CN102146363A

CN102146363A - 一种新的葡聚糖酶，其编码基因及应用

Info

Publication number: CN102146363A
Application number: CN2010101079525A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 耿阿蕾; 王钱福; 严兴; 程林
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CN102146363B

Abstract

本发明涉及一种新的葡聚糖酶(或称为纤维素酶)，其编码基因及应用。本发明还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及利用所述葡聚糖酶形成简单糖的方法。本发明的葡聚糖酶的酶活性高，对温度和盐具有较宽的耐受性，可良好地应用于工业生产。

Description

一种新的葡聚糖酶,其编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的葡聚糖酶，其编码基因及应用。

背景技术

纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，包括三类酶即内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.2.21)，这三种酶协同作用能将纤维素转化为葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的末端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖(Tomme P.等，Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi，Adv.Microbiol.Physiol.，37：1-81，1995；Bhat M.K.，Bhat S.1997.Cellulosedegrading enzymes and their potential industrial applications，BiotechnologyAdvances，15：583-620)。

木质纤维素类生物质是地球上含量最丰富的可再生资源，随着化石原料的不断枯竭以及工业原料与粮食(包括饲料)争地矛盾的凸现，新一代工业生物技术将逐步以木质纤维素类生物质代替淀粉、糖类等粮食类生物质和化石原料，因此，与木质纤维素利用和炼制密切相关的纤维素酶受到普遍关注(Sung K.Lee.等，Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production：from bugs tosynthetic biology to fuels，Current Opinion in Biotechnology 2008，19：556-563)。纤维素酶是代替化石原料、改造传统行业和发展生物质产品的关键，将成为新一代工业生物技术领域最重要的酶制剂之一(Bhat M.K.，Cellulases and relatedenzymes in biotechnology，Biotechnology Advances，18：355-383)。纤维素酶制剂已经广泛应用于棉纺工程、废纸回收业、食品、饲料、和洗涤剂等重要工业领域，是目前第三大工业用酶，预期在不久全面开发其在发酵生产乙醇等生物燃料方面的应用，纤维素酶将变成全球第一大工业用酶(David B.W.，Cellulasesand biofuels，2009，Current Opinion in Biotechnology，20：295-299)。而对纤维素酶在生产生物燃料应用方面的研究也是各国生物技术领域研究的热点，其对关键技术的解决更是全球生物技术领域知识产权争夺的重要制高点。

由于纤维素酶有着广泛的用途，针对不同的用途需要使用不同性质的纤维素酶，而且大部分已知纤维素酶的效率低、价格高，从而使以纤维素为原料生产生物燃料成本太高，无法真正实现产业化。因此，对纤维素酶生产技术的研究，包括纤维素酶新基因的发现、产酶菌株的选育和遗传改造以及发酵工艺条件的优化等方面的研究一直以来受到普遍关注。目前已知的纤维素酶基因大部分都是从纯培养的微生物中分离出来的，但自然界中绝大多数微生物是无法被分离、培养的，可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1％(Amann R.I.等，1995，Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbialcells without cultivation.Microbiol.Rev.，59：143-169)，而剩余99％的不可培养微生物中必然蕴藏着大量的微生物基因资源。近年来，国际上元基因组学(Metagenomics)技术研究的兴起，通过直接从环境中抽提微生物核酸并构建元基因组文库(BAC，Fosmid或者质粒文库)，可以获得群落中所有种群的遗传信息，这些遗传信息就包括了群落中所欲参与生物转化的基因，这些基因编码的酶在克隆宿主中的表达可以用于各种与生物转化相关的酶的筛选，从而有可能获得大量新的基因。目前已经从各种不同环境中克隆到未培养微生物的纤维素酶基因，如Healy等(Healy F.G.等，1995，Direct isolation of functional genesencoding cellulases from the microbial con sortie in a thermophilic，anaerobicdigester maintained on lignocelluloses.Appl Microbiol Biotechnol，43：667-674.)报道从厌氧高温木头堆里克隆到了一个内切葡聚糖酶基因(celA)；Rees等(Ress H.C.等，2003，Detecting cellulose and esterase enzyme activities encoded by novelgenes present in environmental DNA libraries.Extremophiles.7(5)：415-421)从盐湖和火山口湖床沉淀物未培养微生物中克隆到2个纤维素酶基因，Voget等(Voget S.等，2003，Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome.ApplEnviron Microbiol，69(10)：6235-6242；Voget S.，Steele H.L.and Streit W.R.，2006，Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulose.J.Biotechnol.126：26-36)从土壤未培养微生物中克隆到3个纤维素酶基因gnuB和uvs080和celA，Ferrer等(Ferrer M.等，2005，Novel hydrolase diversity retrievedfrom a metagenomic library of bovine rumen microflora.Environ Microbilo.7：1996-2010)从牛瘤胃未培养微生物中鉴定了9个内切葡聚糖酶基因，Feng等(Feng Y.等，2007，Cloning and identification of novel cellulose genes fromuncultured microorganisms in rabbit cecum and characterization of the expressedcellulose.Appl.Microbiol.Biotechnol，75：319-328)从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了4个内切葡聚糖酶基因和7个β-葡萄糖苷酶基因。这些来源于元基因组的纤维素酶基因，跟已知蛋白的序列同源性都比较低，很多都是纤维素酶新基因。来源于元基因组的内切葡聚糖酶活性都不高，其中广西大学冯家勋等通过元基因组技术分离到的内切葡聚糖酶umcel5D的CMC活性最高为42U/mg(专利号：CN200810056691.1)，umcel9B的CMC活性仅为5.6U/mg(HaoPang等，2009，Identification of Cellulase Genes from the Metagenomes ofCompost Soils and Functional Characterization of One Novel Endoglucanase，CurrMicrobiol，58：404-408)，Voget从土壤未培养微生物分离到的内切酶cel5A的CMC活性为68U/mg，韩国学者Kim从元基因组分离到的CelM2是目前已知从元基因组到的活性最高内切酶，其CMC活性为105U/mg(Soo-Jin Kim1等，2008，Characterization ofa gene encoding cellulase fromunculturedsoil bacteria，FEMS Microbiol Lett 282：44-51)。

