CN110923148B - 青霉素v钾高产菌及其在发酵生产青霉素v钾中的应用 - Google Patents

青霉素v钾高产菌及其在发酵生产青霉素v钾中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种青霉素V钾高产菌及其在发酵生产青霉素V钾中的应用，所述青霉素V钾高产菌为产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）B181126菌株，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为CCTCC NO：M2019823，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。产黄青霉菌B181126用于生产时，配合最优发酵工艺，其发酵单位可以达到8万U/mL以上，与出发菌株相比提高了36.4%，大幅度提高青霉素V钾的发酵单位，同时4‑羟青霉素V钾杂质含量小于1.2%。

Description

青霉素V钾高产菌及其在发酵生产青霉素V钾中的应用
技术领域
本发明涉及青霉素V钾发酵技术领域，具体地说涉及一种青霉素V钾高产菌及其在发酵生产青霉素V钾中的应用。
背景技术
青霉素V钾属于β-内酰胺类抗生素，是一种重要的原料药，青霉素V钾在低pH值下不易分解，所以可以加工成口服制剂，通过口服给药。青霉素V钾也可裂解制备6-APA和7-ADCA两种半合成抗生素的中间体，用来合成一系列的半合成青霉素类和半合成头孢菌素类抗生素。
青霉素V钾是由产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）在发酵过程中通过次级代谢而合成的。青霉素V钾的发酵单位一直较低，造成青霉素V钾的生产成本高；青霉素V钾在发酵过程中伴随产生4-羟青霉素V钾杂质，而且4-羟青霉素V钾杂质在青霉素V钾提炼过程中很难去除。所以提高青霉素V钾的发酵单位，降低青霉素V钾的生产成本，并且在发酵过程中降低4-羟青霉素V钾杂质的含量，提高青霉素V钾产品质量，这两项任务是目前生产面临的非常必要和迫切的任务。
发明内容
本发明的目的之一就是提供一种青霉素V钾高产菌株，以提供一种遗传稳定且能够高产青霉素V钾，并且发酵过程中产生的4-羟青霉素V钾杂质少的新菌株。
本发明的目的之二就是提供一种上述青霉素V钾高产菌株在发酵生产青霉素V钾中的应用，其发酵工艺条件有利于提高青霉素V钾的发酵单位，并且有效控制4-羟青霉素V钾在发酵过程中的产生量。
本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：一种青霉素V钾高产菌株，其为产黄青霉菌（PenicilliumChrysogenum）B181126菌株，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为CCTCC NO：M2019823，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
本发明所提供的B181126菌株的微生物学特征如下：
单菌落的形态为：菌落呈白色、圆形、中间凸起、菌落布满规则褶皱；孢子呈白色或灰白色，显微镜下孢子呈圆形。
本发明所述的产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）B181126菌株是利用紫外加亚硝基胍复合诱变，并通过摇瓶筛选得到的高产菌株，其具体步骤如下：
（a）产黄青霉菌孢子悬液制备：出发菌株为华北制药股份有限公司倍达分厂自有生产菌株，无菌称取2 g小米孢子，放入灭菌的250mL三角瓶中（含10个玻璃珠），再向该三角瓶中加入30mL蒸馏水，然后将该三角瓶放在摇床上200r/min振荡5min，将洗下来的孢子液转移到一个无菌的试管中备用，孢子液浓度为107个/mL。
（b）紫外线加亚硝基胍复合诱变：先将孢子液在15W紫外灯下距离25cm照射30S，然后向孢子液中加入终浓度为1.0g/L的亚硝基胍，30℃水浴处理10min。用PB缓冲液洗涤3次去除亚硝基胍残留。
（c）平皿筛选：将诱变后的孢子悬液和对照分别稀释10-3-10-5倍后涂布在含有5-10mg/mL苯氧乙酸的分离培养基平皿上，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养9-12天，挑选的目标菌落为，诱变后菌落直径大于对照菌落直径15%以上的菌落。
