定CPC酰基转移酶的产率。此处，使用重组质粒pBSEM和pBCPC为对照，它们分别含有野生型酰基转移酶编码基因acyII和sem。结果含有pBC-S12质粒的E.coli转化体显示出最高的CPC酰基转移酶产率，为712单位/l的水平。

<表3>

CPC酰基转移酶的形成模式	质粒(CPC酰基转移酶)	CPC酰基转移酶产率(单位/l)
CPC酰基转移酶的形成模式	质粒(CPC酰基转移酶)	CPC酰基转移酶产率(单位/l)	各亚基单独表达	pBSEM(野生型)	11
pBC-TnS5(TnS5六重突变体)	78			pBSEM(野生型)	11
pBC-TnS5(TnS5六重突变体)	78	自消化		pBCPC(野生型)	97

	pBC-TnS5αβ(TnS5αβ六重突变体)	162
	pBC-TnS5αβ(TnS5αβ六重突变体)	162	pBC-S12(S12六重突变体)	712

<3-2>使用pET29-a(+)载体产生CPC酰基转移酶突变体

<3-2-1>制备pET29-TnS5αβ和pET29-S12质粒

分别使用pET29-F引物(SEQ ID NO：40)和pET29-R引物(SEQ IDNO：41)，将重组质粒pBC-TnS5αβ和pBC-S12进行PCR扩增，各获得2.5kb的PCR产物。经PCR扩增后，该PCR产物经XbaI/XhoI消化，并通过纯化试剂盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)纯化，以获得插入DNA。此外，pET29-a(+)载体DNA(Novagen，USA)经XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，从而获得载体DNA。插入DNA和载体DNA通过T4 DNA连接酶(Roche，Germany)在16℃下反应16小时连接起来，并通过电穿孔法转化E.coli MC1061株。将该E.coli株涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，在30℃培养箱中培养过夜以选择含有突变基因的转化体。从所选的转化体中纯化质粒，并分析插入DNA的核苷酸序列，获得pET29-TnS5αβ和pET29-S12质粒。

<3-2-2>利用含有pET29-TnS5αβ或pET29-S12质粒的E.coli转化体生产CPC酰基转移酶突变体

通过电穿孔法将pET29-TnS5αβ和pET29-S12质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，分别制备含有pET29-TnS5αβ和pET29-S12质粒的重组E.coli，测量每一重组E.coli中六重CPC酰基转移酶突变体的产率。这些重组质粒中的TnS5αβ和S12 CPC酰基转移酶突变体基因在T7启动子的作用下转录，后者则由存在于pET29-a(+)载体中的LacI操纵子所控制。

将含有pET-TnS5αβ质粒的重组E.coli接种含有20μg/ml卡那霉素的3ml LB培养基中，并在30℃、200rpm下剧烈振荡培养1 6小时。将50μl该培养物溶液转移到50ml含20μg/ml卡那霉素并各含0、0.02、0.2及2％乳糖的新LB培养基上，并在25℃、200rpm下剧烈振荡培养80小时。此时，为了根据培养的时间进程测定CPC酰基转移酶突变体的产率，分别在培养的24、36、48、72和80小时从培养烧瓶中取出5μl培养基。每一培养溶液均在4℃、8,000rpm下离心10分钟分离沉淀物，并用0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)将沉淀物洗涤两次。将沉淀物悬浮于500μl的相同缓冲溶液中后，用超声波在4℃降解1分钟，并在4℃、15,000rpm下离心20分钟分离上清液，该上清液可作为六重CPC酰基转移酶粗酶溶液使用。根据实施例<1-1-2>中描述的相同方法，使用所述粗酶溶液测定六重CPC酰基转移酶对CPC的活性。