鉴于现有技术中大部分纤维素酶的活力都较低，有必要进一步筛选出新的、酶活性高的葡聚糖酶，以用于工业生产，提高生产效率。

发明内容

本发明的目的在于提供新的、酶活性高的葡聚糖酶。本发明还提供了其编码基因，以及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了表达和纯化该酶的方法。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个优选例中，所述的多肽来源于厌氧沼液发酵系统。

在另一优选例中，所述的多肽是如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(i)如SEQ ID NO：1中155-1420位的序列；

(ii)如SEQ ID NO：1的序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种多肽的制备方法，该方法包含：

(a)培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于水解底物，从而形成简单糖，所述的底物包括(但不限于)：葡聚糖(如纤维素，糖苷)。或者，所述多肽用于制备形成简单糖的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种形成简单糖的方法，该方法包含：用所述的多肽处理待水解的底物，所述的底物包括(但不限于)：葡聚糖(如纤维素，糖苷)。

在另一优选例中，在pH5-9条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在pH7.5±1.5，更佳地pH7.5±0.5条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在温度40-70℃条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在温度50-65℃，更佳地55-62℃条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为能降解羧甲基纤维素的文库克隆质粒EX002C10的BamHI酶切带型。其中，泳道1为marker(片段由上到下依次是23kb、9.4kb、6.5kb、4.3kb、2.3kb、2.0kb)的电泳结果，泳道2为EX002C10的BamH I酶切产物的电泳结果。

图2为表达质粒pET22b-exo2b经双酶切后的电泳图。图中泳道1为载体pET 22r-exo2b的电泳结果，2为marker(片段由上到下依次是23kb、9.4kb、6.5kb、4.3kb、2.3kb、2.0kb)，3为重组质粒pET 22r-exo2b Nde I酶切产物的电泳结果，4为重组质粒pET 22r-exo2b经Sac I和Kpn I双酶切产物的电泳结果，5为DL2000marker的电泳结果(片段由上到下依次是2.0kb、1.0kb、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图3为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-exo2b对于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和4-MUC(4-甲基伞型葡萄糖苷；4-methylumbelliferyl cellobioside)的降解检测。其中，A图中左半区为对CMC-Na的水解结果，右半区为负对照；B图中4、5、6区为对4-MUC水解后紫外照射产生荧光，空区为负对照。

