BRPI0710218A2 - polipeptìdeo isolado, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, para produzir um mutante a partir de uma célula precursora, para produzir uma proteìna, para produzir um polinucleotìdeo, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma substáncia e para inibir a expressão de um polipeptìdeo em uma célula, célula mutante, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna de filamento duplo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEO ISOLADO, POLINUCLEOTìDEO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, METODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTìDEO, PARA PRODUZIR UM MIlITANTE DE UMA CéLULA PRECURSORA, PARA PRODUZIR UMA PROTEINA, PARA PRODUZIR UM POLINUCLEOTìDEO, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULóSICO, PARA PRODUZIR UMA SUBSTáNCIA, E PARA IMBIR A EXPRESSãO DE UM POLIPEPTìDEO EM UMA CéLULA, CéLULA MUTANTE, PLANTA TRANSGêNICA, PARTE DE PLANTA OU CéLULA DE PLANTA, E, MOLéCULA DE RNA DE FILAMENTO DUPLO A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DEÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE,CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARAPRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE DEUMA CÉLULA PRECURSORA, PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA,PARA PRODUZIR UM POLINUCLEOTÍDEO, PARA DEGRADAR OUCONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UMASUBSTÂNCIA, E PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEOEM UMA CÉLULA, CÉLULA MUTANTE, PLANTA TRANSGÊNICA,PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, E, MOLÉCULA DERNA DE FILAMENTO DUPLO"Referência a uma Listagem de Seqüência

Este pedido contém uma Listagem de Seqüência na formalegível em computador. A forma legível em computador é aqui incorporadaspor referência.

Referência a um Depósito de Material Biológico

Este pedido contém uma referência aos depósitos de materialbiológico que foi fabricado no Northern Regional Research Center (NRRL)sob o Tratado de Budapeste e designados os números de acesso NRRL B-30898 e NRRL B-30901, depósitos microbianos estes que são aquiincorporados por referência.Fundamentos da invençãoCampo da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados que codificamos polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácidonucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeosassim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.Descrição da Técnica RelacionadaA celulose é um polímero do açúcar simples glicosecovalentemente ligado pelas ligações beta-1,4. Muitos microorganismosproduzem enzimas que hidrolisam glicanos ligados em beta. Estas enzimasincluem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases. Asendoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-o ao ataque pelas celobioidrolases. As celobioidrolases seqüencialmenteliberam moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose. Acelobioidrolase I é uma atividade de 1,4-beta-D-glicano celobioidrolase (E.C.3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas emcelulose, celotetriose ou qualquer polímero contendo celulose ligada em beta-1,4, liberando celobiose das extremidades redutoras da cadeia. Acelobioidrolase II é uma atividade de 1,4-beta-D-glicano celobioidrolase (E.C.32.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas emcelulose, celotetriose ou qualquer polímero contendo celulose ligada em beta-1,4, liberando celobiose das extremidades não redutoras da cadeia. Acelobiose é um dímero ligado em beta-14 solúvel em água de glicose. Asbeta-glucosidases hidrolisam celobiose em glicose.

A conversão de estoques de alimentação celulósicos em etanoltem a vantagens da disponibilidade fácil de grandes quantidades de estoque dealimentação, o desejo de evitar queimar ou aterrar os materiais e a limpeza docombustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, safras herbáceas eresíduos sólidos municipais foram considerados como estoques dealimentação para a produção de etanol. Estes materiais primariamenteconsistem de celulose, hemicelulose e lignina. Uma vez que a celulose éconvertida para glicose, a glicose é facilmente fermentada pela levedura emetanol.

Kvesitadaze et al, 1995, Applied Biochemistry andBiotechnology 50: 137-143, descreve a isolação e propriedades de umaendoglucanase termoestável de uma cepa mutante termofílica de Thielaviaterrestris. Gilbert et al., 1992. Bioresource Technology 39: 147-154,descrevem a caracterização das enzimas presentes no sistema de celulose deThielavia terrestris 255B Breuil et al., 1986, Biotechnology Letters 8: 673-676, descreve a produção e localização de celulases e beta-glucosidases dascepas C464 e NRRL 8126 de Thielavia terrestris.

Seria uma vantagem na técnica identificar novasendoglucanases tendo propriedades melhoradas, tais como taxa de hidrólisemelhorada, melhor estabilidade térmica, absorção reduzida para a lignina ecapacidade para hidrolisar componentes não celulósicos de biomassa, taiscomo hemicelulose, além de hidrolisar a celulose. As endoglucanases comuma ampla faixa de atividades colaterais na hemicelulose podem serespecialmente benéficas para melhorar o rendimento global da hidrólise desubstratos de biomassa ricos em hemicelulose complexos.

E um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeostendo atividade de endoglucanase melhorada e polinucleotídeos quecodifiquem os polipeptídeos.

Sumário da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de endoglucanase selecionados do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQID NO: 4;

(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência com (i) aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de cDNA contida na seqüência que codifica o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii) ou sobcondições de pelo menos estringência média com (i) a seqüência que codificao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de DNA genômicoque compreende a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);

(c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou pelo menos 60% de identidade com a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ED NO: 3; e

(d) uma variante que compreende uma substituição, deleçãoe/ou inserção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codificam polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase,selecionados do grupo que consiste de:

(a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 90% deidentidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 60%de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4;

(b) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelomenos alta estringência com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ. ID NO: 1. ou (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii) ou sob condições de pelo menos estringênciamédia com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreende a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii);

(c) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência denucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou pelo menos 60% deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3; e

(d) um polinucleotídeo que codifica uma variante quecompreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou maisaminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4,

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem osaminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2, Em um outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 20 a 400 da SEQ ID NO: 4, Emum outro aspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 110 a 1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspectopreferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 58 a 1200 da SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também diz respeito a construções deácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeirasrecombinantes que compreendem os polinucleotídeos e métodos de produzirum polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase.

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir aexpressão de um polipeptídeo em uma célula, que compreendem administrar àcélula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo(dsRNA), em que a dsRNA compreende uma subseqüência de umpolinucleotídeo da presente invenção. A presente também diz respeito a umatal molécula de RNA inibitória de filamento duplo (dsRNA), em queopcionalmente a dsRNA é uma siRNA ou uma molécula miRNA.

A presente invenção também diz respeito a métodos de usar ospolipeptídeos tendo atividade de endoglucanase na conversão de celulose paraglicose e várias substâncias.

A presente invenção também diz respeito a plantas quecompreendem um polinucleotídeo isolado que codifica um tal polipeptídeotendo atividade de endoglucanase.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um tal polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase, quecompreendem: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de plantaque compreendam um polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção diz respeito ainda às construções de ácidonucleico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em que ogene está operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codificaum peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a18 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4, em que ogene é estranho para a primeira e segunda seqüências de nucleotídeo.

Descrição Resumida das Figuras

A Figura 1 mostra um mapa de restrição de pPH23.

As Figuras 2A e 2B mostram a seqüência de DNA genômico ea seqüência de aminoácido deduzida de uma endoglucanase NRRL 8126CEL6B de Thielavia terrestris (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).

A Figura 3 mostra um mapa de restrição de pCIBG146.As Figuras 4A e 48 mostram a seqüência de cDNA e aseqüência de aminoácido deduzida de uma endoglucanase NRRL 8126CEL6C de Thielavia terrestris (SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente).

A Figura 5 mostra um mapa de restrição de ρAlLol.

A Figura 6 mostra um mapa de restrição de pBANelO,

A Figura 7 mostra um mapa de restrição de pAlLo2,

A Figura 8 mostra um mapa de restrição de pEJG105,

A Figura 9 mostra um mapa de restrição de pA2I3G146.

Definições

Atividade de endoglucanase: O termo "atividade deendoglucanase" é aqui definido como uma endo-l,4-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. No. 32.1.4) que catalisa a endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais comocarboximetil celulose e hidroxietil celulose), lignocelulose, derivados delignocelulose, lichenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos misturadostais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material vegetalcontendo componentes celulósicos. Para os propósitos da presente invenção, aatividade de endoglucanase é determinada usando a hidrólise da carboximetilcelulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure andAppl. Chem, 59: 257-268. Uma unidade de atividade de endoglucanase édefinida como 1,0 μηιοί de açúcares redutores produzidos por minuto a 50°C,pH 5,0.

Em um aspecto preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade de enzimavoltada para um ou mais substratos selecionados do grupo que consiste dexilano, xiloglicano, arabinoxilano, 1,4-beta-D-manana e galactomanana. Aatividade dos polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase sobre estessubstratos de polissacarídeo é determinada como porcentagem do substratohidrolisado para reduzir açúcares depois de incubar o substrato (5 mg por ml)com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presente invenção(5 mg de proteína por g de substrato) por 24 horas com agitação intermitenteno pH 5,0 (50 mM de acetato de sódio) e 50°C. Os açúcares redutores emmisturas de hidrólise são determinados pelo ensaio da hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH).

Em um aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade de enzimavoltada para o xilano. Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeosda presente invenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade deenzima voltada para o xiloglicano. Em um outro aspecto mais preferido, ospolipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglucanase têmainda atividade de enzima voltada para o arabinoxilano. Em um outro aspectomais preferido, os polipeptídeos da presente invenção tendo atividade deendoglucanase têm ainda atividade de enzima voltada para a 1,4-beta-D-manana. Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade de enzimavoltada para a galactomanana. Em um outro aspecto mais preferido, ospolipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglucanase têmainda atividade de enzima voltada para o xilano, xiloglicano, arabinoxilano,1,4-beta-D-manana e/ou galactomanana.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%,preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%,mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelomenos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% e ainda maispreferivelmente pelo menos 100% da atividade de endoglucanase dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Família da glicosídeo hidrolase 6 ou Família GH6: Ostermos "Família da glicosídeo hidrolase 6" ou "Família GH6" são aquidefinidos como um polipeptídeo que cai na Família 6 da glicosídeo hidrolasede acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid seqüence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 eHenrissat B. e Bairoch A., 1996, Updating the seqüence-based classificationof glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" comoaqui usado refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o maispreferivelmente pelo menos 90% puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95% puro, como determinado pela SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeosubstancialmente puro" denota aqui uma preparação de polipeptídeo quecontém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, maispreferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, maispreferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, aindamais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1%e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material depolipeptídeo com que o mesmo está nativa ou recombinantemente associado.É, por tanto, preferido que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelomenos 92% puro, preferivelmente pelo menos 94% puro, maispreferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96%puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelomenos 97% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda maispreferivelmente pelo menos 99%, o mais preferivelmente pelo menos 99,5%puro e ainda mais preferivelmente 100% puro em peso do material depolipeptídeo total presente na preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmenteem uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que ospolipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação de polipeptídeo esteja essencialmente livre de outro material depolipeptídeo com que esteja nativa ou recombinantemente associado. Istopode ser realizado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo por meio demétodos recombinantes bem conhecidos ou pelos métodos de purificaçãoclássicos.

Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" ésinônimo com os termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na formaisolada."

Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" é aquidefinido como um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase que está nasua forma final a seguir da tradução e quaisquer modificações póstraducionais, tais como o processamento de terminal N, truncagem determinal C, glicosilação, etc.

Seqüência codificadora de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência codificadora de polipeptídeo maduro" é aqui definido como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglucanase.

Identidade: A relacionabilidade entre duas seqüências deaminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro"identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de aminoácido é determinado usando o algoritmo deNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol, Biol. 48: 443-453)como implementado no programa Needle da EMBOSS com penalidade deabertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e amatriz EBLOSUM62. A saída da "identidade mais longa" rotulada porNeedle é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:(Resíduos Idênticos χ 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número deIntervalos no Alinhamento)

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de nucleotídeo é determinado usando o algoritmo deNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade deabertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e amatriz EDNAFULL. A saída de "identidade mais longa" rotulada por Needleé usada como a identidade percentual e é calculada como segue:

(Resíduos Idênticos χ 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número deIntervalos no Alinhamento)Seqüência homóloga: O termo "seqüência homóloga" é aquidefinido como uma proteína prognosticada que dá um valor E (ou contagemde probabilidade) de menos do que 0,001 em uma pesquisa fasta (Pearson, W.R,, 1999, em Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A.Krawetz, ed., pp. 185-219) com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Fragmento de Polipeptídeo: O termo "fragmento depolipeptídeo" é aqui definido como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos deletados do término amino e/ou carboxila do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência homólogadestas, em que o fragmento tem atividade de endoglucanase. Em um aspectopreferido, um fragmento contém pelo menos 320 resíduos de aminoácido,mais preferivelmente pelo menos 340 resíduos de aminoácido e o maispreferivelmente pelo menos 360 resíduos de aminoácido do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência homóloga desta. Em um outroaspecto preferido, um fragmento contém pelo menos 320 resíduos deaminoácido, mais preferivelmente pelo menos 340 resíduos de aminoácido e omais preferivelmente pelo menos 360 resíduos de aminoácido do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência homóloga desta.

