CN103555807A - 一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得a-氨基己二酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备7-ACA并同时获得α-氨基己二酸的方法，所述方法，经过以下步骤：步骤1，头孢菌素C发酵液的处理；步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-ACA；步骤3，对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理；步骤4，分离出7-ACA；步骤5，从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸。

Description

一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得a-氨基己二酸的方法

技术领域：

本发明涉及一种酶裂解法的应用，具体而言是涉及一种获制备7-氨基头孢霉烷酸并获得α-氨基己二酸的一步酶法应用。 

背景技术：

7-氨基头孢霉烷酸（7—aminocephalosporanic acid，7-ACA）， 

结构式： 

是目前半合成头孢菌素的重要基础原料，目前工业上通常由头孢菌素C(CephalosporinC,CPC)，通过化学法或二步酶法裂解，脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到7-ACA。 

α-氨基己二酸 

α-氨基己二酸（α-Aminoadipic acid），分子量161.16，分子式C6H11N1O4，白色结晶体或者白色结晶粉末。最早发现于玉米种子或者人、天竺鼠的尿中。属于氨基酸的一种，广泛用于医药、食品饲料、化妆品工业等领域，也可以用于合成特殊化学物质的中间体。如低热质甜味剂，螯合物及多肽等。 

化学法生产7-ACA，有着大量排泄环境污染物质的致命缺陷，这与今日的环境保护概念格格不入，在制备7-ACA后生成大量的α-氨基己二酸甲酯，水解后形成α-氨基己二酸残存在废液中，可以采用树脂或者等电点吸附的方式提取回收，但是处理过程相对的繁琐不经济。后发展出二步酶法生产7-ACA，头孢菌素C通过两个酶，即D-氨基酸氧化酶及戊二酰7-ACA酰化酶的作用，可以生成7-ACA。如1990年《中国科学报》报导了中国科学院植物生理研究所，以头孢菌素C为原料，二步酶法制备7-ACA获得成功。1986年日本有了一步酶法制备7-ACA的专利申请。二步酶法虽然解决了化学法的污染环境问题，但是二步酶法在收率、纯度及成本方面显得有些不足，并且前一步GL-7-ACA的工艺过程较难控制。 

中国专利CN200510089965提供了一种从头孢菌素Ｃ制备7－氨基头孢霉烷酸的两步酶法，其中所用的Ｄ－氨基酸氧化酶为一种经纯化的三角酵母Ｄ－氨基酸氧化酶突变体。 

中国专利CN94112285提供一种一步两酶法从头孢菌素Ｃ制造7－氨基头孢霉烷酸的方法。即在一个反应器的水相系统中加入Ｄ－氨基酸氧化酶、ＧＬ－7ＡＣＡ酰化酶。 

中国专利CN200410016825.9以D-氨基酸氧化酶（DAAO）氧化头孢菌素C生产戊二酰-7-氨基头孢酶烷酸（GL-7-ACA），再由GL-7-ACA酰化酶催化脱酰生产7-ACA。以及中国专利CN200410039573一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，CN200310113563一种生产7-氨基头孢烷酸的方法及其专用重组酶公开的方法也存在同样的问题。 

这些方法虽然一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸比二步酶法优越，但采用不同的酶其效率具有很大的不同，其具体的处理方法也会对产物的收率和纯度产生影响，并没有涉及α-氨基己二酸的回收和处理，本发明通过现有的工业化的固定化酶，找到一种法兼有了化学法（高收率和高纯度）和二步酶法（环保和高收益）的优点，同时给出了一种可以简单高效的回收α-氨基己二酸的方法，比现有一步酶法获得的7-ACA更加简洁，产物收率更高，纯度更高，反应条件更加温和快速，排放的废水几乎没有污染，不但节省了生产成本，保护了环境还创造了新的效益。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种制备7-ACA并同时获得α-氨基己二酸的方法。 

本发明的方法，经过以下步骤： 

步骤1，头孢菌素C发酵液的处理； 

步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-ACA； 

步骤3，对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理； 

步骤4，分离出7-ACA； 

步骤5，从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸。 

其中，步骤1中所述头孢菌素C发酵液的处理是用碱调pH到碱性，并浓缩到适当浓度及纯度。 

步骤2中酶解反应过程要恰当控制反应PH、酶用量等参数，优 选的头孢菌素C酰基转移酶购买自山东鲁抗立科药业有限公司。 

步骤3所述对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理是对7-ACA裂解液采用浓缩，脱炭、过滤等措施处理，使其达到结晶前的良好状态。 

步骤4所述分离出7-ACA采用析晶并分离的方法。 

步骤5所述从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸是用等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来。 

本发明优选的方法，经过以下步骤： 

步骤1，取头孢菌素C发酵滤液，调pH到9-10。 

步骤2，头孢菌素C酰基转移酶(NRB103)和头孢菌素C在室温下反应，直到用高效液相仪鉴测7-氨基头孢霉烷酸完全生成，控制反应pH在9-10。 

步骤3，向上一步得到的7-氨基头孢霉烷酸反应液中加入Na₂S₂O₄,调pH6-7，加吐温80和二氯甲烷，分相，在水相中加入活性炭和EDTA，过滤得7-氨基头孢霉烷酸液体。 

