CN101225378A

CN101225378A - 内切葡聚糖酶和它的编码基因与应用

Info

Publication number: CN101225378A
Application number: CNA2008100566911A
Authority: CN
Inventors: 段承杰; 冯家勋; 方颖慧; 唐纪良
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2008-07-23
Anticipated expiration: 2028-01-23
Also published as: CN101225378B

Abstract

本发明公开了一种内切葡聚糖酶和它的编码基因与应用。本发明提供的一种内切葡聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。实验证明本发明的内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性(达42229U/g)，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供内切葡聚糖酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。

Description

内切葡聚糖酶和它的编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种内切葡聚糖酶和它的编码基因与应用。

背景技术

纤维素主要是植物利用二氧化碳和水在太阳能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×10⁹吨，其中89％尚未被人类利用(Dunlap C，Chiang GC.Utilization and recycle of agriculture wastes and residues.Shuler M L.Boca Raton，Florida.USA：CRC Press Inc.1980.19)。纤维素是多个葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维素。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，包括三类酶即内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖(Tomme P，WarrenR A J，Gilkes N R.1995.Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi.Adv.Microbiol.Physiol.37：1-81.1995；Bhat M K，Bhat S.1997.Cellulosedegrading enzymes and their potential industrial applications.BiotechnologyAdvances，15：583-620)。葡萄糖可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食和饲料短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素酶可广泛应用于酿酒、饲料、食品、纺织、造纸等行业。如纤维素酶作为饲料添加剂可增加饲料的可消化性，减少排泄的粪便量。纤维素酶可取代浮石进行牛仔裤的“石洗”处理，也可处理其它含纤维织物以降低粗糙度和增加光亮。纤维素酶可添加到洗涤剂中以提高洗涤剂的清洁能力(Bhat MK.2000.Cellulases and related enzymes in biotechnology.BiotechnologyAdvances，18：355-383)。由于纤维素酶的广泛用途以及针对不同的用途需要使用不同性质的纤维素酶，更由于纤维素酶的效率低、价格高而使以纤维素为原料生产燃料酒精的成本太高以至于无法真正实现产业化，因此，需要新的纤维素酶。

纤维素酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域如碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding modules，CBMs)组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families)(Davies G.Henrissat B.1995.Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases.Structure 3：853-859；Henrissat B.1991.A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.280：309-316；Henrissat B.Bairoch A.1993New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities.Biochem.J.293：781-788；Henrissat B.BairochA.1996.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696)。根据Cazy服务器(server)(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有108个家族，纤维素酶分属于糖基水解酶类家族1、3、5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、61、74。将未知的纤维素酶与已知的纤维素酶做序列同源性比较可对其进行分类。

人类所克隆的大部分纤维素酶基因都是从纯培养的微生物中来的，但并不是自然界中所有微生物都是可以被分离、培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1％(Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H.1995.Phylogenetic identification and insitu detection of individual microbial cells without cultivation.Microbiol.Rev.59：143-169)，那么剩余的99％的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离基因已是成熟技术(Lorenz P，Schleper C.2002.Metagenome-a challenging source of enzyme discovery.Journal of MolecularCatalysis B：Enzymatic 19-20：13-19)。目前世界上已克隆得到来源于不同环境的未培养微生物的纤维素酶基因，其中包括Healy等(Healy F G，Ray R M，Aldrich H C，Wilkie A C，IngramL O and Shanmugam K T.1995.Direct isolation of functional genes encoding cellulases from themicrobial consortia in a thermophilic，anaerobic digester maintained on lignocellulose.ApplMicrobiol Biotechnol.43：667-674.)报道从厌氧高温木头堆里克隆到了一个纤维素酶基因；Rees等(Rees HC，Grant S，Jones B，Grant WD，Heaphy S.2003.Detecting cellulase and esteraseenzyme activities encoded by novel genes present in environmental DNA libraries.Extremophiles.7(5)：415-421)报道从湖水和湖床沉积物未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因CRATCEL和HKCEL，Voget等(Voget S，Leggewie C，Uesbeck A，Raasch C，Jaeger KE，Streit WR.2003.Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome.Appl Environ Microbiol.69(10)：6235-6242；Voget S，Steele H L，and Streit W R.2006.Characterization of ametagenome-derived halotolerant cellulase.J.Biotechnol.126：26-36)报道从土壤未培养微生物中克隆到3个纤维素酶基因gnuB、uvs080和cel5A；Ferrer等(Ferrer M，Golyshina OV，Chernikova T N，Khachane A N，Reyes-Duarte D，Santos V A，Strompl C，Elborough K，Jarvis G，Neef A，Yakimov M M，Timmis K N，and Golyshin P N.2005.Novel hydrolase diversityretrieved from a metagenomic library of bovine rumen microflora.Environ Microbiol.7：1996-2010)从牛瘤胃未培养微生物中鉴定了9个纤维素酶基因。Feng等(Feng Y，Duan CJ，Pang H，Mo XC，Wu CF，Yu Y，Hu YL，Wei J，Tang JL，and Feng JX.2007.Cloning andidentification of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum andcharacterization of the expressed cellulases.Appl.Microbiol.Biotechnol.75：319-328)从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了11个纤维素酶基因。这些来源于未培养微生物宏基因组的纤维素酶基因从序列上来说都是新的，说明宏基因组方法是得到新基因的好方法。反刍动物的瘤胃是自然界中纤维素降解最剧烈的主要场所之一，植物的纤维素类物质是被瘤胃中共生的纤维素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、细菌、原生动物和古细菌。目前研究认为瘤胃中有85％的微生物是未培养的(Krause D O，Denman S E，Mackie R I，MorrisonM，Rae A L，Attwood G T，and McSweeney C S.2003.Opportunities to improve fiberdegradation in the rumen：microbiology，ecology，and genomics.FEMS Microbiol Rev27：663-693)，可以推测这些未培养微生物中一定含有大量的基因资源如纤维素酶基因资源，通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库，极有可能从中筛选得到比目前已知的最好的纤维素酶还要好的酶的基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种内切葡聚糖酶和它的编码基因与应用。