Subseqüência: O termo "subseqüência" é aqui definido comouma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos deletados dasextremidades 5' e/ou 3' da seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3: ou uma seqüência homóloga desta; em quea subseqüência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, uma subseqüência contém pelomenos 960 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 1020 nucleotídeose o mais preferivelmente pelo menos 1080 nucleotídeos da seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou um seqüência homólogadesta, Em um outro aspecto preferido, um subseqüência contém pelo menos960 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 1020 nucleotídeos e omais preferivelmente pelo menos 1080 nucleotídeos da seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ED NO: 3 ou uma seqüênciahomóloga desta.

Variante alélica: O termo "variante alélica" denota aquiqualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa omesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através damutação e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. Asmutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeocodificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidoalteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeocodificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo isolado: O termo "polinucleotídeo isolado"como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o maispreferivelmente pelo menos 90% puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95% puro, como determinado pela eletroforese em agarose.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo"polinucleotídeo substancialmente puro" como aqui usado refere-se a umapreparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou nãodesejados e em uma forma adequada para o uso dentro de sistemas deprodução de proteína geneticamente engendradas. Assim, um polinucleotídeosubstancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente nomáximo 1% e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outromaterial de polinucleotídeo com o qual o mesmo está nativa ourecombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro,entretanto, pode incluir regiões não traduzidas 5' e 3' que ocorremnaturalmente, tais como promotores e terminadores. É preferido que opolinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro,preferivelmente pelo menos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94%puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelomenos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda maispreferivelmente pelo menos 98% puro, o mais preferivelmente pelo menos99% e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro em peso. Ospolinucleotídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma formasubstancialmente pura. Em particular, é preferido que os polinucleotídeosaqui divulgados estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação de polinucleotídeo seja essencialmente livre de outro material depolinucleotídeo com o qual o mesmo esteja nativa ou recombinantementeassociado. Aqui, o termo "polinucleotídeo substancialmente puro" é sinônimocom os termos "polinucleotídeo isolado" e "polinucleotídeo na formaisolada." Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA,semi-sintética, sintética ou quaisquer combinações destes.

Seqüência codiflcadora: Quando aqui usado o termo"seqüência codiflcadora" significa uma seqüência de nucleotídeo, quediretamente especifica a seqüência de aminoácido do seu produto de proteína.Os limites da seqüência codiflcadora são no geral determinada por uma matrizde leitura aberta, que usualmente começa com o códon de partida ATG oucódons de partida alternativos tais como GTG e TTG e extremidades com umcódon de parada tal como TAA, TAG e TGA. A seqüência codiflcadora podeser um DNA, cDNA ou seqüência de nucleotídeo recombinante.

Seqüência codiflcadora de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência codiflcadora de polipeptídeo maduro" é aqui definido como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglucanase.cDNA: O termo "cDNA" é aqui definido como uma moléculade DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa a partir de umamolécula de mRNA madura, combinada, obtida de uma célula eucariótica. OcDNA carece de seqüências de intron que estão usualmente presentes noDNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário é umprecursor para o mRNA que é processado através de uma série de etapas antesde aparecer como mRNA maduro combinado. Estas etapas incluem aremoção de seqüências de intron por um processo chamado combinação. OcDNA derivado de mRNA carece, portanto, de qualquer seqüência de intron.

Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácidonucleico" como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucleico, defilamento único ou duplo, que é isolada de um gene que ocorre naturalmenteou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos em umamaneira que de outro modo não existiria na natureza. O termo construção deácido nucleico é sinônimo com o termo "cassete de expressão" quando aconstrução de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridaspara a expressão de uma seqüência codificadora da presente invenção.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" éaqui definido para incluir todos os componentes, que são necessários ouvantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode sernativa ou estranha à seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ounativa ou estranha entre si. Tais seqüências de controle incluem, mas não sãolimitadas a, um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo,promotor, seqüência de peptídeo de sinal e terminador de transcrição. Em ummínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de paradatranscricional e traducional. As seqüências de controle podem ser fornecidascom ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicosque facilitem a ligação das seqüências de controle com a região codificadorada seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo "operavelmente ligado"denota aqui uma configuração em que uma seqüência de controle é colocadaem uma posição apropriada em relação à seqüência codificadora da seqüênciade polinucleotídeo tal que a seqüência de controle direcione a expressão daseqüência codificadora de um polipeptídeo.

Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapaenvolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a,transcrição, modificação pós transcricional, tradução, modificação póstraducional e secreção.

Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é aquidefinido como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção e que éoperavelmente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem a suaexpressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como aquiusado, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação,transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucleico ouvetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo "modificação" significa aqui qualquermodificação química do polipeptídeo que consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; ou uma seqüência homóloga destas; assimcomo manipulação genética do DNA que codifica um tal polipeptídeo. Amodificação pode ser substituições, deleções e/ou inserções de um ou maisaminoácidos assim como substituições de uma ou mais cadeias laterais deaminoácido.

Variante artificial: Quando aqui usado, o termo "varianteartificial" significa um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanaseproduzido por um organismo que expressa uma seqüência de nucleotídeomodificada do polipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO:1 ou SEQ LD NO: 3; ou uma seqüência homóloga destas. A seqüência denucleotídeo modificada é obtida através da intervenção humana pelamodificação da seqüência de nucleotídeo divulgada na SEQ ID NO: 1 ou SEQID NO: 3; ou uma seqüência homóloga destas.

Descrição Detalhada da Invenção

Polipeptídeos Tendo Atividade de EndoglucanaseEm um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados compreendendo uma seqüência de aminoácido quetenha um grau de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ouSEQ ID NO: 4 de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, maispreferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%,mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmentepelo menos 95% e ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou99% que tenha atividade de endoglucanase (a seguir "polipeptídeoshomólogos"). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos têm umaseqüência de aminoácido que difere em dez aminoácidos, preferivelmente emcinco aminoácidos, mais preferivelmente em quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente em três aminoácidos, o mais preferivelmente em doisaminoácidos e ainda mais preferivelmente em um aminoácido do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variantealélica desta; ou um fragmento desta que tenha atividade de endoglucanase.Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 1 a 42 daSEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreendeos aminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta;ou um fragmento desta que tenha atividade de endoglucanase. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo compreende os aminoácidos de 19 a 396da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consisteda seqüência do aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta;ou um fragmento desta que tem atividade de endoglucanase. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido daSEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste dos aminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2 ou umavariante alélica desta; ou um fragmento desta que tenha atividade deendoglucanase. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dosaminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variantealélica desta; ou um fragmento desta que tenham atividade de endoglucanase.Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende os aminoácidos de 20 a400 da SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento destaque tem atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende aminoácidos de 20 a 400 da SEQ ID NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácidoda SEQ ID NO: 4 ou um variante alélica desta; ou um fragmento desta quetem atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dosaminoácidos de 20 a 400 da SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica desta; ouum fragmento desta que tenham atividade de endoglucanase. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos de 20 a 400 daSEQ ID NO: 4.

Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito aospolipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase que são codificadospelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muitobaixa, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmentecondições de estringência média, mais preferivelmente condições deestringência média-alta, ainda mais preferivelmente condições de estringênciaalta e o mais preferivelmente condições de estringência muito alta com (i) aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ IDNO: 3, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou a seqüência de DNA genômicocompreende a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii) ou (iv) um filamentocomplementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold SpringHarbor, Nova Iorque). Uma subseqüência da seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 contém pelo menos100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeoscontíguos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento depolipeptídeo que tenha atividade de endoglucanase. Em um aspecto preferidoa seqüência codificadora do polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 110a 1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 58 a 1200 daSEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, o filamento complementar é ofilamento complementar de tamanho natural da seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

A seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:3 ou uma subseqüência destas, assim como a seqüência de aminoácido daSEQ ID NO: 2 ou SEQ ED NO: 4 ou um fragmento destas, podem ser usadaspara planejar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonarpolipeptídeos que codificam DNA tendo atividade de endoglucanase a partirde cepas de gêneros ou espécies diferentes de acordo com os métodos bemconhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para ahibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou espécie deinteresse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, de modo aidentificar e isolar o gene correspondente nisto. Tais sondas podem serconsideravelmente mais curtas do que a seqüência inteira, mas devem ter pelomenos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos35 e o mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos no comprimento.

Entretanto, é preferido que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100nucleotídeos no comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico podeter pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos ou maispreferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos. Sondas ainda mais longaspodem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que tenham pelomenos 600 nucleotídeos, pelo menos preferivelmente pelo menos 700nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos ou o maispreferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos no comprimento. As sondastanto de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamenterotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32Ρ, 3H, 35S,biotina ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada apartir de tais outras cepas, portanto, pode ser tríada quanto ao DNA quehibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. O DNA genômico ou outro DNA de tais outrascepas pode ser separado pela eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamidaou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separadopodem ser transferido para e imobilizados em nitrocelulose ou outro materialcarregador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que sejahomólogo com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ou uma subseqüênciadestas, o material carregador é preferivelmente usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indicaque a seqüência de nucleotídeo hibridiza com uma sonda de ácido nucleicorotulada correspondente à seqüência codificadora do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, a seqüência de cDNA contida na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou a seqüência deDNA genômico que compreende a seqüência codificadora de polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 3, seu filamento complementar ou uma subseqüênciadestas, sob condições de estringência muito baixa a muito alta. As moléculascom as quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podemser detectadas usando por exemplo, película de raio X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico tem os nucleotídeos de 110a 1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo daSEQ ID NO: 2 ou uma subseqüência desta. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida noplasmídeo pPF147 que está contido na E. coli NRRL B-30898, em que aseqüência de polinucleotídeo desta codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleicoé a região que codifica o polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pPH47que está contido na E. coli NRRL B-30898.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico tem os nucleotídeos de 58 a1200 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo daSEQ ID NO; 4 ou uma subseqüência desta. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida noplasmídeo pCIBG146 que está contida na E. coli NRRL B-30901, em que aseqüência de polinucleotídeo desta codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleicoé a região que codifica o polipeptídeo maduro contido no plasmídeopCIBG146 que está contido na E. coli NRRL B-30901.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos nocomprimento, condições de estringência muito baixa a muito alta sãodefinidas como pré hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% deSDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e25% de formamida para as estringências muito baixas e baixas, 35% deformamida para as estringências médias e médias-altas ou 50% de formamidapara as estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos deSouthern blotting padrão por 12 a 24 horas de modo ideal.

Para as sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos nocomprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS preferivelmente pelo menos a 45°C(estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C(estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringênciamédia), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta),ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência alta) e o maispreferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas que são de cerca de 15 nucleotídeos a cercade 70 nucleotídeos no comprimento, as condições de estringência sãodefinidas como pré hibridização, hibridização e lavagem pós hibridização decerca de 50C a cerca de 10°C abaixo da Tm calculada usando o cálculo deacordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academyof Sciences USA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6mM de EDTA, 0,5% de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfatode sódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blottingpadrão por 12 a 24 horas de modo ideal.

Para sondas curtas que são de cerca de 15 nucleotídeos a cercade 70 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é lavado uma vezem 6X SCC mais 0,1% de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados codificados pelos polinucleotídeos que compreendemou que consistem de seqüências de nucleotídeo que tenham um grau deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou SEQ ID NO: 3 de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelomenos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmentepelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda maispreferivelmente pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelo menos 97%de identidade, que codifica um polipeptídeo ativo. Em um aspecto preferido, aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de IlOa1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 58 a 1200 da SEQ IDNO: 3. Ver a seção polinucleotídeo aqui.Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito avariantes artificiais que compreendem uma substituição, deleção e/ou inserçãode um ou mais (ou de vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; ou uma seqüência homóloga desta.

Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, istoé substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetamsignificantemente a dobra e/ou atividade da proteína; deleções pequenas,tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino oucarboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina de terminal amino;um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou umaextensão pequena que facilita a purificação pela mudança da carga líquida ouuma outra função, tal como um trecho de poli-histidina, um epítopoantigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidosácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina easparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina),aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidospequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições deaminoácido que no geral não alteram a atividade específica são conhecidas natécnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, Em,The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. A mudanças que ocorrem maishabitualmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, os aminoácidos não padrão(tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico,isovalina e alfa-metil serina) podem ser substituídos no lugar dos resíduos deaminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado deaminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelocódigo genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos no lugardos resíduos de aminoácido. Os "aminoácidos não naturais" forammodificados depois da síntese da proteína e/ou têm uma estrutura químicana(s) sua(s) cadeia(s) lateral(is) diferente daquela dos aminoácidos padrão. Osaminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados epreferivelmente, são comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico,ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de umanatureza tal que as propriedades físico químicas dos polipeptídeos sãoalteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar aestabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato,mudar o pH ideal e outros.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podemser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, taiscomo a mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese de varredura dealanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na últimatécnica, as mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo namolécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividadebiológica (isto é, a atividade de endoglucanase) para identificar resíduos deaminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hiltonet al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outrainteração biológica também podem ser determinados pela análise física daestrutura, como determinada por técnicas tais como ressonância magnéticanuclear, cristalografia, difração de elétron ou rotulação de fotoafinidade, emconjunção com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver,por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J.Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Asidentidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas daanálise de identidades com polipeptídeos que estejam relacionados com umpolipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidoúnicas ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos demutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por umprocedimento de triagem relevante, tal como aqueles divulgados porReidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625.Outros métodos que podem ser usados incluem a PCR propensa a erro,demonstração de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente U.S. N- 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênesedirecionada à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988,DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem sercombinados com métodos de triagem de alto rendimento, automatizados paradetectar a atividade de polipeptídeos clonados, mutagenizados expressadospelas células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeosativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamenteseqüenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem adeterminação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuaisem um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados aos polipeptídeos deestrutura desconhecida.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções deaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, taiscomo os aminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos de 20a 400 da SEQ ID NO: 4, é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8,mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, maispreferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, omais preferivelmente 2 e ainda mais preferivelmente 1.Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Endoglucanase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partirde microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presenteinvenção, o termo "obtido a partir de" como aqui usado em conexão com umadada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma seqüênciade nucleotídeo é produzida pela fonte ou por uma cepa em que a seqüência denucleotídeo da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeoobtido a partir de uma dada fonte é extracelularmente secretado.

Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeopode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeode Bacillus, Streptococcus, Streptomyees, Staphyloeoeeus, Enteroeoeeus,Lactobacillus, Laetocoecus, Clostridium, Geobacillus ou Oceanobacillustendo atividade de endoglucanase ou um polipeptídeo bacteriano Gramnegativo tal como um polipeptídeo de E. eoli, Pseudomonas, Salmonella,Campylobacter, Helieobaeter, Flavobaeterium, Fusobaeterium, Ilyobaeter,Neisseria ou Ureaplasma tendo atividade de endoglucanase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deBacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacilluseireulars, Bacillus elaush, Bacillus coagulans, Bacillus finnus, Bacilluslautus, Bacillus lentus, Bacillus lieheniformis, Bacillus megaterium, Bacilluspumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillusthuringiensis tendo atividade de endoglucanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptoeoeeus pyogenes,Streptoeoeeus uberis ou Streptoeoeeus equi subsp. Zooepidemicus tendoatividade de endoglucanase.Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Streptomyces aehromagenes, Streptomyces avermitilis,Streptomyees coelieolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividans tendoatividade de endoglucanase.

Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção também pode ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmenteum polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida,Kluyveromyces, Piehia, Saccharomyces, Schizosaceharomyees ou Yarrowiatendo atividade de endoglucanase; ou mais preferivelmente um polipeptídeofungico filamentoso tal como um Aeremanium, Aspergillus, Aureobasidium,Chrysospofium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humieola,Magnaporthe, Mueor, Myeeilophthota, Neocallimastix, Neurospora,Paeeilomyees, Penieilliurn, Piromyces, Schizophillurn, Talarornyees,Thermoaseus, Thielavia, Tolypociadiurn ou Triehoderma tendo atividade deendoglucanase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deSaccharomyces earlsbergensis, Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyeesdiastaticus, Saccharomyees douglasii. Saccharomyees kluyveri,Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis tendo atividade deendoglucanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Aspergillus aeuleatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfurnigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidufans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum,Chrysosporium lueknowense, Chrysosporiwn tropieum, Chrysosporiummerdarium, Chrysosporium mops, Chrysosporium pannieoia, Chrysosporiumqueenslandieum, Chrysosporium zonatum, Fusarium baetridioides, Fusariumeerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium eultnorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum. Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides,Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penieilliumbrasilianum, Penieillium eamembertii, Penicillium eapsulatum, Penieilliumehrysogenum, Penicillium eitreonigrum, Penicillium eitrinum, Penicilliumelaviforme, Penicillium eorylophitum, Penicillium erustosum, Penicilliumdigitatum, Penieillium expansum, Penieillium funieulosum. Penicilliumgiabrum, Penicillium granulatum, griseofulvum. Penicillium islandieum,Penicillium italieum, Penieiltium janthinellum, Penicillium lividum,Penicillium megasporum, Penicillium melinii, Penicillium notatum,Penieillium oxalieum, Penicillium puberulum, Penieillium purpureseens,Penicillium purpurogenum, Penieillium roquefortii, Penicillium rugulosum,Penicillium spinulosum, Penicillium waksmanii, Triehoderma harzianum,Triehoderma koningii, Triehoderma longibraehíatum. Triehoderma reesei ouTriehoderma viride tendo atividade de endoglucanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thielavia aehromatiea, Thielavia albomyees, Thielaviaalbopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thieiavia mierospota,Thielavia ovispora, Thielavia peniviana, Thielavia spededonium, Thielaviasetosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Thielavia terrieola,Thielavia thermophila, Thielavia variospora ou Thielavia wareingii tendoatividade de endoglucanase.

Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thielavia terrestris e o mais preferivelmente um polipeptídeode Thielavia terrestris NRRL 8126, por exemplo, o polipeptídeo da SEQ IDNO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou o polipeptídeo maduro destas.

Será entendido que para as espécies anteriormentemencionadas, a invenção abrange os estados tanto perfeitos quantoimperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos,independente do nome da espécie pelo qual eles são conhecidos. Aqueleshabilitados na técnica facilmente reconhecerão a identidade de equivalentesapropriados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao públicoem várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional ResearchCenter (NRRL).

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados eobtidos a partir de outras fontes incluindo microorganismos isolados danatureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondasmencionadas acima. As técnicas para isolar microorganismos de habitaisnaturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode ser depoisobtido triando-se similarmente uma biblioteca genômica ou de cDNA de umtal microorganismo. Uma vez que uma seqüência de polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo tenha sido detectada com a(s) sonda(s), opolinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se técnicas que sãobem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluempolipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivados em que um outropolipeptídeo é fundido no término N ou no término C do polipeptídeo oufragmento deste. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo-se umaseqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta) que codifica um outropolipeptídeo a uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta) dapresente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão sãoconhecidas na técnica e incluem ligar as seqüências codificadoras quecodificam os polipeptídeos de modo que eles estejam na matriz e que aexpressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle dos mesmospromotor(es) e terminador.

Um polipeptídeo de fusão pode compreender ainda um sítio declivagem. Na secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando opolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da proteína de fusão.

Os exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não sãolimitados a, um sítio Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnot 3: 568-76; Svetina et al, 2000, J.Biotechnol 76: 245-251: Rasmussen-Wilson et al, 1997, App. Environ,Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; eContreras et al, 1991, Biotechnology 9: 378-381), um sítio Ile-(Glu ou Asp)-Gly-Arg, que é clivado por uma protease de Fator Xa depois do resíduo dearginina (Eaton et al, 1966, Biochem. 25: 505-512); um sítio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por uma enterocinase depois da lisina (Collins-Racieet al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); um sítio His-Tyr-Glu ou sítio His-Tyr-Asp, que é clivado pela Genenase I (Carter et al., 1989, Proteins:Structure, Function and Genetics 6: 240-248); um sítio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado pela trombina depois do Arg (Stevens, 2003, DrugDiscovery World 4: 3548); um sítio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que éclivado pela TEV protease depois do Gln (Stevens, 2003, supra); e um sítioLeu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma formageneticamente engendrada de rinovírus 3C humano protease depois do Gln(Stevens, 2003, supra).Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeoisolado que compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeo quecodifica um polipeptídeo da presente invenção tendo atividade de31

endoglucanase.

Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto maispreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüênciacontida no plasmídeo pPH47 que está contido na E. coli NRRL 8-30898. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste da região que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 110 a 1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outroaspecto mais preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião que codifica o polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pPH47 queestá contido na E. coli NRRL 8-30898. A presente invenção também abrangeas seqüências de nucleotídeo que codificam os polipeptídeos quecompreendem ou que consistem da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:2 ou o polipeptídeo maduro desta, que difere da SEQ ID NO: 1 ou a seqüênciaque codifica o polipeptídeo maduro desta em virtude da degenerescência docódigo genético. A presente invenção também diz respeito às subseqüênciasda SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 2 que têmatividade de endoglucanase.

Em um outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto maispreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüênciacontida no plasmídeo pClBG146 que está contido na E coli NRRL B-30901.Em um outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste do polipeptídeo maduro que codifica a região da SEQ ID NO: 3. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 58 a 1200 da SEQ ID NO: 3. Em um outroaspecto mais preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião codificadora do polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pClBG146que está contido na E. coli NRRL B-30901. A presente invenção tambémabrange seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos quecompreendem ou que consistem da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:4 ou o polipeptídeo maduro desta, que difere da SEQID NO: 3 ou a seqüênciaque codifica o polipeptídeo maduro desta em virtude da degenerescência docódigo genético. A presente invenção também diz respeito às subseqüênciasda SEQ ID NO: 3 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 4 que têmatividade de endoglucanase.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosmutantes que compreendem ou consistem de pelo menos uma mutação naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ IDNO: 3, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Em um aspecto preferido, opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2. Emum outro aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 20a 400 da SEQ ID NO: 4.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeoque codifica um polipeptídeo são conhecidas no ramo e incluem a isolação deDNA genômico, preparação de cDNA ou uma combinação destes. Aclonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir de tal DNAgenômico pode ser efetuada, por exemplo, usando-se a reação da cadeia dapolimerase (PCR) bem conhecida ou triagem de anticorpo de bibliotecas deexpressão para detectar fragmentos de DNA clonado com característicasestruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: AGuide to Methods and Applications, Academic Press, Nova Iorque. Outrosprocedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como a reação dacadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação combase na seqüência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Ospolinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Myceliophthoratermomophila CBS 117.65, basidiomiceto CBS 494.95 ou basidiomiceto CBS495.95 ou um outro organismo ou organismo relacionado e assim, porexemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie variante da região quecodifica o polipeptídeo da seqüência de nucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeosque compreendem ou consistem das seqüências de nucleotídeo que têm umgrau de identidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 de pelo menos 60%, preferivelmente pelomenos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmentepelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, maispreferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%,ainda mais preferivelmente pelo menos 95% e o mais preferivelmente pelomenos 97% de identidade, que codifica um polipeptídeo ativo. Em umaspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 110a 1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferidoa seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 58 a1200 da SEQ ID NO: 3.

A modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese depolipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo"substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se às formas que nãoocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir emalgum modo engendrado a partir do polipeptídeo isolado da sua fonte nativa,por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica,termoestabilidade, pH ótimo ou semelhante. A seqüência variante pode serconstruída com base na seqüência de nucleotídeo apresentada como a regiãoque codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, porexemplo, uma subseqüência destas e/ou pela introdução de substituições denucleotídeo que não dão origem a uma outra seqüência de aminoácido dopolipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo, mas que correspondeao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção daenzima ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que podem darorigem a uma seqüência de aminoácido diferentes. Para uma descrição geralde substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, ProteinExpression and Purification 2: 95-107.

Estará evidente àqueles habilitados na técnica que taissubstituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função damolécula e ainda resulta em um polipeptídeo ativo.

