CN105624257A - 7-氨基头孢烷酸的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种7-氨基头孢烷酸的制备方法,特别是利用固定化头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法。所述方法包括:将固定化头孢菌素C酰化酶与头孢菌素C在液体中混合,在反应周期内将反应体系的温度从初始反应温度连续地或不连续地升温至16-37℃。该方法具有稳定的催化速率、较短的反应时间和固定化CPC酰化酶能够多批次使用等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种7-氨基头孢烷酸的制备方法及用途,特别是涉及利用固定化头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法及用途。
背景技术
头孢菌素C(CephalosporinC,CPC)酰化酶是一步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanicacid,7-ACA)的一种酰化酶,可以直接催化底物头孢菌素C,脱去D-α-氨基己二酸侧链,一步生产7-ACA。与传统的两步酶法相比,一步酶法操作更简单、方便,成本低,日益受到重视。
固定化酶技术产生于20世纪六十年代,目前已广泛应用于生物催化领域的工业生产中。与游离酶相比,固定化酶具有稳定性高、回收方便、易于控制、可重复使用、成本低廉等优点,在两步酶法生产7-ACA的生产中的酶制剂采用的即是固定化酶技术(刘秀伟,司芳,郭林,等.酶固定化研究进展[J].化工技术经济,2003,21(4):12-17.)。
在固定化酶的工业应用中,为了降低固定化酶的使用成本,一般要求固定化酶具有较好的催化活性和稳定性,可以重复、多批次的使用。因此在固定化CPC酰化酶的开发中,可以通过酶分子的基因工程改造、采用新型固定化酶载体、对固定化工艺进行改进等多种手段制备得到酶活高、稳定性好的固定化CPC酰化酶。
尽管固定化酶通常具有较好的稳定性等优点,但在固定化酶颗粒内存在较严重的底物和产物的传质阻力问题(GaoF,MaG.EffectsofMicroenvironmentonSupportedEnzymes.TopicsinCatalysis,2012,55(16-18):1114-1123)。
在通常的利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制备7-ACA的方法中,底物消耗和产物生成曲线呈现了典型的“前快后慢”特征。这是因为对于固定化CPC酰化酶的催化来说,和大多数固定化酶的催化类似,反应初始阶段由于较高的底物浓度和较低的产物浓度(产物经常也是酶的抑制剂),初始的催化速度是最快的;在反应后期由于底物浓度的降低和产物浓度提高(相应的产物抑制会增强),固定化酶反应速度大大降低。而且,在实际的生产过程中,这种低速的反应过程占总反应时间的比例很大。
发明内容
针对这一问题,本发明提出一种利用固定化头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法及用途,该方法具有稳定的催化速率、较短的反应时间和固定化CPC酰化酶能够多批次使用等优点。
本发明提供了利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法,该方法包括:将固定化CPC酰化酶与CPC在液体中混合,在反应周期内将反应体系的温度从初始反应温度例如0-15℃连续地或不连续地逐渐升温至16-37℃,优选20-35℃,再优选25-35℃。
本发明的上述方法具有以下优点:
(1)反应周期内固定化CPC酰化酶的催化时间明显缩短而总催化批次并没有减少,有效地提高了酶的催化稳定性,从而降低生产成本;
(2)不需要加入其他试剂只需调控温度,生产过程容易操作,无污染。
附图说明
图1示出了固定化CPC酰化酶在不同温度下的酶活稳定性。
图2示出了固定化CPC酰化酶在有或没有7-ACA存在下的热稳定性。
图3示出了固定化CPC酰化酶在不同pH值条件下的酶活稳定性。
具体实施方式
