JPH11505425A - ６−アミノペニシラン酸（６−ａｐａ）を製造するためのかわりの方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ６−アミノペニシラン酸を得るためのかわりの方法。本方法は、固体としての中間体ペニシリン塩の有機溶媒での抽出並びに単離及び分離のステップを、少なくともこの連続的ステップにおける培養ブイヨンの限外ろ過の方法に置き換えることを含む。その第１のステップは、20,000ダルトンの分子量のための遮断を有し、第２のステップは、2000ダルトンのそれを有する。酵素転化ステップの後、そのステップからの産物は一連の陰イオン交換クロマトグラフィーステップにかけられる。

Description

【発明の詳細な説明】 ６−アミノペニシラン酸（６−APA）を製造するためのかわりの方法 本発明は、培養ブイヨンの超遠心、及びイオン交換樹脂を用いる酵素加水分解 産物の分画的回収により、６−アミノペニシラン酸(６−APA)を得る及び根本的 に回収するための新しいかわりの方法を含む。 従来技術 ６−APA の１つは種々のペニシリンの必要なｂ−ラクタム化合物である。ペニ シリンは、ペプチド結合を通して６位におけるアミノ基に結合した側鎖の性質に より互いから分解する、β−ラクタム（４員）環に融合した（１の硫黄原子を含 む５員の）チアゾリジン環からなるヘテロ環基からなる。６−APA の式は： である。 ６−APA の形態及び存在がペニシリンの発酵により検出されている場合でさえ 、そして結果としてブイヨン内で、その量がほんの少しである場合でさえ、その 使用方法はこの産物を得る様式が他の経路に先んじて、通常次の順序に従う。 栄養素及びエネルギーの使用のための最適条件下でのペニシリウム・キリソゲ ヌム(Penicillium chrysogenum)タイプの微生物の発 酵は、通常 PenＧ又は PenＶである用いられる前駆体により、対応するペニシリ ンの最も大きな産出量を得ることを可能にする。他の代謝物を形成する他の反応 、並びにペニシラン酸へのペニシリンの避けるのが難しいデグラデーション反応 及び制御されなければならないＯ−ヒドロキシフェニル酢酸のような酸化誘導体 へのフェニル酢酸前駆体の酸化がこのタイプの発酵の間に、及びペニシリン生合 成反応と一緒におこる。 発酵が完了した後、その培養ブイヨンは上述の化合物＋生物量の微生物を含み 、通常の過程は、基本的に、周知の物理学的手順：ろ過、遠心等によりこの生物 量を取り除いて、より多い又は少ない程度に分類されており、生物量を含まない ろ過されたブイヨンを作ることからなる。 この溶液から始めて、最も広く用いられる方法は、ほとんどの場合、界面活性 剤の使用を要求する、ブイヨンと有機溶媒との間に形成するエマルションを扱う ことができる適切な装置を用いて酢酸pHにおいて液体−液体抽出を行うことを含 む。ブイヨンと混和しないものでなければならない通常用いられる溶媒は、エス テル、例えば酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル等；ケトン、例えばメチルイソブチル ケトン；アルコール、例えばｎ−ブチノール等を含む。この段階の効力は、温度 制御、酢酸pHにおける不活性化と有機相の不適切な分離に関連した物理的損失と の両方により消耗され、含まれて残り得、そしていずれの場合にも高価な装置を 要求するブイヨン中の特性の損失、コスト及び環境の問題を生ずる界面活性剤の 使用、並びに溶媒の使用によって影響を受ける。 この方法によって得られた有機物の豊富な相は、通常不純物を除去するために 、精製段階：遠心、洗浄、活性炭素での処理等を要求する。ペニシリンは、それ を不溶にし、後にろ過によって分離され るようにするために、適切な形態において、対応する陽イオン、通常Ｋ⁺を導入 することによりこの有機相から結晶析出され、乾燥、パッケージング及び検査で 終了する。 通常高い純度を有する結果として生ずるペニシリンは、いくつかの場合に問題 を生じ得るいくらかの不純物を含むとしても、位置６のアミノ基に結合した側鎖 を除去する反応によって６−APA に転化される。