Os resíduos de aminoácido essenciais para a atividade dopolipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção eportanto preferivelmente não submetido à substituição, pode ser identificadode acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênesedirecionada ao sítio ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo,Cunningham e Wells, 1989, supra). Na última técnica, as mutações sãointroduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula e asmoléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade deendoglucanase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para aatividade da molécula. Os sítios de interação de substrato-enzima tambémpodem ser determinados pela análise da estrutura tridimensional comodeterminado por técnicas tais como a análise de ressonância magnéticanuclear, cristalografia ou rotulação de fotoafinidade (ver, por exemplo, deVos et ai., 1992, supra; Smith et ai., 1992, supra; Wlodaver et al., 1992,supra).

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção, que hibridizamsob condições de estringência muito baixa, preferivelmente condições deestringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média,mais preferivelmente condições de estringência média-alta, ainda maispreferivelmente condições de estringência alta e o mais preferivelmentecondições de estringência muito alta com sob pelo menos condições deestringência alta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de cDNA contida naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii)ou (iv) um filamento complementar de (i) ou (ii); ou variantes alélicas destas(Sambrook et al., 1989, supra), como aqui definido. Em um aspecto preferido,a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de IlOa1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 58 a 1200 da SEQ IDNO: 3. Em um outro aspecto preferido, o filamento complementar é ofilamento complementar de tamanho natural da seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados obtidos pela (a) hibridização de uma população de DNA sobcondições de estringência muito baixa, baixa, média, média-alta, alta ou muitoalta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou o a seqüência de DNAgenômico que compreende a seqüência codificadora do polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 3 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b)isolar o polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. Em um aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de IlOa 1557 da SEQ IDNO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 58 a 1200 da SEQ ID NO: 3. Emum outro aspecto preferido, o filamento complementar é o filamentocomplementar de tamanho natural da seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.Construções de ácido nucleico

A presente invenção também diz respeito às construções deácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo isolado da presenteinvenção operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle quedirecionam a expressão da seqüência codificadora em uma célula hospedeiraadequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo dapresente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos parafornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência dopolinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ounecessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar asseqüências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante sãobem conhecidos na técnica.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotoraapropriada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célulahospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. A seqüência promotora contém seqüênciasde controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. Opromotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que mostre atividadetranscricional na célula hospedeira de escolha incluindo os promotoresmutantes, truncados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes quecodificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ouheterólogos para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das construções de ácido nucleico da presente invenção,especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotoresobtidos do operon Iac de E. coli, do gene da agarase de Streptomycescoelicolor (dagA), do gene da levansacarase de Bacillus subtilis (sacB), dogene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amil), do gene da amilasemaltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), do gene da alfa-amilasede Bacillus amiloliquefaeiens (amyQ), do gene da penicilinase de Bacilluslicheniformis (penP), genes da xylA e xylB de Bacillus subtilis e do gene dabeta-lactamase procariótica (ViHa-Kamaroff et ai., 1978, Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), assim como o promotortac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 80: 2125). Outros promotores são descritos em "Usefiil proteins fromrecombinant bactéria" no Scientific American, 1980, 242: 74-94; e emSambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em umacélula hospedeira fungica filamentosa são promotores obtidos a partir dosgenes para a amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica deRhizomueor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilaseestável em ácido de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ouAspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomueor miehei, protease alcalinade Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae,acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglucosidase de Fusariumvenenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900),Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), protease equivalente atripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidase deTriehoderma reesei, celobioidrolase I de Triehoderma reesei, celobioidrolaseII de Triehoderma reesei, endoglucanase I de Triehoderma reesei,endoglucanase II de Triehoderma reesei, endoglucanase III de Triehodermareesei, endoglucanase IV de Triehoderma reesei, endoglucanase V deTriehoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II deTriehoderma reesei, beta-xilosidase de Triehoderma reesei, assim como opromotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para a alfa-amilaseneutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae);e promotores mutantes, truncados e híbridos destes.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis sãoobtidos dos genes para a enolase de Saccharomyces eerevisiae (ENO-1),galactocinase de Saccharomyces eerevisiae (GAL1), álcooldesidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyeeseerevisiae (ADH1,ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyceseerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyees eerevisiae (CUPl) e 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyees eerevisiae. Outros promotores úteispara as células hospedeiras de levedura são descritas por Romanos et al.,1992, Yeast 8: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüênciaterminadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora estáoperavelmente ligada ao término 3' da seqüência de nucleotídeo que codificao polipeptídeo. Qualquer terminado que seja funcional na célula hospedeirade escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeirasfüngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para a amilase TAKA deAspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase deAspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger e proteaseequivalente a tripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyeeseerevisiae, citocromo C de Saccharomyces eerevisiae (CYCl) egliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces eerevisiae. Outrosterminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos porRomanos et al., 1992, supra.A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um mRNA que seja importante para atradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é operavelmente ligada aotérmino 5' da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquerseqüência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode serusada na presente invenção.

Os líderes preferidos para as células hospedeiras de fungofilamentoso são obtidos a partir dos genes para a amilase TAKA deAspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura sãoobtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces eerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinase de Saceharomyces eerevisiae, fator alfa deSaccharomyces eerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase de Saceharomyces eerevisiae (ADH2/GAP).

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência operavelmente ligada ao término 3' daseqüência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célulahospedeira como um sinal para a adição de resíduos de poliadenosina aomRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que seja funcional nacélula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas para as célulashospedeiras fungicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para aamilase TAKA de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger,antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease equivalente a tripsina deFusarium oxysporum e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.

As seqüências de poliadenilação úteis para as célulashospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, MolecularCellularBiology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidoligada ao término amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeocodificado dentro do caminho secretor da célula. A extremidade 5' daseqüência codificadora da seqüência de nucleotídeo pode inerentementeconter uma região codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligada namatriz de leitura de tradução com o segmento da região codificadora quecodifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' daseqüência codificadora pode conter uma região codificadora de peptídeo desinal que seja estranha para a seqüência codificadora. A região codificadorade peptídeo de sinal estranha pode ser requerida onde a seqüênciacodificadora não contém naturalmente uma região codificadora de peptídeode sinal. Alternativamente, a região codificadora de peptídeo de sinal estranhapode simplesmente substituir a região codificadora de peptídeo de sinalnatural de modo a realçar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquerregião codificadora de peptídeo de sinal que direcione o polipeptídeoexpressado dentro do caminho secretor de uma célula hospedeira de escolha,isto é secretado em um meio de cultura, pode ser usada na presente invenção.

As regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para ascélulas hospedeiras bacterianas são as regiões codificadoras de peptídeo desinal obtidas a partir dos genes para a amilase maltogênica NCIB 11837 deBacillus, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacilluslieheniformis, beta-lactamase de Bacillus Iieheniformis, proteases neutras deBacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis.Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993,Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para ascélulas hospedeiras fungicas filamentosas são as regiões codificadoras depeptídeo de sinal obtidas a partir dos genes para amilase TAKA deAspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase deAspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase deHumicola insolens, endoglucanase V de Humieola insolens e lipase deHumieola lanuginosa.

Os peptídeos de sinal úteis para as células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para o fator alfa de Saccharomyeeseerevisiae e invertase de Saccharomyces eerevisiae. Outras regiõescodificadoras de peptídeo de sinal úteis são descritos por Romanos et al.,1992, supra.

Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal compreende ouconsiste dos aminoácidos de 1 a 18 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspectopreferido, a região codificadora de polipeptídeo de sinal tem os nucleotídeosde 56 a 109 da SEQ ID NO: 1.

Em um outro aspecto preferido, o peptídeo de sinalcompreende ou consiste dos aminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, a região codificadora de polipeptídeo de sinalcompreende ou consiste dos nucleotídeos de 1 a 57 da SEQ ID NO: 3.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de pró-peptídeo que codifica uma seqüência de aminoácidoposicionada no término amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma pró enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogeno emalguns casos). Um pró-polipeptídeo é no geral inativo e pode ser convertido aum polipeptídeo ativo maduro pela clivagem catalítica ou auto-catalítica dopró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A região codificadora de pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes para a protease alcalina deBacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfade Saccharomyces eerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei elacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Onde as regiões tanto de peptídeo de sinal quanto de pró-peptídeo estão presentes no término amino de um polipeptídeo, a região depró-peptídeo é posicionada a seguir do terminal amino de um polipeptídeo e aregião de peptídeo de sinal é posicionada a seguir do terminal amino da regiãode pró-peptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências reguladorasque permitam a regulagem da expressão do polipeptídeo em relação aocrescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores sãoaqueles que fazem com que a expressão do gene seja ativada ou desativadaem resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de umcomposto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticosincluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2ou sistema GALl podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor daalfa-amilase TAKA, o promotor da glicoamilase de Aspergillus niger e opromotor da glicoamilase de Aspergillus oryzae pode ser usado comoseqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüências reguladoras sãoaqueles que permitem quanto a amplificação de gene. Em sistemaseucarióticos, estes incluem o gene da diidrofoliato redutase que é amplificadona presença dos genes de metotrexato e de metalotioneína que sãoamplificados com metais pesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeoque codifica o polipeptídeo seria operavelmente ligado com a seqüênciareguladora.

Vetores de Expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presenteinvenção, um promotor e sinais de parada transcricional e traducional. Os vários ácidos nucleicos e seqüências de controle aqui descritos podem serunidos entre si para produzir um vetor de expressão recombinante que podeincluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ousubstituição da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo em taissítios. Alternativamente, uma seqüência de polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser expressada inserindo-se a seqüência de nucleotídeo ou umaconstrução de ácido nucleico que compreenda a seqüência em um vetorapropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüênciacodificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadoraseja operavelmente ligada com as seqüências de controle apropriadas para aexpressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor(por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientementesubmetido aos procedimentos de DNA recombinante e possa realizar aexpressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor tipicamentedependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual ovetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser lineares ou plasmídeoscirculares fechados.

O vetor pode ser um vetor que replique autonomamente, isto é,um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação doqual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, umplasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma ou umcromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir aauto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quandointroduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado juntocom o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) o mesmo foi integrado. Além disso,um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos quejuntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeiraou um transposon podem ser usados.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de célulastransformadas, transfectadas, transduzidas ou células semelhantes. Ummarcador selecionável é um gene o produto do qual fornece resistência abiocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia para auxótrofos eoutras.

Os exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são osgenes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheníformis ou marcadores queconferem resistência a antibiótico tal como resistência à ampicilina,canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores adequados para ascélulas hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3. LEU2, LYS2, MET3,TRPl e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célulahospedeira filamentosa fungica incluem, mas não são limitados a, amdS(acetamidase), argB (ornitina carbamoil-transferase), bar (fosfinotricinaacetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitratoreductase), pyrG (orotidina-5-fosfato descarboxilase), sC (sulfatoadeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), assim como equivalentesdestes. Preferidos para o uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdSe pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar deStreptomyees hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umelemento ou elementos que permitem a integração do vetor no genoma dacélula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independentedo genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetorpode contar com a seqüência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeoou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma pelarecombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração pelarecombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local oulocais exatos no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade deintegração em um local exato, os elementos integracionais devempreferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como100 a 10.000 pares de base, preferivelmente de 400 a 10.000 pares de base e omais preferivelmente de 800 a 10.000 pares de base, que tenham um alto graude identidade com a seqüência alvo correspondente para realçar aprobabilidade de recombinação homóloga, Os elementos integracionaispodem ser qualquer seqüência que seja homóloga com a seqüência alvo nogenoma da célula hospedeira. Além disso, Os elementos integracionais podemser seqüências de nucleotídeo não codificadoras ou codificadoras. Por outrolado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira pelarecombinação não homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender aindauma origem de replicação que permita que o vetor replique autonomamentena célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquerplasmídeo replicador que medeie a replicação autônoma que funcione em umacélula. O termo "origem de replicação" ou "plasmídeo replicador" é aquidefinido como uma seqüência de nucleotídeo que permite que um plasmídeoou vetor replique in vivo.

