CN101892209A

CN101892209A - 具有多糖结合能力的多肽

Info

Publication number: CN101892209A
Application number: CN2010102065271A
Authority: CN
Inventors: 冯家勋; 段承杰; 刘君梁; 吴茜; 唐纪良
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2010-06-12
Filing date: 2010-06-12
Publication date: 2010-11-24

Abstract

本发明公开了一种具有多糖结合能力的多肽。本发明提供的多肽(CBM_Umcel5B)，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多糖结合能力的由序列1衍生的多肽。本发明所提供的CBM_Umcel5B及其编码DNA序列可广泛应用于多糖的降解及提高酶的稳定性方面。

Description

具有多糖结合能力的多肽

技术领域

本发明涉及一种具有多糖结合能力的多肽。

背景技术

纤维素酶是水解纤维素链的β-1，4糖苷键的酶的总称，根据它们对纤维素水解方式的不同分为三类：内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC3.2.1.4)、外切-β-1，4-葡聚糖酶(exo-β-1，4-glucanase，又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)。这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖(Lynd L R，Weimer P J，van Zyl W H，and Pretorius I S.2002.Microbial cellulose utilization：fundamentals andbiotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：506-577.)。大部分纤维素酶由一个或几个催化功能域和一个或更多个其它的功能域如碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding modules，CBMs)组成，两者间由连接肽连接(Shoseyov O，Shani Z，and Levy I.2006.Carbohydrate binding modules：biochemical propertiesand novel applications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70：283-295.)。

第一个碳水化合物结合组件是1986年在瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维二糖水解酶Ⅰ中发现的，最初该结构域被命名为纤维素结合功能域(cellulose-binding domain，CBD)，以它能识别和吸附纤维素而命名的(VanTilbeurgh H，Tomme P，Claeyssens M，Bhikhabhai R.and Pettersson G.1986.Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I fromTrichoderma reesei.FEBSLett.204：223-227)。后来发现该结构域不仅能吸附纤维素，还能识别和吸附植物细胞壁其他的多糖成分，包括几丁质、β-1，3-葡聚糖、β-1，3-1，4-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等，还有些碳水化合结合组件可以结合不可溶的储存多糖，例如淀粉，所以现在将具有这样性质的结构域命名为碳水化合物结合组件。碳水化合物结合组件不仅在纤维素酶中被发现，在其他的酶类或蛋白中也有发现，如糖基水解酶、酯酶、果胶酶等。

碳水化合物结合组件一般位于酶的氨基端或羧基端，其大小通常大于30个氨基酸及小于250个氨基酸，所以其分子量一般大于4k道尔顿和小于40k道尔顿。根据氨基酸序列相似性，碳水化合物结合组件被划分成不同的家族(families)。根据Cazy服务器(server)(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列碳水化合物结合组件的最新清单，目前碳水化合物结合组件被分为59个家族。随着新的酶的发现，同时伴随着新的家族的碳水化合物结合组件的被发现。一系列未知功能的结构域已经被鉴定为新的碳水化合物结合组件(Bolam D N，Xie H，Pell G，Hogg D，Galbraith G，HenrissatB，and Gilbert H J.2004.X4 modules represent a new family ofcarbohydrate-binding modules that display novel properties.J.Biol.Chem.279：22953-22963；Dvortsov I.A，Lunina N A，Chekanovskaya L A，Schwarz W H，ZverlovV V，and Velikodvorskaya G A.2009.Carbohydrate-binding properties of aseparately folding protein module from beta-1，3-glucanase Lic16A ofClostridium thermocellum.Microbiology 155：2442-2449.)。

碳水化合物结合组件的主要功能是识别和吸附多糖，它通过增加底物表面酶的浓度提高酶对可溶或不可溶底物的活性(Beguin P，and Aubert J P.1994.Thebiological degradation of cellulose.FEMS Microbiol.Rev.13：25-58；ShoseyovO，Shani Z，and Levy I.2006.Carbohydrate binding modules：biochemicalproperties and novel applications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70：283-295)。另外CBM还有其他的一些功能，如有些CBM可以破坏底物的结构，使晶体结构变得松散，有利于酶更好的作用底物(Levy I，Shani Z，and Shoseyov O.2002.Modificationof polysaccharides and plant cell wall by endo-1，4-beta-glucanase andcellulose-binding domains.Biomol.Eng.19：17-30；Giardina T，Gunning A P，JugeN，Faulds C B，Furniss C S，Svensson B，Morris V J，and Williamson G.2001.Both binding sites of the starch-binding domain of Aspergillus nigerglucoamylase are essential for inducing a conformational change in amylose.J.Mol.Biol.313：1149-1159.)。有些碳水化合物结合组件可以增强酶对温度和pH的稳定性(Sunna A，Gibbs M D，and Bergquist P L.2000.A novel thermostablemultidomain 1，4-beta-xylanase from Caldibacillus cellulovorans and effect ofits xylan-binding domain on enzyme activity.Microbiology 146：2947-2955.)。近来还发现家族35和37的碳水化合物结合组件还能结合到细菌细胞的表面，介导携带该组件的酶结合到宿主的表面(Montanier C，van Bueren A L，Dumon C，Flint J E，Correia M A，Prates J A，Firbank S J，Lewis R J，Grondin G G，Ghinet M G，GlosterT M，Herve C，Knox J P，Talbot B G，Turkenburg J P，Kerovuo J，Brzezinski R，Fontes C M，Davies G J，Boraston A B，and Gilbert H J.2009.Evidence that family35 carbohydrate binding modules display conserved specificity but divergentfunction.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 106：3065-3070；Ezer A，Matalon E，JindouS，Borovok I，Atamna N，Yu Z，Morrison M，Bayer EA，and Lamed R.2008.Cellsurface enzyme attachment is mediated by family 37 carbohydrate-bindingmodules，unique to Ruminococcus albus.J.Bacteriol.190：8220-8222.)。

