CN110964772A - 连续制备7-氨基头孢烷酸的方法 - Google Patents

连续制备7-氨基头孢烷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及连续制备7‑氨基头孢烷酸的方法，特别涉及利用头孢菌素C酰化酶一步酶法催化连续制备7‑氨基头孢烷酸的方法。具体地，该方法包括使包含头孢菌素C以及碳酸氢铵和/或碳酸铵的水溶液连续通过装填有固定化头孢菌素C酰化酶的反应器。本发明还涉及碳酸氢铵和/或碳酸铵在用于维持头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C制备7‑氨基头孢烷酸过程中pH的稳定性的用途。

Description

连续制备7-氨基头孢烷酸的方法
技术领域
本发明涉及连续制备7-氨基头孢烷酸的方法，特别涉及利用头孢菌素C酰化酶一步酶法催化连续制备7-氨基头孢烷酸的方法。
背景技术
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid)简称7-ACA，分子式为C10H12N2O5S，是医药工业中合成多种头孢菌素类抗生素的母核，具有十分重要的市场价值。
7-ACA的生产方法有化学法和生物酶法两种。传统的化学法具有高污染、高能耗的缺点，其在工业生产中存在诸多问题。相比化学法，生物酶法具有高效、低耗、绿色环保等显著优势。目前工业上主要采用一步酶法生产7-ACA，即在头孢菌素C酰化酶(以下简称“CPC酰化酶”)的作用下，底物头孢菌素C(CPC)直接水解生成α-氨基己二酸和产物7-ACA。
目前，在工业上应用的酶催化中普遍采用纯水体系。由于在CPC酰化酶催化CPC生成7-ACA的过程中产生酸性物质，因此需要不断加碱调节pH以维持催化反应的顺利进行，但是，加入强碱的操作会造成局部溶液的pH值过高，这可能会导致酶的失活，使得CPC酰化酶催化稳定性降低。
也有采用磷酸盐缓冲液体系，但是通常浓度的缓冲液的缓冲容量往往不足以维持反应体系的pH值不变，而且加入缓冲液会影响产物的后续分离(缓冲液中的盐成分随7-ACA结晶，使得产物7-ACA的纯度下降)，导致产品质量下降和成本增加。
因此，在工业上需要进一步提高CPC酰化酶的催化稳定性。同时，也期望能实现连续生产从而简化操作并降低成本。
但是，由于7-ACA的一步酶催化过程中产生酸性物质，需要不断加碱调节pH以维持催化反应的顺利进行，在传统的用于连续反应的填充床反应器中进行酶催化无法实现加入碱液调节pH的操作，难以控制酶催化体系pH值的稳定，从而无法采用填充床反应器这种简单的连续化催化形式。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中存在的问题的连续制备7-ACA的方法，在本发明的方法中，酶的稳定性得到提高并且能够实现连续催化制备7-ACA。
本发明人在研究中发现，通过在催化反应体系中加入碳酸氢铵和/或碳酸铵能够改善CPC酰化酶的催化稳定性，同时能够稳定反应体系中的pH值。
与经常用到的缓冲液(例如磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、Tris-HCl和碳酸钠等)不同，碳酸氢铵和/或碳酸铵本身非常不稳定，通常并不用它配制缓冲液。但本发明人通过研究出人意料地发现在催化体系中加入碳酸氢铵和/或碳酸铵能够显著提高CPC酰化酶的催化稳定性，并能够稳定反应体系中的pH值。
另外，碳酸氢铵和/或碳酸铵很容易在催化产物的后续分离中除去(7-ACA通常采用盐酸调节pH至酸性来进行沉淀，在此过程中碳酸氢氨和/或碳酸铵会生成二氧化碳去除)，不会影响7-ACA的产品质量。就生产成本而言，碳酸氢铵和碳酸铵价格十分低廉。
附图说明
图1是在搅拌釜反应器中分别在纯水、磷酸盐缓冲液以及碳酸氢铵水溶液中进行催化反应的固定化CPC酰化酶微环境中的pH变化。
图2是一步酶催化连续制备7-ACA的方法示意图。
具体实施方式
以下更详细地介绍本发明的各种实施方式。
使用CPC酰化酶以CPC为底物一步酶催化制备7-ACA的工艺是已知的。反应过程简单示意如下：
Figure BDA0001817335560000031
作为反应底物CPC，在实际使用中，CPC结构中的羧基在水溶液中电离为-COO-，其可以结合各种各样的阳离子，但是，无论是结合何种阳离子，所得到的CPC盐均包含在本发明的术语“头孢菌素C”或“CPC”的范围内。因此，在本发明上下文中，术语“头孢菌素C”或“CPC”应当广义理解，不仅包括CPC本身，还包括CPC的盐例如CPC钠盐和CPC锌盐等以及CPC发酵直通液等，CPC发酵直通液是指以发酵法制备CPC获得的发酵液经过初步纯化后获得的溶液。在本发明中，作为例举，使用了CPC钠盐。