本发明所提供的内切葡聚糖酶，名称为Umcel5B，来源于水牛瘤胃未培养细菌，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)自序列表中的SEQ ID №.2的氨基端第21-537位氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID №.2的氨基端第21-537位氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由537个氨基酸残基组成。自序列2的氨基端的第1-20位氨基酸为信号肽(signal peptide)，自序列2的氨基端的的第40-334位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。Umcel5B同来源于瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶(GenBank索引号ABX76045)的同源性最高，两者的相似性为66％、相同性为54％。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的Umcel5B便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的Umcel5B可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Umcel5B的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №：1的自5′端第326至1881位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述Umcel5B的氨基末端添加上信号肽序列。如添加由序列表中2的自氨基末端第1至20位氨基酸残基组成的多肽，得到由序列表中2所示的氨基酸序列组成的蛋白。

上述内切葡聚糖酶编码基因(umcel5B)也属于本发明的保护范围。

上述内切葡聚糖酶的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中SEQ ID №：1的5′端第326-1881位核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的序列1由2297个脱氧核苷酸组成，自序列1的5’端的第271至1884位核苷酸为umcel5B的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自序列1的5’端的第271-273位核苷酸为umcel5B基因的起始密码子ATG，自序列1的5’端的第1882-1884位核苷酸为umcel5B基因的终止密码子TAA。序列表中序列1编码序列表中序列2的蛋白质序列。自序列表中SEQ ID №：1的5′端第331-1881位核苷酸序列编码自序列表中的SEQ ID №.2的氨基端第21-537位氨基酸残基序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明通过构建水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的内切葡聚糖酶活性平板检测筛选法，得到了新的内切葡聚糖酶基因，该内切葡聚糖酶基因可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该内切葡聚糖酶，用于纤维素的降解，实验证明本发明的内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性(达42229U/g)，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供内切葡聚糖酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。

附图说明

图1为从水牛瘤胃内容物样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。

图2为水牛瘤胃未培养微生物基因文库克隆的限制性内切酶BamHI酶切分析图。

图3为瘤胃未培养微生物基因文库中表达内切葡聚糖酶活性克隆的筛选，阳性克隆EPI100/pGXNC56所在的平板图。

图4为能降解羧甲基纤维素的文库克隆质粒pGXNC56的BamHI酶切带型。

图5为初筛获得的重组质粒pGXNC56转化大肠杆菌后得到的转化子对羧甲基纤维素降解水解圈照片。

图6为表达质粒pET-umcel5B重组质粒经NcoI和XhoI双酶切后电泳图。

图7为重组大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5B和大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-30a羧甲基纤维素降解检测。

图8umcel5B基因的表达、表达产物Umcel5B的纯化及活性胶检测。

图9Umcel5B在不同pH值条件下的酶相对活力曲线。

图10Umcel5B在不同温度条件下的酶相对活力曲线。

图11Umcel5B的pH耐受性检测结果。

图12Umcel5B的温度耐受性检测结果。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI100(购自Epicentre公司)；表达菌株Rosetta^TM(DE3)(购自Novagen公司)；柯斯质粒载体pWEB::TNC(购自Epicentre公司)；文库制备试剂盒(购自Epicentre公司，pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)；表达载体pET-30a(购自Novagen公司)；限制性内切酶、修饰酶、聚合酶及羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose，CMC)等试剂购自Promega、TAKARA、SIGMA或MBI。

