CN104502612A - 一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法 - Google Patents
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Abstract
一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，属于生物检测技术领域，方法是：利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列,将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达，纯化了对βG具有特异结合性的蛋白质。有益效果是：具有成本低、快速、灵敏度高等特点。将来可广泛应用在食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域。本发明利用比浊法对β-葡聚糖进行测定，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域。
背景技术
β-葡聚糖其来源于新鲜的食品啤酒酵母、燕麦、食用菌类等。根据糖键结构差异可分β-（1→3）-葡聚糖和β-（1→6）-葡聚糖，β-葡聚糖的活性结构是有葡萄糖单位组成的多聚糖，她能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，从而提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统。此外，β-葡聚糖还有清楚游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等感染等作用，固广泛用于医药、食品、化妆品等行业。β-葡聚糖还具有治疗肿瘤、肝炎、心血管、糖尿病和降血脂、抗衰老等方面有独特的生物活性。因此检测β-葡聚糖在食品领域和化妆品领域都有很广阔的空间。
真菌的细胞壁主要成分为(1,3)-β-D葡聚糖（βG）。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，βG可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中β-葡聚糖含量增高。对βG进行测定，实现真菌感染早期诊断及早期治疗，是改善患者愈后，提高患者生存质量的关键。
国内外用于检测β-葡聚糖的方法如下：
1.粘度法:原理是大麦抽提液粘度主要由β-葡聚糖产生,但β-葡聚糖粘度同时与含量和分子量有关,分子量越大,粘度越大,因此该法测定结果误差很大。
2.沉淀法:原理是利用特定盐或有机溶剂沉淀抽提液中价葡聚糖;该方法局限性在于抽提不能完全排除其它物质干扰。
3.酶法:此方法采用特定β-葡聚糖内切酶得到寡糖,经酸解后采用葡萄糖氧化酶/过氧化酶试剂测定葡萄糖含量,双酶法有较高的专一性和准确性,是目前国际上较通用的测定方法,缺点是测定时间长, 试剂盒单价高, 试剂保存时间短。
4.刚果红:用于测定啤酒中βG含量,能和多种聚合糖发生作用，形成颜色浓郁的多聚糖-刚果红络合物。但测定的结果过低, 可能是供试品中βG分子被其他分子包裹未能充分溶解, 使显色不足, 故不适于测定固态供试品中βG含量。
5.荧光法:主要是利用荧光物质可与β-葡聚糖特异性结合，而与其它多糖和纤维素、戊聚糖亲和力很弱这一特性进行测定，此法在一些啤酒企业中使用。
6.苯酚-硫酸法：测定结果与供试品的已知含量有相当大的差别, 可能因为多糖和寡糖被浓硫酸水解成单糖, 并通过苯酚显色, 对βG无专一性。
7.鲎试剂法:测定微量β-葡聚糖的方法就是利用鲎试剂（鲎的血细胞提取物），原理：G因子是丝氨酸蛋白酶前体，通过结合βG而被活化，从而启动G因子系统的蛋白酶级联。并且被活化的G因子使凝固酶前体被活化，最终生成凝胶。将含鲎血细胞提取物的试剂与含βG的血液样品混合，测定该混合液在光照射开始之后达到规定值所需的时间，将所得的该时间代入使用浓度已知的βG溶液预先制成的表示凝胶化时间与βG浓度的关系的标准曲线中，求出样品中的βG浓度，对患者做出真菌感染的检测。虽然这种检测方法灵敏度很高，但是鲎血源于天然材料，必将会担心资源的枯竭，鲎现已经列入某些地区的二级保护动物，因此鲎试剂的成本比较高，还需要对样品进行前处理，测定时间长。
因此，现今国内外对βG浓度的测定方法都不是很理想，有些方法存在稳定性差、特异性差、价格昂贵、灵敏性差、检测时间长等缺点，本专利发明了对βG的新型测定方法，为将来的食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域提供技术基础，满足现代生物检测各领域日益增长的需求。
发明内容
本发明的目的是：提供一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，它能够低成本高敏度特异性地测定βG。
本发明的方法是：利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列,将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达，纯化了对βG具有特异结合性的蛋白质。