自然界大部分的微生物在实验室的条件下是不容易被分离和培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的约1％(Amann R I，Ludwig W，andSchleifer K H.1995.Phylogenetic identification and in situ detection ofindividual microbial cells without cultivation.Microbiol.Rev.59：143-169；Cardenas E，and Tiedje JM.2008.New tools for discovering and characterizingmicrobial diversity.Curr.Opin.Biotech.19：544-549)，剩余的约99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物中提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离基因已是成熟技术(Lorenz P，and Eck J.2005.Metagenomics and industrial applications.Nat.Rev.Microbiol.3：510-516.)。宏基因组学方法已经被广泛地应用到从各种环境样品的未培养微生物中挖掘新的具有生物催化活性的酶的基因，现在已经从未培养微生物中鉴定了很多新酶的基因，包括编码一些新家族的水解酶类的基因，说明宏基因组学方法是得到新基因的好方法。

反刍动物的瘤胃是自然界中纤维素降解最剧烈的主要场所之一，植物的纤维素类物质是被瘤胃中共生的纤维素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、细菌、原生动物和古细菌。目前研究认为瘤胃中有85％的微生物是未培养的(Krause D O，DenmanS E，Mackie R I，Morrison M，Rae A L，Attwood G T，and McSweeney C S.2003.Opportunities to improve fiber degradation in the rumen：microbiology，ecology，and genomics.FEMS Microbiol Rev 27：663-693)，可以推测这些未培养微生物中一定含有大量的新基因资源。

专利“内切葡聚糖酶及其编码基因与应用”(专利申请号“200810056691.1)中提到了umcel5B基因和Umcel5B蛋白，Umcel5B蛋白如序列表的序列3所示，umcel5B基因的开放阅读框如序列表的序列4自5’末端第91至1704位核苷酸所示。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有多种多糖结合能力的多肽。

本发明所提供的多肽，名称为CBM_Umcel5B，来源于水牛瘤胃未培养细菌，是内切葡聚糖酶(GenBank索引号ACA61140)的羧基末端的未知功能域。

多肽CBM_Umcel5B是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多糖结合能力的的由序列1衍生的多肽。

为了使(a)中的CBM_Umcel5B便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的CBM_Umcel5B可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CBM_Umcel5B的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

序列表中的序列1由189个氨基酸残基组成。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中的序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有多糖结合能力的多肽的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有多糖结合能力的多肽的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由567个脱氧核苷酸组成。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

所述重组表达载体具体可为在pET-30a(+)的多克隆位点之间插入所述基因得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将将所述重组表达载体导入E.coli Rosetta^TM(DE3)得到的重组菌。

本发明还保护所述多肽在结合多糖中的应用。

所述多糖可为可溶性多糖或不溶性多糖。所述不溶性多糖具体可为结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末、木薯生淀粉、琼脂糖或Sephadex-G100。

所述可溶性多糖具体可为甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、桦树木聚糖或羧甲基纤维素。

所述多肽或所述基因可用于提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽的pH稳定性和温度稳定性。

所述多肽或所述基因可用于提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽对不溶性多糖的降解能力。所述不溶性多糖具体可为地衣多糖、桦树木聚糖或酸膨胀的纤维素。

所述多肽可用作多肽的吸附剂。

本发明在大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)中表达CBM_Umcel5BDNA序列、纯化表达产物CBM_Umcel5B多肽并检测该多肽对多糖的结合，发现该多肽可以结合广泛的底物，包括人工底物结晶纤维素、非结晶纤维素、几丁质、β-1，3-1，4-葡聚糖和木聚糖，对天然底物如甘蔗渣粉末、木薯生淀粉也具有结合功能，证明该多肽是一个新的碳水化合物结合组件。通过对rUmcel5B(含有糖基水解酶家族5的催化结构域rGHF5和碳水化合物结合组件CBM_Umcel5B)及其单独的催化结构域rGHF5的研究，发现该碳水化合物结合组件的存在可以提高酶对不可溶颗粒状多糖的水解活性及对pH和温度的稳定性。本发明所提供的碳水化合物结合组件CBM_Umcel5B及其编码DNA序列可广泛应用于多糖的降解及提高酶的稳定性方面。

附图说明

图1为Umcel5B蛋白、rUmcel5B、rGHF5与CBM_Umcel5B的比较。

图2为pET-rUmcel5B、pET-rGHF5和pET-CBM的酶切电泳图谱。

图3为rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBM_Umcel5B酶液的电泳图。

图4为不同pH值条件下酶液的相对酶活力。

图5为不同温度条件下酶液的相对酶活力。

图6为pH耐受性测定结果。

图7为温度耐受性测定结果。

图8为CBM_Umcel5B对不可溶多糖的结合能力的电泳检测结果。

图9为CBM_Umcel5B对可溶多糖的结合能力的电泳检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

限制性内切酶：购自TAKARA公司。羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose，CMC)、结晶纤维素(Avicel)、几丁质(Chitin)、地衣多糖(Lichenan)、大麦葡聚糖(barley-glucan)、甲基纤维素(methylcellulose)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose)、桦树木聚糖(birchwood xylan)、Sephadex G-100、昆布多糖(laminarin)等试剂购自SIGMA公司。琼脂糖购自Ameresco公司。