Os exemplos de origens bacterianas de replicação são asorigens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 epACYC184 que permitem a replicação na E. coli e pUBllO, pE194,pTA1060 e ρΑΜβΙ que permitem a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em umacélula hospedeira de levedura são a origem de 2 mícrons de replicação, ARS1,ARS4, a combinação de ARSl e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célulafungica filamentosa são AMAI e ANSl (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67;Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883).A isolação do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores quecompreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodosdivulgados na WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar aprodução do produto de gene. Um aumento no número de cópia dopolinucleotídeo pode ser obtido integrando-se pelo menos uma cópiaadicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou incluindo-se umgene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde ascélulas contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e destemodo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadascultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosacima para construir os vetores de expressão recombinantes da presenteinvenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et al., 1989, supra).Células hospedeiras

A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produçãorecombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, umprocariota ou um eucariota.

A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactériaGram positiva ou uma bactéria Gram negativa. As bactérias Gram positivasincluem, mas não são limitadas a, Bacillus, Streptococcus. Streptomyees,Staphylococcus, Enteroeoceus, Lactobacillus, Lactoeoceus, Clostridium,Geobacillus e Oceanobacillus. As bactérias Gram negativas incluem, mas nãosão limitadas a, E. eoli, Pseudomonas Salmonella, Campylobacter,Helicobaeter, Flavobacterium, Fusobaeterium, llyobaeter, Neisseria eUreaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula deBacillus. As células de Bacillus úteis na prática da presente invenção incluem,mas não são limitadas a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillusamiloliquefaciens. Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii,Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacilluslicheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Bacillus amiloliquefaeiens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,Baeillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um aspecto maispreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillusamiloliquefaeiens. em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus elausii. Em um outro aspecto maispreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacilluslicheniformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus subtilis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquercélula de Streptococcus. As células de Streptoeoeeus úteis na prática dapresente invenção incluem, mas não são limitadas a, Streptoeoeeusequisimilis, Streptoeoeeus pyogenes, Streptoeoeeus uberis e Streptoeoeeusegui subsp. Zooepidemicus.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Streptoeoeeus equisimilis. Em um outro aspecto preferido, a célulahospedeira bacteriana é uma célula de Streptoeoeeus pyogenes. Em um outroaspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula deStreptoeoeeus uberis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Streptoeoeeus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquercélula de Streptomyces. As células de Streptomyces útil na prática da presenteinvenção incluem, mas não são limitadas a, Streptomyees achromogenes,Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus eStreptomyees lividans.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Streptomyees achromogenes. Em um outro aspecto preferido acélula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces avermitilis. Em umoutro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula deStreptomyces coelicolor. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em um outro aspectopreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyceslividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus, porexemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, porexemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115),pelo uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961,Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971,Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por eletroporação (ver, porexemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6, 742-751) ou pelaconjugação (ver, por exemplo, Koehler e Theme, 1987, Journal ofBacteriology 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E.eoli, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver,por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol, Biol. 166: 557-580) ou eletroporação(ver, por exemplo, Dower et al., 1988. Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Aintrodução de DNA em uma célula de Streptomyees, por exemplo, pode serefetuada pela transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo,Gong et al., 2004, Folie Microbial. (Praha) 49: 399-405), pela conjugação(ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) oupela transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas,por exemplo, pode ser efetuada pela eletroporação (ver, por exemplo, Choi etal., 2006, J. Microbial. Methods 64: 391-397) ou pela conjugação (ver, porexemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Aintrodução de DNA em uma célula de Streptococcus, por exemplo, pode serefetuada pela competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu,1981, Infect. Immun, 32: 1295-1297), pela transformação de protoplasto (ver,por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-2070, pelaeletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al,. 1999, Appl. Environ,Microbiol. 65: 3800-3804) ou pela conjugação (ver, por exemplo, Clewell,1981, Microbial. Rev. 45: 409-436), Entretanto, qualquer método conhecidona para a introdução de DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal comouma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célulafungica. "Fungos" como aqui usado inclui os filos Ascomycota,Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido porHawksworth et al., Em, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8aedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assimcomo o Oomyeota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula de levedura. "Levedura" como aqui usado inclui leveduraascosporogênea (Endomyeetales), levedura basidiosporogênea e levedurapertencente ao Fungi Imperfeeti (Blastomycetes). Visto que a classificação delevedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, leveduradeve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner,EA., Passmore, S. M. e Davenport, R. R., eds, Soe. App. Bacterial.Symposium Series No. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia,Saccharomyees, Schizosaccharomyces ou Yarrowia,

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de leveduraé uma célula de Saccharomyces earlsbergensis, Saccharomyces eerevisiae,Saccharomyces diastatieus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyceskluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyees oviformis. Em umoutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula deKlvyveromyces laetis. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitiea.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica é uma célula fungica filamentosa. "Fungos Filamentosos" incluemtodas as formas filamentosas da subdivisão Eumyeota e Oomyeota (comodefinido por Hawksworth et ai., 1995, supra). Os fungos filamentosos são nogeral caracterizados por uma parede de micélios composta de quitina,celulose, glicano, quitosano, manana e outros polissacarídeos complexos. Ocrescimento vegetativo é pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono éobrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo pelasleveduras tais como Saccharomyees eerevisiae é pelo brotamento de um talounicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula de Aeremonium. Aspergillus,Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus,Coriolus, Cryptoeoeeus, Filibasidium, Fusatium, Humicola, Magnaporthe,Mueor, Myeeliophthora, Neoeallimastix, Neurospora, Paecilomyees,Penicillium, Phaneroehaete, Phlebia, Piromyees, Pieurotus, Sehtzophilium,Talammyees, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes- ouTriehoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungicafilamentosa é uma célula de Aspergillus awatroti, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae, Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium baetridioides.Fusarium eerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum. Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioid.es,Fusarium sulphureum- Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ouFusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta,Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa,Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporiumkeratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum,Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola,Chrysosporium queensiandieum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus,Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei,Mycellophthora thermophila, Neurospora Grasse, Penicillium brasilianum,Penieillium purpurogenum. Phaneroehaete ehrysosporium, Phlebia radiate,Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor,Triehoderma harzianum, Triehoderma koningii, Triehodermalongibraehiatum, 'Triehoderma taesel ou Triehoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processoenvolvendo a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos eregeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Osprocedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras deAspergillus e Trichoderma são descritas na EP 238 023 e Yelton et al., 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81' 1470-1474. Osmétodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritas porMalardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedura podeser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente,Em Abelson, J. N. e Simon, Μ, I, editores, Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187,Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

Métodos de Produção

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivaruma célula, que na sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sobcondições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar opolipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Thielavia. Emum aspecto mais preferido a célula é de Thielavia terrestris. Em um aspectomais preferido a célula é de Thielavia terrestris NRRL 8126.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivaruma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivaruma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência denucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, emque a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo quecompreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQID NO: 4 e (b) recuperar o polipeptídeo.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem osaminoácidos de 19 a 396 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 20 a 400 da SEQ ID NO: 4. Emum outro aspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 110 a 1557 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspectopreferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 58 a 1200 da SEQ ID NO: 3.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células sãocultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode sercultivada pelo cultivo em frasco agitado e fermentação em pequena escala ougrande escala (incluindo as fermentações contínuas, batelada, lote alimentadoou estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizadasem um meio adequado e sob condições que possibilitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutrienteadequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos,usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados sãodisponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordocom composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, opolipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo nãoé secretado no meio, o mesmo pode ser recuperado de lisados de célula.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodosconhecidos na técnica que sejam específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formaçãode um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Porexemplo, um ensaio enzimático pode ser usado para determinar a atividade dopolipeptídeo como aqui descrito.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado domeio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas nãolimitado a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização,evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadospor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, masnão limitado a, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade,hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentoseletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidadediferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGEou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e LarsRyden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterpolipeptídeos substancialmente puros.

Plantas

A presente invenção também diz respeito a plantas, porexemplo, uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta,compreendendo um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeotendo atividade de endoglucanase da presente invenção de modo a expressar eproduzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode serrecuperado da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parteda planta contendo o polipeptídeo recombinante podem ser usadas como taispara melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar ovalor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir umfator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) oumonocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot sãogramas, tais como a grama dos prados (grama azul, Poa), grama forrageira talcomo Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis e cereais, porexemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (milho).

Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais comotremoço, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja e plantas crucíferas(família Brassicaceaé), tais como couve-flor, colza e o organismo modelointimamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Os exemplos de partes de planta são haste, calo, folhas, raiz,frutas, sementes e tubérculos assim como os tecidos individuais quecompreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima,tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos de célula de plantaespecíficos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos,peroxissomas e citoplasma também são considerados ser uma parte da planta.Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, éconsiderada ser uma parte da planta. Do mesmo modo, partes da planta taiscomo tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização dainvenção também são consideradas partes da planta, por exemplo, embriões,endospermas, aleurona e revestimentos de sementes.

Também incluídos dentro do escopo da presente invenção sãoa progênie de tais plantas, partes da planta e células vegetais.

A planta ou célula de planta transgênicas que expressam umpolipeptídeo da presente invenção podem ser construídas de acordo commétodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta sãoconstruídas pela incorporação de uma ou mais construções de expressão quecodifica um polipeptídeo da presente invenção no genoma do hospedeirovegetal ou genoma de cloroplasto e propagando a planta ou célula de plantamodificadas resultantes em uma planta ou célula de planta transgênicas.

A construção de expressão é convenientemente umaconstrução de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado comseqüências reguladoras apropriadas requeridas para a expressão da seqüênciade nucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além disso, aconstrução de expressão pode compreender um marcador selecionável útilpara identificar as células hospedeiras nas quais a construção de expressão foiintegrada e seqüências de DNA necessárias para a introdução da construçãona planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA aser usado).A escolha de seqüências reguladoras, tais como seqüênciaspromotoras e terminadoras e opcionalmente seqüências de sinal ou trânsito édeterminada, por exemplo, com base em quando, onde e como o polipeptídeoé desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene que codifica umpolipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível ou podeser específica de desenvolvimento, estágio ou tecido e o produto de gene podeser alvejado a um tecido ou parte da planta específicos tais como sementes oufolhas. As seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague etal., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, os promotores 3 5S-CaMV, daubiquitina 1 do milho e da actina 1 do arroz podem ser usados (Franck et al.,1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicosde órgão podem ser, por exemplo, um promotor dos tecidos de depósito dearmazenagem tais como sementes, tubérculos da batata e frutas (Edwards &Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) ou de tecidos de depósitometabólico tais como meristemas (Ito et al, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor da glutelina,prolamina, globulina ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant and CellPhysiology 39: 885-889), um promotor da Vicia faba da legumina B4 e ogene da proteína de semente desconhecido da Vicia faba (Conrad et al., 1998,Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína decorpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39:935-941), o promotor napA da proteína de armazenagem de Brassica napusou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, porexemplo, como descrito na WO 91/14772. Além disso, o promotor pode serum promotor específico de folha tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate(Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor do geneda adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, PlantMolecular Biology 26: 85-93) ou o promotor do gene aldP do arroz (Kagayaet al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) ou um promotorindutível por ferimento tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993,Plant Molecular Biology 22: 573-588). Do mesmo modo, o promotor pode serindutível pelos tratamentos abióticos tais como temperatura, seca oualterações na salinidade ou induzido pelas substâncias exogenamenteaplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios,hormônios vegetais tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico emetais pesados.

Um elemento realçador de promotor também pode ser usadopara se obter a expressão mais alta de um polipeptídeo da presente invençãona planta. Por exemplo, o elemento realçador de promotor pode ser um intronque é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al, 1993, supra,divulgam o uso do primeiro intron do gene da actina 1 do arroz para realçar aexpressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes daconstrução de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis natécnica.

A construção de ácido nucleico é incorporada no genomavegetal de acordo com técnicas convencionais conhecidas no ramo, incluindoa transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada porvírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística eeletroporação (Gasser et al, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990,Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Presentemente, a transferência de gene mediada pelaAgrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotstransgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, PlantMolecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usada para transformarmonocots, embora outros métodos de transformação sejam freqüentementeusados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerarmonocots transgênicas é o bombardeamento de partícula (partículas de ouroou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA transformador) de calosembrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162;Vasil et ai., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo paraa transformação de monocots está fundamentado na transformação deprotoplasto como descrito por Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology21:415-428.

