CN101210237B - 动物内源性的内切-β-1,4-葡聚糖酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的来自福寿螺的内切-β-1，4-葡聚糖酶、编码该酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法。本发明还公开了含该内切-β-1，4-葡聚糖酶的载体和宿主细胞，及其在生产简单糖和葡萄糖方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。更具体地，本发明涉及一种新的内切-β-1，4-葡聚糖酶、编码该酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法。本发明还涉及含该内切-β-1，4-葡聚糖酶的载体和宿主细胞及其在生产简单糖和葡萄糖方面的用途。
背景技术
自上世纪七十年代能源危机以来，国际油价屡创新高，人们逐渐开始寻找新的可再生燃料来代替石油，燃料乙醇被视为最有可能替代汽油的可再生能源之一，而其中纤维乙醇燃料的应用前景被广泛看好。
纤维素是自然界最丰富的可再生的能源。将未经任何化学处理的纤维素生物转化成简单糖或葡萄糖，作为发酵碳源生产酒精，是最理想和有效利用天然纤维素资源的方法之一。
通常认为，生物转化纤维素生成葡萄糖至少需要三种不同的酶的协同作用：(1)葡聚糖内切酶(Endo-1，4-β-D-glucanase，E.C.3.2.1.4，也称之为纤维素内切酶)。它作用于纤维素的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键生成带非还原端的较短的寡聚糖，(2)葡聚糖外切酶(Exo-1，4-β-D-glucanase，E.C.3.2.1.91)，它作用于纤维素分子的非还原末端水解β-1，4-糖苷键产生纤维二糖，(3)β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，E.C.3.2.1.21)，它将纤维二糖水解为葡萄糖。
目前，研究较为集中的是真菌和细菌的纤维素酶系。丝状真菌中的李氏木霉(T.reesei)和绿色木霉(T.viride)以及热纤梭菌(C.thermocellum)和cellulomonasfimi等物种的纤维素酶系较复杂，有多种亚类的内切酶，外切酶及葡萄糖苷酶[ThomasM.Wood，Biochemical.SocietyTransactions.1992，20，46-53]，例如绿色木霉有6种亚型的内切酶[Beldman，G.et alEur.J.Biochem.1985，146：301-308]。热纤梭菌的纤维素酶需要同多个蛋白质形成分子量巨大的纤维体(Cellulosome)才能起催化反应[Felix C.Rand L.G.Lj iungdahl，Annu.Rev.Microbiol.1993，47：791-819]，显然这样复杂的酶系必然会给研究和应用带来极大的困难。另一方面，纯化的单一组分的内切酶和外切酶要么不能水解未经化学处理的天然纤维素生成简单糖，要么水解活力极低，如李氏木霉(T.reesei)的纤维素酶系统中至少需14类纤维素酶的协同作用才能水解将未经化学处理的植物纤维。
传统的观点认为动物没有自己的纤维素酶系，需依赖共生菌的纤维素酶将纤维素水解成单糖，供生命活动需要。但是90年代末发现了白蚁和小龙虾内在的纤维素内切酶[Hirofumi，W.Gaku，T，nathan，L Nature，1998，394：330-331；Keren A.B.et al.，Gene，1999，239，317-324]。此外，在拟南芥中也发现了12种内切酶基因[del Compillo，Curr.Top.Dev.Boil.1999，46：39-61]。
近年以来，在其他微生物(细菌、放线菌、真菌等)、昆虫、植物、动物中相继发现了纤维素酶基因。把这些基因克隆到细菌、酵母或昆虫细胞中来构建新的纤维素表达系统成为获得高的纤维素酶产量和活性的方法之一。
在地球上每年由固定CO2的光合作用就能形成100亿吨以是上的干植物物质，其中这些物质的组成一半以上是由纤维素，其次是半纤维素(主要由木聚糖所构成)。如果再加上人类活动所造成的废弃的纤维素，如稻草，麦秸等，其存在量则要以天文数字来计算。如何采用生物技术综合利用植物干物质或废弃的纤维素的问题上，纤维素酶和木聚糖酶(半纤维素酶)起着关键作用。有效地将这些天然的纤维素转化为简单糖是纤维素作为再生能源的关键。
目前的纤维素酶还远不能适应将植物纤维素转化为简单糖作为再生能源的需求。因此，本领域迫切需要开发不同来源的具有能高效率水解纤维素的新的纤维素酶，以及新的生产葡萄糖的工艺。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的内切-β-1，4-葡聚糖酶以及其片段、类似物和衍生物，及其编码序列。
本发明的另一目的是提供生产内切-β-1，4-葡聚糖酶的方法以及其用途。
本发明的另一目的是提供新的生产简单糖和葡萄糖的工艺。
在本发明的第一方面，提供了新颖的分离出的福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶，它包含：具有SEQ ID NO：2或4中第1-195位或第17-195位氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该酶选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:2或4氨基酸序列经过一个或多个(例如1-40个，较佳地1-20个，更佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有水解羧甲基纤维素功能的由(a)衍生的多肽；
(c)具有SEQ ID NO：2或4中第17-195位的氨基酸序列的多肽(即去除了信号肽的成熟多肽)；