酸膨胀的纤维素(Acid-swollen cellulose)按照以下方法制备而成：

①将10克Avicel悬浮在85％的H₃PO₄水溶液中，1℃搅拌1小时。

②将混合物倒入4L冰冷的水中，放置30min。

③先用预冷的水洗涤步骤③处理后的Avicel几次，然后用1％的NaHCO₃洗涤，再用预冷的水洗涤至酸碱平衡，得到酸膨胀的纤维素。

④酸膨胀的纤维素储存在5mM NaN₃水溶液中，1℃保存。

来源于甘蔗渣的木聚糖按照以下方法制备而成：

①取10g甘蔗渣，装入250ml锥形瓶中，加入65ml蒸馏水，0.5ml冰醋酸，0.6g亚氯酸钠，摇匀，封口，置于75℃恒温水浴中加热，经常旋转并摇动锥形瓶。

②1h后加入0.5mL冰醋酸及0.6g亚氯酸钠，继续放回水浴锅加热1h，重复三次。

③离心弃上清，用蒸馏水将沉淀(甘蔗渣)洗至中性，60℃真空干燥至恒重。

④处理后的甘蔗渣置于10％KOH水溶液中，45℃下振荡抽提20h，离心取上清，加入乙酸将上清pH调至5.0，再离心分离得到沉淀(木聚糖)；

⑤将步骤④离心所得的上清液用四倍体积的95％乙醇沉淀，离心分离后得到沉淀(残留的木聚糖)。

⑥将步骤④和步骤⑤所得的木聚糖在真空干燥箱中60℃真空干燥72h，得到干燥的木聚糖。

实施例1、重组质粒的构建和各个重组蛋白的表达

一、各个DNA片段的制备

1、rUmcel5B的制备

人工合成序列表的序列4自5′末端第145位至1701位核苷酸所示的DNA，命名为rUmcel5B(长度为1557bp)。rUmcel5B编码序列3自氨基末端第19至537位氨基酸残基所示的多肽(由519个氨基酸残基组成)，命名为rUmcel5B。rUmcel5B的预计分子量为58.39332KDa，等电点pI为4.98。

2、rGHF5的制备

人工合成序列表的序列4自5′末端第145位至1134位核苷酸所示的DNA，命名为rGHF5(长度为990bp)。rGHF5编码序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽(由330个氨基酸残基组成)，命名为rGHF5。rGHF5的预计分子量为37.69215KDa，等电点pI为5.00。

3、CBM_Umcel5B的制备

人工合成序列表中序列2所示的DNA(序列2所示DNA即为序列4所示DNA自5’末端第1135位至1701位核苷酸所示DNA)，命名为CBM_Umcel5B(长度为567bp)。CBM_Umcel5B编码序列表中序列1所示的多肽(序列1所示多肽由189个氨基酸残基组成，即为序列3所示多肽自氨基末端第349至537位氨基酸残基)，命名为CBM_Umcel5B。CBM_Umcel5B的预计分子量为20.71817KDa，等电点pI为4.95。

4、Umcel5B蛋白、rUmcel5B、rGHF5与CBM_Umcel5B的比较

Umcel5B蛋白、rUmcel5B、rGHF5与CBM_Umccl5B的比较见图1。Umcel5B包括一个氨基端的信号肽(signal peptide，SP)、一个属于糖基水解酶家族5的催化结构域(GHF5)和一个羧基末端未知的功能域(X)；rUmcel5B包括催化结构域GHF5和未知功能域X，rGHF5只含有催化功能域GHF5，CBM_Umcel5B只含有未知功能域X。

二、重组质粒的构建和鉴定

1、pET-rUmcel5B的构建

①以rUmcel5B为模板，用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，在rUmcel5B的上游和下游分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到PCR产物甲。

引物1：5’-CAGCCATGGCTAAGGCACAAGATTTTGAGACTGCTACCGAA-3’；

引物2：5’-GACCTCGAGTTGTGCTATGTATTTTTTGCCGTTCTGG-3’；

引物序列中带下划线的序列为酶切位点。

②用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物甲，回收酶切产物。

③用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切质粒pET-30a(+)(购自Novagen公司)，回收载体骨架。

④将步骤②的酶切产物和步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-rUmcel5B(骨架为pET-30a(+)，在NcoI和XhoI酶切位点之间插入了rUmcel5B序列)。

2、pET-rGHF5的构建

①以rGHF5为模板，用引物3和引物4组成的引物对进行PCR扩增，在rGHF5的上游和下游分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到PCR产物乙。

引物3：5’-CAGCCATGGCTAAGGCACAAGATTTTGAGACTGCTACCGAA-3’；

引物4：5’-GGGCTCGAGGGTTAATGTCTCAGCCAGGTCAGGCTG-3’；

引物序列中带下划线的序列为酶切位点。

②用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物乙，回收酶切产物。

④将步骤②的酶切产物和步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-rGHF5(骨架为pET-30a(+)，在NcoI和XhoI酶切位点之间插入了rGHF5序列)。

3、pET-CBM的构建

①以CBM_Umcel5B为模板，用引物5和引物6组成的引物对进行PCR扩增，在CBM_Umcel5B的上游和下游分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到PCR产物丙。

引物5：5’-GGGCCATGGCCAAAGCCTATCATGGCAGCGCGTTC-3’；

引物6：5’-GACCTCGAGTTGTGCTATGTATTTTTTGCCGTTCTGG-3’；

引物序列中带下划线的序列为酶切位点。

②用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物丙，回收酶切产物。

④将步骤②的酶切产物和步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-CBM(骨架为pET-30a(+)，在NcoI和XhoI酶切位点之间插入了CBM_Umcel5B序列)。

4、重组质粒的鉴定

pET-rUmcel5B、pET-rGHF5和pET-CBM的酶切电泳图谱如图2所示。图2中，泳道1为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1kb，0.75kb，0.5kb)；泳道2-4依次为pET-rUmcel5B、pET-rGHF5和pET-CBM用NcoI和XhoI双酶切后的酶切产物。三个质粒均具有5.3kb的载体骨架条带。pET-rUmcel5B具有约1.5kb的rUmcel5B条带。pET-rGHF5具有约1kb的rGHF5条带。pET-CBM具有约600bp的CBM_Umcel5B条带。

pET-rUmcel5B、pET-rGHF5和pET-CBM中，起始密码子和终止密码子由pET30a(+)提供。表达产物的N端和C端分别有一个由表达载体提供的His标签(6×His Tag)。