图4为exo2b基因的表达、表达产物的纯化SDS-PAGE图。其中，泳道1为原液的电泳结果，泳道2为含250mM咪唑缓冲液的洗脱液的电泳结果，泳道3为500mM咪唑缓冲液的洗脱液的电泳结果，泳道4为蛋白Marker的电泳结果(分子量由上到下依次为97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3Kd)。

图5为Exo2b在不同pH条件下的酶活力曲线。其中，▲表示NaAc缓冲液中酶活力，□表示NaH₂PO₄缓冲液中酶活力，◇表示CAPSO缓冲液中酶活力。

图6为Exo2b在不同温度条件下的酶活力曲线。

图7为Exo2b的温度耐受性检测结果。

图8为Exo2b对3M NaCl高盐的耐受性。

具体实施方式

本发明人经过大规模的筛选，首次从厌氧发酵系统中分离得到一种新的葡聚糖酶(或称为纤维素酶)，其酶活性高，对温度和盐具有较宽的耐受性，可良好地应用于工业生产。所述的葡聚糖酶的氨基酸序列与已知氨基酸序列的相似性最高的为48％，证明其是一种新的蛋白。本发明的葡聚糖酶具有很高的酶活性(达260U/mg)。

在本发明中，术语“Exo2b蛋白”、“Exo2b多肽”或“葡聚糖酶Exo2b”可互换使用，都指具有葡聚糖酶Exo2b氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的葡聚糖酶Exo2b。

本发明的多肽可作用于葡聚糖长链分子的内部，将长链切成短链(较佳地，随机切割链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端)。本发明的多肽也可作用于葡聚糖长链分子的末端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖。本发明的多肽也可切割纤维二糖生成葡萄糖。

如本文所用，所述的“简单糖”广义地指葡聚糖链(或多糖链)被切割后形成的一类糖的总称，其链长度低于被切割前。例如，所述的简单糖含有1-50个葡萄糖，较佳的，含有1-30个葡萄糖；更佳的，含有1-15个葡萄糖。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的Exo2b蛋白或多肽”是指Exo2b多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Exo2b蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。Exo2b多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括Exo2b蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Exo2b蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“Exo2b多肽”指具有Exo2b蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与Exo2b蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Exo2b蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Exo2b DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Exo2b多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Exo2b多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Exo2b多肽的可溶性片段。通常，该片段具有Exo2b多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供Exo2b蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Exo2b多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“Exo2b蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser

Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的Exo2b蛋白的氨基端(或羧基端)还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述Exo2b的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Exo2b蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的Exo2b核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Exo2b蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Exo2b多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码Exo2b多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Exo2b多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Exo2b编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的Exo2b的用途包括(但不限于)：水解葡聚糖，将葡聚糖长链切割为短链，或形成单个糖。大部分已知葡聚糖酶的活力都低于本发明的Exo2b的酶活力，预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高Exo2b的酶活力，因此其应用前景良好。

用表达的重组Exo2b蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Exo2b蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对Exo2b DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Exo2b基因产物或片段。较佳地，指那些能与Exo2b基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Exo2b蛋白的分子，也包括那些并不影响Exo2b蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Exo2b基因产物结合的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Exo2b基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Exo2b蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。抗Exo2b蛋白的抗体可用于检测样本中的Exo2b蛋白。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Exo2b蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的Exo2b多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从厌氧发酵系统构建的Fosmid文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1420个碱基，其开放读框位于第155-1420位，编码全长为421个氨基酸的Exo2b蛋白(SEQ ID NO：2)，自该序列的氨基端的第75-395位氨基酸为糖水解酶第五家族(glycosyl hydrolase family 5)保守功能域。所述的Exo2b蛋白具有很高的水解葡聚糖(如纤维素)的活性，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、沼气发酵系统Fosmid元基因组文库的构建