この反応は、最初に化学的過程 によって行われるが、現在それは頻繁に、種々の手順によって固定化され、即ち 例えばスペイン特許第369,125 号において記載されるような、支持体への捕獲、 イオン又は共有結合として一緒に一団にされたペニシリンアシラーゼ又はアミダ ーゼ（３，５，１，11）タイプの酵素を用いて酵素過程を通して行われる。酵素 のソースは種々であり、例えば種々のバクテリアタイプの微生物のものであり、 大腸菌からのアシラーゼ及び工業的に改良されているこの種の様からのアシラー ゼが最も頻繁に用いられることが認められている。この酵素の機能は、弱アルカ リ性のpHの制御下で水性相で通常おこる反応において側鎖を認識し、それを６− APA 核に連結するペプチド結合を破壊することである。次に６−APA は、そのpH を等電点に対応するpHに調節することによって単離され、他方側鎖構成物は最初 に溶媒抽出され、次に適切なテストの後に発酵自体における前駆体として再利用 するための更なる水相抽出が行われる。 次に結晶化母液中に存在する６−APA 産物の回収の段階が、結晶化をより容易 にする濃度への逆浸透による濃縮を通して要求され得る。 本発明が克服する当該技術に固有の問題は種々の種類のものである。一方で、 溶媒及び脱乳化剤（基本的に第４アンモニウム塩）の使用は廃棄物の主要な環境 的問題を生じ、その処理はコスト並びに 方法並びにそれに関連する装置及び設備の複雑さに影響を与える。 同様に、粉末状固体の分画的調製は、高い最終産物の汚染の危険を生じさせる 。 本発明は、６−アミノペニシラン酸の生産において現在存在するいくつかの問 題を克服するようデザインされる。特に、本発明は段階を排除することにより生 産の過程を単純化する。ろ過されたペニシリンブイヨンから始めて、発酵ブイヨ ン自体の直接的使用の可能性が除外され得ないとしても、その最終的分析におけ る目的がこの段階を正当化する速度及び倹約の条件下で後の酵素加水分解を許容 する純度の適切なレベルを有する中間生成物を調製することである。 −有機溶媒での抽出 −固体としての中間体のペニシリン塩の単離及び分離 の段階がそれ自体本質的でなく、装置、コスト及び環境的要求に関して上述の問 題を生じさせると感じられる。 ６−APA への酵素転化のために用いることができる溶液中のペニシリンを精製 するこの目的を達成するかわりのものが本発明の内容である。有機溶媒での抽出 により達成される不純物の除去及び結晶化から生ずる更なる精製は限外ろ過（UF ）段階に置き換えられる。 UFが膜内の孔より大きい全て又はほとんどの分子を保持するのに十分な大きさ で、小さい大きさの又は分子遮断より小さい大きさの溶媒及び分子の通過を許容 する孔を有する、フィルター障壁として機能する膜を通しての対応する溶解のス テップを基本的に通してのそれらの大きさに従う溶けた分子の分離のための技術 であるという事実に基づいて、大きな分子が豊富な画分−保持画分−及び小さな 分子が豊富で大きな分子を含まない溶液又は浸透液がこの方法で得られる。圧力 、温度及び溶液のpHの効果とあわせて、この分離を達 成することにおける決定因子は、膜の化学的性質及び分子の大きさの遮断値にお いて反映する孔の実際の大きさである。 バイオテクノロジーの範囲内でのUFの適用は、例えばZA8003750,JP56148683， JP61070999，WO8707525，WO8704169で周知であるが、ブイヨンの導入量と浸透液 ／透析ろ液の生産量との間を伝わる距離が、20℃未満の温度の適切な制御下で可 能性ある微生物の汚染の効果が減少し溶けた産物の安定性が増加する結果を生ず るとともに最少になるように、連続的過程の条件下で最大の精製を達成するとい う要求を満たしながら作業を行うことは重大な価値があることであると感じられ る。 