（d）高产菌株筛选：挑取符合标准的单菌落接种到斜面培养基上，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养5-8天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到30-40mL种子培养基摇瓶中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%、220rpm的条件下培养38-45h，菌种成熟后将其接种到30-40mL发酵培养基摇瓶中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%、220rpm的条件下培养6-8天，得到发酵液，利用HPLC法测定各发酵液中青霉素V钾的效价和4-羟青霉素V钾杂质的含量，效价高于对照20%，并且4-羟青霉素V钾杂质含量小于1.5%的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复试，复试过程同初筛，复试和初筛发酵液中青霉素V钾效价最高，并且4-羟青霉素V钾杂质含量比较低的发酵液对应的菌株即为产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）B181126。
本发明所述步骤（c）中所用分离培养基，按质量体积比计算，其成分为：0.5-2.5%红糖，0.1-0.6%酵母粉，0.5-1.5%甘油，0.5-2.0% 氯化钠，0.01-0.08%硫酸钙，0.0005-0.002%磷酸二氢钾，0.0004-0.002%硫酸镁，0.0001-0.001%硫酸铜，0.0001-0.001%硫酸亚铁，1.5-2.0%琼脂，用蒸馏水配制，加入苯氧乙酸至5-10mg/mL，将分离培养基的pH调节至6.8±0.2。
本发明所述步骤（d）中所用斜面培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-3.0%红糖，0.5-1.0%酵母粉，0.1-1.0%甘油，0.5-2.0% 氯化钠，0.01-0.08%硫酸钙，0.001-0.01%磷酸二氢钾，1.5-2.0%琼脂，用蒸馏水配制，将斜面培养基的pH调节至 6.8±0.2。
本发明所述步骤（d）中所用种子培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-3.5%蔗糖，3.0-8.0%玉米浆，0.1-0.6%硫酸铵，0.2-1.0%碳酸钙，用蒸馏水配制，将种子培养基的pH调节至 5.8±0.2。
本发明所述步骤（d）中所用发酵培养基，按质量体积比计算，其成分为：11-15%乳糖，0.1-0.6%玉米蛋白粉，3.0-8.0%玉米浆，0.1-0.8%硫酸铵，0.1-0.4%磷酸二氢钾，0.05-0.2%硫酸钠，0.001-0.003%硫酸锰，0.005-0.02%硫酸亚铁，0.2-1.0%碳酸钙，用蒸馏水配制，将发酵培养基的pH调节至5.8±0.2，每天补入10%苯氧乙酸0.3mL。
本发明的目的之二是通过以下技术方案实现的：上述的青霉素V钾高产菌株在发酵生产青霉素V钾中的应用。
青霉素V钾的发酵过程包括以下步骤：
a、将所述B181126菌株接种到小米孢子培养基中，然后在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养6-10天，米孢子成熟后于4℃保藏；
b、将小米孢子接种到种子罐培养基中，并在25±0.5℃、120-150rpm、通气比1:1.0-1:1.5的条件下培养60-80h，待菌体离心量达到30%后，发酵用种子即为长好；
c、将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在25±0.5℃、100-130rpm、通气比1:1.2-1:1.6的条件下培养6-8天，即可制得青霉素V钾发酵液；在整个发酵过程中，为了能够有效控制4-羟青霉素V钾的产生，向发酵罐中补入无菌的酚型抗氧化剂，所述酚型抗氧化剂为二丁基羟基甲苯 (BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)中的至少一种，所述酚型抗氧化剂的含量控制在0.01-0.5mg/mL。其中，最优选是二丁基羟基甲苯 (BHT)，二丁基羟基甲苯含量控制在0.01-0.5mg/mL。
步骤a中，所用小米孢子培养基的制备过程为：
a-1、按质量体积比计算，称取0.1-0.5%蔗糖、1.5-2.5%玉米浆、0.05-0.15%氯化钠、0.0001-0.001%硫酸镁、0.0002-0.005%硫酸亚铁，用蒸馏水配制完成后，将所配制的培养基的pH调节至 6.8±0.2；
a-2、将步骤a-1配制的培养基每100mL加入220-280g干燥的小米，搅匀后在消毒柜中100±2℃条件下蒸20min，将蒸好的米放在风扇口吹凉、搓散，然后分装入茄子瓶中，将茄子瓶放入消毒柜于121 ℃条件下处理30min，即得所述小米孢子培养基。
步骤b中，所用种子罐培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-3.5%蔗糖，3.0-8.0%玉米浆，0.1-0.6%硫酸铵，0.2-1.0%碳酸钙，用深井水配制，将种子培养基的pH调节至6.0±0.2。
步骤c中，发酵过程中补入无菌的葡萄糖，残糖含量控制在0.01-0.05mg/mL；补入无菌的硫酸铵氨，氨氮含量控制在0.1-0.3mg/mL；补入无菌的苯氧乙酸钠，苯氧乙酸钠含量控制在3-7mg/mL，补入无菌的氨水，将发酵罐的pH值控制在6.2-6.7。
