CN112047961B - 从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法 - Google Patents

从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从青霉素酶解液中分离结晶6‑氨基青霉烷酸的方法，该方法包括：采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液进行纳滤，得到第一纳滤浓液和第一纳滤稀液；向第一纳滤浓液中补加水，而后进行第二次纳滤，得到第二纳滤浓液和第二纳滤稀液；向第二纳滤浓液中补加水，用酸调节其pH值至6‑APA的等电点，6‑APA结晶析出，过滤、干燥，得到6‑氨基青霉烷酸晶体。本发明的方法操作简便，无需使用有机溶媒和酸碱，工艺简便、成本低且环境友好。

Description

从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法
技术领域
本发明属于制药技术领域，涉及一种从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法。
背景技术
6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid，6-APA)作为青霉素系列抗生素的母核，是合成青霉素类药品的必要中间体。通过与不同的侧链结合合成不同的抗生素类药品，如阿莫西林、氨苄西林、美洛西林等形成了诸多抗菌性强、服用方便的系列产品，在抗菌产品中是不可或缺的重要组成部分。目前我国的青霉素产量达到5-7万吨，占全球产能的一半以上，是世界上青霉素的生产大国。
6-氨基青霉烷酸(6-APA)是由天然青霉素G经过酶裂解断开侧链而获得的青霉素母核，是合成半青霉素的重要中间体，如何从青霉素G的裂解液中提取、分离、纯化6-APA是整个工艺中极为关键的步骤。
中国专利文献CN104004002B公开了一种由青霉素发酵液直接制备6-氨基青霉烷酸的方法，该方法包括：青霉素发酵液在酶裂解之后，经过微滤、超滤、纳滤浓缩，得到6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的浓缩混合溶液；该混合溶液经脱色处理，使用树脂吸附混合溶液中的苯乙酸，得到6-氨基青霉烷酸的水溶液；该6-氨基青霉烷酸的水溶液使用氨水调节pH为4.3，得到6-氨基青霉烷酸结晶。其中，存在如下问题：(1)操作步骤繁琐，需要树脂的清洗、活化等等的步骤，大大加重了劳动量及人工成本；(2)处理树脂时不可避免地要使用酸或碱进行清洗，造成了成本的升高及环保的压力；(3)在解析过程中使用溶媒为解析剂，进而提高了成本和环保的压力，由于溶媒的使用不可避免会将杂质引入产品中，对产品的含量产生影响，不符合制药的理念。
一般传统提取6-APA的方法为溶媒萃取法，此种方案弊端为：(1)溶媒用量大，回收困难，在控制上也难于把控，且在萃取过程是一个酸性的环境，酸性达到了1左右，在强的酸性条件下6-APA会快速分解而严重损失，降低了产品的收率；(2)使用溶媒萃取，一方面提高了成本和环保的压力，由于溶媒的使用不可避免会将杂质引入产品中，对产品的含量产生影响，不符合制药的理念。
由于6-APA的市场需求大，优化和改进6-APA的制备工艺，有着重要的经济和环保意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简便、成本低且环境友好的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，采用对青霉素酶解液进行二次纳滤，有效地实现了6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的分离，该方法操作简便，无需使用有机溶媒和酸碱。
根据本发明，本发明提供的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，包括如下步骤：
1.纳滤分离6-氨基青霉烷酸和苯乙酸
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液进行纳滤，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，得到第一纳滤浓液和第一纳滤稀液，其中第一纳滤稀液与第一纳滤浓液体积比为8.5～9.5:1；
向第一纳滤浓液中补加水，使其体积回到原始青霉素酶解液体积，而后采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜进行第二次纳滤，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，得到第二纳滤浓液和第二纳滤稀液，其中第二纳滤稀液与第二纳滤浓液体积比为8.5～9.5:1；
2.6-氨基青霉烷酸结晶