由于通常用于在pET29载体及E.coli BL21(DE3)表达系统中诱导外源基因高表达的IPTG太过昂贵，难以将其应用于工业规模的培养。因此，本发明采用一种低价诱导物——乳糖(DIFCO，USA)，以代替IPTG大规模生产CPC酰基转移酶突变体。此外，本领域中众所周知，通过在培养的早期阶段不加诱导物培养转化体一定时间以使其增殖，再于某一固定点加入诱导物以进一步培养，可使pET29载体及E.coli BL21(DE3)的表达系统在短时期内高度表达外源基因。不过，由于已知用上述诱导性表达方法生产CPC酰基转移酶时，会产生大量的无活性多肽副产物，本发明培养E.coli转化体时，在早期培养阶段加入乳糖以诱导组成性表达。根据培养的时间过程，结果在使用2％乳糖培养时，在乳糖的诱导物作用下CPC酰基转移酶的产率有所提高(表4)。

此外，从培养48小时的含有3种不同浓度乳糖(0.02、0.2及2％)的培养液中制备各种粗酶溶液，并将其进行SDS-PAGE(12％SDS聚丙烯酰胺凝胶)，以测定某一蛋白质的表达模式。结果在用2％乳糖培养时，产生了大量的CPC酰基转移酶突变体(图12)。此外，不存在对应于分子量约83kDa的无活性前体条带，从而证实，大部分无活性前体形式都经过有效的自消化转变为CPC酰基转移酶的活性形式。

<表4>

乳糖浓度	培养时间(小时)	细长生长(OD₆₀₀)	CPC酰基转移酶突变体产率(单位/l)
乳糖浓度	培养时间(小时)	细长生长(OD₆₀₀)	CPC酰基转移酶突变体产率(单位/l)	0％	24	6.8	5
36	6.9	6			24	6.8	5
36	6.9	6	48		5.8	3
0.02％	24	4.7	48		5.8	3	35
	24	4.7	36	4.2	36		35
	48	3.5	36	4.2	36	32
	48	3.5	0.2％	24	5.8	32	71
36	5.2	72		24	5.8		71
36	5.2	72		48	4.4	64
2％	24	5.7		48	4.4	64	118
	24	5.7	36	7.8	132		118
	48	9.5	36	7.8	132	168
	48	9.5	60	11.2	304	168
	72	11.5	60	11.2	304	334
	72	11.5	80	12.2	312	334

根据，根据上述相同的方法测定E.coli BL21(DE3)转化体(含有pET29-S12重组质粒)中S12突变体产生CPC酰基转移酶的产率，只是主要使用50ml含20μg/ml卡那霉素和2％乳糖的LB培养基进行培养，并将E.coli转化体在25℃、200rpm下剧烈振荡培养72小时。结果显示V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC酰基转移酶突变体(S12)的产率为1,207单位/l。

将经过pET29-S12质粒(其中含有本发明的V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC酰基转移酶突变体基因S12)转化的E.coli BL21(DE3)转化体命名为E.coli BL21(DE3)/pET-S12，根据关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约，将该转化体于2003年7月30日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic ofKorea)，登陆号KCTC 10503BP。

实施例4：使用CPC酰基转移酶突变体将CPC一步转化为7-ACA

将实施例<3-2>中分别含有pET29-TnS5αβ和pET29-S12质粒的E.coli BL21(DE3)转化体，培养在5l含20μg/ml卡那霉素和2％乳糖的5l LB培养基中，于25℃、200rpm下剧烈振荡72小时。另外，含有野生型CPC酰基转移酶基因的E.coli MC1061(pBCPC)，也被培养在含25μg/ml氯霉素的10l LB培养基中，于25℃、200rpm下剧烈振荡48小时。随后，根据如实施例<2-1>中描述的相同方法，分别从各培养基中纯化野生型CPC酰基转移酶、TnS5αβ和S12 CPC酰基转移酶突变体。得到的纯化蛋白质经过50mM磷酸盐缓冲溶液(pH 8.5)透析，透析所得的渗出液被用于CPC转化反应。