如上所述,本发明提供了利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法,该方法包括:将固定化CPC酰化酶与CPC在液体中混合,在反应周期内将反应体系的温度从初始反应温度连续地或不连续地逐渐升温至16-37℃,优选20-35℃,再优选25-35℃。
所述初始反应温度为0-15℃,优选3-15℃,更优选5-10℃。
所述液体可以是水或常用缓冲液例如磷酸钠缓冲液。
固定化CPC酰化酶与CPC的混合方式没有特别的限制,只要得到固定化CPC酰化酶与CPC的混合溶液即可。例如,可以先将固定化CPC酰化酶和CPC分别分散或溶于水或缓冲液中,再将二者混合;也可以直接将固定化CPC酰化酶和CPC同时投入水或缓冲液中混合;还可以将固定化CPC酰化酶直接投入CPC的水或缓冲液溶液中。
上述反应周期是指在一个批次的反应中,根据实际生产要求,底物CPC的转化率为90-99%的反应时间段。
所述连续地升温是指在反应周期内温度连续不间断地升高直到反应结束。上述连续地升温的方式包括以恒定的升温速度的方式和以不恒定的升温速度的方式。所述恒定的升温速度例如在0.01℃/分钟-3.0℃/分钟范围内的任一升温速度,优选0.05℃/分钟-2.0℃/分钟,更优选0.1℃/分钟-1.0℃/分钟。在不恒定的升温速度的情况下,优选先慢后快的升温速度,但是升温的平均速度落入0.01℃/分钟-3.0℃/分钟的范围内,优选0.05℃/分钟-2.0℃/分钟,更优选0.1℃/分钟-1.0℃/分钟。
所述不连续地升温是指在反应周期内的升温间断进行。不连续的升温方式包括多种,只要在升温过程中发生间断,就包括在上述的不连续升温的范围内。另外,在升温过程中可以包括有一个或多个降温阶段,只要在反应周期内温度整体来看是上升的即可。上述不连续地升温的方式包括例如阶梯式升温。
所述阶梯式升温包括两阶段升温或更多阶段升温,例如在5-15℃保持总反应时间的1/2-3/4然后在20-37℃保持总反应时间的1/4-1/2的两阶段升温,或者在5-15℃保持总反应时间的1/4-1/2然后在20-25℃保持总反应时间的1/4-2/3然后在28-37℃保持总反应时间的1/4-1/3的三阶段升温。
反应体系的pH值采用常规pH值,例如pH8.0±1。
在本发明的方法中,其它反应条件和参数采用常规实验室或工业生产中所采用的条件和参数。
作为本发明的方法中使用的固定化CPC酰化酶,其可以通过本领域技术人员已知的方法获得,例如可以商购获得或者通过实验室常规酶固定化工艺获得。举例来说,CPC酰化酶可以通过微生物例如重组大肠杆菌培养获得;例如,由重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CPCacy经过摇瓶培养,超声波细胞破碎,离心,制备而得(ZhuXW,etal.,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2011,27(4):823-829)。所用的固定化载体为酶固定化工艺中常用环氧基或氨基载体,例如LX1000-EPC和LX1000-HA,得自西安蓝晓科技有限公司。
作为在本发明的方法中使用的固定化CPC酰化酶可以带有荧光标记,这是通过在固定化CPC酰化酶上固定荧光物质如5-氨基荧光素钠实现的。
本发明的上述技术方案是基于以下研究形成的:
在对固定化CPC酰化酶进行研究时,发现CPC酰化酶在低pH条件下的催化稳定性差,由于固定化酶内底物和产物的扩散问题,随着反应的进行,反应体系中的pH值并不代表固定化CPC酰化酶中酶本身所处的pH环境。固定化CPC酰化酶颗粒周围和内部微环境的pH变化情况(也即是酶分子实际所处的pH环境)对酶的催化稳定性影响较大。因此本申请的发明人针对如何调控才能实现固定化CPC酰化酶所处微环境pH的小幅度平稳变化做了多种尝试。
发明人通过研究发现由于在初始阶段的催化速度最快,大量的酸性产物堆积在固定化酶周围使得CPC酰化酶的微环境pH与反应体系的pH发生明显的偏移,从而导致CPC酰化酶的催化稳定性显著下降。同时,发明人还出人意料地发现CPC酰化酶在与产物7-ACA共存条件下对温度的耐受性明显提高。换句话说,虽然产物7-ACA是CPC酰化酶的反应抑制剂,但是在高温下却起到对CPC酰化酶的保护作用。