向上述第二纳滤浓液补加水，使其体积回到原始青霉素酶解液体积，用酸调节其pH值至6-APA的等电点，6-APA结晶析出，过滤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸晶体。
下面，更具体地说明本发明的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法。
在本发明的方法中，所述青霉素酶解液经过滤除去固定化青霉素酰化酶，pH值一般为7.5～8.5，6-APA含量40～48mg/mL，苯乙酸含量28～35mg/mL。
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液进行纳滤，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，得到第一纳滤浓液和第一纳滤稀液，其中第一纳滤稀液与第一纳滤浓液体积比为8.5～9.5:1。
在本发明中，所使用的聚醚砜纳滤膜，截留分子量为150～200道尔顿，选择聚醚砜膜孔径高度均一，且强度和耐腐蚀性更加稳定，清洗后膜通量的恢复性好，从而耐久性好。在本发明中，选择如下方法制备的聚醚砜膜：将含有聚醚砜的铸膜液在基底上铸膜，而后在含有表面活性剂的水溶液中凝固、老化，而后干燥，所述表面活性剂例如有机硅表面活性剂、聚乙烯醇表面活性剂等。这样得到的聚醚砜膜，由于凝结变慢、成膜时间长，在成膜过程中收缩应力小，使孔结构大小一致性好；且耐冲击性、耐腐蚀好；表面性能好，清洗通道宽，抗污染性很强，使用清洗剂正向循环清洗即可，清洗简单。
由于截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜，孔结构大小一致性好，在纳滤过程中，苯乙酸与水通过纳滤膜，而6-APA被截留，从而实现了6-APA与苯乙酸的分离。
在采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液进行纳滤时，温度保持在10℃以下，特别是5±2℃下；进膜压力选择为0.3～0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，从而保证纳滤过程的稳定进行。
为了使6-APA与苯乙酸充分分离，得到高品质的6-氨基青霉烷酸，进行第二次纳滤。即：向第一纳滤浓液中补加水，使其体积回到原始青霉素酶解液体积，而后采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜进行第二次纳滤，且保进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，得到第二纳滤浓液和第二纳滤稀液，其中第二纳滤稀液与第二纳滤浓液体积比为8.5～9.5:1。
在第二次纳滤过程中，与第一次纳滤相同，温度保持在10℃以下，特别是5±2℃下；进膜压力选择为0.3～0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，从而保证纳滤过程的稳定进行。
一般而言，青霉素酶解液采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜二次纳滤之后，6-APA与苯乙酸充分分离，即所得到的第二纳滤浓液在补加水使其体积回到原始青霉素酶解液体积时，苯乙酸含量小于0.2mg/mL，6-APA含量为40～48mg/mL。
如果当第二纳滤浓液在补加水使其体积回到原始青霉素酶解液体积时，苯乙酸含量为0.2mg/mL以上时，可以重复上述补加水和纳滤操作，直到纳滤浓液中苯乙酸含量符合工艺要求。
在步骤2中，即6-氨基青霉烷酸结晶中，向所述第二纳滤浓液补加水，使其体积回到原始青霉素酶解液体积，用酸调节其pH值至6-APA的等电点，6-APA结晶析出，过滤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸晶体。优选，在温度7±2℃下，用盐酸调节pH至4.0±0.2，6-氨基青霉烷酸结晶析出，养晶1～2小时，过滤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸。
在本发明中，所述青霉素酶解液可以优选按照如下制备方法由青霉素发酵液制备得到：
(1)对青霉素发酵液进行一级超滤
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为30000～100000道尔顿、优选30000～50000道尔顿的聚醚砜超滤膜对青霉素发酵液进行一级超滤，进膜压力选择为0.30～0.50MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到第一超滤浓液和第一超滤稀液；
(2)对第一超滤稀液进行二级超滤
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为10000至小于30000道尔顿的聚醚砜超滤膜对第一超滤稀液进行二级超滤，进膜压力选择为0.30～0.50MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到第二超滤浓液和第二超滤稀液；
