CN109628541B - 一种酶法合成青霉素v盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法合成青霉素V盐的方法，该方法是将6‑APA和苯氧乙酸衍生物及青霉素酰化酶催化剂在溶液中进行酶催化反应生成青霉素V；将溶液中的青霉素酰化酶分离后，酸化析出青霉素V晶体，青霉素V晶体经过盐化，即得青霉素V盐，该方法与现有技术相比，生产周期短、操作简单、绿色无污染、生产成本低，制备的青霉素V盐液相纯度可达99.7％以上，4‑羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％，产品质量远远超过现有的发酵法生产的青霉素V盐，高于国外同类原料药质量标准，具有良好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种青霉素V盐的合成方法，特别涉及一种6-APA和苯氧乙酸衍生物原料在青霉素酰化酶催化作用下一步反应生成青霉素V的方法，属于医药化工技术领域。
背景技术
青霉素V盐(青霉素V钾、青霉素V钠)是临床上常用的抗生素药物，其中青霉素V钾应用更广泛。青霉素V钾属β-内酰胺酶类抗生素，抗菌谱与青霉素G相似，能够破坏细菌细胞壁，具有杀菌作用，是治疗革兰阳性菌及部分阴性菌感染的首选药物，临床上已广泛应用于治疗脓肿、化脓性脑膜炎，肺炎、淋病等症。青霉素V钾与青霉素G钾/钠相比，其对酸稳定，不易被胃酸破坏，口服吸收好，其口服制剂尤其适合儿童使用。另外，被β-内酰胺酶的破坏比青霉素G钾/钠慢，故对耐药性金葡菌引起的感染比青霉素G钾/钠更有效。
国外青霉素V钾片最早于1952年开始应用于临床，1957年9月获美国FDA批准，美国药典、英国药典、日本药局方等均有收载。目前，美国、加拿大、英国、德国、日本等国家均有生产，是国际上临床使用较广泛的一种口服抗生素。青霉素应用至今发生过敏反应的机率较高，常见的过敏反应包括皮疹、荨麻疹、皮炎、发热、血管神经性水肿、哮喘、过敏性休克等，其中以过敏性休克最为严重，甚至可导致死亡。为了防止过敏反应的发生，特别是严重过敏反应的发生，国内规定青霉素在使用前需要做皮肤敏感试验，皮试阴性的药物可以给病人使用，皮试阳性的则禁止使用，而在国外口服的青霉素类药品均是免皮试的。
近年来口服青霉素V制剂的需求量大大增加，但是国内生产的青霉素V盐原料药产品质量同国外的原料药质量相比还存在相当大的距离。因此，如何生产达到甚至超过国外原料药质量水平的青霉素V盐、得到杂质含量低尤其是聚合物杂质含量低的青霉素V盐，是一个有重大意义的课题。
目前国内能自行生产青霉素V钾原料药的供应商主要是华北制药，利用微生物菌株从发酵工艺生产，所述菌株能在存在侧链前体苯氧乙酸时生产青霉素V，发酵之后，从发酵培养液中回收青霉素V。如中国专利(CN101747341A)提到的青霉素V钾的生产方法包括如下工序：发酵、酸化提取、脱色过滤、碳酸盐溶液抽提、共沸结晶、洗涤、干燥，整个过程需要半个月以上。青霉素V钾原料及制剂中可能会含有其合成前体、工艺副产物以及各种降解产物；另外，青霉素V钾也可能自身聚合，产生高分子聚合物。工艺副产物、降解产物和聚合物杂质最大来源是生产过程，生产过程越长，杂质产生几率越大。β-内酰胺类抗生素所致的过敏反应，经多年来的研究已经证明和药物中存在的高分子聚合物有关。现有的生产青霉素V钾的方法因发酵周期长、生产工序长，故各种工艺副产物、降解产物和聚合物杂质含量高。与发酵法相比，酶法合成法具有生产周期短、工艺简单、反应条件温和、转化率高、副产物少、杂质含量少、产品质量高等优点，近年来受到广泛关注，目前未见酶法合成青霉素V盐的公开文献报道。
发明内容
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明的目的是在于提供一种酶法合成青霉素V盐的方法，该方法生产周期短、操作简单、绿色无污染、生产成本低，制备的青霉素V盐液相纯度可达99.7％以上，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％，产品质量远远超过现有的发酵法生产的青霉素V盐，高于国外同类原料药质量标准。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种酶法合成青霉素V盐的方法，该方法是将6-APA和苯氧乙酸衍生物及青霉素酰化酶催化剂在溶液中进行酶催化反应生成青霉素V；将溶液中的青霉素酰化酶分离后，酸化析出青霉素V晶体，青霉素V晶体经过盐化，即得；所述青霉素酰化酶包括青霉素G酰化酶突变体和/或青霉素V酰化酶突变体。