实施例1、内切葡聚糖酶Umcel5B及其编码基因的获得

一、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建

1、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的提取

取50g水牛瘤胃内容物(样品的来源为南宁市肉联厂刚屠宰的水牛的瘤胃，采集的样品立即用液氮保存)，悬浮在200ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，轻轻震荡均匀，放置10分钟，让瘤胃内容物中的纤维素颗粒自动沉淀，弃上清液，再加入200ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH6.5)洗沉淀块两次，最后一次的沉淀块用直接提取法提取吸附于纤维素颗粒的微生物的宏基因组DNA。在沉淀块中加入100ml提取缓冲液(100mM sodium phosphate pH8.0；100mM Tirs-HCl pH8.0；100mM EDTA pH8.0；1.5M NaCl；1％CTAB；2％SDS)混合均匀，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次后，加入2ml的溶菌酶(20mg/ml)溶液(溶菌酶终浓度为0.4mg/ml)37℃水浴1小时，期间每10分钟颠倒混匀一次，然后加入2ml的蛋白酶K(50mg/ml)溶液(蛋白酶K终浓度为1mg/ml)37℃水浴1小时，期间每10分钟颠倒混匀一次。加入40ml PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone)溶液(购自Sigma公司，目录号P-6755)(PVPP溶液：每100mg PVPP与1ml 0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)混匀)，振荡30秒，再加入2ml 3M CaCl₂溶液，振荡30秒后，在Beckman Coulter Avanti J-E离心机(购自Beckman Coulter公司，目录号369003)JA-10转头用8,000g室温离心20分钟，上清液转移到另一个干净的离心管。在沉淀物中再加入100ml提取缓冲液，混合均匀，在65℃放置60分钟，期间每10分钟颠倒混匀一次，8,000g离心20分钟，合并两次的上清液。在上清液中加入等量的氯仿，上下颠倒离心管混匀，8,000g离心10分钟，取上清入另一个离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，用灭菌的Tip头挑出絮状DNA，用70％乙醇洗两次，于室温中晾干，用5ml TE溶解。

2、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组的纯化获得30kb以上的DNA

将DNA粗提物加到Sephadex G200(购自Pharmacia公司，目录号17-0080-01)的层析柱(200mm×10mm，含有2％PVPP(购自Sigma公司，目录号P-6755)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分1ml分段收集洗脱液，每一组分加入100μl的3M醋酸钠溶液(pH5.2)及1ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7％琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA，回收纯化的DNA电泳图如图1所示，其中泳道1为λDNA(48.5kb)；泳道2为λDNA用EcoRI酶切(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道3为从水牛瘤胃内容物提取的DNA粗提物；泳道4为经过SephadexG-200凝胶初步纯化的DNA；泳道5为经过电洗脱法回收得到的30kb以上的DNA。

3、纯化获得30kb以上的末端补平的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组

为了用上述电洗脱法回收纯化的DNA制作基因文库，首先对这些DNA进行末端补平，以产生平头末端而和文库制备试剂盒(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)中已处理好的同样具平头末端的pWEB::TNC载体相连，具体方法为：依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：6μl 10×末端修补缓冲液(330mM Tris-醋酸(pH7.8)，660mM醋酸钾，100mM醋酸镁，5mM DTT)，6μl 2.5mM dNTP混合物(每种dnNTP2.5mM)，6μl 10mM ATP，10ug 30kb以上的DNA，2μl末端修补酶混合物(T₄ DNA聚合酶和T₄多聚核苷酸激酶)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmidcloning kit，目录号WEBC931)，加灭菌的去离子水补充到总体积60ul。25℃下放置45分钟，再转移到70℃水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含30kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收。

4、末端补平后的水牛瘤胃未培养微生物宏基因组与pWEB::TNC的连接反应

将上述末端补平后回收的DNA片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的pWEB::TNC载体在T₄DNA连接酶的作用下连接起来，具体方法为：依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：12μl无菌水，2μl 10倍快速连接缓冲液(10×Fast-Link Ligation Buffer)，1μl 10mM ATP，1μl pWEB::TNC载体(0.5μg)，3μl低熔点琼脂糖凝胶回收的30kb-45kb的DNA(0.1μg/μl)，1μl快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase，2单位/μl)(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)，混匀后在25℃下放置2个小时，再在70℃放置10分钟以终止酶反应。

5、水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的获得及质量检验

连接反应产物用λ包装蛋白包装，具体方法为：将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(购自Epicentre公司的文库制备试剂盒pWEB::TNC cosmid cloning kit，目录号WEBC931)的一个组分，总共50ul/管)25μl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10μl连接反应产物，充分混匀后置于30℃90分钟后，再往其中加入另外25μl溶化的λ包装提取物，充分混匀后置于30℃90分钟，向其中加入500μl噬菌体稀释缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)，100mM NaCl，10mM MgCl₂)，得到560μl包装反应产物。