(3)对第二超滤稀液进行三级超滤
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为500至小于10000道尔顿、优选为1000～5000道尔顿的聚醚砜超滤膜对第二超滤稀液进行三级超滤，进膜压力选择为0.30～0.50MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到第三超滤浓液和第三超滤稀液；
(4)对第三超滤稀液进行纳滤浓缩
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为150～300道尔顿的聚醚砜纳滤膜进行纳滤浓缩，进膜压力选择为0.20～0.40MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到纳滤浓缩液，最终所得到的纳滤浓缩液效价为250000-270000u/ml；
(5)酶解反应制备青霉素酶解液
将效价为250000-270000u/ml的浓缩液用硼酸调制约140000u/ml后(硼酸作为缓释液起到了中和反应的作用，且可达到结晶的浓度)，在固定化青霉素酰化酶存在下，在温度26±3℃，用氨水调节pH值为8±0.5，进行转化反应70～150分钟；转化反应完成后，过滤除去固定化青霉素酰化酶，得到青霉素酶解液。
有益效果
本发明提供了一种工艺简便、成本低且环境友好的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，采用对青霉素酶解液进行二次纳滤，由于截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜，孔结构大小一致性好，在纳滤过程中，苯乙酸与水通过纳滤膜，而6-APA被截留，有效地实现了6-氨基青霉烷酸和苯乙酸的分离，该方法操作简便，无需使用有机溶媒和酸碱。
具体实施方式
下面通过实施例更具体地说明本发明的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，但本发明的保护范围不局限于如下实施例中。
青霉素酶解液制备例
按如下步骤处理青霉素发酵液：
(1)对青霉素发酵液进行一级超滤
取新鲜青霉素发酵液100L，检验该发酵液质量指标，其中效价为52348u/ml，对于430nm波长的光，透光率为17％；对于625nm波长的光，透光率为75％。
在温度5±2℃下，采用截留分子量为50000道尔顿的聚醚砜超滤膜，以25～30L/h的速度，对青霉素发酵液进行一级超滤，且保持进膜压力为0.50MPa，进、出膜压力差值小于0.02MPa。待收率达到近99％后，停止一级超滤。
收集到第一超滤稀液99L，效价为52186u/ml，430nm波长的光，透光率为28％；625nm波长的光，透光率为88％。
(2)对第一超滤稀液进行二级超滤
取上述制备的第一超滤稀液80L，在温度5±2℃下，采用截留分子量为20000道尔顿的聚醚砜超滤膜，以20～25L/h的速度，对第一超滤稀液进行二级超滤，且保持进膜压力为0.40MPa，进、出膜压力差值小于0.02MPa。待收率达到近99％后，停止二级超滤。
收集到第二超滤稀液79L，效价为51964u/ml，430nm波长的光，透光率为68％；625nm波长的光，透光率为93％。
(3)对第二超滤稀液进行三级超滤
取上述制备的第二超滤稀液70L，在温度5±2℃下，采用截留分子量为5000道尔顿的聚醚砜超滤膜，以20～25L/h的速度，对第二超滤稀液进行三级超滤，且保持进膜压力为0.40MPa，进、出膜压力差值小于0.02MPa。待收率达到近99％后，停止三级超滤。
收集到第三超滤稀液69.5L，效价为52161u/ml，430nm波长的光，透光率为72％；625nm波长的光，透光率为97％。
(4)对第三超滤稀液进行纳滤浓缩
取上述制备的第三超滤稀液50L，在温度5±2℃下，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜，以15～20L/h的速度，对第三超滤稀液进行纳滤浓缩，且保持进膜压力为0.20MPa，进、出膜压力差值小于0.02MPa。待物料效价达到目标效价后，停止纳滤系统。
收集到纳滤浓缩液10L，效价为259827u/ml，430nm波长的光，透光率为38％；625nm波长的光，透光率为89％。
(5)酶解反应制备青霉素酶解液
取500mL纳滤浓缩液，将效价调制14万，在固定化青霉素酰化酶存在下，在温度28-29℃，用氨水调节pH值为7.95-8.05，进行转化反应；转化反应完成后，通过筛网将酶完全分离，反应液出料量1025mL(即青霉素酶解液)，其中苯乙酸含量34.13mg/mL，6-APA含量46.09mg/ml(其中在酶解反应时需要加入硼酸将高效价配成140000u/ml的底物浓度，再进行酶解反应)。
实施例1
按如下步骤从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸：