步骤4，7-氨基头孢霉烷酸液体调pH值使成为酸性，析出结晶后，滤出结晶，用丙酮洗涤，干燥。 

步骤5，通过等电点结晶方式分离出α-氨基己二酸。 

本发明的一步酶法兼有了化学法，二步酶法和现有一步酶法的优点，比较结果如下： 

表1.现有技术与本发明一步酶法比照表 

本发明所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，经过以下三个步骤： 

步骤1，对一步酶法分离出7-ACA后的裂解液进行处理； 

步骤2，分离出α-氨基己二酸； 

步骤3，精制α-氨基己二酸。 

其中， 

步骤1所述对裂解液进行处理，包括加碱并浓缩的步骤。 

步骤2所述分离α-氨基己二酸的方法选自树脂吸附法或者等电点法。 

步骤3所述精制α-氨基己二酸是重结晶法。 

优选的所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的 方法，步骤如下： 

步骤1，裂解液加入氢氧化钠溶液，调整PH值为6.0，随后将裂解液浓缩到原来体积的30%， 

步骤2，把浓缩液用酸调节PH值到3.0，析出α-氨基己二酸， 

步骤3，将过滤得到的α-氨基己二酸粗品加入水和乙醇的混合溶媒中重结晶一次，结晶用丙酮洗涤，干燥即得精品α-氨基己二酸。 

其中，步骤1所述加入氢氧化钠溶液为2mol/L的氢氧化钠溶液2mol/L浓度的氢氧化钠溶液，其配制方法如下：每500毫升水中溶解的氢氧化钠质量为40g，其中将裂解液浓缩采用的方法如下：把裂解液通过纳滤装置进行浓缩。 

其中，步骤2所述用酸调节PH值是用盐酸溶液调节，所述盐酸溶液浓度为：2mol/L左右，其配制方法如下：36-38%浓盐酸和水的配比1：5体积进行混合。。 

其中，步骤3所述的重结晶，是用无水乙醇和水1：1等量混合成为50%的乙醇溶液进行重结晶。 

用本发明的方法制备α-氨基己二酸即可消除废液污染(浓缩液析出结晶后可以调节废液PH中性7左右排放到污水处理站处理)，又可获得一种有用的产品α-氨基己二酸，可谓一举两得，其成本及其低廉。 

表2.现有技术与本发明一步酶法废液处理法比照表 

表3.α-氨基己二酸从废液中分离方法筛选 

本发明工艺收率高，纯度高，步骤少，设备简单，转化率高，反应条件更加温和安全快速，大大节省了生产成本。 

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。 实施例1.头孢菌素C(CPC)液的预处理： 

取头孢菌素C(CPC)发酵滤液10升（750mM,相当于纯CPC311克），过1μm膜滤，用氨水调PH到10。 

实施例2反应条件控制： 

向反应器中加入（NRB-103）酶1800克，水洗二次，加入CPC液后，快速搅拌下，用氨水控制PH为8-10，反应30分钟，7-ACA转化率98%。 

实施例3裂解液（7-ACA液）的处理： 

向得到的15升7-ACA液中加入100克Na₂S₂O₄,用氨水调PH为7，加吐温80，10毫升，加入二氯甲烷2000毫升，搅拌10分钟，分相，在水相中加入活性炭20克，加入EDTA10克，搅拌15分钟，过滤除炭得7-ACA处理液。 

实施例47-ACA结晶 

向7-ACA处理液中滴加3摩尔的盐酸,使PH为5，结晶完全后，滤出结晶，收集过滤母液，之后300毫升丙酮洗涤结晶，真空干燥至干，重量收率63.7%，纯度99.5%。 

实施例5α-氨基己二酸结晶 

取经过一步酶法制备7-ACA的废液15升，用氢氧化钠调节PH值到6，经过纳滤浓缩到5升，滴加3摩尔的盐酸,使PH为3.0，使α-氨基己二酸结晶，过滤100毫升丙酮洗涤，真空干燥，烘干，干燥后α-氨基己二酸结晶加入水200毫升加入乙醇200毫升搅拌过滤得到纯度99%淡黄色α-氨基己二酸大约100克。 

实施例6 

α-氨基己二酸纯度检测方法： 

采用甲醛定量测量氨基酸的含量并于标准品比较可以获得纯度，由于甲醛可以与氨基酸的氨基结合生成羟甲基化合物，是溶液酸度增加，用酚酞多指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定可以通过测定氨基酸中的氨基氮的含量计算出氨基酸的含量： 

测量氨基酸的含量=（V2-V1）xCx14/V 

其中V1为空白试验消耗氢氧化钠体积ML 

V2为测定消耗氢氧化钠体积ML 

V为取获得样品配制的一定比例的溶液ML 

C为标准氢氧化钠体积（0.5mol/l）14为氮的摩尔质量g/mol 

α-氨基己二酸纯度=测量氨基酸的含量/标准品含量。 

Claims (9)