将CPC溶解于50mM磷酸盐缓冲溶液(pH 8.5)，使最终浓度为50mM后，将溶解于相同缓冲溶液中的纯化酶溶液加入上述得到的CPC溶液中，使最终浓度为5单位/ml，以制备50ml反应混合物。反应混合物在25℃下搅拌1小时以诱导CPC转化反应。此时，为了防止在转化反应中反应混合物的pH降低，当反应混合物的pH降至8.4时，通过pH调节器自动将0.2N NaOH溶液注入反应混合物内以恒定保持反应混合物pH为8.5。在转化反应的某一固定时间取出100μl反应混合物，并立即对其进行HPLC分析以定量反应混合物中的CPC和7-ACA。在HPLC分析中，使用Symmetry C18柱(Waters，USA)，以20mM醋酸胺缓冲溶液(pH 5.0)和乙腈的混合物(90∶10)为流动相。此外，流动相的流速为0.6ml/分钟，用50mM磷酸盐缓冲溶液(pH 8.5)适当稀释反应混合物，以制备将注入的样品(20μl)，在UV250nm处测量其吸收度。

结果显示，在上述反应条件下野生型CPC酰基转移酶的CPC转化率水平为60％，而本发明TnS5αβ和S12 CPC酰基转移酶突变体的CPC转化率水平则分别为86％和98％(图13)。尤其是本发明S12 CPC酰基转移酶突变体，能够有效地将CPC转化为7-ACA，并具有高水平的7-ACA产率(90％或以上)(图13和14)。