三、重组蛋白的表达和纯化

1、制备重组菌

用pET-rUmcel5B转化E.coli Rosetta^TM(DE3)(购自Novagen公司)，得到重组菌Rosetta^TM(DE3)/pET-rUmcel5B。用pET-rGHF5转化E.coli Rosetta^TM(DE3)，得到重组菌Rosetta^TM(DE3)/pET-rGHF5。用pET-CBM转化E.coli Rosetta^TM(DE3)，得到重组菌Rosetta^TM(DE3)/pET-CBM。

2、重组蛋白的表达

分别培养三种重组菌并诱导重组蛋白表达，得到rUmcel5B粗酶液、rGHF5粗酶液和CBM_Umcel5B粗酶液。具体步骤如下：

①培养和诱导表达

将重组菌接种到10ml含有34μg/ml氯霉素与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃、200rpm培养过夜；取5ml过夜培养物到100ml含有34μg/ml氯霉素与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，28℃继续培养5个小时，5000g离心收集菌体。

②制备粗酶液

将收集的菌体加入平衡/洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH7.0)，悬浮菌体，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400w作用40次，每次作用时间10s，每次作用间隔12s。12000g离心20分钟，收集上清(粗酶液)。

3、重组蛋白的纯化

分别将rUmcel5B粗酶液、rGHF5粗酶液和CBM_Umcel5B粗酶液用Clotech公司的TALONMetal Affinity Resins试剂盒(方法参照试剂盒说明书)进行纯化，得到rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBM_Umcel5B酶液。纯化步骤如下：

①将试剂盒中TALON树脂完全悬浮，快速吸取1ml的树脂到一个灭菌的50ml的离心管中，离心(700g，2分钟)沉淀树脂，小心取出上清丢弃。

②在树脂中加10ml的平衡/洗涤缓冲液，轻轻混匀，平衡树脂，离心(700g，2分钟)沉淀树脂，取出上清丢弃。

③重复步骤②。

④将粗酶液加入树脂中，在室温轻轻摇动20分钟，使带有多组氨酸标签的目标蛋白和树脂结合，然后离心(700g，5分钟)。

⑤仔细取出上清，尽可能不搅动树脂，再加入20ml平衡/洗涤缓冲液于树脂中，轻轻搅动混匀，在室温摇动10分钟后，离心(700g，5分钟)，取出上清丢弃。

⑥重复步骤⑤。

⑦加1ml的平衡/洗涤缓冲液于树脂中，悬浮树脂，将树脂混合液转移到2ml的柱子中(加底盖)，静置让树脂沉淀下来。去掉底盖，让缓冲液流出来，确定在树脂中没有气泡。

⑧用2ml的平衡/洗涤缓冲液洗3次。

⑨加5ml的洗脱液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，150mM咪唑，pH7.0)到柱子中，分管(500μl/管)收集洗脱液(酶液)。

rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBM_Umcel5B酶液的电泳图见图3。图3中：1为蛋白质分子量标准(marker)；2为TALON树脂纯化的rUmcel5B；3为TALON树脂纯化的rGHF5；4为TALON树脂纯化的CBM_Umcel5B。经TALON树脂纯化后重组蛋白均已达到SDS-PAGE单条带纯。

实施例2、rUmcel5B和rGHF5的酶学特性的研究

一、内切葡聚糖酶的酶活测定方法(DNS法)

1、配制DNS试剂

①称取10克NaOH用400ml ddH₂O溶解；

②称取10克二硝基水杨酸、2克苯酚、0.5克无水亚硫酸钠、200克四水酒石酸钾钠，将其溶解于300ml ddH₂O中；

③两种溶液混合，定容到1升，避光保存。

2、葡萄糖标准曲线的绘制

取9只薄壁试管，按表2配制标准品。混匀后在沸水中反应5分钟，室温冷却，用酶标仪测A₅₃₀。

表2葡萄糖标准品的配方

3、酶活测定

酶活(IU)定义为：1U为每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原糖所需的酶量。

比活力的定义：每mg蛋白质所含的酶活力(IU/mg)。

取10μl待测样品液，加入200μl含1％CMC(羧甲基纤维素)的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，反应10分钟，反应结束后加入1ml DNS试剂和290μl双蒸水，置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A₅₃₀。对照标准曲线得到待测样品液的酶活力，根据样品样的酶活力和样品液的蛋白含量，计算得到蛋白的比活力。

二、最适pH值的测定

分别测定实施例1中得到的rUmcel5B酶液(浓度为0.125mg/ml)和rGHF5酶液(0.145mg/ml)在不同pH的缓冲液(pH范围为3～7.5；梯度为0.5)中，39℃反应温度下的酶活(采用步骤一的方法)。

在39℃的反应条件下，rUmcel5B酶液和rGHF5酶液都在pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的比活力最高。以最高比活力为100％，分别换算两种酶液各pH值下的相对酶活力。结果见图4。rUmcel5B酶液和rGHF5酶液的最适pH都为5.0。

三、最适温度的测定

分别测定实施例1中得到的rUmcel5B酶液(浓度为0.125mg/ml)和rGHF5酶液(0.145mg/ml)在pH5.0缓冲液中，不同反应温度(15℃～70℃；梯度为5℃)下的酶活(采用步骤一的方法)。