1.纳滤分离6-氨基青霉烷酸和苯乙酸
(1)取新鲜青霉素酶解液100L，其中6-APA含量为42.8mg/mL，苯乙酸含量为31.1mg/mL；在温度保持约5℃，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液以15-20L/min的速度进行纳滤，进膜压力为0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，收集得到第一纳滤浓液10L和第一纳滤稀液90L。
(2)向第一纳滤浓液中补加水至100L，在温度保持约5℃，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液以15-20L/min的速度进行纳滤，进膜压力为0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，收集得到第二纳滤浓液10L和第二纳滤稀液90L。
2.6-氨基青霉烷酸结晶
向第二纳滤浓液中补加水至100L，其中6-APA含量为42.6mg/mL，苯乙酸含量为0.17mg/mL。
取1000mL加水后的第二纳滤浓液加入2L的烧瓶中，用盐酸将其pH值调节至3.83，析出晶体，搅拌10分钟后继续将pH值调节至3.9，将温度控制在10℃以下，搅拌养晶1小时，而后过滤、洗涤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸39.42g，收率92.1％。
6-氨基青霉烷酸成品质量：
Figure BDA0002631074100000081
实施例2(中试)
按如下步骤从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸：
1.纳滤分离6-氨基青霉烷酸和苯乙酸
(1)取新鲜青霉素酶解液2m3，其中6-APA含量为41.4mg/mL，苯乙酸含量为29.2mg/mL；在温度保持约5℃，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液以500-700L/h的速度进行纳滤，进膜压力为0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，收集得到第一纳滤浓液200L和第一纳滤稀液1800L。
(2)向第一纳滤浓液中补加水至2m3，在温度保持约5℃，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液以500-700L/h的速度进行纳滤，进膜压力为0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，收集得到第二纳滤浓液200L和第二纳滤稀液1800L。
2. 6-氨基青霉烷酸结晶
向第二纳滤浓液中补加水至2m3，其中6-APA含量为41.3mg/mL，苯乙酸含量为0.12mg/mL。
取1000mL加水后的第二纳滤浓液加入2L的烧瓶中，用盐酸将其pH值调节至3.82，析出晶体，搅拌10分钟后继续将pH值调节至3.95，将温度控制在10℃以下，搅拌养晶1小时，而后过滤、洗涤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸38g，收率91.8％。
6-氨基青霉烷酸成品质量：
Figure BDA0002631074100000091
实施例3(中试)
按如下步骤从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸：
1.纳滤分离6-氨基青霉烷酸和苯乙酸
(1)取新鲜青霉素酶解液2m3，其中6-APA含量为41.8mg/mL，苯乙酸含量为30.6mg/mL；在温度保持约5℃，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液以500-700L/h的速度进行纳滤，进膜压力为0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，收集得到第一纳滤浓液200L和第一纳滤稀液1800L。
(2)向第一纳滤浓液中补加水至2m3，在温度保持约5℃，采用截留分子量为200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液以500-700L/h的速度进行纳滤，进膜压力为0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，收集得到第二纳滤浓液200L和第二纳滤稀液1800L。
2. 6-氨基青霉烷酸结晶
向第二纳滤浓液中补加水至2m3，其中6-APA含量为41.2mg/mL，苯乙酸含量为0.15mg/mL。
取1000mL加水后的第二纳滤浓液加入2L的烧瓶中，用盐酸将其pH值调节至3.84，析出晶体，搅拌10分钟后继续将pH值调节至3.92，将温度控制在10℃以下，搅拌养晶1小时，而后过滤、洗涤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸38.5g，收率92％。