取8mL沼液(取自以秸杆和猪粪为原料进行40℃厌氧发酵的沼气池)，8000g离心5min后，取沉淀并用20mL PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH₂PO₄，8.1mM Na₂HPO₄，pH 7.4)洗3次。沉淀用7.68mL DNA抽提缓冲液重悬(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM EDTA，100mM Na₃PO₄，1.5M NaCl，1％(w/v)CTAB)。加入蛋白酶K(终浓度1mg/mL)和SDS(终浓度1％(w/v))后在55℃孵育20min，然后再在70℃孵育10min。粗裂解液于17,000g离心10min后，收集上清。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提上清两次后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提上清一次。用0.6倍体积的异丙醇在5,400g离心5min沉淀DNA，用200μL TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)溶解DNA沉淀。使用Epicentre公司的DNA End-Repair Kit试剂盒对5μg元基因组DNA进行补平和磷酸化，操作按照试剂盒说明书进行。将经过补平和磷酸化的基因组DNA样品，进行脉冲场凝胶电泳(缓冲液0.5×TBE，电压6V/cm，电泳时间18h，转换时间7s，转角120度，温度14℃)。

前述获得的DNA样品电泳后，将36-48kb左右的胶条割下，用电洗脱的方法回收DNA，并对回收DNA进行浓缩到约50ng/μL。使用Epicentre公司的Fast-link试剂盒将元基因组DNA片段与Fosmid载体pCC2FOS(购自Epicentre公司)连接，操作按照试剂盒说明书进行。再用Epicentre公司的MaxplaxLambda试剂盒进行文库的包装，操作按照试剂盒说明书进行。

将一定稀释度的包装颗粒10μL与200μL感受态细胞(大肠杆菌EPI300，购自Epicentre公司)混合，37℃放置20min，加入900μL的含有10mM MgSO₄的LB液体培养基(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母膏，1％(w/v)NaCl，pH 7.0)，37℃培养40min后涂布在含有12.5μg/mL氯霉素的LB平板(1％(w/v)蛋白胨，0.5％酵母膏(w/v)，1％NaCl(w/v)，1.8％(w/v)琼脂粉，pH 7.0)上，并在37℃过夜培养。挑取克隆到含有12.5μg/mL氯霉素的LB液体冻存培养基(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母膏，1％(w/v)NaCl，6.5％(v/v)甘油，pH 7.0)的384孔板中。建立的Fosmid文库克隆数目为10万个，分281块384孔板，冻存于-70℃深低温冰箱。

实施例2、含有生物质转化相关的酶的基因的阳性克隆的筛选

用384孔板接种针将Fosmid克隆从384孔板复制到含0.5％(w/v)羧甲基纤维素纳(CMC-Na)的LB平板上(含有12.5μg/mL氯霉素)。37℃培养20小时后用刚果红进行染色。倒入0.2％(w/v)的刚果红染液染色30分钟后，用氯化钠溶液(1mol/L)清洗至少两次。在菌落边上出现明显黄色水解圈的即为所需的内切葡聚糖酶阳性克隆。从保存的281块384孔板中，选取其中一块(编号BF009)按照上述方法筛选内切葡聚糖酶，筛选到2个有黄色水解圈的内切葡聚糖酶阳性克隆。用该方法从含有10万克隆的Fosmid文库中筛选到341个阳性克隆。

实施例3.葡聚糖酶Exo2b及其编码基因的分离

利用以上元基因组技术从沼液系统中筛选到葡聚糖酶阳性克隆EX002C10，进一步提取该克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全酶切后，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，EX002C10除了含有8.1kb的载体片段外，还有另外7条BamHI酶切片段。

选取上述Fosmid阳性克隆进行454高通量测序技术进行测序，序列拼接后可以获得完整的Fosmid基因序列。通过测序结果，对序列进行分析，得到葡聚糖酶的编码基因，该基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，命名为exo2b。自SEQ ID NO：1的5’端第155至1420位核苷酸为exo2b的开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)，自SEQ ID NO：1的5’端的第155-157位核苷酸为exo2b基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO：1的5’端的第1418至1420位核苷酸为exo2b基因的终止密码子TAG。

葡聚糖酶基因exo2b编码一个含有421个氨基酸的蛋白质Exo2b，具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为47.7Kd，等电点pI为4.76。自SEQ ID NO：2的氨基端的第75至395位氨基酸为糖基水解酶第五家族的保守功能域。Exo2b同已知序列的葡聚糖酶的同源性最高仅为48％，表明该葡聚糖酶为新酶。