表达蛋白可以与β-葡聚糖特异性结合，形成一定结构的复合物，在促聚剂聚乙二醇作用下，成为悬浮于反应溶剂中的微粒，使样品浊度发生变化；当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于复合物的吸收其吸光值增大，故在一定范围内吸收度与复合物量呈正相关；当蛋白质浓度固定时，样品的浊度与其中所含βG量成正比，绘制标准曲线，从而达到未知βG的测定。
采用粒径为180nm的大颗粒聚乙二醇微乳颗粒，具有较大的粒径，增加血液中βG和蛋白反应时的浊度，从而增加测试反应的灵敏度、缩短了反应时间，可以在570nm的波长下进行检测；用固定的蛋白质浓度测定不同βG量，测出吸光值，绘制曲线，得到一定范围内的标准曲线，可以求出未知βG的量。
序列表
序列1 1251bp DNA 美洲鲎属
aat aca cct tct cct gtt gac gtt act cat tta tct ggt tac tat ttt 48
Asn Thr Pro Ser Pro Val Asp Val Thr His Leu Ser Gly Tyr Tyr Phe
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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Asn Gln Gln Phe Asp Phe Val His Leu Gly Asn Lys Val Tyr Lys Ile
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
gca cgc agc act gga aag tta gtg gaa gta gca gat ttg aat aaa gac 384
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115 120 125
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Pro Gly Gly Lys Ile Gln Gln Trp Ser Asp Asp Gly Gln Leu Ser Gly
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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Ala Tyr Lys Asp Ile Asn Phe Pro Ser Ser Gly Thr Tyr Gln Val Glu
195 200 205
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210 215 220
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Asn Ala Gly Ser Ile Val Leu Gly Met Leu Asn Val Pro Ser Thr Gly
225 230 235 240
gga ttg cag aag tgg acc acc att tcc cac aca gtg aat gta agt tca 768
Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Ser Ser
245 250 255
ggt acg tac aac ttg ggg atc agt gtt caa cga ccc ggg tgg aat atc 816
Gly Thr Tyr Asn Leu Gly Ile Ser Val Gln Arg Pro Gly Trp Asn Ile
260 265 270
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Asn Trp Ile Asn Ile Thr Lys Val Ser Ser Gln Leu Lys Ser Ile Pro
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp Asn Ile Asn Trp Ile Lys Ile Thr Lys
405 410 415
gtt 1251
Val
本发明的有益效果是：具有成本低、快速、灵敏度高等特点。将来可广泛应用在食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域。本专利利用比浊法对β-葡聚糖进行测定，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。
成本低：本专利利用自己表达的蛋白，弥补了酶法试剂盒单价高, 试剂保存时间短的特点，无需利用天然材料鲎试剂，现已列入二级保护动物，而担心资源枯竭，成本高的不足。
快速：实验简便，结果回报时间短只需10分钟，便于及时反馈信息，可节约大量人力物力，有利于大批量样品的处理。可以利用测光仪进行快速检测，待测物用量少，具有明显的应用优势。改进了其它方法在测定时复杂过程，反应比较慢的缺点。