优选的方案，所述苯氧乙酸衍生物具有式1结构：
其中，R为-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH(CH3)2、-O(CH2)3CH3、-OCH2(CHOH)2CH2OH、-NH2或
本发明的苯氧乙酸衍生物中R主要为离去基团，其对反应的影响相对较小，理论上选择范围较广，本发明优选为本领域常见的有机取代基团。
优选的方案，所述青霉素酰化酶以固定化细胞形式和固定化酶形式加入。本发明的青霉素酰化酶采用固定化细胞形式和固定化酶形式加入，主要是使酶更稳定化，更有利于后续的酶与反应液的分离，通过简单的过滤即可实现酶的分离回收，实现再利用。本发明的采用的青霉素G酰化酶及青霉素V酰化酶均来自现有技术，如中国专利(CN105274082A)或(CN105087533A)中报道的青霉素G酰化酶突变体，以及(Enzyme and microbialtechnology，Volume 119，December 2018，Pages 65-70)中报道的青霉素V酰化酶突变体。而本发明技术方案首次发现这两种酶可以催化6-APA和苯氧乙酸衍生物之间的反应一步高选择性合成青霉素V。
优选的方案，6-APA与苯氧乙酸衍生物的摩尔比为1：1.1～1.5。
优选的方案，6-APA与青霉素酰化酶的重量比为1：2～4。
优选的方案，所述酶催化反应的条件为：在温度为5～40℃，pH为4.0～8.0条件下，反应1～2h。较优选的温度为10～30℃。较优选的pH为5.0～6.0。较优选的反应时间为80～100min。在优选的条件下有利于酶活性的发挥，提高酶催化反应效率。
优选的方案，所述酸化过程为：采用酸液调节溶液pH值至2.5～3.5，养晶10～30分钟。在优选的条件下有利于青霉素V晶体的生成和长大。酸液可以为盐酸、硫酸等常见酸液。
优选的方案，所述盐化过程为：将青霉素V晶体采用碳酸盐溶液调节pH5.5～7.5，再添加带水剂，减压蒸发浓缩至晶体析出。碳酸盐主要是指碳酸钠或碳酸钾。带水剂如正丁醇、甲苯等，带水剂主要是与水形成共沸，带走水分。
本发明的青霉素V盐的制备过程中，由原料到获得产物，整个合成、纯化及结晶全过程不超过24小时。
本发明制备的青霉素V盐液相纯度可达99.7％以上，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％。
本发明的青霉素V盐合成路线如下：
相对现有技术，本发明技术方案带来的有益效果为：
本发明首次发现最新报道的青霉素G酰化酶突变体和青霉素V酰化酶突变体对6-APA和苯氧乙酸衍生物之间的反应具有很好的催化活性，可以实现青霉素V的高效合成，以进一步获得高纯度青霉素V盐。
本发明的青霉素V盐的生产周期短，青霉素V盐合成、纯化、结晶全过程不超过24小时。
本发明的青霉素V盐的生产过程操作简单，只需一步合成和两步结晶步骤。
本发明的青霉素V盐的合成过程绿色无污染，不需使用醋酸丁酯等进行萃取纯化。
本发明的青霉素V盐合成以6-APA和苯氧乙酸衍生物为原材料，且青霉素酰化酶可以反复利用，成本低。
本发明的青霉素V盐产品质量好，远远超过现有的发酵法生产的青霉素V盐，高于国外同类原料药质量标准，液相纯度可达99.7％以上，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质低于0.02％，可改变国内现有的青霉素V药物必须做皮试的现状。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备的青霉素V钾结晶粉HPLC检测色谱图。
图2是本发明实施例2中制备青霉素V反应过程中HPLC检测色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步阐明本发明内容，但不以任何形式限制本发明权利要求保护范围。
实施例1
取25.0g 6-APA，加入300mL纯水，滴加3mol/L的氨水溶液使6-APA充分溶解，加入30.0g苯氧乙酸乙二醇酯，混合均匀，加入50.0g固定化青霉素酰化酶，滴加3mol/L的氨水溶液使反应pH5.0，温度30℃，反应90分钟取样HPLC检测，此时的6-APA浓度为0.8mg/mL，青霉素V浓度为106.9mg/mL；筛网分离固定化酶与反应液，将反应液用6mol/L的盐酸调节pH值至3.0，养晶20分钟，过滤，得到青霉素V酸滤饼；滤饼转至5倍重量的纯水中，用一定浓度的碳酸钾溶液调节混合溶液pH值至6.0，再补加正丁醇至一定浓度，减压蒸发浓缩至有晶体析出，晶体经过滤、洗涤、干燥后得到青霉素V钾结晶粉38.8g，青霉素V钾摩尔收率86.39％，青霉素V钾各项检测结果均符合《中国药典》2015版要求，青霉素V钾液相纯度99.80％，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质0.010％。