此外，还分离到另一新的内切酶(其表达蛋白名称：D10)，其与已知序列最高同源性为47％(Fosmid编号：CMC01D10)。

实施例4.exo2b在大肠杆菌中的表达

1.表达质粒的构建

以pET 41b(购自Invitrogen公司)为模板，将pET22b(购自Invitrogen公司)的Nde I/Xho I(60bp)片段插入到pET 41b Nde I/Xho I中，构建的质粒命名为pET22r。pET 22r含有N端pelB信号肽，能够使表达蛋白分泌到周质空间，便于表达产物的筛选；同时，pET 22r含有C端His-tag标签，便于蛋白纯化；该质粒为卡那霉素抗性，其多克隆位点与pET 41b相同。

以exo2bf(SEQ ID NO：3)和exo2br(SEQ ID NO：4)为引物，从上述筛选到的Fosmid阳性克隆中PCR扩增预测到的葡聚糖酶ORF编码基因，扩增引物两端带有酶切位点Ecor V/Sal I。PCR产物胶回收后克隆到pMD 18-T(购自Invitrogen)载体，酶切验证后送样测序，测序结果正确后，再将该产物克隆到上述构建的载体pET 22r的酶切位点Ecor V/Sal I中，得到重组表达载体pET22r-exo2b，并酶切验证，酶切图谱如图2所示。图中，重组质粒经NdeI酶切后得到一条1.2kb的片段和5.1kb的载体片段，经SacI和KpnI双酶切后，得到一条376bp的小片段和5.9kb的载体片段。

2.exo2b基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

将上述构建好的质粒pET 22r-exo2b电转入大肠杆菌BL21(DE3)中，将得到的BL21(DE3)/pET22r-exo2b转化子挑取单克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养液中，提取质粒酶切验证；并挑取单克隆于含质量百分比含量为0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的LB培养平板上(含卡那霉素素，并用适量IPTG诱导)。同时将空质粒pET 22r转入大肠杆菌作为空白对照(负对照)，37℃过夜培养。倒入0.2％的刚果红染液至所有菌落被覆盖，用枪头吹起菌落，染色30分钟后用1mol/L的氯化钠清洗，至少两次，然后观察菌落周围有无水解圈。同时，配制LB平板，接菌培养过夜，至有显著菌落长起(一般14小时左右)后，每个平板加入约5ml上层培养基(0.7％琼脂，加0.04％4-MUC的琼脂糖溶液)，37℃培养箱放置1小时，紫外灯下观察并拍照。

结果如图3(A)所示，含重组质粒的BL21(DE3)菌落周围有水解圈，说明目的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中已经高效表达出了具有羧甲基纤维素降解活性的葡聚糖内切酶；如图3(B)所示，含重组质粒的BL21(DE3)菌落周围有水解4-MUC(4-甲基伞型葡萄糖苷)后在紫外照射下产生的荧光，而含空质粒pET 22r的菌落周围没有水解圈或荧光出现。

3.exo2b的较大规模表达和纯化

1)exo2b的表达

接种E.coli BL21(DE3)/pET22r-exo2b于5ml含有25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37℃200rpm培养过夜。取5ml培养液到500ml LB培养液中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.7-0.9。冷水冷却后加入50μM IPTG，于25℃120rpm继续培养16个小时，离心收集菌体。同时做不诱导和空质粒的对照。

2)重组Exo2b蛋白的提取纯化

采用低渗法提取重组Exo2b蛋白，将上述收集的菌体，按每克菌体加入800ml缓冲液(30mM Tris·Cl，20％蔗糖，pH 8.0)中重悬菌体，然后逐滴加入500mM EDTA至终浓度为1mM，在冰上放置5到10分钟。4℃下，8000rpm离心20分钟收集菌体，将细胞重悬在相同体积预冷的5mM MgSO₄，冰浴振荡10分钟，同上离心，收集上清液。

在上述低渗液中直接加入200mM pH 7.4NaH₂PO₄(10×)过1ml镍柱(GE公司)，事先用5-10个柱体积的结合缓冲液(20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，40mM咪唑，pH7.4)平衡柱子。上好样后再用5个柱体积的上述结合缓冲液洗涤柱子，用含250mM咪唑的缓冲液洗脱，此时得到大量目的蛋白，但纯度不够，再用含500mM咪唑的缓冲液洗涤，洗脱用10Kd截留的超滤管浓缩，同时用20mM pH7.4NaH₂PO₄的置换缓冲液，以去除咪唑。用5μl浓缩蛋白上样进行蛋白电泳后可以看到单条带，说明此时已经得到高纯度的目的蛋白，纯化蛋白SDS-PAGE电泳图谱如图4所示。