再将上述得到的560μl包装反应产物加入到5.6mL的OD₆₀₀＝1.0的宿主大肠杆菌EPI100培养液(培养基为LB(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；pH7.0)+10mM MgSO₄)中，25℃下放置20分钟让上述得到的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞E.coli EPI100，在含氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)和氯霉素(终浓度为12ug/ul)的LA平板(每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；琼脂粉，15g，pH7.0)上筛选转导子。结果共获得约15,000个转导子，任意提取14个克隆的质粒DNA，限制性内切酶BamHI酶切后用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果所有质粒除都有一个5.8kb的载体片段外，都含有插入片段，且没有发现有两个质粒具有相同的酶切带型，酶切结果如图2所示，其中泳道1为λDNA用EcoRI酶切片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；其它泳道分别为使用限制性内切酶BamHI酶切的文库克隆质粒。结果表明文库含有非常随机的插入DNA片段，插入片段最大的为42kb，最小的为22kb，平均大小为35kb。说明文库的克隆容量也是相当大的，文库的质量相当好。

二、内切葡聚糖酶及其编码基因(umcel5B)的获得

1、从水牛瘤胃未培养微生物的宏基因组文库中筛选表达内切葡聚糖酶活性的克隆

用平板影印法将步骤一中在含氨苄青霉素和氯霉素的LA平板上得到的文库(每平板约200个菌落左右)分别影印到含0.5％羧甲基纤维素(carboxylmethylcellulose，CMC)(购自Sigma公司，目录号C-5678)、氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)和氯霉素(终浓度12ug/ml)的LA平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养36小时后，将培养好的含羧甲基纤维素的LA平板用质量百分含量为0.5％刚果红溶液染色15分钟，用1M的NaCl溶液脱色15分钟，然后检测菌落周围有无水解圈。

结果如图3所示，箭头所指的菌落为周围有水解圈的克隆。结果表明筛选到1个菌落周围有水解圈的克隆(EPI100/pGXNC56)，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pGXNC56，用限制性内切酶BamHI完全酶切pGXNC56后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4所示，pGXNC56除有一个5.8kb的载体片段外，还有另外5条BamHI片段，大小分别为18.0kb，7.5kb，6kb(和载体带重叠)，3.5kb和2.5kb。结果表明pGXNC56含有37.5kb的插入片段。其中，图4中，泳道1为λ用EcoRI酶切后的片段(片段大小从大到小依次为：21.2kb，7.4kb，5.8kb，5.6kb，4.9kb，3.5kb)；泳道2为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb，1kb)；泳道3为pGXNC56/BamHI(从上至下分别为18.0kb，7.5kb，6kb，5.8kb，，3.5kb和2.5kb)。

为了证实pGXNC56的插入片段确实含有内切葡聚糖酶基因，用pGXNC56质粒DNA和空载体pWEB::TNC分别转化E.coli EPI100，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选转化子，随机挑取由每个质粒转化得到的10个转化子点接到含质量百分含量为0.5％羧甲基纤维素的LA平板上，37℃培养24小时后，用0.5％刚果红溶液染色15分钟，用1M的NaCl溶液脱色，然后观察菌落周围有无水解圈，结果表明所有10个由空载体pWEB::TNC转化得到的转化子周围都没有水解圈，所有10个由pGXNC56转化得到的转化子周围都有水解圈，其中一个转化子的检测结果如图5所示。结果表明重组质粒pGXNC56的插入片段上确实含有内切葡聚糖酶基因。图5中，右边的菌落为初筛获得的重组质粒pGXNC56转化大肠杆菌后得到的转化子(能降解羧甲基纤维素)，左边的菌落为空载体pWEB::TNC转化大肠杆菌后得到的转化子(不能降解羧甲基纤维素)。

2、内切葡聚糖酶及其编码基因(umcel5B)的获得

为了测定重组质粒pGXNC56上内切葡聚糖酶基因的DNA序列，采用亚克隆的方法对该基因进行定位。依次使用限制性内切酶EcoRI对重组质粒pGXNC56进行了亚克隆，亚克隆的步骤：取质粒pGXNC56用EcoRI完全酶切后加入连接酶在25℃连接一个小时(在pGXNC56完全酶切后，该重组质粒含有的载体pWEB::TNC的3.0kb的部分可以利用来克隆各个外源EcoRI片断)。连接产物用化学法转化大肠杆菌XL1-Blue，在含质量百分比含量为0.5％羧甲基纤维素的LA培养基平板上筛选有活性的克隆。在任意挑选24个表达羧甲基纤维素酶活性的克隆，提取质粒做EcoRI酶切分析，其中一个质粒克隆有最少的外源片段，将此质粒命名为pGXNC5614。质粒pGXNC5614的EcoRI酶切分析表明该质粒有3kb和4kb的两个外源片段。分别将3kb和4kb的两个外源片段回收与载体pGEM3zf(+)连接，连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，在含质量百分比含量为0.5％羧甲基纤维素的LA培养基平板上再次筛选有羧甲基纤维素酶活性的克隆，含该两个片段与载体pGEM3zf(+)的正确重组质粒的转化子均无羧甲基纤维素酶活性，说明pGXNC5614的插入片段中编码羧甲基纤维素酶的基因中有一个EcoRI位点。最后将目的基因定位在7kb的EcoRI酶切片段上(即含有该7kb片段的重组质粒为上述的pGXNC5614)。