Seguindo a transformação, os transformantes tendoincorporado a construção de expressão são selecionados e regenerados emplantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.Freqüentemente o procedimento de transformação é planejado para aeliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nasgerações seguintes usando-se, por exemplo, a co-transformação com duasconstruções de T-DNA separadas ou a excisão específica de sítio do gene deseleção por uma recombinase específica.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção que compreendem (a) cultivarum planta transgênica ou uma célula de planta que compreendem umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase da presente invenção sob condições condutivas para aprodução do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.Remoção ou Redução da Atividade de Endoglucanase

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um mutante de uma célula precursora, que compreende romper oudeletar uma seqüência de polinucleotídeo ou uma porção desta, quecodifiquem um polipeptídeo da presente invenção, que resulte na célulamutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula precursora quandocultivada sob as mesmas condições.

A célula mutante pode ser construída pela redução oueliminação da expressão de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos natécnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições ou deleções. Emum aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo é inativada. A seqüência denucleotídeo a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a regiãocodificadora ou uma parte desta essencial para a atividade ou um elementoregulador requerido para a expressão da região codificadora. Um exemplo deuma tal seqüência reguladora ou de controle pode ser uma seqüênciapromotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficientepara afetar a expressão da seqüência de nucleotídeo. Outras seqüências decontrole para a modificação possível incluem, mas não são limitadas a, umalíder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, seqüência depeptídeo de sinal, terminador de transcrição e ativador transcricional.

A modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeo podeser realizada submetendo-se a célula precursora à mutagênese e selecionandoquanto a células mutantes em que a expressão da seqüência de nucleotídeo foireduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória,pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagenizante físicoou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado ousubmetendo-se a seqüência de DNA à mutagênese gerada pela PCR. Alémdisso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinaçãodestes agentes mutagenizantes.

Os exemplos de um agente mutagenizante físico ou químicoadequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV),hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, metano sulfonato de etila (EMS), bissulfito desódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamenterealizada pela incubação da célula precursora a ser mutagenizada na presençado agente mutagenizante de escolha sob condições e triagem adequadas e/ouselecionando quanto a células mutantes que exibem expressão reduzida ounenhuma do gene.

A modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeo podeser realizada pela introdução, substituição ou remoção de um ou maisnucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido para a suatranscrição ou tradução. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ouremovidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, aremoção do códon de parada ou uma mudança na matriz de leitura aberta. Talmodificação ou inativação pode ser realizada pela mutagênese direcionada aosítio ou mutagênese gerada pela PCR de acordo com métodos conhecidos natécnica. Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, i.e.,diretamente na célula para expressar a seqüência de nucleotídeo a sermodificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro comoexemplificado abaixo.

Um exemplo de um modo conveniente para eliminar oureduzir a expressão de uma seqüência de nucleotídeo por um célula estáfundamentado em técnicas de substituição de gene, deleção de gene ourompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, umaseqüência de ácido nucleico que corresponde à seqüência de nucleotídeoendógena é mutagenizada in vitro para produzir uma seqüência de ácidonucleico defeituosa que é depois transformada na célula precursora paraproduzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a seqüência deácido nucleico defeituosa substitui a seqüência de nucleotídeo endógena. Podeser desejável que a seqüência de nucleotídeo defeituosa também codifique ummarcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que aseqüência de nucleotídeo foi modificada ou destruída. Em um aspectoparticularmente preferido, a seqüência de nucleotídeo é rompida com ummarcador selecionável tal como aqueles aqui descritos.

Alternativamente, a modificação ou inativação da seqüência denucleotídeo pode ser realizada pelas técnicas de anti-sentido ou RNAiestabelecidas usando uma seqüência complementar à seqüência denucleotídeo. Mais especificamente, a expressão da seqüência de nucleotídeopor uma célula pode ser reduzida ou eliminada pela introdução de umaseqüência complementar à seqüência de nucleotídeo do gene que pode sertranscrita na célula e é capaz de hibridizar ao mRNA produzido na célula. Sobcondições que permitam que a seqüência de nucleotídeo de anti-sentidocomplementar hibridize com o mRNA, a quantidade de proteína traduzida éassim reduzida ou eliminada.

A presente invenção diz respeito ainda a uma célula mutantede uma célula precursora que compreende um rompimento ou deleção de umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma seqüência decontrole desta, que resulta na célula mutante produzindo menos dopolipeptídeo ou nenhum polipeptídeo comparada com a célula precursora.

As células mutantes deficientes em polipeptídeo assim criadassão particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão depolipeptídeos homólogos e/ou heterólogos. Portanto, a presente invenção dizrespeito ainda a métodos para produzir um polipeptídeo homólogo ouheterólogo que compreendem: (a) cultivar a célula mutante sob condiçõescondutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Otermo "polipeptídeos heterólogos" é aqui definido como polipeptídeos quenão são nativos para a célula hospedeira, uma proteína nativa em quemodificações foram feitas para alterar a seqüência nativa ou uma proteínanativa cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de umamanipulação da célula hospedeira pelas técnicas de DNA recombinantes.Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglucanase pela fermentação de uma célula que produz tantoum polipeptídeo da presente invenção assim como o produto de proteína deinteresse pela adição de uma quantidade eficaz de um agente capaz de inibir aatividade de endoglucanase para o caldo de fermentação antes, durante oudepois que a fermentação tem sido completada, recuperar o produto deinteresse do caldo de fermentação e opcionalmente submeter o produtorecuperado a outra purificação.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglucanase cultivando-se a célula sob condições quepermitam a expressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante aum tratamento de pH e temperatura combinados de modo a reduzir a atividadede endoglucanase substancialmente e recuperar o produto do caldo de cultura.Alternativamente, o tratamento de pH e temperatura combinados pode serrealizado em uma preparação de enzima recuperada do caldo de cultura. Otratamento de pH e temperatura combinados pode ser opcionalmente usadoem combinação com um tratamento com um inibidor de endoglucanase.

De acordo com este aspecto da invenção, é possível removerpelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelomenos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% e o maispreferivelmente pelo menos 99% da atividade de endoglucanase. A remoçãocompleta da atividade de endoglucanase pode ser obtida pelo uso destemétodo.

O tratamento de pH e temperatura combinados épreferivelmente realizado em um pH na faixa de 2 a 3 ou 10 a 11 e umatemperatura na faixa de pelo menos 75 a 85°C por um período suficiente detempo para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, de 1 a 3 horas ésuficiente.

Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto deinteresse podem ser realizados pelos métodos conhecidos na técnica.

Os métodos da presente invenção para produzir um produtoessencialmente isento de endoglucanase é de interesse particular na produçãode polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fóngicas tais comoenzimas. A enzima pode ser selecionada, por exemplo, de uma enzimaamilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulítica,oxidorredutase ou enzima que degrada a parede de célula de planta. Osexemplos de tais enzimas incluem uma aminopeptidase, amilase,amiloglucosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase,cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase,galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, glicose oxidase, glucosidase,haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lactase, ligase, lipase,liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase,fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase,transglutaminase ou xilanase. As células deficientes em endoglucanasetambém podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interessefarmacêutico tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores eoutros,

Deve ser entendido que o termo "polipeptídeos eucarióticos"inclui não apenas polipeptídeos nativos, mas também aqueles polipeptídeos,por exemplo, enzimas, que foram modificados pelas substituições, deíeçõesou adições de aminoácido ou outra de tais modificações para realçar aatividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e outras.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a umproduto de proteína essencialmente livre da atividade de endoglucanase que éproduzido por um método da presente invenção.

Métodos de Inibir a Expressão de um PolipeptídeoA presente invenção também diz respeito a métodos de inibir aexpressão de um polipeptídeo em uma célula, que compreendem administrar àcélula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo(dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de umpolinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNAtem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24; 25 ou mais nucleotídeosduplex no comprimento. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo tematividade de endoglucanase.

O dsRNA é preferivelmente um RNA interferente pequeno(siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA éRNA interferente pequeno (siRNAs) para inibir a transcrição. Em um outroaspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibir a tradução.

A presente invenção também diz respeito a tais moléculas deRNA de filamento duplo (dsRNA) para inibir a expressão de um polipeptídeoem uma célula, em que o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção deum polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ouSEQ ID NO: 4. Embora a presente invenção não seja limitada por qualquermecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar em uma célula e causar adegradação de um RNA de filamento simples (ssRNA) de seqüênciassimilares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula éexposta ao dsRNA, o mRNA do gene homólogo é seletivamente degradadopor um processo chamado de interferência de RNA (RNAi).

Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados emprodutos terapêuticos de silenciamento de gene. Em um aspecto, a invençãofornece métodos para degradar seletivamente RNA usando os dsRNAis dapresente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo.Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar umamutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Osmétodos para fabricar e usar moléculas de dsRNA para degradarseletivamente RNA são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, aPatente U.Sr Na 6.506.559, Patente U.S. Nfi 6.511.824; Patente U.S. Ne6.515.109; e Patente U.S. Ns 6.489.127.

Composições

A presente invenção também diz respeito às composições quecompreendem um polipeptídeo da presente invenção, Preferivelmente, ascomposições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo "enriquecido"indica que a atividade de endoglucanase da composição foi aumentada, porexemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presenteinvenção como o componente enzimático principal, por exemplo, umacomposição de mono-componente. Alternativamente, a composição podecompreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como umaaminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase.quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease,esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase,manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase,fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminaseou xilanase. A(s) enzima(s) adicional(is) pode(m) ser produzida(s), porexemplo, por um microorganismo pertencente ao gênero Aspergillus,preferivelmente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusariumbactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusariumreticulatum, Fusarium toseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sulphureum. Fusarium toruloseum, Fusariumtrichothecioides ou Fusarium venenatum-, Humicola, preferivelmenteHumicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma,preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas deacordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de umacomposição líquida ou uma seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeopode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeoa ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodosconhecidos na técnica.

Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos dascomposições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição depolipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição éusada pode ser determinada com base em métodos conhecidos na técnica.

Usos

A presente invenção também diz respeito a métodos paradegradar ou converter um material celulósico, que compreendem tratar omaterial celulósico com uma composição que compreenda uma quantidadeeficaz de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção. Em um aspecto preferido, o método compreende ainda recuperar omaterial celulósico degradado ou convertido.

Os polipeptídeos e células hospedeiras da presente invençãopodem ser usados na produção de monossacarídeos, dissacarídeos epolissacarídeos como estoques de alimentação química ou fermentação debiomassa celulósica para a produção de etanol, plásticos, outros produtos ouintermediários. A composição que compreende o polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase pode estar na forma de um caldo de fermentação bruto comou sem as células removidas ou na forma de uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada. Alternativamente, a composição pode compreenderuma célula hospedeira da presente invenção como uma fonte do polipeptídeotendo atividade de endoglucanase em um processo de fermentação com abiomassa. A célula hospedeira também pode conter genes nativo ouheterólogos que codificam outras proteínas e enzimas, mencionadas acima,úteis no processamento de biomassa. Em particular, os polipeptídeos e célulashospedeiras da presente invenção podem ser usadas para aumentar o valor deresíduos de processamento (grãos de destiladores secos, grãos gastos dafabricação de cerveja, bagaço de cana de açúcar, etc.) pela degradação parcialou completa de celulose ou hemicelulose. As composições também podemcompreender outras proteínas e enzimas úteis no processamento de biomassa,por exemplo, celobioidrolase, beta-glucosidase, enzimas hemicelulolítica,realçadores (WO 2005/074647, WO 2005/074656), etc.

Nos métodos da presente invenção, qualquer materialcelulósico, tal como biomassa, pode ser usado. E aqui entendido que o termo"material celulósico" abrange lignocelulose. A biomassa pode incluir, masnão é limitado a, recursos lenhoso, resíduos sólidos municipais, papel usado,safras e resíduos de safra (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, emHandbook on Bioetanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Taylor &Francis, Washington D. C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16;Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719:Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, emAdvances in Biochemical Engineering/Biotechnology T. Scheper, editorgeral, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque).

O polissacarídeo predominante na parede de célula primária de biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemi-celulose e oterceiro é a pectina. A parede de célula secundária, produzida depois que acélula parou de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada pelalignina polimérica covalentemente reticulada a hemicelulose. A celulose é umhomopolímero de anidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-D-glicano linear,enquanto que as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, taiscomo xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturasramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora no geralpolimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal primariamente comouma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. Ashemiceluloses usualmente ligam-se por hidrogênio à celulose, assim como aoutras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz de parede celular.

Três classes principais de enzimas são usadas para romper abiomassa celulósica:

(1) As "endo-l,4-beta-glucanases" ou 1,4-beta-D-glicano-4-glicanoidrolases (EC 3.2.1.4), que atuam aleatoriamente em substratos de 1,4-beta-glicano solúveis e insolúveis.