基于上述发现,发明人通过调整反应初期的反应温度在较低的温度范围内,使得产物7-ACA的生成没有那么快,从而使得固定化CPC酰化酶所处的微环境的pH变化没有那么剧烈,从而保护了CPC酰化酶的催化稳定性。随着7-ACA在反应体系内的浓度的提高,由于CPC酰化酶在与产物7-ACA共存条件下对温度的耐受性明显提高,可以逐渐提高反应温度,使得反应时间缩短,而且还不影响CPC酰化酶的催化稳定性,使得固定化CPC酰化酶的催化批次不受大的影响。
实施例
以下通过实施例更详细地描述本发明。但是本发明的范围并不局限于实施例。
实施例中的分析方法:
(1)建立产物7-ACA的标准曲线:
1)用0.1mol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液分别配制20mg/mL的CPC溶液和3mg/mL的7-ACA溶液,并用1mol/L的NaOH溶液调其pH至8.5。
2)分别取0、1、2、4、8、12、16、20μL7-ACA溶液加入到离心管中,再用0.1mol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液逐一补足到20μL。
3)分别向各管中加入20μLCPC溶液(37℃预热3min)并混匀,37℃静置5min后加入200μL终止液(50mmol/L的NaOH溶液与20%的冰醋酸溶液按1:2的体积比混合而成),并震荡充分混匀。
4)将上述混合液12000rpm离心3min,然后各取200μL上清液到新的离心管中,再加入40μL显色剂(对二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液(0.5%,w/v))并混匀,室温静置10min后,各取200μL,以加入0μL7-ACA溶液的样品为空白对照,分别测定其它几个样品在415nm处的吸光度值(采用上海精密科学仪器有限公司生产的722S型可见光分光光度计进行测定)。
5)以7-ACA浓度为横坐标,OD415为纵坐标绘制标准曲线。
(2)固定化CPC酰化酶的酶活测定:
1)称取质量为10mg-100mg的固定化酶于37℃预热3min。
2)加入37℃预热的0.1mol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液分别配制20mg/mL的CPC溶液4mL。
3)37℃、160rpm反应5min。
4)取20μL上清液进行适当稀释,加入200μL终止液,混匀。
5)将上述混合液12000rpm离心3min后取200μL上清液到离心管中,再加入40μL显色剂并混匀,室温静置10min后,取200μL测定其在415nm处的吸光度值(采用上海精密科学仪器有限公司生产的722S型可见光分光光度计进行测定)。
6)通过标准曲线计算7-ACA浓度,最终计算出固定化CPC酰化酶的活性。
CPC酰化酶活力的定义:在37℃、pH8.5、以20mg/mL的CPC溶液为底物的条件下,每分钟催化CPC生成1μmol7-ACA所需的酶量为1个活力单位。
在实施例中,当CPC的转化率达到95%,即认为一批次反应结束。用去离子水清洗固定化CPC酰化酶,便可重复利用于下一批次转化。当在相同反应条件下批反应时间为第一批反应时间的2倍时即认为达到半衰期,停止催化。
对比例1:整个催化过程中恒温(10℃)催化
固定化CPC酰化酶的制备:在约20gEPC载体中,按400U/g投酶量加入CPC酰化酶和两倍酶液体积的1.25M磷酸钠缓冲液(pH8.0),使磷酸钠缓冲液终浓度为0.83M。25℃,160rpm条件下,放置24h。24h后,用去离子水和0.1MPBS对载体进行清洗,抽滤回收4℃保存。采用前述的方法测定酶活。
催化反应:将步骤(1)中得到的固定化酶采用6U/ml的投酶量,投入25mg/ml的头孢菌素C水溶液中,并用2M氨水调节反应体系pH8.5,用循环水控制反应温度为10℃直到反应结束。
整个反应过程中定时取样采用高效液相色谱测定产物7-ACA和CPC的含量。当CPC的转化率达到95%时,停止催化,用去离子水清洗固定化酶2-3次,应用于下一批的催化。
整个催化过程用时62min,而催化批次为29批时酶活降为初始的一半。
对比例2-4:
除了分别将催化反应过程中的温度控制在15℃、20℃和30℃直到反应结束,按照对比例1所述进行对比例2、3和4。结果如下表所示:
表1:
从表1的对比例可以看出,固定化CPC酰化酶在低温下酶活低损失少,但是反应时间长,从工业生产上来说,这是不利的,同时,为了保持全程在低温下反应需要消耗大量的能量。在较高的温度下固定化CPC酰化酶的反应时间短,但是,酶活损失很大,由于固定化酰化酶的价格相对较高,从生产成本上考虑,也是不利的。另外,由于本领域公知在较高的温度下酶活损失大,从而也不会考虑在较高的温度下进行反应。在工业上的一般做法是综合考虑二者因素,选取折中的温度进行反应。
实施例1:
固定化CPC酰化酶的制备:在约20gEPC载体中,按400U/g投酶量加入CPC酰化酶和两倍酶液体积的1.25M磷酸钠缓冲液(pH8.0),使磷酸钠缓冲液终浓度为0.83M。25℃,160rpm条件下,放置24h。24h后,用去离子水和0.1MPBS对载体进行清洗,抽滤回收4℃保存。并采用前述的方法测定酶活。
催化反应:将步骤(1)中得到的固定化酶采用6U/ml的投酶量,投入25mg/ml的头孢菌素C水溶液中,并用2M氨水调节反应体系pH8.5,用循环水控制反应温度为10℃保持30分钟,之后将反应温度控制在37℃至反应结束。
整个反应过程中定时取样采用高效液相色谱测定产物7-ACA和CPC的含量。当CPC的转化率达到95%时,停止催化,用去离子水清洗固定化酶2-3次,应用于下一批的催化。
整个催化过程用时40min,催化批次为29批时酶活降为初始的一半。与10℃恒温催化相比,本实施例的反应时间缩短了22min,达到酶活半衰期的催化批次相同。
实施例2-6:
除了如下的温度变化方式,按照实施例1所述进行实施例2-6。
实施例2:先将反应温度在10℃保持30分钟,之后将反应温度控制在30℃至反应结束。
实施例3:先将反应温度在15℃保持20分钟,之后将反应温度控制在37℃至反应结束。
实施例4:先将反应温度在15℃保持20分钟,之后将反应温度控制在30℃至反应结束。
实施例5:先将反应温度在20℃保持10分钟,之后将反应温度控制在37℃至反应结束。
实施例6:先将反应温度在20℃保持10分钟,之后将反应温度控制在30℃至反应结束。
实验结果如下表所示:
表2:
与对比例1相比,实施例1和2采用在反应后期增加温度,可以看到反应时间显著缩短(从62分钟缩短为40或45分钟),而且,酶活半衰期的催化批次没有变化。
与对比例2相比,实施例3和4采用在反应后期增加温度,可以看到反应时间显著缩短(从50分钟缩短为28或32分钟),而且,酶活半衰期的催化批次没有明显变化。
与对比例3相比,实施例5和6采用在反应后期增加温度,可以看到反应时间显著缩短(从33分钟缩短为15或17分钟),而且,酶活半衰期的催化批次没有明显变化。
因此,本发明的方法在工业上有显著的意义,而这是基于对固定化CPC酰化酶的微环境pH的研究以及出人意料地发现CPC酰化酶在与产物7-ACA共存的情况下对热的耐受性明显提高所做出的。
实施例中所用的固定化CPC酰化酶的热稳定性和pH耐受性
固定化CPC酰化酶的制备同实施例1。
热稳定性:
分别将1g固定化CPC酰化酶加入到10mL的磷酸钠缓冲液中(20mM,pH8.0)中得到三个样品,将三个样品分别在10℃,20℃,37℃温育,定时取样测定酶活。结果见图1。
从图1可以看到,温度越高,CPC酰化酶的酶活性损失越大。所以在现有技术中尽量避免在高温下进行反应。
与7-ACA共存情况下的热稳定性:
分别将1g固定化CPC酰化酶加入到10mL的磷酸钠缓冲液中(20mM,pH8.0)得到两个样品,在其中一个样品中加入7-ACA使得7-ACA的浓度为2mg/m,将这两个样品分别在37℃下温育,定时取样测定酶活。结果见图2。
从图2可以看出,在有产物7-ACA存在条件下,CPC酰化酶对温度的稳定性显著提高。
pH耐受性:
分别将1g固定化CPC酰化酶置于10mL的pH分别为6.0,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5的20mM磷酸钠缓冲液中,20℃下温育,定时取样测定酶活。结果如图3所示。
从图3可以看到,CPC酰化酶在pH8.5时稳定性最好。
催化进程中固定化CPC酰化酶颗粒微环境的pH变化检测:
(1)通过5-氨基荧光素(5-AF)作为pH荧光指示剂可反映催化过程微环境中pH的变化情况,需要将CPC酰化酶与5-AF共同固定到EPC上。在约2gEPC载体中加入约0.01g5-AF(5-AF:EPC载体质量比为0.0050:1),按400U/g投酶量加入CPC酰化酶和两倍酶液体积的1.25M磷酸钠缓冲液(pH8.0),使磷酸钠缓冲液终浓度为0.83M。25℃,160rpm条件下,放置24h。24h后,用去离子水和0.1MPBS对载体进行清洗,抽滤回收4℃保存。并采用前述的方法测定酶活。