将该重组质粒pGXNC5614寄送大连宝生物工程公司采用双脱氧核苷酸法对该亚克隆进行双向双链测序。测序结果用软件DNAStar(DNASTAR公司，版本5)及NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件对DNA序列进行分析，如Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，得到内切葡聚糖酶的编码基因，该基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，命名为umcel5B。自序列表中序列1的5′端的第271至1884位核苷酸为umcel5B的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，由1614个核苷酸组成，自序列1的5′端的第271-273位核苷酸为umcel5B基因的起始密码子ATG，自序列1的5′端的1882-1884位核苷酸为umcel5B基因的终止密码子TAA。

内切葡聚糖酶基因umcel5B编码一个含537个氨基酸的蛋白质Umcel5B，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为60317.83道尔顿，等电点pI为5.15。用简单组件结构研究工具(Simple ModularArchitecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析内切葡聚糖酶Umcel5B的组件结构，结果是自序列2的氨基端的第1-20位氨基酸为信号肽(signal peptide)，自序列2的氨基端的第40-334位氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。Umcel5B同来源于瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶(GenBank索引号ABX76045)的同源性最高，两者的相似性为66％、相同性为54％。

实施例2、umcel5B在大肠杆菌中的表达

1、可表达umcel5B的重组载体(pET-umcel5B)的构建

带有编码信号肽的基因在体内表达后很有可能将表达产物分泌到细胞外。为避免表达产物分泌到细胞外，只需要人工合成序列1的自5′端第326位至1881位碱基(即umcel5B基因中除编码信号肽功能域和终止密码子外的DNA序列)，1556bp，预计其编码蛋白的分子量为58.39332KDa，等电点pI为4.98。

人工合成umcel5B基因除了信号肽和终止密码子以外的全部序列(即自序列1的5′端第326-1881位核苷酸序列)，合成umcel5B基因两端带有NcoI和XhoI酶切位点，将合成后并测序表明正确的umcel5B基因片段用NcoI和XhoI酶切后，插入载体pET-30a(+)(购自Novagen公司)的NcoI和XhoI位点间，得到重组表达载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将酶切和测序表明含有umcel5B基因编码序列的正确的重组载体命名为pET-umcel5B。起始密码子和终止密码子由表达载体pET30a(+)提供。表达产物的N端和C端分别有一个由表达载体提供的His标签(6×His Tag)。其中，pET-umcel5B重组质粒的酶切电泳图谱如图6所示，图6中可以看到重组质粒经NcoI和XhoI双酶切后释放出一条5.3kb的载体带和一条与人工合成umcel5B基因经EcoRI和XhoI酶切后同样大小的1.556kb的片段。图6中，泳道1为1kb ladder(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb，2.5kb，2.0kb，1.5kb)；泳道2为重组质粒经NcoI和XhoI双酶切后结果。

2、umcel5B基因在E.coli Rosetta^TM(DE3)中的表达

把pET-umcel5B转化至E.coli Rosetta^TM(DE3)中得到含有pET-umcel5B的转化子Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5B，挑取Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5B单菌落于含质量百分比含量为0.5％羧甲基纤维素的LA培养基平板上(含氯霉素34μg/mL，卡那霉素25μg/ml，IPTG 1.0mmol/L)，同时用Rosetta^TM(DE3)/pET-30a(+)[转入pET-30a(+)的Rosetta^TM(DE3)]作为空白对照，37℃培养24小时。菌体经氯仿破壁后用质量百分浓度为0.5％刚果红溶液染色15分钟，用1mol/L的NaCl溶液脱色，然后观察菌落周围有无水解圈。

结果如图7所示，结果表明重组菌Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5B周围有水解圈，而空白对照Rosetta^TM(DE3)/pET-30a周围无水解圈，说明靶基因umcel5B在E.coliRosetta^TM(DE3)中已经高效表达出了有纤维素(羧甲基纤维素)降解活性的蛋白质产物。图7中右边的菌落为重组大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-umcel5B(能降解羧甲基纤维素)，左边的菌落为含有空载体的大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)/pET-30a(不能降解羧甲基纤维素)。

3、Umcel5B的表达和纯化

1)RosettaTM(DE3)/pET-umcel5B菌体发酵

接种RosettaTM(DE3)/pET-umcel5B到10ml含有34μg/ml氯霉素(CAM)与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃ 200rpm培养过夜。取5ml过夜培养物到100ml含有34μg/ml氯霉素(CAM)与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，在37℃培养200rpm培养至OD₆₀₀为0.6。加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养5个小时，5,000g离心收集菌体。共作2瓶样品，收集200ml的培养液的菌体。

2)Umcel5B的提取与纯化

在步骤1)收集获得的菌体中，按每克菌体重量加入5ml的裂解缓冲液(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole(咪唑)，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH8.0)，悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400w作用20次，每次作用时间10s，每次作用间隔12s。12,000g离心20分钟，收集上清得到Umcel5B粗酶液。取5ul用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。