实施例5.重组Exo2b蛋白酶学性质的分析

1.酶活测定

所述的葡聚糖酶的酶活测定采用DNS法，具体操作如下：

1)DNS配制

称取10克NaOH，溶解于大约400ml ddH₂O中，再称取10g二硝基水杨酸、2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠、200g四水酒石酸钾钠，将其溶解于大约300ml ddH₂O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。

2)标准曲线制备

取9支薄壁试管，按表3加入溶液。

表3

标样编号	1	2	3	4	5	6	7	8
									葡萄糖总量(μg)	0	12	16	20	24	28	32	36
葡萄糖母液体积(μl)	0	60	80	100	120	140	160	180
									补充纯水(μl)	200	140	120	100	80	60	40	20

葡萄糖母液浓度为0.2g/L。表2中每份标样加DNS 200μl，沸水浴5min显色，酶标仪测530nm光吸收，标样1为空白对照。各样品值减空白后制备标线。

3)标准酶活测定

取100μl 2％羧甲基纤维素(CMC)和50μl ddH₂O于58℃预热5分钟，然后加入用含60mM半胱氨酸的50mM pH7.5Na₂HPO₄缓冲液稀释至一定稀释度的酶液58℃反应10分钟，再加入200μl DNS终止反应(对照为在上述反应体系中先加入200μl DNS后再加酶液)，沸水浴中反应5分钟显色，用酶标仪测530nm光吸收值，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位U。

酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化水解羧甲基纤维素产生1μmol还原糖所需的酶量。

比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

结果表明，Exo2b对羧甲基纤维素在pH7.5，58℃下的比活力为260U/mg。

对于获得的另一内切酶D10，采取同样的方法进行重组表达和活性鉴定。经鉴定，表达后羧甲基纤维素酶活性仅为1U/mg。

2.Exo2b最适pH测定

pH范围为4-10，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的10×缓冲液配制为：500mM NaAc用5M HCl调pH至pH 4.0，pH 4.5，pH 5.0，pH 5.5；500mMNaH₂PO₄用10M NaOH调pH至pH 6.0，pH 6.5，pH 7.0，pH 7.5，pH 8.0；500mMCAPSO酸用10M NaOH调pH至pH 8.5，pH 9.0，pH 9.5，pH 10.0。各取50μl含指定pH缓冲液的酶液，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在58℃反应条件下，Exo2b在pH7.5的NaH₂PO₄缓冲液中的比活力最高，以此为100％，换算各pH值下的相对酶活力。

结果如图5所示，表明Exo2b的最适pH为7.5。

3.Exo2b最适温度测定

在最适pH7.5条件下，测定在不同温度条件下的酶活力。取50μl一定倍数的酶液，于最适pH7.5下，选温度范围为20-70℃下，按如前所述标准酶活测定方法步骤测定。在pH7.5的50mM Na₂HPO₄缓冲液条件下，Exo2b在58℃下的比活力最高，以此为100％，换算各温度下的相对酶活力。

结果如图6所示，表明Exo2b的最适温度为58℃。

4.Exo2b温度耐受性测定

将Exo2b酶液保存于最适pH缓冲液中，在不同温度(45-70℃)保持一定时间后，在上述最适pH值和最适温度酶活力测定条件下测定酶活力(缓冲液含60mM的半胱氨酸)。其对照是未热处理的酶液在pH7.5，58℃下所测定的活力，以此为100％。

结果如图7所示，表明Exo2b在60℃下保持15小时候仍然保持100％活力，在70℃下放置1小时后仍能保持50％以上酶活力，说明Exo2b有较宽的温度耐受性。

5.Exo2b对高盐的耐受性

将Exo2b置于终浓度3M NaCl中，于4℃存放，其对3M NaCl的高盐耐受情况见图8，放置20小时后，其残余酶活仍在60％以上，并且活力的损失主要在起始40min内发生(损失了23％的活力)，而后则逐渐适应高盐环境，趋于稳定。

6.外切葡聚糖酶活力的测定

经验证，Exo2b还具有外切微晶纤维素，硝基苯纤维二糖苷(p-Nitrophenylcellobioside，pNPC)的活性。

7.纤维二糖酶活力(β-葡萄糖苷酶活性)的测定

Exo2b还具有β-葡萄糖苷酶活性，可水解纤维二糖，对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)。