6-氨基青霉烷酸成品质量：
Figure BDA0002631074100000101

Claims (4)

1.一种从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，包括如下步骤：
1.纳滤分离6-氨基青霉烷酸和苯乙酸
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液进行纳滤，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，得到第一纳滤浓液和第一纳滤稀液，其中第一纳滤稀液与第一纳滤浓液体积比为8.5～9.5:1；
向第一纳滤浓液中补加水，使其体积回到原始青霉素酶解液体积，而后采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜进行第二次纳滤，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa，得到第二纳滤浓液和第二纳滤稀液，其中第二纳滤稀液与第二纳滤浓液体积比为8.5～9.5:1；
2.6-氨基青霉烷酸结晶
向上述第二纳滤浓液补加水，使其体积回到原始青霉素酶解液体积，用酸调节其pH值至6-APA的等电点，6-APA结晶析出，过滤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸晶体，
其中，所述青霉素酶解液经过滤除去固定化青霉素酰化酶，pH值为7.5～8.5，6-APA含量40～48mg/mL，苯乙酸含量28～35mg/mL；
所述聚醚砜纳滤膜按如下方法制备：将含有聚醚砜的铸膜液在基底上铸膜，而后在含有表面活性剂的水溶液中凝固、老化，而后干燥，其中所述表面活性剂为有机硅表面活性剂或者聚乙烯醇。
2.根据权利要求1所述的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，其特征是，在采用截留分子量为150～200道尔顿的聚醚砜纳滤膜对青霉素酶解液进行纳滤时，温度保持在5±2℃下，进膜压力选择为0.3～0.5MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.2MPa。
3.根据权利要求1所述的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，其特征是，在6-氨基青霉烷酸结晶中，在温度7±2℃下，用盐酸调节pH至4.0±0.2，6-氨基青霉烷酸结晶析出，养晶1～2小时，过滤、干燥，得到6-氨基青霉烷酸。
4.根据权利要求1所述的从青霉素酶解液中分离结晶6-氨基青霉烷酸的方法，其特征是，所述青霉素酶解液按照如下制备方法由青霉素发酵液制备得到：
(1)对青霉素发酵液进行一级超滤
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为30000～100000道尔顿的聚醚砜超滤膜对青霉素发酵液进行一级超滤，进膜压力选择为0.30～0.50MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到第一超滤浓液和第一超滤稀液；
(2)对第一超滤稀液进行二级超滤
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为10000至小于30000道尔顿的聚醚砜超滤膜对第一超滤稀液进行二级超滤，进膜压力选择为0.30～0.50MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到第二超滤浓液和第二超滤稀液；
(3)对第二超滤稀液进行三级超滤
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为500至小于10000道尔顿的聚醚砜超滤膜对第二超滤稀液进行三级超滤，进膜压力选择为0.30～0.50MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到第三超滤浓液和第三超滤稀液；
(4)对第三超滤稀液进行纳滤浓缩
在温度保持在10℃以下，采用截留分子量为150～300道尔顿的聚醚砜纳滤膜进行纳滤浓缩，进膜压力选择为0.20～0.40MPa，进膜压力大于出膜压力，且保持进膜压力与出膜压力差值小于0.02MPa，得到纳滤浓缩液，最终所得到的纳滤浓缩液效价为250000-270000u/ml；
(5)酶解反应制备青霉素酶解液
将效价为250000-270000u/ml的浓缩液用硼酸调制140000u/ml后，在固定化青霉素酰化酶存在下，在温度26±3℃，用氨水调节pH值为8±0.5，进行转化反应70～150分钟；转化反应完成后，过滤除去固定化青霉素酰化酶，得到青霉素酶解液。
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