(d)将SEQ ID NO：2或4中第17-195位的氨基酸序列经过1-10个(例如1-40个，较佳地1-20个，更佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有水解羧甲基纤维素功能的由(c)衍生的多肽。
本发明还提供了一种从福寿螺中分离出的内切-β-1，4-葡聚糖酶，其分子量约为27kd，具有水解纤维素的活力，其中水解羧甲基纤维素的活力为11IU/mg。同时该酶还具有水解木聚糖和微晶纤维素的活力。
在本发明的第二方面，提供编码分离的内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(更佳地至少80％，至少90％相同性)：(a)编码上述内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或4中第1-195位或第17-195位氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(i)具有SEQ ID NO：1或3中27-611位的序列；(ii)具有SEQ ID NO：1或3中1-692位的序列；或(iii)具有SEQ IDNO：1或3中75-692位的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了内切-β-1，4-葡聚糖酶的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达该内切-β-1，4-葡聚糖酶的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出该内切-β-1，4-葡聚糖酶。
在本发明的第五方面，提供了本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶、其编码序列、载体或表达该酶的宿主细胞的用途，它们被用于生产简单糖的工艺。较佳地，所述的简单糖是纤维二糖、葡萄糖及其混合物。更佳地，所述的简单糖是葡萄糖。尤其是利用如稻草等植物干物质为原料。
在本发明的第六方面，提供了一种新的生产简单糖(如葡萄糖)的工艺，包括步骤：(a)用本发明上述的内切-β-1，4-葡聚糖酶或转化或转导的宿主细胞(协助)处理纤维素材料，从而产生简单糖；(b)分离出所述的简单糖。
在另一优选例中，步骤(a)中使用额外的常规外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了EG27的组织纯酶电泳图。其中，泳道1.EG27组织纯酶；泳道2.低分子量蛋白标准品。
图2显示了不同pH值对EG27活性的影响。
图3显示了EG27的pH值稳定性。
图4显示了不同温度对EG27的活性影响。
图5显示了EG27的温度稳定性。
图6显示了EG27-1的氨基酸序列和核苷酸序列。
图7显示了EG27-2的氨基酸序列和核苷酸序列。
图8显示了用于表达EG27的大肠杆菌表达载体。
图9显示了用于表达EG27的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体。
图10显示了纯化后Pichia pastoris表达的重组EG27-1、EG27-2的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1.重组EG27-1的SDS-PAGE均一酶。泳道2.重组EG27-2的SDS-PAGE均一酶。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从从福寿螺(AmpullariumCrossean)中分离纯化了分子量27kd的内切-β-1，4-葡聚糖酶(简称为EG27)。本发明人还克隆了该酶的基因并在大肠杆菌和甲醇酵母中得到表达。研究表明，该酶具有微观不均一的两种形式的内切-β-1，4-葡聚糖酶，水解羧甲基纤维素的活力为11IU/mg，同时该酶还具有水解木聚糖和微晶纤维素的活力。该酶属分子量较小的酸性纤维素内切酶。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶”“福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27”、“酶EG27”，或“内切-β-1，4-葡聚糖酶”都可互换使用，都指具有内切-β-1，4-葡聚糖酶氨基酸序列(SEQ ID NO：2或4)的蛋白或多肽。该术语包括含有信号肽的多肽以及不含信号肽的成熟的内切-β-1，4-葡聚糖酶。还包括含有或不含起始甲硫氨酸的内切-β-1，4-葡聚糖酶。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的内切-β-1，4-葡聚糖酶蛋白或多肽”是指内切-β-1，4-葡聚糖酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该内切-β-1，4-葡聚糖酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的带。