步骤c中，所用发酵培养基，按质量体积比计算，其成分为：11-15%乳糖，0.1-0.6%玉米蛋白粉，3.0-8.0%玉米浆，0.1-0.8%硫酸铵，0.1-0.4%磷酸二氢钾，0.05-0.2%硫酸钠，0.001-0.003%硫酸锰，0.005-0.02%硫酸亚铁，0.2-1.0%碳酸钙，用蒸馏水配制，将发酵培养基的pH调节至5.8±0.2。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明采用紫外加亚硝基胍复合诱变的方法，筛选到产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）B181126，该菌株具有摇瓶效价高，产生的4-羟青霉素V钾杂质少，传代稳定性良好等特点，并且可以用于青霉素V钾生产。
该菌株用于生产时，通过对整个发酵过程中的工艺控制进行最优化，尤为重要的是向发酵罐中补入二丁基羟基甲苯 (BHT)，在发酵过程中加入二丁基羟基甲苯 (BHT)能够有效控制4-羟青霉素V钾的产生。
产黄青霉菌B181126用于生产时，配合最优发酵工艺，其发酵单位可以达到8万 U/mL以上，与出发菌株相比提高了36.4%，大幅度提高青霉素V钾的发酵单位，同时4-羟青霉素V钾杂质含量小于1.2%。该菌株在实际生产上的成功运用可以有效的提高青霉素V钾的产量，明显降低发酵用的原材料、水、电和蒸汽等成本，减少单位产量的污染排放，具有较高的经济效益。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但其并不可以任何形式限制本发明。
实施例1 青霉素V钾高产菌株的筛选
（a）产黄青霉菌孢子悬液制备：出发菌株为华北制药股份有限公司倍达分厂自有生产菌株，无菌称取2g小米孢子，放入灭菌的250mL三角瓶中（含10个玻璃珠），再向该三角瓶中加入30mL无菌蒸馏水，然后将该三角瓶放在摇床上200r/min振荡5min，将洗下来的孢子液转移到一个无菌的试管中备用，孢子液浓度为107个/mL。
（b）紫外线加亚硝基胍复合诱变：将10mL孢子液转移到无菌玻璃平皿中，将平皿中的孢子液在15W紫外灯下距离25cm照射30S，然后将孢子液转移到无菌100mL三角瓶中并加入终浓度为1.0g/L的亚硝基胍，30℃水浴处理10min。将复合诱变后的孢子液取10mL 移入无菌离心管3000rpm 离心10min，弃上清后加入10mL PB缓冲液（0.01 mol/L磷酸缓冲液，pH6.5），用玻璃棒搅均后3000rpm 离心10min，重复上述洗涤过程 3次以去除亚硝基胍残留。
（c）平皿筛选：将诱变后的孢子悬液和对照分别稀释10-3-10-5倍后涂布在含有5-10mg/mL苯氧乙酸的分离培养基平皿上，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养11天，挑选的目标菌落为，诱变后菌落直径大于对照菌落直径15%以上的菌落。
分离培养基制备：称取200g红糖，50g酵母粉，100g甘油，150g 氯化钠，5g硫酸钙，0.1g磷酸二氢钾，0.08g硫酸镁，0.05g硫酸铜， 0.1g硫酸亚铁，180g琼脂，加入苯乙酸至8mg/mL，用蒸馏水定容至10000mL，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至 6.8±0.2，121℃下灭菌30min，灭菌完成后倒入无菌平皿中，自然冷却凝固后得分离培养基。
（d）高产菌株筛选：
斜面培养基制备：称取称取40g红糖，12g酵母粉，10g甘油，30g 氯化钠，0.5g硫酸钙， 0.03g磷酸二氢钾，36g琼脂，蒸馏水定容至2000mL，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至 6.8±0.2，121℃下灭菌30min，灭菌完成后分装置若干试管中，铺成斜面，凝固后得到斜面培养基；
种子培养基制备：称取30g蔗糖，70g玉米浆，3g硫酸铵，5g碳酸钙，蒸馏水定容至1000mL，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至 5.8±0.2，每个250mL三角瓶分装30mL种子培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌30min，冷却后得种子培养基；
发酵培养基制备：称取420g乳糖，15g玉米蛋白粉，200g玉米浆，15g硫酸铵，12g磷酸二氢钾，4g硫酸钠，0.008g硫酸锰，0.4g硫酸亚铁，15g碳酸钙，蒸馏水定容至3000mL，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至 5.8±0.2，每个250mL三角瓶分装30mL发酵培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌30min，冷却后得发酵培养基；