(2) As "exo-l,4-beta-D-glucanases" incluindo tanto as 1,4-beta-D-glicano glicoidrolases (EC 3.2.1.74), que liberam D-glicose a partir de1,4-beta-D-glicanos e hidrolisam D-celobiose lentamente e celobioidrolases(1,4-beta-D-glicano celobioidrolases. EC 3.2.1.91), que liberam D-celobiosede 1,4-beta-glicanos.

(3) As "beta-D-glucosidases" ou beta-D-glicosídeoglicoidrolases (EC 3.2.1.21), que atuam para liberar unidades de D-glicose decelobiose e celodextrinas solúveis, assim como uma série de glicosídeos.

Os polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção são preferivelmente usados em conjunção com outras proteínascelulolíticas, por exemplo, exo-l,4-beta-D-glucanases e beta-D-glucosidases,para degradar o componente de celulose do substrato de biomassa, (ver, porexemplo. Brigham et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E.Wyman, editor), pp, 119-141 Taylor & Francis, Washington DC.: Lee, 1997,Journal of Biotechnology 56: 1-24). O termo "proteínas celulolíticas" é aquidefinido como aquelas proteínas ou misturas de proteínas mostradas comosendo capazes de hidrolisar ou converter ou degradar a celulose sob ascondições testadas.

As exo-l,4-beta-D-glucanases e beta-D-glucosidases podemser produzidas por qualquer método conhecidos na técnica (ver, por exemplo,Bennett, J. W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press, CA, 1991).

As quantidades ótimas de um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase e outras proteínas celulolíticas depende de diversos fatoresincluindo, mas não são limitados à mistura de proteínas celulolíticascomponentes, o substrato celulósico, a concentração de substrato celulósico,o(s) pré tratamento(s) do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH einclusão de organismo de fermentação (por exemplo, levedura para aSacarificação e Fermentação Simultâneas).

Em um aspecto preferido, a quantidade de polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase por g de material celulósico é de cerca de 0,5 acerca de 50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente decerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 15 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e omais preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de materialcelulósico.

Em um outro aspecto preferido, a quantidade de proteínascelulolíticas por g de material celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg,preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente decerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e o mais preferivelmente decerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

Nos métodos da presente invenção, a composição pode sersuplementada por uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorara degradação do material celulósico. As enzimas adicionais preferidas sãohemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases e/ou cutinases),proteases, lacases, peroxidases ou misturas destes.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s)adicional(is) pode(m) ser adicionadas antes ou durante a fermentação,incluindo durante ou depois da propagação do(s) microorganismo(s) defermentação.

As enzimas podem ser derivadas ou obtidas a partir dequalquer origem adequada, incluindo, origem bacteriana, fungica, de leveduraou mamífera. O termo "obtida" significa aqui que a enzima pode ter sidoisolada de um organismo que naturalmente produz a enzima como umaenzima nativa. O termo "obtida" também significa aqui que a enzima pode tersido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, em que aenzima recombinantemente produzida é nativa ou estranha para o organismohospedeiro ou tem uma seqüência de aminoácido modificada, por exemplo,tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos,isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou umfragmento de uma seqüência de aminoácido nativa ou uma enzima produzidapelos processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica.Abrangidos dentro do significado de uma enzima nativa estão as variantesnaturais e dentro do significado de uma enzima estranha estão variantesobtidas recombinantemente, tais como pela mutagênese direcionada ao sítioou embaralhamento.

As enzimas também podem ser purificadas. O termo"purificada" como aqui usado abrange enzimas livres de outros componentesdo organismo a partir do qual a mesma é derivada. O termo "purificada"também abrange enzimas livres de componentes do organismo nativo a partirdo qual a mesma é obtida. As enzimas podem ser purificadas, apenas comquantidades menores de outras proteínas estando presentes. A expressão"outras proteínas" diz respeito em particular a outras enzimas. O termo"purificada" como aqui usado também refere-se à remoção de outroscomponentes, particularmente outras proteínas e mais particularmente outrasenzimas presentes na célula de origem da enzima da invenção, A enzima podeser "substancialmente pura," isto é, livre de outros componentes do organismono qual a mesma é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiropara as enzimas recombinantemente produzidas. Em um aspecto preferido, asenzimas são pelo menos 75% (p/p), preferivelmente pelo menos 80%, maispreferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%,mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, ainda mais preferivelmente pelomenos 98% ou o mais preferivelmente pelo menos 99% puras. Em um outroaspecto preferido, a enzima é 100% pura.

As enzimas usadas na presente invenção pode estar emqualquer forma adequada para o uso nos processos aqui descritos, tais como,por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células, um pó ougranulado secos, um granulado não pulverulento, um líquido, um líquidoestabilizado ou uma enzima protegida. Os granulados podem ser produzidos,por exemplo, como divulgado nas Patentes U.S. Nss 4.106.991 e 4.661.452 epodem ser opcionalmente revestidos por processos conhecidos na técnica. Aspreparações de enzima líquidas, por exemplo, podem ser estabilizadas pelaadição de estabilizadores tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou umoutro poliol e/ou ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo comprocesso estabelecido. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordocom o processo divulgado na EP 238.216.

Os métodos da presente invenção podem ser usados paraprocessar um material celulósico em muitos produtos orgânicos, produtosquímicos e combustíveis úteis, Além de etanol, algumas mercadorias eprodutos químicos especiais que podem ser produzidos a partir de celuloseincluem xilose, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (porexemplo, ácido láctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol,furfiiral, poliidroxialcanoatos, eis, ácido cis-mucônico e ração de animal(Lynd, L. R., Wyman, C. E e Gerngross, T. U., 1999. BiocommodityEngineering, Biotechnol. Prog., 15: 777-793; Philippidis, G. P.. 1996,Cellulose bioconversion technology, no Handbook on Bioethanol Productionand Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212: e Ryu. D. D. Y. e Mandeis, M., 1980, Cellulases: biosynthesis andapplications, Enz. Microb. Technol., 2: 91-102), os benefícios de co-produçãopotenciais estendem-se além da síntese de produtos orgânicos múltiplos apartir de carboidrato fermentáveis. Os resíduos ricos em lignina quepermanecem depois do processamento biológico podem ser convertidos paraprodutos químicos derivados de lignina ou usados para energizar a produção.

Os métodos convencionais usados para processar o materialcelulósico de acordo com os métodos da presente invenção são bementendidos por aqueles habilitados na técnica. Os métodos da presenteinvenção podem ser implementados usando qualquer aparelho que processebiomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

Um tal aparelho pode incluir um reator de lote agitado, umreator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, um reator de coluna detampão de fluxo contínuo (Gusakov, Α. V. e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics ofthe enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batchreactor process, Enz. Microb. Technol, 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu,S. K. e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attritionbioreactor, Biotechnot. Bioeng, 25: 53-65) ou um reator com agitaçãointensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, Α. V., Sinitsyn,A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement ofenzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensivestirring induced by electromagnetic field, AppL Biochem. Biotechnol. 56:141-153).

Os métodos convencionais incluem, mas não são limitados a,sacarificação, fermentação, hidrólise e fermentação separadas (SHF),sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentaçãosimultâneas (SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHF) e conversãomicrobiana direta (DMC).

A SHF usa etapas de processo separadas para primeirohidrolisar enzimaticamente a celulose para glicose e depois fermentar aglicose para etanol, Na SSF, a hidrólise enzimática de celulose e afermentação de glicose para etanol são combinadas em uma etapa(Philippidis, G. P, 1996, Cellulose bioconversion technology, no Handbookon Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212). A SSCF inclui a cofermentação deaçúcares múltiplos (Sheehan, J. e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy andthe environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy'sresearch and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15:817-827). A HHF inclui duas etapas separadas realizadas no mesmo reator mas emtemperaturas diferentes, i.e., sacarificação enzimática de alta temperaturaseguida por SSF em uma temperatura mais baixa que a cepa de fermentaçãopossa tolerar. DMC combina todos os três processos (produção de celulose,hidrólise da celulose e fermentação) em uma etapa (Lynd, L R., Weimer. P. J.,van Zil, W. H. e Pretorius, S., 2002, Microbial cellulose utilization:Fundamentais and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577).

"Fermentação" ou "processo de fermentação" referem-se aqualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreenda umaetapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, sem limitação,processos de fermentação usados para produzir produtos de fermentaçãoincluindo álcoois (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol,1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácidoacético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido2,5-diceto-D-glicônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácidoglicônico. ácido glicurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácidoitacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácidopropiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (por exemplo, acetonâ);aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina,serina e treonina); gases (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido decarbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)). Os processos de fermentaçãotambém incluem processos de fermentação usados na indústria de álcoolconsumivel (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínio (porexemplo, produtos de laticínio fermentado), indústria do couro e indústria dotabaco.

A presente invenção diz respeito ainda a métodos de produziruma substância, que compreendem: (a) sacarificar um material celulósico comuma composição que compreenda uma quantidade eficaz de um polipeptídeotendo atividade de endoglucanase; (b) fermentar o material celulósicosacarificado da etapa (a) com um ou mais microorganismos de fermentação: e(c) recuperar a substância da fermentação. A composição que compreende opolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase pode estar na forma de umcaldo de fermentação bruto com ou sem as células removidas ou na forma deuma preparação de enzima semi-purificada ou purificada ou a composiçãopode compreender uma célula hospedeira da presente invenção como umafonte do polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase em um processo defermentação com a biomassa.

A substância pode ser qualquer substância derivada dafermentação. Em uma forma de realização preferida, a substância é um álcool.Deve ser entendido que o termo "álcool" abrange uma substância que contémuma ou mais porções de hidroxila. Em uma forma de realização maispreferida, o álcool é arabinitol. Em uma outra forma de realização maispreferida, o álcool é butanol. Em uma outra forma de realização maispreferida, o álcool é etanol. Em uma outra forma de realização mais preferida,o álcool é glicerol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcoolé metanol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é 1,3-propanodiol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool ésorbitol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é xilitol.Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, EthanolProduction firam renewable resources. em Advances in BiochemicalEngineering/ Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag BerlinHeidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, Μ. M. e Jonas, R.: 2002: Thebiotechnological production of sorbitol, App. Microbiol, Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P. e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production ofxilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T.C., Qureshi, N. e Blaschek. H. P., 2003, Production of acetone, butanal andethanol by Clostridium beijerinckii BAlOl and in situ recovery by gasstripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância é umácido orgânico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é ácido acético. Em uma outra forma de realização mais preferida, oácido orgânico é o ácido acetônico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido adípico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido ascórbico. Em uma outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido cítrico. Emuma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido 2,5-diceto-D-glicônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é o ácido fórmico, Em uma outra forma de realização mais preferida,o ácido orgânico é o ácido fumárico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido glucárico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glicônico. Em uma outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glicurônico.Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácidoglutárico. Em uma outra forma de realização preferida: o ácido orgânico é oácido 3-hidroxipropiônico. Em uma outra forma de realização mais preferida,o ácido orgânico é o ácido itacônico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido láctico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido málico, Em uma outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido malônico. Emuma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácidooxálico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico éo ácido propiônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é o ácido succínico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R. eLee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction firom celulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância éuma cetona. Deve ser entendido que o termo "cetona" abrange uma substânciaque contém uma ou mais porções de cetona. Em uma outra forma derealização mais preferida, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi eBlaschek, 2003, supra.

Em uma outra forma de realização preferida, a substância é umaminoácido. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é o ácido aspártico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o aminoácido é o ácido glutâmico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é glicina. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é lisina. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é serina. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo,Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poli(glutamic acid) production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em uma outra forma de realização preferida; a substância é umgás. Em uma outra forma de realização mais preferida, o gás é metano. Emuma outra forma de realização mais preferida, o gás é H2. Em uma outraforma de realização mais preferida, o gás é CO2. Em uma outra forma derealização mais preferida, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A.Miya e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuousculture system of hydrogen-producting anaerobic bactéria, Water Science andTechnology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V. N. em Biomass and Bioenergy,Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for metaneproduction: A review.

A produção de uma substância a partir de material celulósicotipicamente requer quatro etapas principal. Estas quatro etapas são prétratamento, hidrólise enzimática, fermentação e recuperação. E exemplificadoabaixo um processo para produzir etanol, mas deve ser entendido queprocessos similares podem ser usados para produzir outras substâncias, porexemplo, as substâncias descritas acima.