在pH值为5.0的缓冲液中，rUmcel5B酶液在50℃时比活力最高，rGHF5酶液在35℃时比活力最高。以最高比活力为100％，分别换算两种酶液各温度下的相对酶活力，结果见图5。rUmcel5B酶液和rGHF5酶液的最适温度分别为50℃和35℃。

四、pH耐受性测定

将实施例1中得到的rUmcel5B酶液保存于不同pH值(pH2.5-12.0，梯度为0.5；pH 2.5-7.0为0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液；pH7.5-8.5为Tris-Cl缓冲液；pH9.0-12.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)，4℃放置24小时，然后测定在pH5.0缓冲液中50℃反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。

将实施例1中得到的rGHF5酶液保存于不同pH值(pH2.5-12.0，梯度为0.5；pH2.5-7.0为0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液；pH7.5-8.5为Tris-Cl缓冲液；pH9.0-12.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)，4℃放置24小时，然后测定在pH5.0缓冲液中35℃反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。

以最高比活力为100％，分别换算各酶液在各pH值保存后的相对酶活力，结果见图6。rUmcel5B酶液在pH4.0～10.5之间保持24小时后仍具有80％以上的活力，这说明该酶具有好的pH耐受性，rGHF5酶液在pH5.0～9.5之间保持24小时后仍具有80％以上活力。说明缺失了未知功能域X(CBM_Umcel5B)的单独催化功能域对pH的稳定性下降。

五、酶的温度耐受性测定

将实施例1中得到的rUmcel5B酶液保存于pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，不同温度下(15℃～70℃，梯度为5℃)放置1小时，然后测定在pH5.0缓冲液中50℃反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。

将实施例1中纯化得到的rGHF5酶液保存于pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，不同温度下(15℃～70℃，梯度为5℃)放置1小时，然后测定在pH5.0缓冲液中35℃反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。

以步骤三中的最高比活力为100％，分别换算各酶液在各温度保存后的相对酶活力，结果见图7。55℃以下，rUmcel5B酶液都能保持80％以上的相对活方，rGHF5酶液只能在45℃以下保持80％以上的相对活力。说明缺失了未知功能域X(CBM_Umcel5B)的单独的催化功能域对温度的稳定性下降。

六、底物特异性

采用步骤一的方法检测实施例1中得到的rUmcel5B酶液在pH值5.0缓冲液中50℃反应条件下的酶活；检测实施例1中得到的rUmcel5B酶液在pH值5.0缓冲液中50℃反应条件下对于不用底物的酶活：分别用等质量的其它多糖(结晶纤维素、桦树木聚糖、地衣多糖、酸膨胀的纤维素、甲基纤维素或羟乙基纤维素)替换CMC(羧甲基纤维素)，反应时间及酶量根据酶对不同底物的活性高低而改变，对桦树木聚糖和酸膨胀的纤维素的作用时间为30分钟，对地衣多糖、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素的作用时间为5分钟，对甲基纤维素的作用时间为10分钟，对结晶纤维素的作用时间为2小时。

采用步骤一的方法检测实施例1中得到的rGHF5酶液在pH值5.0缓冲液中35℃反应条件下的酶活；检测实施例1中得到的rGHF5酶液在pH值5.0缓冲液中35℃反应条件下对于不用底物的酶活：反应体系中，分别用等质量的其它多糖(结晶纤维素、桦树木聚糖、地衣多糖、酸膨胀的纤维素、甲基纤维素或羟乙基纤维素)替换CMC(羧甲基纤维素)，反应时间及酶量根据酶对不同底物的活性高低而改变，对桦树木聚糖和酸膨胀的纤维素的作用时间为30分钟，对地衣多糖、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素的作用时间为5分钟，对甲基纤维素的作用时间为10分钟，对结晶纤维素的作用时间为2小时。

结果见表3。

表3rUmcel5B和rGHF5对不同底物的比活力

rUmcel5B对不可溶的颗粒底物如地衣多糖、桦树木聚糖和酸膨胀的纤维素的活性是rGHF5的3倍，而对可溶底物的活性基本一致。说明缺失未知功能域X(CBM_Umcel5B)的rGHF5对不可溶多糖的活性下降，所以该未知功能域X(CBM_Umcel5B)具有提高酶对不可溶底物的活性的应用潜力。

实施例3、rUmcel5B、rGHF5和CBM_Umcel5B对多糖的吸附

用实施例1制备的rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBM_Umcel5B酶液或各个酶液冻干得到的蛋白进行实验。

一、rUmcel5B和rGHF5对结晶纤维素的结合

1、结晶纤维素浓度和混合时间对结合的影响

①分别取20μg rUmcel5B(或rGHF5)加入200μl含不同浓度的结晶纤维素的pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中(结晶纤维素质量百分含量为0％，1％、2％、4％或8％)，置于冰上1小时或5小时(每隔15分钟轻轻震荡混匀)；

②10000g离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；

③每个处理分别取10μl上清液在pH5.0缓冲液中最适反应温度(rUmcel5B为50℃；rGHF5为35℃)下测定酶活(方法同实施例2的步骤一)。

结晶纤维素质量百分含量为0％为对照，目的是防止酶在测试条件下的沉淀反应。对照的酶活代表多肽(rUmcel5B或rGHF5)总量，上清液的酶活力代表未结合到结晶纤维素的多肽，对照的酶活减去上清液的酶活代表结合到结晶纤维素的多肽。根据上清的酶活和对照的酶活可以确定在各个浓度的结晶纤维素条件下，与结晶纤维素结合的多肽占总多肽的比例。结果见表4。

表4不同结晶纤维素浓度条件下结合多肽占总多肽的比例(rUmcel5B)

rUmcel5B能够与结晶纤维素结合，它的结合能力与结晶纤维素的浓度和混合的时间成正比，结晶纤维素浓度越高及混合时间越长，结晶纤维素结合的越多；在结晶纤维素浓度4％以上、混合时间为5小时时，90％以上的多肽都已结合到结晶纤维素上。相反rGHF5在所有条件下都不能结合到Avicel上。这说明rUmcel5B含有一个碳水化合物结合组件，而且该碳水化合物结合组件位于rUmcel5B的羧基末端。