作为用于本发明的催化剂CPC酰化酶，本领域技术人员知道，能催化CPC的CPC酰化酶都可以用于一步酶催化制备工艺中。作为详细介绍本发明的例子，列举了来自山东鲁抗立科药业有限公司的工业用固定化头孢菌素C酰化酶(酶活180U/g)以及使用基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-acy或者BL21(DE3)/pET28-CPCacy产生的CPC酰化酶(安明,于慧敏,罗晖,宋文斯,沈忠耀.CPC酰化酶基因的人工合成与重组表达.清华大学学报,2008,48(9):119-123；于慧敏，宋文斯，安明，罗晖，沈忠耀.一种头孢菌素C酰化酶及其载体和应用.专利号：ZL 200810102219.7)。
在本发明中，为了实现连续制备7-ACA，将CPC酰化酶进行固定化，并将固定化酶填充到反应器(例如填充床反应器)中。CPC酰化酶的固定化可以采用常规技术进行，可以采用常规载体，例如，来自西安蓝晓科技有限公司的LX1000-EP和LX1000-EPC。将包含碳酸氢氨和/或碳酸铵以及CPC的水溶液连续通过填充有固定化CPC酰化酶的反应器(例如填充床反应器)，控制流速和反应条件使得底物转化率达到所需的水平，例如98％的转化率，95％的转化率，90％的转化率。
在本发明中，在反应体系中使用碳酸氢铵和/或碳酸铵，可以大幅度提高CPC酰化酶的催化稳定性，从而延长酶的使用寿命。不希望受任何理论的束缚，本发明人推测碳酸氢铵和/或碳酸铵的使用使得CPC酰化酶周围的微环境pH得以稳定地调节，从而保持了CPC酰化酶的稳定性。
参见图1，在搅拌釜反应器中分别在纯水、磷酸盐缓冲液以及碳酸氢铵水溶液中进行催化反应的固定化酶CPC酰化酶微环境中的pH变化。其中，在反应进行过程中，反应体系的主相的pH都保持在8.5。但是，在使用纯水的反应体系中，虽然一直通过滴加氨水来控制主体相溶液pH为8.5，但是固定化酶微环境pH有较大程度的降低，最低微环境pH值甚至达到7.2左右，远低于最佳pH值8.5。在加入了0.1M磷酸缓冲液的催化过程中，其固定化酶微环境pH有一定程度的控制，最低微环境pH在8以上。而在加入了0.1M碳酸氢氨作为缓冲溶液的催化过程中，固定化酶微环境pH一直控制在pH8.5左右。在实施例6中给出了图1中数据的获得方法。
同时，在本发明中，还出人意料地发现，在连续制备过程中不需要额外加入酸和/或碱来调节催化体系的pH值，就可以使得催化体系的pH保持在适宜范围内，从而确保了制备的连续进行。
在本发明的上下文中，术语“反应体系”或“催化体系”具有本领域通常的含义，包括在催化进行过程中参与反应的底物、酶以及所得到的产物和副产物，还包括溶剂以及其中加入的各种助剂；实践中，可以理解为进行催化反应的容器中除了反应器设备之外的内容物。
在本发明的上下文中，术语“约”表示±10％(优选±5％)的误差范围均被涵盖在所述数值的范围内，例如，9-11以内(优选9.5-10.5以内)的数值都被涵盖在“约10”的表述的范围内。
优选地，本发明的连续催化反应包括：将CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液中，用稀盐酸或氨水调节溶液pH7～9，例如8-9，例如8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9，特别是8.5。优选地，碳酸氢铵和/或碳酸铵在水溶液中的浓度为10mmol/L～2mol/L，例如10mmol/L～500mmol/L，50mmol/L～400mmol/L，80mmol/L～300mmol/L，100mmol/L～300mmol/L，100mmol/L～280mmol/L。在本发明中，本领域技术人员应当理解，CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液中的顺序没有特别的限制，可以先将碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液，然后再加入CPC；也可以先将CPC溶于水溶液，然后再加入碳酸氢铵和/或碳酸铵；还可以将CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵分别溶于水溶液，然后将二者的水溶液混合在一起，同时，保持pH在上述范围内。pH值保持在上述范围内，可以通过将CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液之后进行调节，也可以在混合过程中调节，还可以通过估算调节二者混合前的pH，使得二者混合后的pH处于上述范围内。
优选地，本发明的连续催化反应包括：将包含CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵的水溶液连续通过填充有固定化CPC酰化酶的反应器例如填充床反应器，催化体系温度保持在10℃-37℃，例如，10℃，12℃，15℃，20℃，25℃，30℃。温度越高酶活越高，但酶的催化稳定性降低，且底物CPC容易降解。催化过程中无需加入碱液来调节反应器内的pH值，通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的CPC，当底物转化率低于95％时适当调低进料流速。上述连续通过可以通过本领域现有技术来实现，例如通过泵(例如计量泵)来泵送。