Umcel5B的纯化使用Qiagen公司的The QIAexpressionist kit试剂盒(方法参照试剂盒说明书)。按每4ml上述获得的裂解上清液加入1ml质量百分比含量为50％的NI-NTA胶体，在4℃用200rpm摇60分钟，混合物灌注到The QIAexpressionistkit试剂盒附带的柱子。加4ml洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mMimidazole，1mM PMSF，pH8.0)到柱子里，缓慢搅拌，重复冲洗6次。加入0.5ml的洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，1mM PMSF，pH8.0)，收集流出物，重复洗脱8次。合并8管蛋白质，即为镍柱纯化后的Umcel5B，取5ul用SDS PAGE检测蛋白质的纯度。

选择Amersham biosiences的阴离子柱(Mono Q)在蛋白质纯化仪AKTA explorer来进一步纯化Umcel5B，选择的洗脱缓冲液是pH值为6.5的磷酸缓冲液(含1M的NaCl)，结果在盐浓度达到约0.3M的时候目的蛋白被洗脱下来，取3ul洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图8所示，表明Umcel5B经阴离子柱纯化后已达到SDS-PAGE单条纯。

为了检测纯化的Umcel5B是否还有内切葡聚糖酶活性，用活性胶染色法进行了检测，过程如下。首先Umcel5B在聚丙烯酰胺变性胶上进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，然后对电泳后在变性胶中已变性的Umcel5D进行复性处理。复性处理：把电泳后的变性胶浸入在50ml的复性缓冲液中(复性缓冲液的配制：Tris 3.025g，0.5M EDTA(pH 8.0)5ml，β-巯基乙醇0.173ml，加水至总体积500ml)，4℃下浸泡30分钟，更换复性缓冲液，重复三次，前两次在复性缓冲液中添加0.5ml的异丙醇。再用10mM pH7.0的磷酸钾缓冲液洗胶两次。把复性胶贴在含质量百分比含量为0.5％羧甲基纤维素的LA培养基平板上，用塑料袋包裹培养皿，在37℃中保温1小时。取出平板用质量百分比浓度为0.5％刚果红溶液染色15分钟，用1mol/L的NaCl溶液脱色。活性胶检测纯化的Umcel5B具有CMCase(内切葡聚糖酶)活性(附图8)，说明umcel5B是按正确的阅读框架表达的。图8中1为分子量标准(marker)；2为Umcel5B基因的表达的粗酶液；3为镍柱纯化后的Umcel5B；4为分子筛纯化的Umcel5B；5为Umcel5B的活性胶检测。

4、Umcel5B酶学特性的研究

内切葡聚糖酶的酶活测定采用DNS法，具体操作如下：

1)配制DNS试剂：称取10克NaOH用约400ml ddH₂O溶解，再称取10克二硝基水杨酸、2克苯酚、0.5克无水亚硫酸钠、200克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约300ml ddH₂O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。

2)葡萄糖标准曲线的绘制

取9只薄壁试管，按下表加入溶液

混匀后在沸水中反应5分钟，室温冷却，用酶标仪测A₅₃₀。

3)酶活测定

取10μl步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液(Umcel5B浓度为0.316mg/ml)，加入190μl pH值4.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，再加入300μl质量百分比含量为1％CMC(羧甲基纤维素)(溶剂为pH值相同的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液)溶液反应，在45℃温度下反应10分钟，待反应结束后加入1ml步骤1)制备的DNS试剂置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A₅₃₀。

酶活(IU)定义为：1U为每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量。

比活力的定义：每g蛋白质所含的酶活力(U/g)。

结果表明，Umcel5B对羧甲基纤维素的在最适pH值4.0最适温度45℃下比活力为42229U/g。

4)酶的最适pH值的测定

测定Umcel5B在37℃，pH范围为2.5～8.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中的酶活，梯度为0.5。具体方法为：分别取10μl步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液，分别加入190μl pH值为2.5～8.0(梯度为0.5)的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，再分别加入300μl质量百分含量为1％CMC(羧甲基纤维素)(溶剂为与之前相同pH值的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液)溶液，在37℃反应10分钟后，加入1ml步骤(1)制备的DNS试剂置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A₅₃₀。酶活(IU)定义为：1U为每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量。

在37℃的反应条件下，Umcel5B在pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力，结果如图9所示，结果表明Umcel5B的最适pH为4.0。

5)酶的最适温度的测定

在最适pH4.0条件下测定不同温度下(25℃～80℃)的Umcel5B酶活。具体方法为：分别取10μl步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液，加入190μl pH值为4.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，再加入300μl质量百分含量为1％CMC(羧甲基纤维素)(溶剂为pH值为4.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液)溶液，分别置于25℃～80℃(梯度为5℃)进行反应10分钟后，加入1ml步骤(1)制备的DNS试剂置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A₅₃₀。酶活(IU)定义为：1U为每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶量。在pH值为4.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中反应条件下，Umcel5B在45℃时比活力最高，以此为100％，换算各温度下的相对酶活力，结果如图10所示，结果表明Umcel5B的最适温度为45℃