2、pH对rUmcel5B与结晶纤维素结合的影响

①取20μg rUmcel5B加入200μl含4％结晶纤维素的不同pH值(4.0、5.0、6.0或7.0)的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上5小时(每隔15分钟轻轻震荡混匀)；

②10000g离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；

③每个处理分别取10μl上清液在pH5.0缓冲液中50℃反应温度下测定酶活(方法同实施例2的步骤一)。

结果见表5。

表5不同pH条件下结合多肽占总多肽的比例(rUmcel5B)

结合条件	与结晶纤维素结合的多肽(％)
		4％Avicel (pH5.0)	92.1±1.2
4％Avicel (pH4.0)	83.6±0.4
		4％Avicel (pH6.0)	63.5±3.2
4％Avicel (pH7.0)	62.0±3.5

rUmcel5B在pH5.0的时候与结晶纤维素结合达到90％以上，而反应pH的降低和升高都会影响到rUmcel5B与结晶纤维素的结合。

3、小牛血清蛋白(BSA)对rUmcel5B与结晶纤维素结合的影响

①取20μg rUmcel5B加入200μl含4％结晶纤维素和小牛血清蛋白(0.08％或0.01％)的pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上5小时(每隔15分钟轻轻震荡混匀)；

②10000g离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；

结果见表6。

表6不同浓度BSA条件下结合多肽占总多肽的比例(rUmcel5B)

结合条件	与结晶纤维素结合的多肽(％)
		4％Avicel+0.08％BSA	79.8±1.1
4％Avicel+0.01％BSA	81.5±1.9

0.08％和0.01％的小牛血清蛋白只能较轻微的影响到rUmcel5B与结晶纤维素结合；即使溶液中含有0.08％小牛血清蛋白(小牛血清蛋白与rUmcel5B的分子比为13∶1)，还有大概80％的rUmcel5B与结晶纤维素结合，这说明rUmcel5B与结晶纤维素的结合是特异性的结合，而不是随机的结合。

二、CBM_Umcel5B对多糖的结合

1、CBM_Umcel5B对不可溶多糖的结合

分别检测CBM_Umcel5B对如下几种不溶性多糖的结合能力：结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、琼脂糖、Sephadex G-100、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末和木薯生淀粉。

①取30μg CBM_Umcel5B加入200μl含4％不溶性多糖的pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上5小时(每隔15分钟轻轻震荡混匀)；

②10000g离心10分钟；

③小心将步骤②离心得到的上清液移取到一个新的EP管(此部分为未与底物结合部分)；

④将步骤②离心得到的沉淀加入1ml pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，混匀，10000g离心10分钟，弃上清；

⑤重复步骤④一次；

⑥向步骤⑤得到的沉淀中加入100μl含2％SDS水溶液，混匀后37℃水浴30分钟，10000g离心10分钟，取上清液到一个新的EP管(此部分为与底物结合的蛋白部分)。

分别将步骤③得到的上清液和步骤⑥得到的上清液进行SDS-PAGE，结果见图8。在图8中，M为标准分子量的蛋白质；A组为结晶纤维素；B组为酸膨胀的纤维素；C组为几丁质；D组为地衣多糖；E组为琼脂糖；F组为Sephadex G-100；G组为来源于甘蔗渣的木聚糖；H组为甘蔗渣粉末；I组为木薯生淀粉；1为结合部分蛋白；2为不结合部分的蛋白；CK为未加入多糖的对照的总蛋白。CBM_Umcel5B对广泛的不可溶多糖都具有结合能力，其中对结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末和木薯生淀粉都有较强的结合能力，对琼脂糖和Sephadex-G100也有比较微弱的结合能力。

2、CBM_Umcel5B对可溶多糖的结合

分别检测CBM_Umcel5B对如下几种可溶多糖的结合能力：羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、甲基纤维素、桦树木聚糖、昆布多糖(laminarin)和可溶的淀粉。

通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)测试CBM_Umcel5B对7种可溶多糖的结合能力。所有溶液中不加入SDS，浓缩胶和分离胶分别含5％和10％的丙烯酰胺，分离胶和浓缩胶中都加入终浓度为0.1％的可溶多糖，其它同普通电泳；同时做另一块未添加多糖的胶作为对照。取7.5μg的CBM_Umcel5B(或小牛血清蛋白，阴性对照)，4℃电泳3小时。电泳结果见图9。图9，M为对照小牛血清蛋白(BSA)；CBM为CBM_Umcel5B；a为不含有任何多糖的天然胶；b为天然胶中添加了甲基纤维素；c为天然胶中加入了羟乙基纤维素；d为天然胶中加入了大麦葡聚糖；e为天然胶中加入了桦树木聚糖；f为天然胶中加入了羧甲基纤维素；g为天然胶中加入了昆布多糖；h为在天然胶中加入了可溶性淀粉。

对照小牛血清蛋白在含多糖和未含多糖的胶中电泳距离没有什么变化，而CBM_Umcel5B在含有甲基纤维素、羟乙基纤维素和大麦葡聚糖的自然胶中电泳距离相比于未添加多糖的对照胶中明显滞后很多，说明CBM_Umcel5B对该三种可溶多糖具有强的吸附作用，同时也可以看到CBM_Umcel5B对桦树木聚糖和羧甲基纤维素有较弱的结合，然而对昆布多糖和可溶的淀粉无吸附功能。