此外，Exo2b还具有磷酸肿胀纤维素(phosphoric acid swollen cellulose，PASC)和大麦葡聚糖(barley β-glucan)降解活性。

实施例6.重组Exo2b蛋白变异体的活性分析

用一编码序列替换表达载体pET 22r-exo2b中的Exo2b编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第320位为Leu(Exo2b野生型蛋白中为Ile)。同前述实施例4方法将该载体转化E.coli BL21(DE3)，进行表达和纯化，获得纯化的重组Exo2b蛋白变异体M1。

用一编码序列替换表达载体pET 22r-exo2b中的Exo2b编码区，所述编码序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2类似的序列，不同处仅在于第11位为Val(Exo2b野生型蛋白中为Ala)。同前述实施例4方法将该载体转化E.coli BL21(DE3)，进行表达和纯化，获得纯化的重组Exo2b蛋白变异体M2。

将上述获得的纯化的重组Exo2b蛋白变异体M1和M2如实施例5进行酶活测定，结果发现，它们的水解羧甲基纤维素的酶活力与Exo2b野生型蛋白基本相同。

综上，本发明人通过构建厌氧沼液发酵系统未培养微生物的元基因组DNA文库和文库克隆的葡聚糖酶活性平板检测筛选法，得到新的葡聚糖酶基因，该葡聚糖酶基因可在宿主细胞中大量表达，用于葡聚糖的降解。实验证明本发明的葡聚糖酶具有很好的羧甲基纤维素酶活性(达260U/mg)，还具有外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性，而且该酶适宜的pH值范围和温度范围非常广。本发明所提供葡聚糖酶及其编码基因可广泛应用于纤维素的降解。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种新的葡聚糖酶，其编码基因及应用

<130>100613

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1420

<212>DNA

<213>anaerobic bacteria

<400>1

agagactact tagggataaa gaaagataat gggaggcaag gggcagtagc aaagaaactg 60

ctttagataa aacataaaaa aacaggggga atgaaaattg atagctaata agaaaagatt 120

gttaattggg ctaatactag tcctagccct agtcatgagc atgtttgcag gatgctctag 180

ggatgctgat aaggctacgg ctacacctac agctgagccg agtgagagtc cagatgtaac 240

aaaggaaccc gaagaaactc aggaaccagt agaaagcaag agcccagagc caaaggatga 300

tccaaagacc agtgaaatca aaatacctga cctttccata gaggcatttg atattccaga 360

tacagatagc caggcctttg ttaacaatat gaagcttggt tggaacctag gcaatacctt 420

tgatgcccat gactgtacct ggctttccaa caagttggat tatgagaagg gctggtcagg 480

gataaagact actgaagaga tgatccaggc agtaaaggat gccggcttta acactgtacg 540

tataccagta tcctggcata accatgtctc aggcgatgac cacaccatag accaggcctg 600

gctagacagg gtccaggagg tagtagacta tgctatagac aatggccttt atgccattat 660

caatatacat cacgatatgg gtgaggactt tatttatcca agtagccaat acatggacca 720

gtcctcccat tatgtaaggc gtatttggac ccagctagct gaaagattta aggattatga 780

cgaacaccta atatttgaat ccttaaatga gccccggatg gtaggcagta agtatgagtg 840

gtggctagat tcaaatgatg agagctgcaa ggatgcagta gctagcatca acaagcttaa 900

ccaaatattt gtcgatactg taagggccag tggtgctaat aataagagcc gctatcttat 960

ggtaccaggc tacgcagcct cagtggaagg agcacttaat aagggctttg agcttcccaa 1020

ggatagggta gaggatagac taatcctttc catacatgcc tatacccctt acaattttgc 1080

cttagaggct ggaggggtta gtagctttga cattaataag tccagcagtg tcagggagat 1140

agaccagttt atgacccagc tgcacgagaa atttgtttcc caggcagtcc cagttgtaat 1200

aggtgagttt ggtgctagga ataaaaagaa caaccttcag gacagggtgg atttctctgc 1260

atattacgtg gcatcagcca gggccagggg catgacctgc atatggtggg acaaccatgc 1320

ctttactgga gacggtgagc tctttggtat cctagacagg tccaaatcaa gctggaagta 1380

cccagagatt gtagaggcta tgttaaaata cgctgactag 1420

<210>2

<211>421

<212>PRT

<213>anaerobic bacteria

<400>2

Met Ser Met Phe Ala Gly Cys Ser Arg Asp Ala Asp Lys Ala Thr Ala

1 5 10 15

Thr Pro Thr Ala Glu Pro Ser Glu Ser Pro Asp Val Thr Lys Glu Pro

20 25 30

Glu Glu Thr Gln Glu Pro Val Glu Ser Lys Ser Pro Glu Pro Lys Asp

35 40 45

Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Lys Ile Pro Asp Leu Ser Ile Glu Ala