本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶可以是重组的、天然的、合成的，优选是重组的。本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括该内切-β-1，4-葡聚糖酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然内切-β-1，4-葡聚糖酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶”指具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID NO：2或4的全长序列(第1-195位)或成熟序列(第17-195位)的多肽。该术语还包括具有内切-β-1，4-葡聚糖酶的、SEQ ID NO：2或4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的活性片段和活性衍生物。当然，本发明的EG27-1也可视为EG27-2的变异形式，反之亦然。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的可溶性片段。通常，该片段具有福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶序列的至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶或多肽的类似物。这些类似物与天然福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的保守性变异多肽”指与SEQID NO：2或4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2或4的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)+非编码序列。
术语“编码福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸”可以是包括仅编码福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽具有外切-β-1，4-葡聚糖酶活性和内切-β-1，4-木聚糖酶活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶的多聚核苷酸。
本发明的福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用按常规方法所制备的福寿螺cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或内切-β-1，4-葡聚糖酶编码序列转化的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的内切-β-1，4-葡聚糖酶。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，内切-β-1，4-葡聚糖酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含内切-β-1，4-葡聚糖酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、以及新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞。较佳地是大肠杆菌。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的酶还包括固定在固相载体上的固定化酶。本领域熟知的各种固定化酶技术都可用于制备本发明的固定化的内切-β-1，4-葡聚糖酶。
此外，本发明提供了内切-β-1，4-葡聚糖酶、其编码序列、载体或宿主细胞的用途，它们被用于生产简单糖，尤其是葡萄糖的工艺。所述的简单糖包括纤维二糖、简单戊糖、葡萄糖及其混合物。
本发明的生产简单糖的工艺包括步骤：(a)用本发明上述的内切-β-1，4-葡聚糖酶或转化或转导的宿主细胞处理纤维素材料，从而产生简单糖；(b)分离出所述的简单糖。本发明酶可直接产生纤维二糖、简单戊糖等简单糖。优选的工艺还包括加入其他酶，例如β-葡萄糖苷酶(可将纤维二糖水解为葡萄糖)，这样就可直接产生葡萄糖。
一种代表性的工艺包括步骤：(a)将用机械铰碎稻草与含0.1M氯化钠的0.05M pH5.2醋酸缓冲液按20-30％混合(按重量/体积)在45℃预热10-15分钟。(b)然后加入0.05-0.2％本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶以及其他常规的外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，缓慢搅动，在45℃水浴反应12-24小时，收集自然沉降的90％上清部分。蒸干得到葡萄糖粗品。(c)沉淀部分补加含0.1M氯化钠的0.05M pH5.2醋酸缓冲液至原体积，缓慢搅动在45℃水浴反应24小时，收集自然沉降的90％上清部分。蒸干得到葡萄糖粗品。
本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的主要优点在于：
(1)是一种新的内切-β-1，4-葡聚糖酶。
(2)利用基因工程技术在甲醇酵母中表达得到的重组酶具有同福寿螺胃液组织中纯化得到的组织酶相当的活力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
从福寿螺胃液中纯化出内切-β-1，4-葡聚糖酶：EG27
福寿螺广泛分布在中国福建、广东，广西，浙江，江苏等省，福寿螺是20年前作为食用从南美引进的，其喜食秧苗，即使水质不佳，福寿螺也能成倍繁殖生长，成了河道及水稻田里的一大祸害。将市场上购得的福寿螺作为实验材料。
(1)抽提福寿螺胃液，用65％饱和度硫酸铵沉淀蛋白。
(2)离心后收集沉淀，用20mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.51mM EDTA溶解，透析。
(3)DEAE-sepharose fast flow柱层析纯化，收集穿出CMC水解活力峰。
(4)在20mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.01mM EDTA0.75M(NH4)2SO4条件下，过Phenyl-sepharose CL-4B柱层析纯化，收集穿出CMC水解活力峰。