将经过填充床反应器催化后得到反应清液，通过常规方法结晶获得7-ACA晶体；例如，加入盐酸调节其pH值至pH3.5，在4℃放置，析出7-ACA晶体，离心后用丙酮洗涤晶体，干燥得到7-ACA产品。
实施例
以下通过实施例对本发明的方法进行详细的阐述。
测定或计算方法：
CPC的转化率的计算方法为：
CPC转化率＝(反应零时刻CPC浓度-反应结束时CPC浓度)/反应零时刻CPC浓度
7-ACA的摩尔收率的计算方法为：
7-ACA的摩尔收率＝反应结束时7-ACA摩尔浓度/(反应零时刻CPC摩尔浓度-反应结束时CPC摩尔浓度)
CPC浓度或7-ACA浓度的检测方法：
反应过程中，取20μL反应液加入180μL的终止液(50mmol/L的NaOH溶液与20％的冰醋酸溶液按1:2的体积比混合而成)，再取20μL的上述液体加至180μL的超纯水中，即将反应液稀释了100倍，取40μL进行液相色谱上样，根据7-ACA和CPC出峰的积分峰面积，根据标准曲线得出7-ACA和CPC的浓度。
液相色谱分析条件为：色谱柱为Phenomenex Luna C-18(4.6×150mm)，以15％甲醇-7.5％乙腈-1％乙酸为流动相，流速为0.8mL/min、检测波长为254nm。
酶活定义：在37℃，pH8.5条件下，1min催化产生1μmol 7-ACA所需的酶量为1个酶活单位。
固定化CPC酰化酶1的制备：
基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy的培养
培养基：
LBK培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，卡那霉素50μg/mL，pH7.0)
玉米浆培养基(5％玉米浆，0.017M KH2PO4，0.072M K2HPO4，0.4％葡萄糖，20mM乳糖，50μg/mL卡那霉素,pH7.5)
培养：在LBK培养基中，37℃，200r/min，对基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy进行培养10h，以4％接种量接种到玉米浆培养基中，30℃，200r/min，培养12h。
收集：10000rpm离心5min收获菌体。
将1g菌体用100ml去离子水重悬，超声波破碎菌体。超声的条件是：超声3秒，间隔3秒，99个循环，超声功率200W，共破碎两次。4℃下，10000rpm离心10min，上清液即为头孢菌素C酰化酶酶液。
调节头孢菌素C酰化酶酶液pH8.5，加入共价偶联固定化酶载体LX1000-EP(来自西安蓝晓科技有限公司)，在20℃摇床中振荡24小时。用去pH8.5、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液清洗三次，真空抽滤得到所需的固定化头孢菌素C酰化酶1。4℃保存备用。
实施例1：填充床反应器的催化
CPC溶液的配制：将头孢菌素C钠盐溶解于250mM的碳酸氢铵溶液中，得到CPC浓度为30mg/ml的溶液，用氨水调节溶液至pH8.5。
催化：将配制的CPC溶液用输液泵通过硅胶管输送通过填充床反应器(Ф5×100mm的柱式反应器中装填入0.9g上述制备的固定化头孢菌素C酰化酶1(酶活63U/g))，初始流速0.05ml/min，反应温度25℃。反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行分析。控制进入填充床反应器的头孢菌素C溶液的流速，使得经过反应器的底物转化率超过95％。反应器出口的pH降为约8.25。通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的头孢菌素C，当底物转化率低于95％时适当调低进料流速，连续运行39天后进料流速降至0.02ml/min，此时固定化酶的7-ACA产量为33.9g/g固定化酶。
实施例2：填充床反应器的催化
CPC溶液的配制：头孢菌素C钠盐溶解于200mM的碳酸氢铵溶液中，得到CPC浓度为30mg/ml的溶液，用氨水调节溶液pH8.5。
催化：将配制的CPC溶液用输液泵通过硅胶管输送通过填充床反应器(Ф5×100mm的柱式反应器中装填入0.9g上述固定化头孢菌素C酰化酶1(酶活63U/g))，流速0.02ml/min，反应温度20℃。反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行分析。初始反应时，进入填充床反应器的头孢菌素C溶液的转化率超过98％。通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的头孢菌素C和反应生成的7-ACA。以恒定的底物进料流速连续运行60天后，反应器出料中CPC的转化率为88％，此时固定化酶的7-ACA产量为31.2g/g固定化酶。