6)酶的pH耐受性测定

将步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液保存于不同pH值(pH 2.5-10.0，梯度为0.5)的缓冲液中，于4℃放置24小时后在最适pH值4.0和最适温度45℃下测定酶活(方法同步骤3))。其对照(即100％的活力)是未处理的步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液在pH4.0，45℃下所测得的活力。结果如图11所示，结果表明Umcel5B在pH4.0～10.0之间保持24小时后仍具有80％以上的活力，这说明该酶具有较好的pH耐受性。

7)酶的温度耐受性测定

将步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液保存于最适pH值的缓冲液中，置于不同温度下(20℃～70℃，梯度为5℃)放置1小时后在该酶的最适pH值和最适温度下测定酶活(方法同步骤(3))。其对照(即100％的活力)是未处理的步骤3中的步骤(2)中获得的Umcel5B酶液在pH4.0，45℃下所测得的活力。结果如图12所示，结果表明50℃以下，Umcel5B都能保持80％以上的相对活力，说明该酶在相当大的温度范围内比较稳定。

序列表

<160>2

<210>1

<211>2297

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>

<400>1

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 60

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 120

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattctca 180

aaatctttag atatttattt gcctacttca caaataaatc gtaaatttgc agaagttttt 240

taagattact aacaaataat aatatcgctt atgaagaaaa ctctactttt gctgtgtgga 300

atgctggtgc ttggcactca tgctaaggca caagattttg agactgctac cgaagctgtc 360

aagaacatgg gcgtgggctg gaaccttggt aacacgctcg atgccagtag cggtagcaaa 420

cagggactgg aatcagagac atactgggga cagcctgtca caaagcccga actcatgaaa 480

atgatgaaag aggcagggtt cggagccata cgtgtgccag taacatggta taaccatatg 540

gacaccagtg gaacagtcga cgaggaatgg atgaagcgtg ttcacgaggt ggtggactat 600

gtcatcgatc agggaatgta ttgcatcgtg aatgtccatc atgacacagg tgacggcacg 660

caatggctgc atgccagtac agcgacctac gacaaagtca agtcaaagta cgaatatctg 720

tggaaacaga tagccaatga gtttaaggac tacgaccaga agttgctttt tgaatcctac 780

aacgaaatgc tggatgacga gaacaaatgg aacgagcctg ctactgacga cggctataag 840

gccattaaca attatgccaa gcttttcgtc aatacagtgc gtaaaacagg tggcaacaac 900

aagaatcgca acctggtagt caacacctat tcggccagta gcgccgctaa cgcgatgaaa 960

gcccttgaat tacctgaaga atctggtcac atcattttcc agctgcatag ctatcctgac 1020

tggcagaatg aaagtaatgc gaaaagtata gtcgataacc tgatcagtac cattaaaacg 1080

aatctgctga aaagggctcc agtcattatc ggtgaatatg ccacattcag gacttggcct 1140

acaaatctgg attattataa tgagaaccgc gaattagccc tttatgcgat ggactatttc 1200

atcaagaaga ccaaagaggc cggtatcggt accttctact ggatgggtct ctctgacgga 1260

atctatcgtt cagaaccagc cttcaatcag cctgacctgg ctgagacatt aaccaaagcc 1320

tatcatggca gcgcgttcga aggaaaatac cctgttcatg attcttcgaa gggtactgtt 1380

gcttttgaag gcgagaagac gttggaatgg ggagaaggcg tgttcgttcc atcctctatg 1440

ttgacagacg tgggagaaga tgtggaagta gaactgacct ataaactcga cttcaccgac 1500

tatgatgata ttcagttcat gtataataat ggtggatggc agaagatacc cagtggtctt 1560

tcaatggatg ggaaagcgtt cgacggtgcc gacttcagcg cttccagcgt atatggcatt 1620

caatcgggcg atacaaagac atcggtcttg actttcgatg cctcggctta tggatatgtt 1680

tctaaatatg agatggtgat ccaaggacac ggcgttatca tgaaaaaggt tactgtaaga 1740

gcaccttccg gtacgtcagc aattcccctt atcaaagcag attatccaga taataccatc 1800

atatacaacc tcaatggcca gcgtgtcgaa acgcctcgta agggaatcta tatccagaac 1860

ggcaaaaaat acatagcaca ataacggcta ctgacttctg aaaagaacgc ccccgactac 1920

ttatcacaag caatcggggg ctacaaaaaa cctttatatt tgaaaaacct tattatttat 1980

tcacctggaa cttagtgtca ccatccttga agaaggcgtt gatctgcttg gcggcagcaa 2040

taccggcatt gatattggcc tcggcagtct gagcacccat cttcttcgga gtcgagaagt 2100

aacggccact gaacttggcg aactcgtgat cggcatcagg catgatgtcg gtgacaaact 2160

tcagatcgtc acgctcctgc atcagctgaa tcagctcagc ctcgttgatc acttccttac 2220

gggctgtgtt cacgaggata ccacccttct tcatcttacc caccagcgca gcattgatgc 2280

tctgcttggt ctcaggc 2297

<210>2

<211>537

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>

<400>2

Met Lys Lys Thr Leu Leu Leu Leu Cys Gly Met Leu Val Leu Gly Thr

1 5 10 15

His Ala Lys Ala Gln Asp Phe Glu Thr Ala Thr Glu Ala Val Lys Asn

20 25 30

Met Gly Val Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Leu Asp Ala Ser Ser Gly