(5)在20mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.01mM EDTA条件下，过Bio-gel P-100柱层析纯化，收集CMC水解活力峰。
(6)再在20mM Tris-HCl pH8.21mM EDTA条件下，过经DEAE-sepharosefast flow柱层析纯化，收集0～1M NaCl洗脱CMC水解活力峰，合并后浓缩即得到EG27的纯酶。SDS-PAGE显示为均一条带(图1)。
实施例2
福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27酶活力测定
2.1内切-β-1，4-葡聚糖酶水解活力的测定
200μl1％羧甲基纤维素钠(溶于100mM pH4.8醋酸钠缓冲液中)50℃水浴预热10min，加入适量酶液，50℃水浴反应10分钟，加入0.5ml含40μg/ml葡萄糖的DNS试剂，沸水浴6分钟，立即用冷水冷却后，加入0.5ml双蒸水，读取540nm处吸收光值。
内切-β-1，4-葡聚糖酶水解活力定义为在上述条件下，每分钟水解生成1μmol葡萄糖还原当量所需的酶量为一个单位(U)。
2.2木聚糖(Oat spelt)水解活力的测定
500μl1％木聚糖(溶于100mM pH4.8醋酸钠缓冲液中)50℃水浴预热10min，加入适量酶液，50℃水浴反应2小时，加入0.5ml含40μg/ml葡萄糖的DNS试剂，沸水浴6分钟，立即用冷水冷却后，加入0.5ml双蒸水，读取540nm处吸收光值。
木聚糖(Oat spelt)水解活力定义为在上述条件下，每分钟水解生成1μmol葡萄糖还原当量所需的酶量为一个单位(U)。
2.3微晶纤维素(Sigmacell)水解活力的测定
500μl1％微晶纤维素(溶于100mM pH4.8醋酸钠缓冲液中)50℃水浴预热10min，加入适量酶液，50℃水浴反应2小时，加入0.5ml含40μg/ml葡萄糖的DNS试剂，离心后取上清，沸水浴6分钟，立即用冷水冷却后，加入0.5ml双蒸水，读取540nm处吸收光值。
微晶纤维素(Sigmacell)水解活力定义为在上述条件下，每分钟水解生成1μmol葡萄糖还原当量所需的酶量为一个单位(U)。
在以上条件下，测得的福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27酶活力总结于表1。
表1：福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27对不同底物的水解活力
注：Sigmacell是Sigma公司的微晶纤维素商品名。
定义：每分钟水解微晶纤维素(Sigmacell)或聚木糖(birchwood)产生1μmol简单糖为1个U。
实施例3
福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27的酶学性质
3.1EG27的最适pH值、pH稳定性
取100μl1％羧甲基纤维素钠与100μl0.1M不同pH值的缓冲液混合后，与适量酶在50℃反应10分钟，测定其活性。
结果表明，EG27的最适pH值在4.5～5.0之间(图2)。
将酶在0.1M不同pH值缓冲液中，30℃温浴24小时，然后用标准方法测定酶活的残留活性。
结果表明，在上述方法下测得EG27在pH3.0～11.0范围内有很好的稳定性，在pH1.0残留40％的活性，在pH12.0残留有70％的活性(图3)。
3.2EG27的最适温度、温度稳定性
取200μl1％羧甲基纤维素钠(溶于100mM pH4.8醋酸钠缓冲液中)与适量的酶在25～70℃范围内不同温度下，反应10分钟，测得EG27的酶活性。
结果表明，EG27的最适反应温度为55℃(图4)。
将酶在0.1M pH4.8醋酸钠缓冲液中，不同温度下温浴24小时，然后用标准方法测定酶活的残留活性。
结果表明，EG27在25～60℃范围内有比较好的稳定性，其中60℃还残留有约85％的活性(图5)。
实施例4
福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27氨基酸序列的测定
4.1主要试剂与仪器
PVDF膜购自Millpore公司。Trypsin蛋白酶购自Progema公司。DTT购自Sigma公司。碘代乙酰胺(Iodoacetamide)购自Sigma公司。电转膜系统选用LKB公司2117-250 NOVAβLOT电泳转膜试剂盒。
4.2内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27组织酶N-末端氨基酸序列测定
内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27组织纯酶进行SDS-PAGE电泳，其中浓缩胶7.5％，分离胶15％，上样15μg，电泳75V30分钟，100V90分钟。
电泳结束后，将分离胶以半干法转膜。转膜结束后以丽春红染料(0.2％丽春红，3％三氯乙酸，3％磺基水杨酸)染色PVDF膜1分钟，用双蒸水脱色，剪下粉红色蛋白条带。委托同济大学进行氨基酸序列测定。
测得内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27组织酶N-末端氨基酸序列为：
NH2-Ala-Gln-Leu-Cys-Gln-Pro-Asp-Ser-Arg-Gly-Val
4.3内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27蛋白酶水解片段测定
用Trypsin蛋白酶水解EG27，SDS-PAGE电泳分离蛋白酶解产物，电泳结束后，将分离胶以半干法转膜。转膜结束后以丽春红染料(0.2％丽春红，3％三氯乙酸，3％磺基水杨酸)染色PVDF膜1分钟，用双蒸水脱色，剪下粉红色蛋白条带。委托同济大学进行氨基酸序列测定。