1.一种制备7-ACA并同时获得α-氨基己二酸的方法，所述方法，经过以下步骤：

步骤1，头孢菌素C发酵液的处理；

步骤2，头孢菌素C在头孢菌素C酰基转移酶的作用下进行酶解反应得到7-ACA；

步骤3，对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理；

步骤4，分离出7-ACA；

步骤5，从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤1中所述头孢菌素C发酵液的处理是用碱调pH到碱性，并浓缩到适当浓度及纯度。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2中酶解反应过程要控制反应PH、酶用量等参数。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤3所述对酶解后得到的7-ACA裂解液进行处理是对7-ACA裂解液采用浓缩，脱炭、过滤，使其达到结晶前的良好状态。

5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤4所述分离出7-ACA采用析晶并分离的方法。

6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤5所述从分离出7-ACA的裂解液中分离α-氨基己二酸是用等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，经过以下三个步骤：

步骤1，对一步酶法分离出7-ACA后的裂解液进行处理；

步骤2，分离出α-氨基己二酸；

步骤3，精制α-氨基己二酸；

其中，步骤1所述对裂解液进行处理，包括加碱并浓缩的步骤；步骤2所述分离α-氨基己二酸的方法选自树脂吸附法或者等电点法；步骤3所述精制α-氨基己二酸是重结晶法。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述的等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来的方法，经过以下三个步骤：

步骤1，裂解液加入氢氧化钠溶液，调整PH值为6.0，随后将裂解液浓缩到原来体积的30%；

步骤2，把浓缩液用酸调节PH值到3.0，析出α-氨基己二酸；

步骤3，将过滤得到的α-氨基己二酸粗品加入水和乙醇的混合溶媒中重结晶一次，结晶用丙酮洗涤，干燥即得精品α-氨基己二酸；

其中，步骤1所述加入氢氧化钠溶液为2mol/L的氢氧化钠溶液2mol/L浓度的氢氧化钠溶液，其配制方法如下：每500毫升水中溶解的氢氧化钠质量为40g，其中将裂解液浓缩采用的方法如下：把裂解液通过纳滤装置进行浓缩；其中，步骤2所述用酸调节PH值是用盐酸溶液调节，所述盐酸溶液浓度为：2mol/L左右，其配制方法如下：36-38%浓盐酸和水的配比1：5体积进行混合；其中，步骤3所述的重结晶，是用无水乙醇和水1：1等量混合成为50%的乙醇溶液进行重结晶。

9.如权利要求1所述的方法，经过以下步骤：

步骤1，取头孢菌素C发酵滤液，调pH到9-10；

步骤2，头孢菌素C酰基转移酶(NRB103)和头孢菌素C在室温下反应，直到用高效液相仪鉴测7-氨基头孢霉烷酸完全生成，控制反应pH在9-10；

步骤3，向上一步得到的7-氨基头孢霉烷酸反应液中加入Na₂S₂O₄,调pH6-7，加吐温80和二氯甲烷，分相，在水相中加入活性炭和EDTA，过滤得7-氨基头孢霉烷酸液体；

步骤4，7-氨基头孢霉烷酸液体调pH值使成为酸性，析出结晶后，滤出结晶，用丙酮洗涤，干燥；

步骤5，通过等电点法将α-氨基己二酸从裂解液中结晶出来，方法如下：裂解液加入氢氧化钠溶液，调整PH值为6.0，随后将裂解液浓缩到原来体积的30%，把浓缩液用酸调节PH值到3.0，析出α-氨基己二酸，将过滤得到的α-氨基己二酸粗品加入水和乙醇的混合溶媒中重结晶一次，结晶用丙酮洗涤，干燥即得精品α-氨基己二酸。10、如权利要求1所述的方法，经过以下步骤：

取头孢菌素C(CPC)发酵滤液10升（750mM,相当于纯CPC311克），过1μm膜滤，用氨水调PH到10；

向反应器中加入（NRB-103）酶1800克，水洗二次，加入CPC液后，快速搅拌下，用氨水控制PH为8-10，反应30分钟，7-ACA转化率98%；

向得到的15升7-ACA液中加入100克Na₂S₂O₄,用氨水调PH为7，加吐温80，10毫升，加入二氯甲烷2000毫升，搅拌10分钟，分相，在水相中加入活性炭20克，加入EDTA10克，搅拌15分钟，过滤除炭得7-ACA处理液；

向7-ACA处理液中滴加3摩尔的盐酸,使PH为5，结晶完全后，滤出结晶，收集过滤母液，之后300毫升丙酮洗涤结晶，真空干燥至干，重量收率63.7%，纯度99.5%；

取经过一步酶法制备7-ACA的废液15升，用氢氧化钠调节PH值到6，经过纳滤浓缩到5升，滴加3摩尔的盐酸,使PH为3.0，使α-氨基己二酸结晶，过滤100毫升丙酮洗涤，真空干燥，烘干，干燥后α-氨基己二酸结晶加入水200毫升加入乙醇200毫升搅拌过滤得到纯度99%淡黄色α-氨基己二酸大约100克。