高产菌株筛选：挑取符合标准的单菌落接种到斜面培养基上，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养8天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到40mL种子培养基摇瓶中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%、220rpm的条件下培养45h，菌种成熟后将其接种到30mL发酵培养基摇瓶中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%、220rpm的条件下培养7天，得到发酵液，利用HPLC法测定各发酵液中青霉素V钾的效价和4-羟青霉素V钾杂质的含量，效价高于对照20%，并且4-羟青霉素V钾杂质含量小于1.5%的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复试，复试过程同初筛，复试和初筛发酵液中最高青霉素V钾效价为23450μ/mL和23765μ/mL，对应的4-羟青霉素V钾杂质含量为1.33%和1.31%，将其对应的菌株命名为产黄青霉菌B181126。
将B181126菌株进行超低温冷冻保藏：向保存有B181126菌株的斜面中加入8mL含有20%甘油的无菌水溶液，用接种环将孢子刮下，混匀后用吸管分装至冷冻管中（1mL/支），注明菌株名称，制备时间和有效期，冷冻至超低温冰箱中，其保藏单位是中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2019823，保藏日期为2019年10月14日。
实施例2 青霉素V钾高产菌株的遗传稳定性考察
取实施例1中保藏的产黄青霉菌B181126接种于实施例1制备的斜面培养基，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养8天，斜面菌种成熟后将其再次接种于斜面培养基中进行培养，重复四次；将这五次培养出的菌株分别各自转接至实施例1制备的种子培养基中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%、220rpm的条件下培养45h，菌种成熟后各自转至接实施例1制备的发酵培养基中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%、220rpm的条件下培养7天，制得五组含有青霉素V钾的发酵液，HPLC测定发酵液中青霉素V钾的效价，按照传代培养顺序依次为：23226μ/mL、23450μ/mL、23158μ/mL、23250μ/mL、23365μ/mL；从实验结果可以看出，产黄青霉菌B181126具有较好的传代稳定性。
实施例3 青霉素V钾高产菌株优发酵工艺控制
米孢子培养基制备：称取4g蔗糖，20g玉米浆，1g氯化钠，0.005g硫酸镁，0.01g硫酸亚铁，用蒸馏水定容至1000mL，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至 6.8±0.2，倒入装有2600克干燥小米的锅中，搅匀后在消毒柜中100±2℃蒸20min，将蒸好的米放在风扇口吹凉、搓散，将小米分装入茄子瓶中（20g/瓶），将茄子瓶放入消毒柜中，121 ℃下灭菌30min，冷却后得米孢子培养基。
种子罐培养基制备：称取300kg蔗糖，750kg玉米浆，300kg硫酸铵，150kg碳酸钙，用深井水定容至13m3，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至6.0±0.2，对种子罐进行实消，121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得15m3种子培养基。
发酵罐培养基制备：称取100kg玉米蛋白粉，2000kg玉米浆，160kg硫酸铵，120kg磷酸二氢钾，80kg硫酸钠，0.8kg硫酸锰，3kg硫酸亚铁，200kg碳酸钙，用深井水定容至35m3，然后用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH至6.0±0.2，对发酵罐进行实消，121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得40m3发酵培养基。
高产菌株优发酵工艺控制：将高产菌株B181126菌液接种到小米孢子培养基中，在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养8天，米孢子成熟后接种到15m3种子罐培养基中，在25±0.5℃、140rpm、通气比1:1.2的条件下培养70h，待菌体离心量达到30%后将其接种到40m3发酵罐培养基中，在25±0.5℃、120rpm、通气比1:1.4的条件下培养7天。
发酵罐在整个发酵过程中需要补入无菌的含量为65%葡萄糖、无菌的含量为30%硫酸铵、无菌的含量为20%氨水和无菌的含量为15%苯氧乙酸；所控制的工艺参数为：残糖含量0.03mg/mL、氨氮含量0.2mg/mL、苯氧乙酸含量5mg/mL、pH值6.4。在整个发酵过程中，为了能够有效控制4-羟青霉素V钾的产生，向发酵罐中补入二丁基羟基甲苯 (BHT)，二丁基羟基甲苯在发酵罐中控制的含量在0.01-0.5mg/mL。