(2)将步骤(1)中得到的固定化酶采用6U/ml的投酶量,投入25mg/ml的头孢菌素C水溶液中,并用2M氨水调节反应体系pH8.5,用循环水浴控制整个反应的温度。采用磁力搅拌使溶液中固定化酶颗粒均匀分散,用荧光原位pH计(pH-1miniv2,PreSensPrecisionSensingGmbH)检测其荧光振幅。
(3)整个反应过程中采用荧光原位pH计通过荧光振幅的检测来测定反应固定化酶颗粒表面微环境pH的变化。主体相pH是通过自动电位滴定仪控制在8.5。
实验发现在低温10℃催化时固定化酶微环境pH变化幅度较小,约为0.6个单位左右;15℃催化时固定化酶微环境pH变化幅度约为0.8个单位左右;高温30℃催化时固定化酶微环境pH变化幅度较大,约为1.5个单位左右;高温37℃催化时固定化酶微环境pH变化幅度较大,约为1.8个单位左右。通过变温两阶段催化(如实施例2的前期10℃后期30℃,实施例3的前期15℃后期37℃)使催化过程中的微环境pH变化平缓,固定化酶的微环境pH偏离主体相pH的值均在1个单位内,与单一较低温度(如10℃或15℃)催化微环境pH偏离主体相的值基本一致,而与单一较高温度(如30℃或37℃)催化微环境pH偏离主体相的值(接近2个单位)有很大的缩小,在很大程度上提高了固定化酶的稳定性。
最后所应说明的是:以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应该理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换;而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换,均应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.利用固定化头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法,该方法包括:将固定化头孢菌素C酰化酶与头孢菌素C在液体中混合,在反应周期内将反应体系的温度从初始反应温度连续地或不连续地升温至16-37℃,优选20-35℃,再优选25-35℃。
2.根据权利要求1的方法,其中所述初始反应温度为0-15℃,优选3-15℃,更优选5-10℃。
3.根据权利要求1或2的方法,其中所述液体是水或磷酸钠缓冲液。
4.根据权利要求1-3任一项的方法,其中所述连续地升温以恒定的升温速度0.01℃/分钟-3.0℃/分钟,优选0.05℃/分钟-2.0℃/分钟,更优选0.1℃/分钟-1.0℃/分钟进行。
5.根据权利要求1-3任一项的方法,其中所述连续地升温以不恒定的升温速度进行,尤其是先慢后快的升温速度,其中升温的平均速度落入0.01℃/分钟-3.0℃/分钟,优选0.05℃/分钟-2.0℃/分钟,更优选0.1℃/分钟-1.0℃/分钟的范围内。
6.根据权利要求1-3任一项的方法,其中所述不连续地升温以阶梯式进行。
7.根据权利要求6任一项的方法,其中所述阶梯式包括在5-15℃保持总反应时间的1/2-3/4然后在20-37℃保持总反应时间的1/4-1/2的两阶段升温,或者在5-15℃保持总反应时间的1/4-1/2然后在20-25℃保持总反应时间的1/4-2/3然后在28-37℃保持总反应时间的1/4-1/3的三阶段升温。
8.7-氨基头孢烷酸用于保护头孢菌素C酰化酶的热稳定性的用途。
9.根据权利要求8的用途,所述头孢菌素C酰化酶是固定化头孢菌素C酰化酶。
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CN110964771A (zh) * | 2018-09-29 | 2020-04-07 | 北京科技大学 | 制备7-氨基头孢烷酸的方法 |
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CN105624257B (zh) | 2019-11-08 |
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