CN102154429A - 一步酶法制备7-氨基头孢烷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一步酶法制备7-氨基头孢烷酸，本发明的制备7-氨基头孢烷酸的方法，经过以下四个步骤：步骤1，头孢菌素C发酵液的处理；步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-氨基头孢霉烷酸；步骤3，对酶解后得到的7-氨基头孢霉烷酸裂解液进行处理；步骤4，7-氨基头孢霉烷酸的结晶和干燥。
Description
技术领域：
本发明涉及一种酶裂解法的应用，具体而言是涉及一种用于制备7-氨基头孢烷酸的一步酶法应用。
背景技术：
7-氨基头孢烷酸，又名：7-氨基头孢霉烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，结构式：
是目前半合成头孢菌素的重要基础原料，目前工业上通常由头孢菌素C(CephalosporinC，CPC)，通过化学法或二步酶法裂解制备，脱去7-位的D-α-氨基己二酸侧链得到7-ACA.
化学法生产7-ACA，有着大量排泄环境污染物质的致命缺陷，这与今日的环境保护概念格格不入，后来发展出二步酶法生产7-ACA，用头孢菌素C通过两种酶，即D-氨基酸氧化酶及戊二酰7-ACA酰化酶的作用，可以生成7-ACA。1990年《中国科学报》报导了中国科学院植物生理研究所，以头孢菌素C为原料，二步酶法制备7-ACA获得成功。1986年日本有了一步酶法制备7-ACA的专利申请。二步酶法虽然解决了化学法的污染环境问题，但是二步酶法在收率、纯度及成本方面显得有些不足，并且后一步GL-7-ACA的工艺过程较难控制。
中国专利CN200510089965提供了一种从头孢菌素C制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法，其中所用的D-氨基酸氧化酶为一种经纯化的三角酵母D-氨基酸氧化酶突变体。
中国专利CN94112285提供一种一步两酶法从头孢菌素C制造7-氨基头孢霉烷酸的方法。即在一个反应器的水相系统中加入D-氨基酸氧化酶、GL-7ACA酰化酶。
中国专利CN 200410016825.9以D-氨基酸氧化酶(DAAO)氧化头孢菌素C生产戊二酰-7-氨基头孢酶烷酸(GL-7-ACA)，再由GL-7-ACA酰化酶催化脱酰生产7-ACA。以及中国专利CN200410039573一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，CN200310113563一种生产7-氨基头孢烷酸的方法及其专用重组酶公开的方法也存在同样的问题。
虽然一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸比二步酶法优越，但采用不同的酶其效率具有很大的不同，其具体的处理方法也会对产物的收率和纯度产生影响，
现有技术公开了一种一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸的方法，但对制备条件没有充分说明，本发明通过筛选，找到最佳的生产条件，获得了一种方法，兼有了化学法(高收率和高纯度)和二步酶法(环保和高收益)的优点，同时比现有一步酶法更加简洁，产物收率更高，纯度更高，反应条件更加温和快速，大大节省了生产成本。
发明内容：
本发明的目的是提供一种一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸的工艺方法，本发明的方法克服了现有技术的缺陷。
本发明的制备7-氨基头孢烷酸的方法，经过以下四个步骤：
步骤1，头孢菌素C发酵液的处理；
步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-氨基头孢霉烷酸；
步骤3，对酶解后得到的7-氨基头孢霉烷酸裂解液进行处理；
步骤4，7-氨基头孢霉烷酸的结晶和干燥。
其中，
步骤1中所取用的头孢菌素C发酵液需经预处理得到适当浓度及纯度方可进行酶解反应。