周知の他のものが、液体−液体抽出によってそれから回収することができるAF A の溶液を残す結晶化を通しての６−AFA の分離をもたらすこの転化の終了に基 づくと、順番に転化の終りを樹脂を用いる精製の段階と組み合わせることは、６ −APA 及びAPA の単離はかりでなく連続的だとしても溶出の制御を通して１つの 作業でそれらを同時に分離することも達成する。この点で、強塩基性樹脂を用い る文献(F．R．Batchelor ら、Proc．Roy．Soc．Biochemistry-1961-Vol．154，4 98)に記載される樹脂の使用に関する指示は他の付随する化合物から独立しての ６−APA 単独の単離及び精製に制限される。 ６−APA 溶出液は、結晶化によるこの産物の主要物分離、及び容量を減少させ ることにより濃度を増加させることによる母液からの更なる量の６−APA の回収 を達成することを可能にする。 発明の記載 本発明は、６−APA を得るための周知の方法にかわる方法であって、そのコス ト及びその収率を改良し、用いられる装置を単純化し 、そしてその環境的要求を増進させる方法に関し、その方法は、以下の改良： ２つの段階： 20,000ダルトンのオーダーの見掛けの遮断の新段階 2000ダルトンのオーダーの見掛けの遮断の第２段階 における限外ろ過(ultrafiltration)膜での処理の段階を通してのろ過され又 は遠心されたブイヨンのコンディショニングによりなされる。 ペニシリンブイヨンの場合に、このUFの原理を用いる最も優れた精製効果は、 2000ダルトンのオーダーの分子遮断を有する膜を用いる微小ろ過(nanofiltratio n)の効果と組み合わせた、20,000ダルトンのオーダーの分子遮断を有するポリス ルホン又はポリエーテルスルホン膜を用いて達成される。微小ろ過は、特に塩化 物及び硫酸塩の形態における二価のCa²⁺及びMg²⁺塩並びに溶液汚染物の排除を特 徴とする。この方法において、ブイヨンは、生物量及び不溶性化合物の残りと共 にタンパク質及び高分子量の代謝構成物を除去することにより、精製することが できる。得られた代謝物及び酵素の豊富なフィルター固形物は動物飼料として更 に用いることができる。 −固体としての中間体のペニシリン塩の単離及び分離の段階と共に、有機溶媒 での抽出による精製の段階を除去する。 −固定された酵素を用いて、UFにより精製されたペニシリン溶液上での迅速な 転化の条件下で酵素転化を行う。限外ろ過段階から生ずる浸透液は、他の可溶性 化合物と共にペニシリンＧの溶液を含む。保存容器を通して、酵素／基質定量を 、加水分解時間が相当に削減され得、作業が準連続的であるように調整すること ができる。酵素の作用の結果として、６−APA，AFA、及び酵素の挙動に実質的に 影響を与えない基本的な無機塩の溶液が得られる。 −その方法をくり返し、発酵において側鎖を再使用することを可能による様式 で、交換樹脂を用いて酵素加水分解の産物を同時に回収し及び連続的に分離し、 並びにアンピシリンの対応する誘導体であるアモキシリンタイプへの転化が、適 切な形態において活性化された対応する側鎖と及び関連する酵素との酵素反応に よって続けることができる条件下でこの化合物の溶液を得る。 以下の実施例はいずれの限定を行うこともなく本発明の実施形態として供され る。 実施例１ ろ過により発酵ブイヨンから生物量を分離し、ろ過したブイヨンを、20,000ダ ルトン膜を用いて、連続的に、30倍のオーダーの濃度になるように、限外ろ過し た。ペニシリン活性の損失を減らすため、保持された画分を透析ろ過(diafilter ed)した。2000ダルトン膜を用いた第２のUF通過を、連続的過程と同様に、浸透 液＋透析ろ液(diafiltrate)で行った。 これは、約60〜90分を要する作業においてpH値を維持することによる反応の制 御で、ペニシリンを６−APA 及びフェニル酢酸に転化する様式におけるリサイク ル回路で酵素転化が行われるのを許容するに十分に精製された約20ｇ／ｌのペニ シリンを含む浸透液を生じた。 