高灵敏：稳定性好，此免疫比浊法可以检测βG的下限为6μg/ml,精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、准确。可以代替误差较大的粘度法，抗干扰性不强的沉淀法，使用有局限的刚果红法，检测不灵敏的荧光法。
附图说明
图1是目的片段PCR体系表；
图2是回收片段和pUCm-T载体连接反应体系；
图3是pUCm-T-FVO和PET-15b载体的双酶切反应体系表；
图4是目的基因片段和PET-15b线性载体连接反应体系；
图5是目的蛋白通过Ni柱逐步纯化图；
图6是比浊法在一定范围内测βG的标准曲线。
具体的实施方式
1.目的基因的PCR扩增
在GENBANK中找到目的片段美洲鲎属G因子α亚基的片段a（FVO）（GenBank: AB547712.1），如序列1所示，由上海生物工程公司人工合成其基因，大小是1251bp，合成为JM109-pMD19-T Simple-FVO的工程菌，以重组质粒为模板，采用PCR技术克隆此FVO片段。
引物序列
引物F 5，-CATATGAATACACCTTCTCCTGTTGACG-3，
引物R 5，-GGATCCTGTAACCTTTGT-3，
PCR的反应条件：在98℃加热2分钟之后，将95℃15s、50℃30s、68℃2min重复30次，最后68℃5min。反应体系如图3所示。
2.重组质粒的连接与鉴定
将所得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切下1.2Kbp附近的凝胶，用DNA胶回收试剂盒（Sangon）进行目的基因片段的回收。从切下的凝胶中纯化PCR产物。回收片段和pUCm-T载体连接，建重组质粒pUCm-T-FVO，如图4所示在22℃连接16h。
大肠杆菌DH5a感受态的制备
1)将-80℃冻存的大肠杆菌DH5a在不含抗生素的LB琼脂固体培养基划线，37℃培养16小时。
2)从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于10ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
3)取100μl菌液转接到一个含有10ml LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养3小时左右，培养至OD600=0.4-0.6。
4)用灭菌的枪头取1ml的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置10分钟后，4℃，4000rpm离心10分钟，去上清，加入0.2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液。在旋涡震荡器上震荡1分钟，使细胞充分混悬。冰浴30分钟后， 4℃，4000rpm离心10分钟，去上清，加入0.1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液。
5)将1.5ml离心管放在冰上，每管含0.1ml感受态细胞，细胞可以立即使用。
6)将余下部分感受态细胞迅速转移到-80℃低温冰箱中，备用。
pUCm-T-FVO转化到大肠杆菌DH5a
1)取新鲜制备的100μl感受态细胞，将细胞均匀悬浮后置于冰上。
2)加入10μl pUCm-T-FVO的质粒，冰上放置30分钟。
3) 42℃水浴热激90秒，迅速放置冰上2分钟。
4)加600μl 37℃预热的LB培养液，37℃，80rpm振荡培养15分钟；在120rpm振荡培养15分钟；在150rpm振荡培养30分钟。
5)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
6) 将悬浮菌液涂布预先涂布在含有40μl 2% X-gal和4μl 20% IPTG及100μg/ mL Amp的LB琼脂平板上。
7) 平皿在37℃下正向放置至菌液吸收进琼脂后，将平皿倒置，过夜培养14-16h，进行蓝白班筛选。单克隆子的鉴定，选择泳动明显较慢的单克隆子，送完上海生工有限公司进行序列测定。将测序结果为阳性的单克隆子含有的重组质粒命名为pUCm-T-FVO。
3.重组表达质粒的连接和鉴定
对实验室保存的PET-15b质粒和构建好的重组质粒pUCm-T-FVO进行双酶切，如图5所示放置37℃，时间3h。
构建FVO基因与PET-15b质粒上的lacZ promoter顺向连接的重组质粒PET-15b-FVO。保温3h后，取5μl双酶切反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，看基因片段是否酶切完全，目的基因条带是否清楚，用DNA胶回收试剂盒（Sangon）进行目的基因片段的回收。
将纯化的pUCm-T-FVO基因片段立即与PET-15b线性载体进行连接，反应体系如图6所示，在22℃连接16h。
大肠杆菌DH5a感受态的制备和pET-15b-FVO转化到大肠杆菌DH5a如方法（2）仅是6)将200μl细菌涂布在100μg/ mL Amp的LB琼脂平板上。
7)平皿在37℃下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，过夜培养16小时。