实施例2
取25.0g 6-APA，加入400mL纯水，滴加3mol/L的氨水溶液使6-APA充分溶解，加入30.0g苯氧乙酸甘油酯，混合均匀，加入75.0g固定化青霉素酰化酶，滴加3mol/L的氨水溶液使反应pH6.0，温度20℃，反应80分钟取样HPLC检测，此时的6-APA浓度为0.3mg/mL，青霉素V浓度为87.5mg/mL；筛网分离固定化酶与反应液，将反应液用6mol/L的盐酸调节pH值至2.8，养晶20分钟，过滤，得到青霉素V酸滤饼；滤饼转至4倍重量的纯水中，用一定浓度的碳酸钾溶液调节混合溶液pH值至6.3，再补加正丁醇至一定浓度，减压蒸发浓缩至有晶体析出，晶体经过滤、洗涤、干燥后得到青霉素V钾结晶粉39.1g，青霉素V钾摩尔收率87.06％，青霉素V钾各项检测结果均符合《中国药典》2015版要求，青霉素V钾液相纯度99.85％，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质0.011％。
实施例3
取25.0g 6-APA，加入400mL纯水，滴加3mol/L的氨水溶液使6-APA充分溶解，加入35.0g苯氧乙酸丁四醇酯，混合均匀，加入50.0g固定化青霉素酰化酶，滴加3mol/L的氨水溶液使反应pH5.0，温度30℃，反应90分钟取样HPLC检测，此时的6-APA浓度为0.5mg/mL，青霉素V浓度为89.0mg/mL；筛网分离固定化酶与反应液，将反应液用6mol/L的盐酸调节pH值至2.8，养晶20分钟，过滤，得到青霉素V酸滤饼；滤饼转至4倍重量的纯水中，用一定浓度的碳酸钾溶液调节混合溶液pH值至6.5，再补加正丁醇至一定浓度，减压蒸发浓缩至有晶体析出，晶体经过滤、洗涤、干燥后得到青霉素V钾结晶粉40.5g，青霉素V钾摩尔收率90.18％，青霉素V钾各项检测结果均符合《中国药典》2015版要求，其中青霉素V钾液相纯度99.77％，4-羟基苯氧甲基青霉素(杂质D)未检出，聚合物杂质0.015％。
以上实施例制备的青霉素V钾结晶粉的有关物质检测情况见表1，聚合物检测情况见表2，有关物质和聚合物按照《中国药典》2015版第二部青霉素药典方法检查。
表1不同来源的青霉素V钾结晶粉杂质对比
/代表未检出，杂质D指4-羟基苯氧甲基青霉素对照品，杂质E指苯氧甲基青霉噻唑酸对照品，杂质F指苯氧甲基脱羧青霉噻唑酸对照品。
表2不同来源的青霉素V钾结晶粉聚合物杂质含量对比
Claims (5)
1.一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：将6-APA和苯氧乙酸衍生物及青霉素酰化酶催化剂在水溶液中，在温度为10～30℃，pH为5.0～6.0条件下，反应1～2h，生成青霉素V；将溶液中的青霉素酰化酶分离后，酸化析出青霉素V晶体，青霉素V晶体经过盐化，即得；所述青霉素酰化酶包括青霉素G酰化酶突变体和/或青霉素V酰化酶突变体；
所述苯氧乙酸衍生物具有式1结构：
其中，R为-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CHOHCH2OH、-OCH(CH3)2、-O(CH2)3CH3、-OCH2(CHOH)2CH2OH、-NH2或
2.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述青霉素酰化酶以固定化细胞形式和固定化酶形式加入。
3.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：6-APA与苯氧乙酸衍生物的摩尔比为1：1.1～1.5；6-APA与青霉素酰化酶的重量比为1：2～4。
4.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述酸化过程为：采用酸液调节水溶液pH值至2.5～3.5，养晶10～30分钟。
5.根据权利要求1所述的一种酶法合成青霉素V盐的方法，其特征在于：所述盐化过程为：将青霉素V晶体采用碳酸盐溶液调节pH 5.5～7.5，再添加带水剂，减压蒸发浓缩至晶体析出。
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