35 40 45

Ser Lys Gln Gly Leu Glu Ser Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Pro Val Thr

50 55 60

Lys Pro Glu Leu Met Lys Met Met Lys Glu Ala Gly Phe Gly Ala Ile

65 70 75 80

Arg Val Pro Val Thr Trp Tyr Asn His Met Asp Thr Ser Gly Thr Val

85 90 95

Asp Glu Glu Trp Met Lys Arg Val His Glu Val Val Asp Tyr Val Ile

100 105 110

Asp Gln Gly Met Tyr Cys Ile Val Asn Val His His Asp Thr Gly Asp

115 120 125

Gly Thr Gln Trp Leu His Ala Ser Thr Ala Thr Tyr Asp Lys Val Lys

130 135 140

Ser Lys Tyr Glu Tyr Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asn Glu Phe Lys Asp

145 150 155 160

Tyr Asp Gln Lys Leu Leu Phe Glu Ser Tyr Asn Glu Met Leu Asp Asp

165 170 175

Glu Asn Lys Trp Asn Glu Pro Ala Thr Asp Asp Gly Tyr Lys Ala Ile

180 185 190

Asn Asn Tyr Ala Lys Leu Phe Val Asn Thr Val Arg Lys Thr Gly Gly

195 200 205

Asn Asn Lys Asn Arg Asn Leu Val Val Asn Thr Tyr Ser Ala Ser Ser

210 215 220

Ala Ala Asn Ala Met Lys Ala Leu Glu Leu Pro Glu Glu Ser Gly His

225 230 235 240

Ile Ile Phe Gln Leu His Ser Tyr Pro Asp Trp Gln Asn Glu Ser Asn

245 250 255

Ala Lys Ser Ile Val Asp Asn Leu Ile Ser Thr Ile Lys Thr Asn Leu

260 265 270

Leu Lys Arg Ala Pro Val Ile Ile Gly Glu Tyr Ala Thr Phe Arg Thr

275 280 285

Trp Pro Thr Asn Leu Asp Tyr Tyr Asn Glu Asn Arg Glu Leu Ala Leu

290 295 300

Tyr Ala Met Asp Tyr Phe Ile Lys Lys Thr Lys Glu Ala Gly Ile Gly

305 310 315 320

Thr Phe Tyr Trp Met Gly Leu Ser Asp Gly Ile Tyr Arg Ser Glu Pro

325 330 335

Ala Phe Asn Gln Pro Asp Leu Ala Glu Thr Leu Thr Lys Ala Tyr His

340 345 350

Gly Ser Ala Phe Glu Gly Lys Tyr Pro Val His Asp Ser Ser Lys Gly

355 360 365

Thr Val Ala Phe Glu Gly Glu Lys Thr Leu Glu Trp Gly Glu Gly Val

370 375 380

Phe Val Pro Ser Ser Met Leu Thr Asp Val Gly Glu Asp Val Glu Val

385 390 395 400

Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Asp Asp Ile Gln Phe

405 410 415

Met Tyr Asn Asn Gly Gly Trp Gln Lys Ile Pro Ser Gly Leu Ser Met

420 425 430

Asp Gly Lys Ala Phe Asp Gly Ala Asp Phe Ser Ala Ser Ser Val Tyr

435 440 445

Gly Ile Gln Ser Gly Asp Thr Lys Thr Ser Val Leu Thr Phe Asp Ala

450 455 460

Ser Ala Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Tyr Glu Met Val Ile Gln Gly His

465 470 475 480

Gly Val Ile Met Lys Lys Val Thr Val Arg Ala Pro Ser Gly Thr Ser

485 490 495

Ala Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Tyr Pro Asp Asn Thr Ile Ile Tyr

500 505 510

Asn Leu Asn Gly Gln Arg Val Glu Thr Pro Arg Lys Gly Ile Tyr Ile

515 520 525

Gln Asn Gly Lys Lys Tyr Ile Ala Gln

530 535

Claims

1.一种内切葡聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

2.根据权利要求1所述的内切葡聚糖酶，其特征在于：所述内切葡聚糖酶具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。

3.权利要求1或2所述的内切葡聚糖酶的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述内切葡聚糖酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中SEQ ID №：1的5′端第326-1881位核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

5.含有权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因的重组表达载体。

6.含有权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因的宿主菌。

8.权利要求1或2所述的内切葡聚糖酶在纤维素降解中的应用。

9.权利要求3或4所述的内切葡聚糖酶编码基因在纤维素降解中的应用。