方法同上配置Bl21感受态，将构建的表达质粒pET-15b-FVO导入。
4.重组蛋白的表达和分离纯化
将BL21-pET-15b-FVO菌按体积比1：50到LB（Amp100μg/ ml）液体培养液中活化37℃，180 rpm过夜，次日转接培养的菌液按体积比1：20到LB（Amp100μg/ ml）液体培养液中扩大，37℃，180 rpm 培养至OD600约为0.8（约在4小时），加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养48小时，培养后，将培养液进行离心分离，回收所得的沉淀物（菌体）。将沉淀物用PBS洗涤，然后放一定量的溶菌酶，反复冻融，进行超声破碎，工作参数：工作10s，间歇9s，功率200W，循环30次。10000rpm，4℃离心10min。过柱纯化前将样品溶液分别用0.22μm孔径滤膜过滤。过Ni柱，依据附带的说明书记载的方法进行利用Ni-琼脂糖的亲和纯化，从上述所得的上清组分中纯化目的蛋白，经过透析去除多余的咪唑，浓缩，收集每步样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果示于图1，目的蛋白的分子量约为40kDa。
5. 将蛋白与聚乙二醇偶联
将纯化好的目的蛋白与羧基微球偶联
1）取一定量180nm的微球，用0.02M的MES溶液调整到15mg/ml，混匀；
2）逐滴加入10mg/mlEDC溶液，边加入边混匀，终浓度0.1mg/ml，37℃旋转混匀（或室温混匀）,反应25分钟后，取下离心20分钟；
3）沉淀悬浮在0.05M PBS溶液中，超声确保微球均匀分散；
4）逐滴加入抗体边加入边混匀，通常抗体的包被比为10mg微球：1-1.5mg抗体；
5）37℃反应3小时后加入浓度为100mg/mlBSA溶液，终浓度3mg/ml；
6）1小时候后加入1M甘氨酸溶液，终浓度0.05M,室温反应过夜即可。
6. 免疫比浊法
做四组一样的样品进行测定，βG标准品200μg/ml，将βG按体积梯度稀释，向96孔板内加入(50μl),再加入100μg/ml(100μl)的特异性蛋白质，混匀，反应5分钟，以蒸馏水代替βG的样品进行测定，作为空白值，在570nm的波长下进行测定，每组数据的吸光值是实际吸光度值减去空白值，以βG浓度为x轴，以这4组数据的平均吸光值为y轴，绘制曲线，得到较好的线性关系，如图2所示，此免疫比浊法可以检测βG的下限为6μg/ml。
序列表
长春理工大学
一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法
48
PatentIn Version 3.3 1
1251
DNA
美洲鲎属(Limulus sp.)
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385 390 395
tac gtt caa caa ccc ggg tgg aat atc aac tgg att aag att aca aag 1248
Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp Asn Ile Asn Trp Ile Lys Ile Thr Lys
405 410 415
gtt 1251
Val
Claims (3)
1.一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，其方法是：利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列,将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达并纯化，该蛋白与β-葡聚糖具有特异结合性，建立一种检测β-葡聚糖的比浊法。
2.如权利要求1所述的一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，其方法是：表达蛋白与β-葡聚糖特异性结合，形成一定结构的复合物，在促聚剂聚乙二醇作用下，成为悬浮于反应溶剂中的微粒，使样品浊度发生变化；当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于复合物的吸光度增大，故在一定范围内吸光度与复合物量呈正相关；当蛋白质浓度固定时，样品的浊度与其中所含β-葡聚糖量成正比，绘制标准曲线，从而达到未知β-葡聚糖的测定。
3.如权利要求2所述的一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，其方法是：采用粒径为180nm的大颗粒聚乙二醇微乳颗粒，增加β-葡聚糖和此特异蛋白反应时的浊度，从而增加测试反应的灵敏度、缩短了反应时间，在570nm的波长下进行检测；用固定的特异蛋白质浓度测定不同β-葡聚糖量，测出吸光值，绘制曲线，得到一定范围内的标准曲线，可以求出未知β-葡聚糖的量。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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