步骤2中酶解反应过程要恰当控制反应PH、酶用量等参数，优选的头孢菌素C酰基转移酶是(NRB-103)购买自NURIBIOTECH Co.，Ltd公司。
步骤3中7-氨基头孢霉烷酸裂解液采用浓缩，脱炭、过滤等措施处理，使其达到结晶前的良好状态。
步骤4中为获得良好的7-氨基头孢霉烷酸结晶产品，选用了最优的结晶方法。
本发明优选的方法，经过以下四个步骤：
步骤1，取头孢菌素C发酵滤液，过滤，调pH到9-10。
步骤2，头孢菌素C酰基转移酶(NRB103)和头孢菌素C在室温下反应，直到用高效液相仪鉴测7-氨基头孢霉烷酸完全生成，控制反应pH在9-10。
步骤3，向上一步得到的7-氨基头孢霉烷酸反应液中加入Na2S2O4，调pH6-7，加吐温80和二氯甲烷，分相，在水相中加入活性炭和EDTA，过滤得7-氨基头孢霉烷酸液体。
步骤4，7-氨基头孢霉烷酸液体调pH值使成为酸性，析出结晶后，滤出结晶，用丙酮洗涤，干燥。
本发明的一步酶法兼有了化学法(高收率和高纯度)和二步酶法(环保和高收益)的优点，比较结果如下：
附表1.现有技术与本发明一步酶法比照表
本发明工艺收率高，纯度高，步骤少，设备简单，转化率高，反应条件更加温和安全快速，大大节省了生产成本。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1.头孢菌素C(CPC)液的预处理：
取头孢菌素C(CPC)发酵滤液1升(75mM，相当于纯CPC31.1克)，过1μm膜滤，用氨水调PH到10。
实施例2反应条件控制：
向反应器中加入(NRB-103)酶167克，水洗二次，加入CPC液后，快速搅拌下，用氨水控制PH为10，反应30分钟，7-ACA转化率98％。
实施例3裂解液(7-ACA液)的处理：
向得到的2升7-ACA液中加入10克Na2S2O4，用氨水调PH为7，加吐温80，1毫升，加入二氯甲烷200毫升，搅拌10分钟，分相，在水相中加入活性炭2.0克，加入EDTA1.0克，搅拌15分钟，过滤除炭得7-ACA处理液。
实施例4 7-ACA结晶
向7-ACA处理液中滴加浓盐酸，使PH为2，结晶完全后，滤出结晶，300毫升丙酮洗涤结晶，真空干燥至干，重量收率65.24％，纯度98.56％。
Claims (2)
1.一种制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于，包括以下四个步骤：
步骤1，取头孢菌素C发酵滤液，过滤，调pH到9-10；
步骤2，头孢菌素C酰基转移酶和头孢菌素C在室温下反应，直到用高效液相仪鉴测7-氨基头孢霉烷酸完全生成，控制反应pH在9-10；
步骤3，向上一步得到的7-氨基头孢霉烷酸反应液中加入Na2S2O4，调pH6-7，加吐温80和二氯甲烷，分相，在水相中加入活性炭和EDTA，过滤得7-氨基头孢霉烷酸液体；
步骤4，7-氨基头孢霉烷酸液体调pH值使成为酸性，析出结晶后，滤出结晶，用丙酮洗涤，干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下四个步骤：
步骤1，取头孢菌素C发酵滤液1升，过1μm膜滤，用氨水调PH到10得到头孢菌素C处理液；
步骤2，向反应器中加入头孢菌素C酰基转移酶NRB-103，167克，水洗二次，加入步骤1得到的头孢菌素C处理液液后，快速搅拌下，用氨水控制PH为10，反应30分钟，得到7-氨基头孢霉烷酸，转化率98％；
步骤3，向得到的2升7-氨基头孢霉烷酸液中加入10克Na2S2O4，用氨水调PH为7，加吐温80，1毫升，加入二氯甲烷200毫升，搅拌10分钟，分相，在水相中加入活性炭2.0克，加入EDTA1.0克，搅拌15分钟，过滤除炭得7-氨基头孢霉烷酸处理液；
步骤4，向7-氨基头孢霉烷酸处理液中滴加浓盐酸，使PH为2，结晶完全后，滤出结晶，300毫升丙酮洗涤结晶，真空干燥至干，重量收率65.24％，纯度98.56％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110817 |