实施例3：填充床反应器的催化
CPC溶液的配制：头孢菌素C钠盐溶解于200mM的碳酸氢铵溶液中，得到CPC浓度为25mg/ml的溶液，用氨水调节溶液pH8.5。
催化：将配制的CPC溶液用输液泵通过硅胶管输送通过填充床反应器(Ф5×100mm的柱式反应器中装填入0.9g来自山东鲁抗立科药业有限公司的工业用的固定化头孢菌素C酰化酶(酶活180U/g))，初始流速0.02ml/min，反应温度25℃。反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行分析。控制进入填充床反应器的头孢菌素C溶液的流速，使得经过反应器的底物转化率超过99％。通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的头孢菌素C，连续运行90天底物头孢菌素C的转化率一直都超过98.5％，此时固定化酶的产量为47.53g/g固定化酶。
实施例4：搅拌釜与填充床反应器的联合催化
在一个带夹套控温的50ml搅拌釜反应器中加入30ml溶解于去离子水的37.5mg/ml底物头孢菌素C钠盐(用氨水调节pH值为8.5)，加入2.5g固定化头孢菌素C酰化酶(来自山东鲁抗立科药业有限公司的工业用酶，酶活180U/g)，控制催化温度为12℃，用2M氨水自动控制催化pH8.5。同时，将底物溶液(头孢菌素C水溶液浓度为37.5mg/ml，氨水调节pH值为8.5)用输液泵以0.2ml/min的流速连续进料到反应釜中。将2倍体积的转化率为80％左右的反应釜反应液与1倍体积的0.3M碳酸氢铵水溶液混合后，在填充柱反应器(Ф8×110mm的柱式反应器中装填入3.5g来自山东鲁抗立科药业有限公司的工业用固定化头孢菌素C酰化酶，酶活180U/g)中25℃和0.2ml/min流速下接着进行催化，反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行HPLC分析，转化率达到99％以上。连续运行10天后，搅拌釜中底物头孢菌素C的转化率稳定在80％左右，填充柱反应器催化后的底物头孢菌素C的转化率超过99％，此时固定化酶的7-ACA产量为11.09g/g固定化酶。
实施例5：催化产物的分离与纯化
在实施例1中所获得的催化反应液100ml，冷却至10℃，向反应液底部中缓慢加入15％的盐酸调节其pH为3.8，于4℃下放置5h，过滤，用丙酮淋洗。4℃干燥得到产物粉末，通过液相色谱测其纯度为98.1％，纯化过程的收率为91.2％。
实施例6：固定化酶催化过程中微环境pH的检测
CPC酰化酶的制备：
将保存的菌种E·coli BL21(DE3)/pET28-CPCAcy接种到LBK培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，卡那霉素50μg/mL，pH7.0)中，37℃，160rpm摇床培养12h，转接到新鲜的LBK培养基中，培养6h，保证菌种达到对数生长期。再将获得菌种以2.5％的接种量接入培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4·12H2O 8.95g/L，KH2PO43.4g/L，NH4Cl2.67g/L，Na2SO40.7g/L，MgSO40.24g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L)中上罐发酵，具体发酵条件为：28℃，搅拌速度300rpm，料液体积3L，发酵24h。将获得的菌体用0.1mol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液重悬，用高压匀浆机进行细胞破碎，调节破碎压力800bar。破碎液在7000rpm下4℃离心10min，得到上清液即为所需CPC酰化酶的酶液。
标记5-氨基荧光素的固定化CPC酰化酶的制备：
称上述获得的CPC酰化酶的酶液100mL，加入pH8.0、1.25mol/L的磷酸钠缓冲液200mL，混匀。加入3g共价偶联固定化酶载体LX1000-EPC(西安蓝晓科技有限公司)，加入0.015g 5-氨基荧光素钠，混匀。在25℃摇床中振荡24小时。真空抽滤，用大量去离子水洗。用pH8.5、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液清洗三次，抽滤得到所需的固定化CPC酰化酶，4℃保存备用。
CPC溶液的制备：
(1)称取CPC钠盐2.5g，溶解于100ml的100mM碳酸氢铵溶液中，用氨水调节溶液至pH8.5。
(2)称取CPC钠盐2.5g，溶解于100ml的100mM磷酸钠缓冲溶液中，用氨水调节溶液至pH8.5。