测得内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27组织酶中间肽氨基酸序列为：
NH2-Leu-Thr-Pro-Thr-Gly-Gly-Phe-Val-Pro-Gly-Lys。
实施例5
福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27基因的克隆
5.1主要试剂与仪器
TaqTM酶、PyrobestTMDNA聚合酶购自TaKaRa公司。cDNA建库用试剂盒SMARTTMcDNA Library Construction Kit。PCR仪选用MJ ReasearchTM的PTC-0150MiniCycler。
5.2抽提RNA、反转录及其cDNA文库的建立
取新鲜的福寿螺胃组织以Trizol抽提总RNA，以oligo(dT)18为引物反转录生成cDNA，同时建立cDNAλ噬菌体文库。
5.3EG27基因的克隆
根据蛋白测序所得的两段氨基酸序列，合成PCR简并引物Primer1、Primer2，以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，得到一条261bp的DNA片段。将该DNA片段连接入pMD18-T Vector(购自Takara公司)，测序后得到该片段的DNA序列。根据已得DNA序列，以λ噬菌体文库为模板，设计特异性引物Primer3、Primer4，分别与λ噬菌体库载体pTriplEx2(购自CloneTech公司)的两翼序列进行PCR反应，连接入T载体后测序得到内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27的5’端和3’端序列。
根据5’端和3’端序列设计引物Primer5、Primer6、Primer7，以λ噬菌体库为模板进行PCR反应，得到两条同源性为91％，全长692bp的基因序列，分别命名为EG27-1、EG27-2。分别包含5’UTR，CDS，3’UTR。其中CDS为588bp，编码195个氨基酸。经过NCBI序列比对，发现其属于糖苷水解酶45家族，有一个16个氨基酸的信号肽。
表2、EG27基因的克隆中引物的设计
| 名称 | 序列(5’-3’) | SEQ IDNO： |
| Primer1 | CA(A/G)(C/T)TTTG(C/T)CA(A/G)CCTGA(C/T)(A/T)(G/C)T(A/C)G(A/G/C/T)GG | 5 |
| Primer2 | (A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)AC(A/G)AA(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GT(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)G | 6 |
| Primer3 | GTGTCCGGCTGGCACAATTG | 7 |
| Primer4 | GCGGAAGAAACTGTGGAAAATG | 8 |
| Primer5 | ATGAAGCTGTTTTACCTTCTTTGTC | 9 |
| Primer6 | TTAGTCCGAATTGTGGCATT | 10 |
| Primer7 | TTAGCCCGAATTGTGGCATT | 11 |
EG27-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或3所示，编码的氨基酸序列如SEQID NO：2所示(图6)。
EG27-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示(图7)。
其中EG27-1和EG27-2两者的相同性为80％，仅相差40个氨基酸。
实施例6
福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27在大肠杆菌中的表达
6.1表达载体的构建
将得到的福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27-1、EG27-2的基因编码区，经NdeI和EcoRI双酶切后，连接入同样酶切的大肠杆菌表达质粒pET-28a(购自Novagen公司)中，转化大肠杆菌JM109，经测序鉴定正确后得到表达质粒pET-28a-EG271和pET-28a-EG272(图8)。分别转化常规的大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)。
同时将得到的福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27-1、EG27-2的基因编码区，经BamHI和XhoI双酶切后，连接入同样酶切的大肠杆菌表达质粒pET-22b(购自Novagen公司)中，转化大肠杆菌JM109，经测序鉴定正确后得到表达质粒pET-22b-EG271和pET-22b-EG272(图8)。分别转化常规的大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami(DE3)。
6.2EG27-1、EG27-2在大肠杆菌中的诱导表达
将含有pET-28a-EG271、pET-28a-EG272、pET-22b-EG271、pET-22b-EG272的表达菌株接种于3ml LB培养液中，37℃培养过夜，按1：100接种于50ml LB培养液中，37℃培养至OD值0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，20℃诱导20小时。将诱导培养物离心收集菌体，用20mM Tris-HCl pH8.050mMNaCl0.5mMEDTA洗菌体两遍，重悬于20mM Tris-HCl pH8.050mMNaCl0.5mM EDTA0.5mM PMSF0.5mg/mg溶菌酶中，超声破胞，取上清测活，有微弱活性。其中pET-28a-EG271、pET-28a-EG272的活性比pET-22b-EG271、pET-22b-EG272高。