発酵から生じた他の付随する産物と共に７ｇ／ｌのオーダーの濃度のフェニル 酢酸(AFA)＋10ｇ／ｌのオーダーの濃度の６−APA の水性相における混合液から なる酵素転化の終りにおける対応する溶液を、非イオンタイプの樹脂、例えばXA D16 を含む第１のカラム、並びに酢酸塩の形態におけるSA 11Aタイプの強陰イオ ン性樹脂が充填された更なる４つのカラムを含む樹脂の組を通過させた。 カラムXAD16 への供給は、最終的転化溶液の全部で約13ｖ／ｖが２ｖ／ｖ・ｈ のオーダーの比率で下に流れて通過するように、及びこの樹脂からの流出が第１ の陰イオン樹脂カラムの頂上に供給されるようにした。同様に、この第１の陰イ オン性カラムの底からの流出が第２の陰イオン樹脂カラムの頂上に供給されるよ う、全ての４つのカラムのセットを通過するまでそれを行った。非イオン性カラ ムへの供給が完了した時に、第１の陰イオン樹脂カラムに供給された容量に加え られた１ｖ／ｖの水でそれを流した。 この時点において、XAD16 樹脂はそれがAFA 又は６−APA を吸着していないこ とを検査することによりその仕事を行い、形成された対応する廃物が使用されな いものであるとしても、再生され得ることが考慮され得た。処理を要する固体の ４〜10ｇ／ｌのオーダーを含む残留物は溶出されることが見い出された。 保持された６−APA の量が置き換えられ、第２のカラムに供給されるように、 ６ｖ／ｖの0.05ＮのNaCl溶液を第１の陰イオン性カラムを通過させた。次にこれ を同様の手順を用いて、2.5 ｖ／ｖの同じ溶液で流した。この方法において、第 １及び第２のカラムは選択的にAFA で満たされ、他方第３及び第４のカラムは６ −APA で満たされた。次に各々のカラムを、発酵のために再使用され得るAFA の 溶液を調製することを可能にする第１及び第２のカラムのためのNaOHの溶液を用 いて、並びに６−APA の溶解に影響を与える２ｖ／ｖの割合の第３及び第４のカ ラムのための１Ｍ NaCl を用いて、別個にて溶出させた。活性の近似的分布は次 の通りであった。 AFA は、第１及び第２のカラムに応じて溶出された混合液から回 収され、又はその検査された濃度及び特徴により発酵にリサイクルすることがで きた。同様に、しかし別個に、６−APA はそのpHをその産物についての等電点に 調節することにより、第３及び第４のカラムに対応する溶出液の混合液を用いて 結晶析出し、単離することができた。 実施例２ ろ過により発酵ブイヨンから生物量を分離し、ろ過したブイヨンを、20,000ダ ルトン膜を用いて、連続的に、30倍のオーダーの濃度になるように、限外ろ過し た。ペニシリン活性の損失を減らすため、保持された画分を透析ろ過(diafilter ed)した。2000ダルトン膜を用いる第２のUF通過を、連続的過程と同様に、浸透 液＋透析ろ液(diafiltrate)で行った。 これは、約60〜90分を要する作業においてpH値を維持することによる反応の制 御で、ペニシリンを６−APA 及びフェニル酢酸に転化する様式におけるリサイク ル回路で酵素転化が行われるのを許容するに十分に精製された約20ｇ／ｌのペニ シリンを含む浸透液を生じた。 発酵から生じた他の付随する産物と共に７ｇ／ｌのオーダーの濃度のフェニル 酢酸(AFA)＋10ｇ／ｌのオーダーの濃度の６−APA の水性相における混合液から なる酵素転化の終りにおける対応する溶液を、非イオンタイプの樹脂、例えばXA D16 を含む第１のカラム、並びに酢酸塩形態において再生され、コンディショニ ングされるIRA68 タイプの弱陰イオン性樹脂が充填された更なる２つのカラム、 更に酢酸塩の形態において同様に再生されコンディショニングされるSA 11Aタイ プの強陰イオン性樹脂が充填された更なる２つのカラムを含む樹脂の組を通過さ せた。 カラムXAD16 への供給は、最終的転化溶液の全部で約13ｖ／ｖが ４ｖ／ｖ・ｈのオーダーの比率で下に流れて通過するように、及びこの樹脂から の流出が第１の弱陰イオン樹脂カラムの頂上に供給されるようにした。同様に、 この第１の陰イオン性カラムの底からの流出が第２の陰イオン樹脂カラムの頂上 に供給されるよう、全ての４つのカラムのセットを通過するまでそれを行った。 