发酵结束后制得青霉素V钾发酵液。将该生产过程重复三次，HPLC测定青霉素V钾发酵液中青霉素V钾的效价，分别为82320μ/mL、84760μ/mL和83870μ/mL，平均值为83650μ/mL；对应的青霉素V钾发酵液中4-羟青霉素V钾杂质含量分别为1.48%、1.39%和1.51%，平均值为1.46%。
实施例4 出发菌株对比实验
以产黄青霉菌B181126的出发菌株B140832号孢子液（华北制药股份有限公司倍达分厂自有生产菌株）为发酵菌株，采用实施例3的生产条件进行三次平行实验，在发酵过程中，不向发酵罐中补入二丁基羟基甲苯 (BHT)。发酵结束后检测发酵液中青霉素V钾的效价，分别为61615μ/mL、59870μ/mL、62490μ/mL，平均值为61325μ/mL；对应的青霉素V钾发酵液中4-羟青霉素V钾杂质含量分别为3.32%、3.45%和3.16%，平均值为3.31%。
比较出发菌株发酵液的平均效价与实施例3的发酵液效价可知，与出发株相比本发明所述的产黄青霉菌B181126菌株的青霉素V钾发酵单位提高了36.4%；青霉素V钾发酵液中4-羟青霉素V钾杂质含量降低了55.9%。产黄青霉菌B181126高产菌株，配合最优发酵控制工艺，大幅提高了青霉素V钾的发酵单位，并且有效的控制4-羟青霉素V钾在发酵过程中产生。该菌株在大生产上的成功运用可以有效的提高青霉素V钾的产量和质量，明显降低发酵用的原材料、水、电和蒸汽等成本，减少单位产量的污染排放，具有较高的经济效益。

Claims (7)

1.一种青霉素V钾高产菌株，其特征是，所述青霉素V钾高产菌为产黄青霉菌（Penicillium Chrysogenum）B181126菌株，保藏日期为2019年10月14日，保藏编号为CCTCCNO：M2019823，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
2.权利要求1所述的青霉素V钾高产菌株在发酵生产青霉素V钾中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，青霉素V钾的发酵过程包括以下步骤：
a、将所述B181126菌株接种到小米孢子培养基中，然后在25±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下避光培养6-10天，米孢子成熟后于4℃保藏；
b、将小米孢子接种到种子罐培养基中，并在25±0.5℃、120-150rpm、通气比1:1.0-1:1.5的条件下培养60-80h，待菌体离心量达到30%后，发酵用种子即为长好；
c、将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在25±0.5℃、100-130rpm、通气比1:1.2-1:1.6的条件下培养6-8天，即可制得青霉素V钾发酵液；在整个发酵过程中，向发酵罐中补入无菌的酚型抗氧化剂，所述酚型抗氧化剂为二丁基羟基甲苯，所述酚型抗氧化剂含量控制在0.01-0.5mg/mL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，步骤a中，所用小米孢子培养基的制备过程为：
a-1、按质量体积比计算，称取0.1-0.5%蔗糖、1.5-2.5%玉米浆、0.05-0.15%氯化钠、0.0001-0.001%硫酸镁、0.0002-0.005%硫酸亚铁，用蒸馏水配制完成后，将所配制的培养基的pH调节至 6.8±0.2；
a-2、将步骤a-1配制的培养基每100mL加入220-280g干燥的小米，搅匀后在消毒柜中100±2℃条件下蒸20min，将蒸好的米放在风扇口吹凉、搓散，然后分装入茄子瓶中，将茄子瓶放入消毒柜于121 ℃条件下处理30min，即得所述小米孢子培养基。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征是，步骤b中，所用种子罐培养基，按质量体积比计算，其成分为：1.0-3.5%蔗糖，3.0-8.0%玉米浆，0.1-0.6%硫酸铵，0.2-1.0%碳酸钙，用深井水配制，将种子培养基的pH调节至 6.0±0.2。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征是，步骤c中，所用发酵培养基，按质量体积比计算，其成分为：11-15%乳糖，0.1-0.6%玉米蛋白粉，3.0-8.0%玉米浆，0.1-0.8%硫酸铵，0.1-0.4%磷酸二氢钾，0.05-0.2%硫酸钠，0.001-0.003%硫酸锰，0.005-0.02%硫酸亚铁，0.2-1.0%碳酸钙，用蒸馏水配制，将发酵培养基的pH调节至5.8±0.2。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征是，步骤c中，发酵过程中，残糖含量控制在0.01-0.05mg/mL；氨氮含量控制在0.1-0.3mg/mL；苯氧乙酸钠含量控制在3-7mg/mL；发酵罐的pH值控制在6.2-6.7。
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