50 55 60

Phe Asp Ile Pro Asp Thr Asp Ser Gln Ala Phe Val Asn Asn Met Lys

65 70 75 80

Leu Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Phe Asp Ala His Asp Cys Thr Trp

85 90 95

Leu Ser Asn Lys Leu Asp Tyr Glu Lys Gly Trp Ser Gly Ile Lys Thr

100 105 110

Thr Glu Glu Met Ile Gln Ala Val Lys Asp Ala Gly Phe Asn Thr Val

115 120 125

Arg Ile Pro Val Ser Trp His Asn His Val Ser Gly Asp Asp His Thr

130 135 140

Ile Asp Gln Ala Trp Leu Asp Arg Val Gln Glu Val Val Asp Tyr Ala

145 150 155 160

Ile Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Ile Ile Asn Ile His His Asp Met Gly

165 170 175

Glu Asp Phe Ile Tyr Pro Ser Ser Gln Tyr Met Asp Gln Ser Ser His

180 185 190

Tyr Val Arg Arg Ile Trp Thr Gln Leu Ala Glu Arg Phe Lys Asp Tyr

195 200 205

Asp Glu His Leu Ile Phe Glu Ser Leu Asn Glu Pro Arg Met Val Gly

210 215 220

Ser Lys Tyr Glu Trp Trp Leu Asp Ser Asn Asp Glu Ser Cys Lys Asp

225 230 235 240

Ala Val Ala Ser Ile Asn Lys Leu Asn Gln Ile Phe Val Asp Thr Val

245 250 255

Arg Ala Ser Gly Ala Asn Asn Lys Ser Arg Tyr Leu Met Val Pro Gly

260 265 270

Tyr Ala Ala Ser Val Glu Gly Ala Leu Asn Lys Gly Phe Glu Leu Pro

275 280 285

Lys Asp Arg Val Glu Asp Arg Leu Ile Leu Ser Ile His Ala Tyr Thr

290 295 300

Pro Tyr Asn Phe Ala Leu Glu Ala Gly Gly Val Ser Ser Phe Asp Ile

305 310 315 320

Asn Lys Ser Ser Ser Val Arg Glu Ile Asp Gln Phe Met Thr Gln Leu

325 330 335

His Glu Lys Phe Val Ser Gln Ala Val Pro Val Val Ile Gly Glu Phe

340 345 350

Gly Ala Arg Asn Lys Lys Asn Asn Leu Gln Asp Arg Val Asp Phe Ser

355 360 365

Ala Tyr Tyr Val Ala Ser Ala Arg Ala Arg Gly Met Thr Cys Ile Trp

370 375 380

Trp Asp Asn His Ala Phe Thr Gly Asp Gly Glu Leu Phe Gly Ile Leu

385 390 395 400

Asp Arg Ser Lys Ser Ser Trp Lys Tyr Pro Glu Ile Val Glu Ala Met

405 410 415

Leu Lys Tyr Ala Asp

420

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

atagatatcg gatgctctag ggatgct 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

atagtcgacg tcagcgtatt ttaacat 27

<210>5

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>5

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210>6

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>6

His His His His His His

1 5

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>7

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>8

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>9

Trp Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是如SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(i)如SEQ ID NO：1中155-1420位的序列；

(ii)如SEQ ID NO：1的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

9.权利要求1所述的多肽的用途，用于形成简单糖。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的多肽用于水解底物，从而形成简单糖，所述的底物包括：葡聚糖。

11.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

12.一种形成简单糖的方法，其特征在于该方法包含：用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物，所述的底物包括：葡聚糖。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在pH5-9条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在温度40-70℃条件下，用权利要求1所述的多肽处理待水解的底物。