虽然对本发明的实施方案已进行了描述和说明，但显然在不背离其精神的前提下，可以对之进行多种修饰和改造，本发明的精神仅为附属权利要求的范围所定。

序列表

<110>桑多斯股份公司

<120>头胞菌素C酰基转移酶突变体及用其制备7-ACA的方法

<130>PCA30855/AMI

<160>44

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>2325

<212>DNA

<213>野生型CPC酰基转移酶acyII基因

<400>1

atgaccatgg cggcgaaaac cgatcgtgaa gcgctgcagg cggcgctgcc gccgctgagc 60

ggcagcctga gcatcccggg cctgagcgcg ccggtgcgtg tgcagcgtga tggctggggc 120

atcccgcata tcaaagcgag cggcgaagcg gatgcgtatc gtgcgttggg ctttgtgcat 180

gcgcaggatc gtctgtttca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg 240

gaatggctgg gcgcggaagc ggcggaagcg gatatcctgg tgcgtcgtct gggcatggaa 300

aaagtgtgcc gtcgtgattt tgaagcgctg ggcgcggaag cgaaagatat gctgcgtgcg 360

tatgtggcgg gcgtgaacgc gtttctggcg agcggcgcgc cgctgccgat cgaatatggc 420

ctgctgggcg cggaaccgga accgtgggaa ccgtggcata gcatcgcggt gatgcgtcgt 480

ctgggcctgc tgatgggcag cgtgtggttt aaactgtggc gtatgctggc gctgccggtg 540

gtgggcgcgg cgaacgcgct gaaactgcgt tatgatgatg gcggccagga tctgctgtgc 600

atcccgccgg gcgtggaagc ggaacgtctg gaagcggatc tggcggcgct gcgtccggcg 660

gtggatgcgc tgctgaaagc gatgggcggc gatgcgagcg atgcggcggg cggcggcagc 720

aacaactggg cggtggcgcc gggccgtacc gcgaccggcc gtccgatcct ggcgggcgat 780

ccgcatcgtg tgtttgaaat cccgggcatg tatgcgcagc atcatctggc gtgcgatcgt 840

tttgatatga tcggcctgac cgtgccgggc gtgccgggct ttccgcattt tgcgcataac 900

ggcaaagtgg cgtattgcgt gacccatgcg tttatggata tccatgatct gtatctggaa 960

cagtttgcgg aagatggccg taccgcgcgt tttggcaacg aatttgaacc ggtggcgtgg 1020

cgtcgtgatc gtatcgcggt gcgtggcggc gcggatcgtg aatttgatat cgtggaaacc 1080

cgtcatggcc cggtgatcgc gggcgatccg ctggaaggcg cggcgctgac cctgcgtagc 1140

gtgcagtttg cggaaaccga tctgagcttt gattgcctga cccgtatgcc gggcgcgagc 1200

accgtggcgc agctgtatga tgcgacccgt ggctggggcc tgatcgatca taacctggtg 1260

gcgggcgatg tggcgggcag catcggccat ctggtgcgtg cgcgtgtgcc gagccgtccg 1320

cgtgaaaacg gctggctgcc ggtgccgggc tggagcggcg aacatgaatg gcgtggctgg 1380

attccgcatg aagcgatgcc gcgtgtgatc gatccgccgg gcggcctgat cgtgaccgcg 1440

aacaaccgtg tggtggcgga tgatcatccg gattatctgt gcaccgattg ccatccgccg 1500

tatcgtgcgg aacgtatcat ggaacgtctg gtggcgagcc cggcgtttgc ggtggatgat 1560

gcggcggcga tccatgcgga taccctgagc ccgcatgtgg gcctgctgcg tgcgcgtctg 1620

gaagcgctgg gcatccaggg cagcctgccg gcggaagaac tgcgtcagac cctgatcgcg 1680

tgggatggcc gtatggatgc gggcagccag gcggcgagcg cgtataacgc gtttcgtcgt 1740

gcgctgaccc gtctggtgac cgcgcgtagc ggcctggaac aggcgatcgc gcatccgttt 1800

gcggcggtgc cgccgggcgt gagcccgcag ggccaggtgt ggtgggcggt gccgaccctg 1860

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gcgctgagcg tggcgaccca gaacctgacc ggccgtggct ggggcgaaga acatcgtccg 1980

cgttttaccc atccgctgag cgcgcagttt ccggcgtggg cggcgctgct gaacccggtg 2040

agccgtccga tcggcggcga tggcgatacc gtgctagcga acggcctggt gccgagcgcg 2100

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gatcagaacg cgccgtggag cgattgcgcg atggtgccga tgctgtatag ctgggatcgt 2280

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<210>2

<211>774

<212>PRT

<213>野生型CPC酰基转移酶AcyII蛋白

<400>2

Met Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Ala Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val

20 25 30

Arg Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg

50 55 60

Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala

65 70 75 80

Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg

85 90 95

Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala

100 105 110

Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Ash Ala Phe

115 120 125

Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala

130 135 140

Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg

145 150 155 160

Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu

165 170 175

Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp

180 185 190

Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu

195 200 205

Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu

210 215 220

Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile

245 250 255

Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala

260 265 270

Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val

275 280 285

Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala

290 295 300

Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu

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Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe Glu

325 330 335

Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp

340 345 350

Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly

355 360 365

Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala

370 375 380

Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser

385 390 395 400

Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp

405 410 415

His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val

420 425 430

Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val

435 440 445

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450 455 460

Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Leu Ile Val Thr Ala

465 470 475 480

Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp

485 490 495

Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val Ala

500 505 510

Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr

515 520 525

Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Gly

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Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr Asn

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580 585 590

Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val Ser

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Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Glu Ala Leu Ser Glu

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Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly Glu

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Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly

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Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser

725 730 735

Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val

740 745 750

Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser

755 760 765

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770

<210>3

<211>2334

<212>DNA

<213>野生型CPC酰基转移酶sem基因

<400>3

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gtggatgcgc tgctgaaagc gatgggcggc taatgactag tgaattcaag gaggtaataa 720

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tgcgatcgtt ttgatatgat cggcctgacc gtgccgggcg tgccgggctt tccgcatttt 900

gcgcataacg gcaaagtggc gtattgcgtg acccatgcgt ttatggatat ccatgatctg 960

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catccgtttg cggcggtgcc gccgggcgtg agcccgcagg gccaggtgtg gtgggcggtg 1860

ccgaccctgc tgcgtaacga tgatgcgggc atgctgaaag gctggagctg ggatgaagcg 1920

ctgagcgaag cgctgagcgt ggcgacccag aacctgaccg gccgtggctg gggcgaagaa 1980

catcgtccgc gttttaccca tccgctgagc gcgcagtttc cggcgtgggc ggcgctgctg 2040

aacccggtga gccgtccgat cggcggcgat ggcgataccg tgctagcgaa cggcctggtg 2100

ccgagcgcgg gcccggaagc gacttatggc gcgctgagcc gttatgtgtt tgatgtgggc 2160

aactgggata acagccgttg ggtggtgttt catggcgcga gcggccatcc ggcgagcccg 2220

cattatgcgg atcagaacgc gccgtggagc gattgcgcga tggtgccgat gctgtatagc 2280

tgggatcgta tcgcggcgga agcggtgacc agccaggaac tggtgccggc gtaa 2334

<210>4

<211>229

<212>PRT

<213>CPC酰基转移酶AcyII蛋白的α亚基

<400>4

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1 5 10 15

Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val Arg

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Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly Glu