实施例7
福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27在Pichia pastoris中的表达
7.1Pichia pastoris表达菌株的构建
将得到的福寿螺内切-β-1，4-葡聚糖酶EG27-1、EG27-2的基因编码区，经NotI和EcoRI双酶切后，连接入同样酶切的Pichia pastoris分泌型表达质粒pPIC9K(购自Invitrogen公司)中，转化大肠杆菌JM109，经测序鉴定正确后得到含分泌型重组表达质粒pPIC9K-EG271和pPIC9K-EG272的单克隆菌株(图9)。
抽提重组表达质粒pPIC9K-EG271和pPIC9K-EG272，用限制性内切酶SacI线性化重组表达质粒。用线性化的质粒电转化Pichia pastoris GS115细胞，在含1M山梨醇的MD板上30℃培养至出现单克隆。
7.2Pichia pastoris表达菌株的表达
将含有EG27-1、EG27-2基因的单克隆接种于3ml YPD培养液中，30℃250rpm培养24小时。按1：200接种于10ml BMGY培养基中，30℃250rpm培养至OD达到2～6，将菌体离心收集后，重悬于50ml BMMY培养基中，30℃250rpm培养96小时，每24小时补加甲醇至0.5％。
7.3Pichia pastoris表达的重组EG27的纯化
将发酵96小时的培养液离心取上清，过Ni柱，用20mM Tris-HCl pH7.9500mM NaCl20mM咪唑洗脱后得到重组的EG27-1、EG27-2纯酶(图10)。
7.4活性验证
对重组表达EG27-1和EG27-2，用1％羧甲基纤维素钠(溶于100mM pH4.8醋酸钠缓冲液中)检测其活性，结果表明，重组表达得到的纯酶具有和福寿螺胃液中纯化得到的E27相当的活力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
浙江理工大学
<120>动物内源性的内切-β-1，4-葡聚糖酶及其应用
<130>066104
<160>11
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>692
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<400>11
Claims (9)
1.一种分离的重组的具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶，其特征在于，它选自下组：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示的多肽；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4中第17-195位的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组：
(a)编码如权利要求1所述酶的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸是编码SEQ IDNO：2或4中第1-195位或第17-195位氨基酸序列的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：
(i)SEQ ID NO：1或3中27-611位的核苷酸序列；
(ii)SEQ ID NO：1或3中1-692位的核苷酸序列；
(iii)SEQ ID NO：1或3中75-692位的核苷酸序列。
5.一种重组的表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种转化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的重组的表达载体。
7.一种权利要求1所述的具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出权利要求1所述的具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶。
8.一种权利要求1所述的具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶或权利要求6所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于生产简单糖的工艺；其中，所述的简单糖是纤维二糖、葡萄糖及其混合物。
9.一种生产简单糖的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)用权利要求1所述的具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶或权利要求6所述的宿主细胞处理纤维素，从而产生简单糖；
(b)分离出所述的简单糖，所述的简单糖包括纤维二糖、葡萄糖及其混合物。
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| 李燕红.福寿螺（Ampullaria crossean）内切-β-1，4-葡聚糖酶的研究.中国优秀博硕士学位论文全文数据库 10.2006,(10),摘要，第21-31页. |
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