序列表

<110>广西大学

<120>具有多糖结合能力的多肽

<130>CGGNARY102409

<160>4

<210>1

<211>189

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

Lys Ala Tyr His Gly Ser Ala Phe Glu Gly Lys Tyr Pro Val His Asp

1 5 10 15

Ser Ser Lys Gly Thr Val Ala Phe Glu Gly Glu Lys Thr Leu Glu Trp

20 25 30

Gly Glu Gly Val Phe Val Pro Ser Ser Met Leu Thr Asp Val Gly Glu

35 40 45

Asp Val Glu Val Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Asp

50 55 60

Asp Ile Gln Phe Met Tyr Asn Asn Gly Gly Trp Gln Lys Ile Pro Ser

65 70 75 80

Gly Leu Ser Met Asp Gly Lys Ala Phe Asp Gly Ala Asp Phe Ser Ala

85 90 95

Ser Ser Val Tyr Gly Ile Gln Ser Gly Asp Thr Lys Thr Ser Val Leu

100 105 110

Thr Phe Asp Ala Ser Ala Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Tyr Glu Met Val

115 120 125

Ile Gln Gly His Gly Val Ile Met Lys Lys Val Thr Val Arg Ala Pro

130 135 140

Ser Gly Thr Ser Ala Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Tyr Pro Asp Asn

145 150 155 160

Thr Ile Ile Tyr Asn Leu Asn Gly Gln Arg Val Glu Thr Pro Arg Lys

165 170 175

Gly Ile Tyr Ile Gln Asn Gly Lys Lys Tyr Ile Ala Gln

180 185

<210>2

<211>567

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>2

aaagcctatc atggcagcgc gttcgaagga aaataccctg ttcatgattc ttcgaagggt 60

actgttgctt ttgaaggcga gaagacgttg gaatggggag aaggcgtgtt cgttccatcc 120

tctatgttga cagacgtggg agaagatgtg gaagtagaac tgacctataa actcgacttc 180

accgactatg atgatattca gttcatgtat aataatggtg gatggcagaa gatacccagt 240

ggtctttcaa tggatgggaa agcgttcgac ggtgccgact tcagcgcttc cagcgtatat 300

ggcattcaat cgggcgatac aaagacatcg gtcttgactt tcgatgcctc ggcttatgga 360

tatgtttcta aatatgagat ggtgatccaa ggacacggcg ttatcatgaa aaaggttact 420

gtaagagcac cttccggtac gtcagcaatt ccccttatca aagcagatta tccagataat 480

accatcatat acaacctcaa tggccagcgt gtcgaaacgc ctcgtaaggg aatctatatc 540

cagaacggca aaaaatacat agcacaa 567

<210>3

<211>537

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>3

Met Lys Lys Thr Leu Leu Leu Leu Cys Gly Met Leu Val Leu Gly Thr

1 5 10 15

His Ala Lys Ala Gln Asp Phe Glu Thr Ala Thr Glu Ala Val Lys Asn

20 25 30

Met Gly Val Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Leu Asp Ala Ser Ser Gly

35 40 45

Ser Lys Gln Gly Leu Glu Ser Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Pro Val Thr

50 55 60

Lys Pro Glu Leu Met Lys Met Met Lys Glu Ala Gly Phe Gly Ala Ile

65 70 75 80

Arg Val Pro Val Thr Trp Tyr Asn His Met Asp Thr Ser Gly Thr Val

85 90 95

Asp Glu Glu Trp Met Lys Arg Val His Glu Val Val Asp Tyr Val Ile

100 105 110

Asp Gln Gly Met Tyr Cys Ile Val Asn Val His His Asp Thr Gly Asp

115 120 125

Gly Thr Gln Trp Leu His Ala Ser Thr Ala Thr Tyr Asp Lys Val Lys

130 135 140

Ser Lys Tyr Glu Tyr Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asn Glu Phe Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Asp Gln Lys Leu Leu Phe Glu Ser Tyr Asn Glu Met Leu Asp Asp

165 170 175

Glu Asn Lys Trp Asn Glu Pro Ala Thr Asp Asp Gly Tyr Lys Ala Ile

180 185 190

Asn Asn Tyr Ala Lys Leu Phe Val Asn Thr Val Arg Lys Thr Gly Gly

195 200 205

Asn Asn Lys Asn Arg Asn Leu Val Val Asn Thr Tyr Ser Ala Ser Ser

210 215 220

Ala Ala Asn Ala Met Lys Ala Leu Glu Leu Pro Glu Glu Ser Gly His

225 230 235 240

Ile Ile Phe Gln Leu His Ser Tyr Pro Asp Trp Gln Asn Glu Ser Asn

245 250 255

Ala Lys Ser Ile Val Asp Asn Leu Ile Ser Thr Ile Lys Thr Asn Leu

260 265 270

Leu Lys Arg Ala Pro Val Ile Ile Gly Glu Tyr Ala Thr Phe Arg Thr

275 280 285

Trp Pro Thr Asn Leu Asp Tyr Tyr Asn Glu Asn Arg Glu Leu Ala Leu

290 295 300

Tyr Ala Met Asp Tyr Phe Ile Lys Lys Thr Lys Glu Ala Gly Ile Gly

305 310 315 320

Thr Phe Tyr Trp Met Gly Leu Ser Asp Gly Ile Tyr Arg Ser Glu Pro

325 330 335

Ala Phe Asn Gln Pro Asp Leu Ala Glu Thr Leu Thr Lys Ala Tyr His

340 345 350

Gly Ser Ala Phe Glu Gly Lys Tyr Pro Val His Asp Ser Ser Lys Gly

355 360 365

Thr Val Ala Phe Glu Gly Glu Lys Thr Leu Glu Trp Gly Glu Gly Val

370 375 380

Phe Val Pro Ser Ser Met Leu Thr Asp Val Gly Glu Asp Val Glu Val

385 390 395 400

Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Asp Asp Ile Gln Phe

405 410 415

Met Tyr Asn Asn Gly Gly Trp Gln Lys Ile Pro Ser Gly Leu Ser Met

420 425 430

Asp Gly Lys Ala Phe Asp Gly Ala Asp Phe Ser Ala Ser Ser Val Tyr

435 440 445

Gly Ile Gln Ser Gly Asp Thr Lys Thr Ser Val Leu Thr Phe Asp Ala

450 455 460

Ser Ala Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Tyr Glu Met Val Ile Gln Gly His