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<211>535

<212>PRT

<213>CPC酰基转移酶AcyII蛋白的β亚基

<400>5

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1 5 10 15

Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr

20 25 30

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35 40 45

Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val

50 55 60

Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe

85 90 95

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100 105 110

Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala

115 120 125

Gly Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe

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Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala

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Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile

165 170 175

Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu

180 185 190

Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro

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245 250 255

Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val

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Ala Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp

275 280 285

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Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile

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Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr

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Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val

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Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asn

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Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp

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Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp

465 470 475 480

Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala

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Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met

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<210>6

<211>2325

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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cgtcatggcc cggtgatcgc gggcgatccg ctggaaggcg cggcgctgac cctgcgtagc 1140

gtgcagtttg cggaaaccga tctgagcttt gattgcctga cccgtatgcc gggcgcgagc 1200

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aacaaccgtg tggtggcgga tgatcatccg gattatctgt gcaccgattg ccatccgccg 1500

tatcgtgcgg aacgtatcat ggaacgtctg gtggcgagcc cggcgtttgc ggtggatgat 1560

gcggcggcga tccatgcgga taccctgagc ccgcatgtgg gcctgctgcg tgcgcgtctg 1620

gaagctttgg gcatccaggg cagcctgccg gcggaagaac tgcgtcagac cctgatcgcg 1680

tgggatggcc gtatggatgc gggcagccag gcggcgagcg cgtataacgc gtttcgtcgt 1740

gcgctgaccc gtctggtgac cgcgcgtagc ggcctggaac aggcgatcgc gcatccgttt 1800

gcggcggtgc cgccgggcgt gagcccgcag ggccaggtgt ggtgggcggt gccgaccctg 1860

ctgcgtaacg atgatgcggg catgctgaaa ggctggagct gggatgaagc gctgagcgaa 1920

gcgctgagcg tggcgaccca gaacctgacc ggccgtggct ggggcgaaga acatcgtccg 1980

cgttttaccc atccgctgag cgcgcagttt ccggcgtggg cggcgctgct gaacccggtg 2040

agccgtccga tcggcggcga tggcgatacc gtgctagcga acggcctggt gccgagcgcg 2100

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gatcagaacg cgccgtggag cgattgcgcg atggtgccga tgctgtatag ctgggatcgt 2280

atcgcggcgg aagcggtgac cagccaggaa ctggtgccgg cgtaa 2325

<210>7

<211>229

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>突变的CPC酰基转移酶S12蛋白的α亚基

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Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu

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225

<210>8

<211>535

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>突变的CPC酰基转移酶S12蛋白的β亚基

<400>8

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro

1 5 10 15

Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr

20 25 30

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65 70 75 80

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Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Val

165 170 175

Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu

180 185 190

Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro

195 200 205

Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His

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260 265 270

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Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile

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Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr

325 330 335

Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Gly

340 345 350

Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val

355 360 365

Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Ash

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Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Glu Ala Leu Ser

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Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly

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Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Cys Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp

465 470 475 480

Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala

485 490 495

Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met

500 505 510

Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr

515 520 525

Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala

530 535

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>T3引物

<400>9

aattaaccct cactaaaggg a 21

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>T7引物

<400>10

taatacgact cactataggg 20

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M13-R引物

<400>11

ggaaacagct atgaccatg 19

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M13-F引物

<400>12

gtaaaacgac ggccagt 17

<210>13

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CPC-F引物

<400>13

ataccgctcg aggtcctaga aaaaaccaag gaggtaataa ataatgacca tggcggcg 58

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CPC-R引物

<400>14

ctagctctag agatcctcat tacgccggca ccagttc 37

<210>15

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>αORF-R引物

<400>15

ttattacctc cttgaattca ctagtcatta gccgcccatc gctttc 46

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>βORF-F引物

<400>16

ctagtgaatt caaggaggta ataaataatg agcaacaact gggcgg 46

<210>17

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HindIII-F引物

<400>17

gcgtgcgcgt ctggaagctt tgggcatcca gggc 34

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HindIII-R引物

<400>18

gccctggatg cccaaagctt ccagacgcgc acgc 34

<210>19

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M31βL-R引物

<400>19

gtcaggccga tcatatcaaa acgatcgcac gccagatgat gctgcgcata aaggcccggg 60

atttc 65

<210>20

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F58βM-F引物

<400>20

gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat atggcgcata 60

acggc 65

<210>21

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F58βC-F引物

<400>21

gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat tgcgcgcata 60

acggc 65

<210>22

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F58βA-F引物

<400>22

gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat gcggcgcata 60

acggc 65

<210>23

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F58βV-F引物

<400>23

gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat gtggcgcata 60

acggc 65

<210>24

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F58βL-F引物

<400>24

gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat ctggcgcata 60

acggc 65

<210>25

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F58βN-F引物

<400>25

gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat aatgcgcata 60

acggc 65

<210>26

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H70βS-F引物

<400>26

ggcgtattgc gtgaccagcg cgtttatgga tatcc 35

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H70βS-R引物

<400>27

ggatatccat aaacgcgctg gtcacgcaat acgcc 35

<210>28

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H70βL-F引物

<400>28

ggcgtattgc gtgaccctgg cgtttatgga tatcc 35

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H70βL-R引物

<400>29

ggatatccat aaacgccagg gtcacgcaat acgcc 35

<210>30

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F169αY-F引物

<400>30

gatgggcagc gtgtggtata aactgtggcg tatg 34

<210>31

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F169αY-R引物

<400>31

catacgccac agtttatacc acacgctgcc catc 34

<210>32

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I176βV-F引物

<400>32

cgtggctggg gcctggttga tcataacctg gtg 33

<210>33

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I176βV-R引物

<400>33

caccaggtta tgatcaacca ggccccagcc acg 33

<210>34

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H70β-F引物

<400>34

ggcgtattgc gtgacccatg cgtttatgga tatcc 35

<210>35

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>H70β-R引物

<400>35

ggatatccat aaacgcatgg gtcacgcaat acgcc 35

<210>36

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G139αS-F引物

<400>36

cgctgccgat cgaatatagc ctgctgggcg cggaac 36

<210>37

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G139αS-R引物

<400>37

gttccgcgcc cagcaggcta tattcgatcg gcagcg 36

<210>38

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>αCPC-R引物

<400>38

gctgccgccg cccgccgcat cgctcgcatc gccgcccatc gctttcagc 49

<210>39

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>βCPC-F引物

<400>39

gcgatgcgag cgatgcggcg ggcggcggca gcaacaactg ggcggtg 47

<210>40

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pET29-F引物

<400>40

tcccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg accatggcgg 60

cgaaaactg 69

<210>41

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pET29-R引物

<400>41

gtggtgctcg agtcattacg ccggcaccag ttc 33

<210>42

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M31β-R引物

<400>42

gtcaggccga tcatatcaaa acgatcgcac gccagatgat gctgcgcata catgcccggg 60

atttc 65

<210>43

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I75βT-F引物

<400>43

cgtgacccat gcgtttatgg atacccatga tctgtatctg gaacagtttg 50

<210>44

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I75βT-R引物

<400>44

caaactgttc cagatacaga tcatgggtat ccataaacgc atgggtcacg 50

<210>45

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F169α-F引物

<400>45

gatgggcagc gtgtggttta aactgtggcg tatg 34

<210>46

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F169α-R引物

<400>46

catacgccac agtttaaacc acacgctgcc catc 34

Claims

1.CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于选自下组中的至少一个氨基酸被另一氨基酸所取代，这些氨基酸包括SEQ ID NO：4的CPC酰基转移酶α-亚基中的Val121α、Gly139α和Phe169α和SEQ IDNO：5的CPC酰基转移酶β-亚基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β。