(3)称取CPC钠盐2.5g，溶解于100ml的水中，用氨水调节溶液至pH8.5。
催化：分别将2.5g的上述固定化CPC酰化酶加入到30ml的上述3种CPC溶液中，在37℃下催化反应，加入氨水控制催化主体溶液的pH8.5，同时用光纤pH传感器pH-1mini v2(PreSens Precision Sensing GmbH)进行固定化酶微环境pH的监测。pH-1mini v2检测得到催化体系的荧光强度，固定化酶微环境的pH值用所测荧光强度通过标准pH对应的荧光强度关系曲线来进行换算。将所得的曲线示于图1中。
对比例1
CPC溶液的配制：头孢菌素C钠盐溶解于去离子水中，得到CPC浓度为25mg/ml的溶液，用氨水调节溶液pH8.5。
催化：将配制的CPC溶液用输液泵通过硅胶管输送通过填充床反应器(Ф5×100mm的柱式反应器中装填入上述制备的0.9g固定化头孢菌素C酰化酶1(酶活63U/g))，流速0.05ml/min，反应温度25℃。通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的头孢菌素C，发现头孢菌素C的转化率仅为26％，即无法用水配制的底物进行填充床的连续催化。
对比例2
CPC溶液的配制：头孢菌素C钠盐溶解于250mM的pH8.5磷酸钠溶液中，得到CPC浓度为25mg/ml的溶液。
催化：将配制的CPC溶液用输液泵通过硅胶管输送通过填充床反应器(Ф5×100mm的柱式反应器中装填入0.9g上述制备的固定化头孢菌素C酰化酶1(酶活63U/g))，流速0.05ml/min，反应温度25℃。通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的头孢菌素C，发现底物的转化率仅为53％。即用磷酸钠缓冲液配制的底物进行填充床的连续催化时，无法保证足够高的底物转化率。
对比例3
CPC溶液的配制：头孢菌素C钠盐溶解于250mM的pH8.5磷酸钠溶液中，得到CPC浓度为10mg/ml的溶液。
催化：将配制的CPC溶液用输液泵通过硅胶管输送通过填充床反应器(Ф5×100mm的柱式反应器中装填入0.9g上述制备的固定化头孢菌素C酰化酶1(酶活63U/g))，流速0.05ml/min，反应温度25℃。通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的头孢菌素C，当底物转化率低于95％时适当调低进料流速。反应器出口的pH降为约7.2。由于CPC酰化酶的催化活性在pH7.2时仅为pH8.5的40％左右，且磷酸钠缓冲液的浓度(250mM)不宜继续升高，为保证足够的底物转化率而选择了10mg/ml的头孢菌素C浓度。连续运行42天后进料流速降至0.03ml/min，此时固定化酶的7-ACA产量为11.44g/固定化酶。
将对比例3中所获得的催化反应液100ml，冷却至10℃，向反应液底部中缓慢加入15％的盐酸调节其pH为3.8，于4℃下放置5h，过滤，用丙酮淋洗。4℃干燥得到产物粉末，通过液相色谱测其纯度为64.2％，纯化过程的收率为75.6％。推测磷酸盐在4℃时的溶解度较小，导致磷酸盐进入到7-ACA的晶体中。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.连续制备7-氨基头孢烷酸方法，其特征在于，使包含头孢菌素C以及碳酸氢铵和/或碳酸铵的水溶液连续通过填充有固定化头孢菌素C酰化酶的反应器。
2.如权利要求1所述的方法，其中水溶液的pH为7-9，例如pH8-9，特别是pH8.5。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中反应器内的催化体系温度在10℃-37℃的范围内，例如10-25℃范围内。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，碳酸氢铵和/或碳酸铵在水溶液中的浓度为10mmol/L～2mol/L，例如10mmol/L～500mmol/L。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述头孢菌素C酰化酶是基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-acy或者BL21(DE3)/pET28-CPCacy产生的头孢菌素C酰化酶。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述反应器是填充床反应器。
7.碳酸氢铵和/或碳酸铵在用于维持头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸过程中pH的稳定性的用途。
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