465 470 475 480

Gly Val Ile Met Lys Lys Val Thr Val Arg Ala Pro Ser Gly Thr Ser

485 490 495

Ala Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Tyr Pro Asp Asn Thr Ile Ile Tyr

500 505 510

Asn Leu Asn Gly Gln Arg Val Glu Thr Pro Arg Lys Gly Ile Tyr Ile

515 520 525

Gln Asn Gly Lys Lys Tyr Ile Ala Gln

530 535

<210>4

<211>2117

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>4

aaatctttag atatttattt gcctacttca caaataaatc gtaaatttgc agaagttttt 60

taagattact aacaaataat aatatcgctt atgaagaaaa ctctactttt gctgtgtgga 120

atgctggtgc ttggcactca tgctaaggca caagattttg agactgctac cgaagctgtc 180

aagaacatgg gcgtgggctg gaaccttggt aacacgctcg atgccagtag cggtagcaaa 240

cagggactgg aatcagagac atactgggga cagcctgtca caaagcccga actcatgaaa 300

atgatgaaag aggcagggtt cggagccata cgtgtgccag taacatggta taaccatatg 360

gacaccagtg gaacagtcga cgaggaatgg atgaagcgtg ttcacgaggt ggtggactat 420

gtcatcgatc agggaatgta ttgcatcgtg aatgtccatc atgacacagg tgacggcacg 480

caatggctgc atgccagtac agcgacctac gacaaagtca agtcaaagta cgaatatctg 540

tggaaacaga tagccaatga gtttaaggac tacgaccaga agttgctttt tgaatcctac 600

aacgaaatgc tggatgacga gaacaaatgg aacgagcctg ctactgacga cggctataag 660

gccattaaca attatgccaa gcttttcgtc aatacagtgc gtaaaacagg tggcaacaac 720

aagaatcgca acctggtagt caacacctat tcggccagta gcgccgctaa cgcgatgaaa 780

gcccttgaat tacctgaaga atctggtcac atcattttcc agctgcatag ctatcctgac 840

tggcagaatg aaagtaatgc gaaaagtata gtcgataacc tgatcagtac cattaaaacg 900

aatctgctga aaagggctcc agtcattatc ggtgaatatg ccacattcag gacttggcct 960

acaaatctgg attattataa tgagaaccgc gaattagccc tttatgcgat ggactatttc 1020

atcaagaaga ccaaagaggc cggtatcggt accttctact ggatgggtct ctctgacgga 1080

atctatcgtt cagaaccagc cttcaatcag cctgacctgg ctgagacatt aaccaaagcc 1140

tatcatggca gcgcgttcga aggaaaatac cctgttcatg attcttcgaa gggtactgtt 1200

gcttttgaag gcgagaagac gttggaatgg ggagaaggcg tgttcgttcc atcctctatg 1260

ttgacagacg tgggagaaga tgtggaagta gaactgacct ataaactcga cttcaccgac 1320

tatgatgata ttcagttcat gtataataat ggtggatggc agaagatacc cagtggtctt 1380

tcaatggatg ggaaagcgtt cgacggtgcc gacttcagcg cttccagcgt atatggcatt 1440

caatcgggcg atacaaagac atcggtcttg actttcgatg cctcggctta tggatatgtt 1500

tctaaatatg agatggtgat ccaaggacac ggcgttatca tgaaaaaggt tactgtaaga 1560

gcaccttccg gtacgtcagc aattcccctt atcaaagcag attatccaga taataccatc 1620

atatacaacc tcaatggcca gcgtgtcgaa acgcctcgta agggaatcta tatccagaac 1680

ggcaaaaaat acatagcaca ataacggcta ctgacttctg aaaagaacgc ccccgactac 1740

ttatcacaag caatcggggg ctacaaaaaa cctttatatt tgaaaaacct tattatttat 1800

tcacctggaa cttagtgtca ccatccttga agaaggcgtt gatctgcttg gcggcagcaa 1860

taccggcatt gatattggcc tcggcagtct gagcacccat cttcttcgga gtcgagaagt 1920

aacggccact gaacttggcg aactcgtgat cggcatcagg catgatgtcg gtgacaaact 1980

tcagatcgtc acgctcctgc atcagctgaa tcagctcagc ctcgttgatc acttccttac 2040

gggctgtgtt cacgaggata ccacccttct tcatcttacc caccagcgca gcattgatgc 2100

tctgcttggt ctcaggc 2117

Claims

1.一种多肽，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述多肽的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中的序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pET-30a(+)的多克隆位点之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求5所述重组表达载体导入E.coli Rosetta^TM(DE3)得到的重组菌。

7.权利要求1所述多肽在结合多糖中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述多糖为可溶性多糖或不溶性多糖；所述不溶性多糖为结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末、木薯生淀粉、琼脂糖或Sephadex-G100；所述可溶性多糖为甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、桦树木聚糖或羧甲基纤维素。

9.权利要求1所述多肽或权利要求2或3所述基因在提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽的pH稳定性和温度稳定性中的应用。

10.权利要求1所述多肽或权利要求2或3所述基因在提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽对不溶性多糖的降解能力中的应用；所述不溶性多糖为地衣多糖、桦树木聚糖或酸膨胀的纤维素。