2.如权利要求1的CPC酰基转移酶突变体，其中：

Val121α为丙氨酸所取代；

Gly139α为丝氨酸所取代；

Phe169α为酪氨酸所取代；

Met31β为亮氨酸所取代；

His70β为丝氨酸或亮氨酸所取代；

Ile75β为苏氨酸所取代；

Ile176β为缬氨酸所取代；或

Ser471β为半胱氨酸所取代。

3.如权利要求2的CPC酰基转移酶突变体，其中Met31β为亮氨酸所取代，而Phe58β为丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代。

4.如权利要求3的CPC酰基转移酶突变体，其中His70β进一步为丝氨酸或亮氨酸所取代。

5.如权利要求4的CPC酰基转移酶突变体，其中Phe169α进一步为酪氨酸所取代。

6.如权利要求5的CPC酰基转移酶突变体，其中Ile176β进一步为缬氨酸所取代。

7.如权利要求3的CPC酰基转移酶突变体，其中Phe169α进一步为酪氨酸所取代，而Ile176β进一步为缬氨酸所取代。

8.如权利要求7的CPC酰基转移酶突变体，其中Val121α进一步为丙氨酸所取代。

9.如权利要求7的CPC酰基转移酶突变体，其中Gly139α进一步为丝氨酸所取代。

10.如权利要求7的CPC酰基转移酶突变体，其中Val121α进一步为丙氨酸所取代，而Gly139α进一步为丝氨酸所取代。

11.如权利要求2的CPC酰基转移酶突变体，其中Val121α为丙氨酸所取代；Gly139α为丝氨酸所取代；Phe58β为丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代；而Ile176β为缬氨酸所取代。

12.如权利要求11的CPC酰基转移酶突变体，其中Phe169α进一步为酪氨酸所取代。

13.如权利要求11的CPC酰基转移酶突变体，其中Ile75β进一步为苏氨酸所取代。

14.如权利要求11的CPC酰基转移酶突变体，其中Ser471β进一步为半胱氨酸所取代。

15.如权利要求11的CPC酰基转移酶突变体，其中Ile75β进一步为苏氨酸所取代，而Ser471β进一步为半胱氨酸所取代。

16.如权利要求15的CPC酰基转移酶突变体，其含有SEQ ID NO：7的包括CPC酰基转移酶α-亚基和SEQ ID NO：8的CPC酰基转移酶β-亚基的氨基酸序列。

17.编码权利要求1的CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物的基因。

18.如权利要求17的基因，其具有如SEQ ID NO：6描述的核苷酸序列。

19.含有权利要求17的基因的重组表达载体。

20.如权利要求19的重组表达载体，其是pET29-S12。

21.用权利要求19的重组表达载体转化的微生物。

22.如权利要求21的微生物，其是E.coli BL21(DE3)(pET29-S12)(登陆号：KCTC 10503BP)。

23.制备权利要求1的CPC酰基转移酶突变体的方法，其包括在适当的条件下培养权利要求21的微生物，并从液体培养基中回收CPC酰基转移酶的步骤。

24.如权利要求23的方法，其进一步包括向液体培养基中加入乳糖作为培养早期阶段的诱导物的步骤。

25.含有权利要求1的CPC酰基转移酶突变体的组合物，其用于一步酶合成法制备7-ACA。

26.制备式II的化合物的方法，其包括将式I的化合物与权利要求1的CPC酰基转移酶突变体相接触的步骤：

<式I>

<式II>

其中，R为乙酸基(-OCOCH₃)、羟基(-OH)、氢(-H)或其盐。

27.如权利要求26的方法，其中使用的CPC酰基转移酶包括下列形式：权利要求21的微生物的液体培养基、权利要求25的组合物、从培养物溶液中纯化的CPC酰基转移酶突变体的游离形式或CPC酰基转移酶突变体的固定化形式。

28.如权利要求26的方法，其中式I化合物与CPC酰基转移酶突变体的接触反应在水性溶液中进行。

29.如权利要求26的方法，式I化合物的浓度为1至500mM，而加入CPC酰基转移酶突变体的量为0.1至100U/ml。

30.如权利要求26的方法，其中式I化合物与CPC酰基转移酶突变体的接触反应在pH 7-10、4至40℃下进行0.1至24小时。