非イオン性カラムへの供給が完了した時に、第１の陰イオン樹脂カラムに供給さ れた容量に加えられた１ｖ／ｖの水でそれを流した。 この時点において、XAD16 樹脂はそれがAFA 又は６−APA を吸着していないこ とを検査することによりその仕事を行い、形成された対応する廃物が使用されな いものであるとしても、再生され得ることが考慮され得た。処理を要する固体の ４〜10ｇ／ｌのオーダーを含む残留物は溶出されることが見い出された。 保持された６−APA の量が置き換えられ、第２のカラムに供給されるように、 ６ｖ／ｖの0.05ＮのNaCl溶液を第１の弱陰イオン性カラムを通過させた。次にこ れを同様の手順を用いて、2.5 ｖ／ｖの同じ溶液で流した。この方法において、 第１及び第２のカラムは選択的にAFA で満たされ、他方第３及び第４のカラムは ６−APA で満たされた。次に各々のカラムを各々の場合、１ＭのNaCl溶液を用い て別個に溶出した。第１及び第２のカラムを３ｖ／ｖで溶出してAFA を収集し、 第３及び第４のカラムを２ｖ／ｖで溶出して６−APA の溶液を得た。活性の近似 的分布は次の通りであった。 AFA は、第１及び第２のカラムに応じて溶出された混合液から回収され、又は その検査された濃度及び特徴により発酵にリサイクルすることができた。同様に 、しかし別個に、６−APA はそのpHをそ の産物についての等電点に調節することにより、第３及び第４のカラムに対応す る溶出液の混合液を用いて結晶析出し、単離することができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ゴンザレス デ プラド，エミリアーノ スペイン国，エー−24008 レオン，カレ ー ゴンザロ デ タピア ８ (72)発明者 ビターレル アルバ，アレハンドロ スペイン国，エー−24001 レオン，カレ ー カルメン ３ (72)発明者 サルト マルドナード，フランシスコ スペイン国，エー−28023 マドリード, プラド デ ソモサグアス，カレー デル アブレゴ 33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．微生物の発酵により６−アミノペニシラン酸を得るための方法であって、 該方法が次の連続的ステップ： 培養ブイヨンを限外ろ過にかけるステップと、 ６位におけるアミノ基に結合した側鎖を除去することにより、酵素の使用を通 して前記のペニシリン限外ろ過溶液を６−アミノペニシラン酸に転化するステッ プと、 交換樹脂を用いて、６−アミノペニシラン酸及び他のペニシリンの代謝物、主 にフェニル酢酸を分画的に分離するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ２．前記培養ブイヨンの限外ろ過のステップが、20,000〜2000ダルトンの分子 遮断サイズの範囲を用いて、１又は複数の連続的ステップにおいて行われること を特徴とする請求項１に記載の６−アミノペニシラン酸を得るための方法。 ３．前記酵素転化のステップが、固定化された酵素を用いて行われることを特 徴とする請求項１又は２に記載の６−アミノペニシラン酸を得るための方法。 ４．前記６−アミノペニシラン酸及び必要に応じてフェニル酢酸の分画的分離 のステップが、少なくとも１の陰イオン交換樹脂を通す連続的ステップで行われ ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の６−アミノペニシラン酸を 得るための方法。 ５．請求項１〜４のいずれかに記載の方法により得られた６−アミノペニシラ ン酸。 ６．請求項１〜４のいずれかに記載の方法により得られたフェニル酢酸。 ７．pHを等電点に調節することによる沈殿による単離の後の、ア ンピシリン及び／又はアモキシリンのような半合成的ペニシリンの化学的又は酵 素的合成における請求項５に記載の６−アミノペニシラン酸の使用。 ８．ペニシリンＧの合成のための前駆体としての請求項６に記載のフェニル酢 酸の再使用。