Pré tratamento. Na etapa de pré tratamento ou pré-hidrólise, omaterial celulósico é aquecido para quebrar a lignina e a estrutura decarboidrato, solubilizar a maior parte da hemicelulose e tornar a fração decelulose acessível às enzimas celulolíticas. O aquecimento é realizadodiretamente com vapor ou em pasta fluída onde um catalisador também podeser adicionado ao material para acelerar as reações. Os catalisadores incluemácidos fortes, tais como ácido sulfurico e SO2. ou álcali, tal como hidróxidode sódio. O propósito do estágio de pré-tratamento é facilitar a penetração dasenzimas e microorganismos. A biomassa celulósica também pode sersubmetida a um pré tratamento de explosão de vapor hidrotérmica (Ver aPatente U.S. Pedido N° 20020154730).

Sacarificação. Na etapa de hidrólise enzimática, tambémconhecida como sacarificação, as enzimas como aqui descritas sãoadicionadas ao material pré tratado para converter a fração de celulose paraglicose e/ou outros açúcares. A sacarificação é no geral realizada em reatoresou fermentadores de tanque agitado sob condições de pH, temperatura emistura controladas. Uma etapa de sacarificação pode durar até 200 horas, Asacarificação pode ser realizada em temperaturas de cerca de 30°C a cerca de65°C, em particular em torno de 50°C e em um pH na faixa entre cerca de 4 ecerca de 5, especialmente em torno do pH 4,5. Para produzir glicose que podeser metabolizada pela levedura, a hidrólise é tipicamente realizada napresença de uma beta-glucosidase,

Fermentação. Na etapa de fermentação, os açúcares, liberadosdo material celulósico como um resultado das etapas de pré tratamento ehidrólise enzimática, são fermentados até etanol por um organismo defermentação, tal como levedura. A fermentação também pode ser realizadasimultaneamente com a hidrólise enzimática no mesmo vaso, mais uma vezsob condições de pH, temperatura e mistura controladas. Quando asacarificação e fermentação são realizadas simultaneamente no mesmo vaso,o processo é no geral chamado de sacarificação e fermentação simultâneas ouSSF.

Qualquer substrato celulósico ou matéria prima adequadospode ser usado em um processo de fermentação da presente invenção. Osubstrato é no geral selecionado com base no produto de fermentaçãodesejado, isto é, a substância a ser obtida a partir da fermentação e noprocesso utilizado, como é bem conhecido na técnica. Os exemplos desubstratos adequados para o uso nos métodos da presente invenção incluemmateriais contendo celulose, tais como madeira ou resíduos vegetais ouaçúcares de peso molecular baixo DP1-3 obtido a partir de material celulósicoprocessado que podem ser metabolizados pelo microorganismo defermentação e que podem ser fornecidos pela adição direta ao meio defermentação.

O termo "meio de fermentação" será entendido referir-se a ummeio antes que o(s) microorganismo(s) de fermentação seja(sejam)adicionado(s), tal como, um meio que resulta de um processo desacarificação, assim como um meio usado em um processo de sacarificação efermentação simultâneas (SSF).

"Microorganismo de fermentação" refere-se a qualquermicroorganismo adequado para o uso em um processo de fermentaçãodesejado. Os microorganismos de fermentação adequados de acordo com ainvenção são capazes de fermentar isto é, converter, açúcares, tais comoglicose, xilose, arabinose, manose, galactose ou oligossacarídeos direta ouindiretamente no produto de fermentação desejado. Os exemplos demicroorganismos de fermentação incluem organismos füngicos, tais comolevedura. A levedura preferida inclui cepas da Saccharomyces spp. e emparticular, Saccharomyees eerevisiae. A levedura comercialmente disponívelinclui, por exemplo, Red Star®/Lesaffre Ethanol Red (disponível da RedStar/Lesaffre, USA) FALI (disponível da Fleischmann's Yeast, uma divisãoda Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponível da Alltech),GERT STRAND (disponível da Gert. Strand AB, Suécia) e FERMIOL(disponível da DSM Specialties).

Em um forma de realização preferida, a levedura é umaSaccharomyces spp. Em uma forma de realização mais preferida, a levedura éSacehammyees eerevisiae. Em uma outra forma de realização mais preferida,a levedura é Saccharomyces distatieus. Em uma outra forma de realizaçãomais preferida, a levedura é Sacchammyees uvarum. Em uma outra forma derealização preferida, a levedura é uma Kluyveromyces. Em uma outra formade realização mais preferida, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em umaoutra forma de realização mais preferida, a levedura é Kluyveromyces fragüis.Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Candida, Emuma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Candidapseudotropicalis. Em uma outra forma de realização mais preferida, alevedura é Candida brassicae. Em uma outra forma de realização preferida, alevedura é uma Clavispora. Em uma outra forma de realização mais preferida,a levedura é Clavispora lusitaniae. Em uma outra forma de realização maispreferida, a levedura é Clavispora opuntiae. Em uma outra forma derealização preferida, a levedura é uma Pachysolen. Em uma outra forma derealização mais preferida, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em uma outraforma de realização preferida, a levedura é uma Bretannomyces. Em umaoutra forma de realização mais preferida, a levedura é Bretannomycesclausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, emHandbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed.,Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

As bactérias que podem fermentar eficientemente glicose paraetanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridiumthermocellum (Philippidis, 1996, supra).

É bem conhecido na técnica que os organismos descritosacima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como aquidescrito.

A clonagem de genes heterólogos em Saccharomyeeseerevisiae (Chen, Z., Ho, N. W. Y., 1993, Cloning and improving theexpressão of Pichia stipitis xilose reductase gene in Saccharomyceseerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho, N. W. Y., Chen,Z. Brainard, A. P., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ.Microbiol. 64: 1852-1859) ou em bactérias tais como Escherichia eoli (Beall,D. S., Ohta, K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies of ethanol productionfrom xylose and other sugars by reeombinant Escheriehia coli, Biotech.Bioeng. 38: 296-303); Klebsiella oxitoca (Ingram, L. O., Comes, P. F., Lai,X., Moniruzzaman, M., Wood, B. E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998, Metabolie engineering of bactéria for ethanol production, BiotechnoL Bioeng,58: 204-214) e Zymomonas mobilis (Zhang. M. Eddy, C., Deanda, K.,Finkelstein, M. e Picataggio, S., 1995, Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in etanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, C.; e Picataggio, S., 1996, Developmentof a arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering, Appl. Environ. Microbial. 62: 4465-4470) tem levado àconstrução de organismos capazes de converter hexoses e pentoses paraetanol (co-fermentação).

Levedura ou um outro microorganismo tipicamente éadicionado à celulose degradada ou hidrolisado e a fermentação é continuadapor cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal como de cerca de 35 a cerca de 60horas. A temperatura está tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 40°C,em particular em cerca de 32°C e de cerca do pH 3 a cerca do pH 6, emparticular em torno do pH 4-5.

Em um forma de realização preferida, levedura ou um outromicroorganismo é aplicado à celulose degradada ou hidrolisado e afermentação é continuada por cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal comotipicamente 35 a 60 horas, Em uma forma de realização preferida, atemperatura está no geral entre cerca de 26 a cerca de 40°C, em particular decerca de 32°C e o pH é no geral de cerca de pH 3 a cerca de pH 6,preferivelmente em torno do pH 4-5. Levedura ou um outro microorganismosão preferivelmente aplicados em quantidades de aproximadamente 10 a 10 ,preferivelmente de aproximadamente 10 a 10 , de modo especial deaproximadamente 5x10 contagens viáveis por ml de caldo de fermentação.Durante uma fase de produção de etanol a contagem de célula de leveduradeve estar preferivelmente na faixa de aproximadamente 10 a 10 ,especialmente em torno de aproximadamente 2 χ 10 . Orientação adicionalcom respeito ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrado, porexemplo, em "The Alcohol Textbook (Editores K. Jacques, Τ. P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é por meiodeste incorporada por referência.

O processo mais amplamente usado na técnica é o processo desacarificação e fermentação simultâneas (SSF) onde não há estágio decontenção para a sacarificação, significado que a levedura e a enzima sãoadicionadas juntas.

Para a produção de etanol, a seguir da fermentação a massa édistilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com o processo dainvenção pode ser usado como, por exemplo, etanol de combustível; etanol debeber, isto é, bebida alcoólica neutra potável ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado emcombinação com qualquer um dos processos enzimáticos aqui descritos paramelhorar ainda mais o processo de fermentação e em particular, odesempenho do microorganismo de fermentação, tal como, realce da taxa erendimento de etanol. Um "estimulador de fermentação" refere-se aosestimuladores para o cultivo do microorganismos de fermentação, emparticular, levedura. Os estimuladores de fermentação para cultivo incluemvitaminas e minerais. Os exemplos de vitaminas incluem multivitaminas,biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina,ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e Vitaminas A, B, C, D eE. Ver, por exemplo, Alfenore et al., improving ethanol production andviability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy duringfed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é por meio deste incorporadapor referência. Os exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais quepossam fornecer nutrientes que compreendam Ρ, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu

Recuperação. O álcool é separado do material celulósicofermentado e purificado pelos métodos convencionais de distilação. Etanolcom uma pureza de até cerca de 96% em vol. de etanol pode ser obtido, quepode ser usado como, por exemplo, etanol de combustível, etanol de beber,isto é, bebidas alcoólicas neutras potáveis ou etanol industrial.

Para outras substâncias, qualquer método conhecido na técnicapode ser usado incluindo, mas não são limitados a, cromatografia (porexemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização eexclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo,focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo,precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, destilação ou extração.

Nos métodos da presente invenção, o polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase e outra(s) proteína(s) celulolítica(s) pode(m) sersuplementada(s) por uma ou mais atividades de enzima adicionais paramelhorar a degradação do material celulósico. As enzimas adicionaispreferidas são hemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipasese/ou cutinases), proteases, lacases, peroxidases ou misturas destas.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s)adicional(is) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação,incluindo durante ou depois da propagação do(s) microorganismo(s) defermentação.

Peptídeos de Sinal

A presente invenção também diz respeito às construções deácido nucleico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em queo gene é operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codificaum peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a18 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4, em que ogene é estranho para a primeira e segunda seqüências de nucleotídeo.

Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste dos nucleotídeos de 56 a 109 da SEQ ID NO: 1. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 1 a 57 da SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes quecompreendem tais construções de ácido nucleico.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir uma proteína que compreende (a) cultivar uma tal célula hospedeirarecombinante sob condições adequadas para a produção da proteína: e (b)recuperar a proteína.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célulahospedeira. O termo "proteína" não é aqui intencionado a se referir a umcomprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange peptídeos,oligopeptídeos e proteínas. O termo "proteína" também abrange dois ou maispolipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínastambém incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinaçãode seqüências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas a partir de pelomenos duas proteínas diferentes em que uma ou mais podem ser heterólogasou nativas para a célula hospedeira. As proteínas incluem ainda variaçõesalélicas que ocorrem naturalmente e variações engendradas das proteínasmencionadas acima e proteínas híbridas.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste,enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste ou repórter. Emum aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidorredutase, transferase,hidrolase, liase, isomerase ou ligase. Em um aspecto ainda mais preferido, aproteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase,catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina, glicosiltransferase,desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase,glicoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, lacase, uma outralipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase,fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminaseou xilanase.

O gene pode ser obtido a partir de qualquer procariótico,eucariótico ou outra fonte.

A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplosque não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção,

Exemplos

Materiais

Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram produtos

comerciais de pelo menos grau reagente.

Cepas

Thielavia terrestris NRRL 8126 foi usada como a fonte dospolipeptídeos da Família 6 tendo atividade de endoglucanase. ASaccharomyces eerevisiae cepa W3124 (MATa: ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200: pep 4-1137: prcl::HIS3: prbl; LEU2; cir+) foi usada para a triagem debibliotecas de expressão de Thielavia terrestris NRRL 8126 quanto aatividade de endoglucanase. Aspergillus oryzae cepa HowB 104 (negativa emalfa-amilase) foi usada para a expressão do polipeptídeo CEL6B de Thielaviaterrestris NRRL 8126 tendo atividade de endoglucanase. Aspergillus oryzaecepa JaL250 (WO 99/61651) foi usada para a expressão do polipeptídeoCEL6C de Thielavia terrestris NRRL 8126 tendo atividade de endoglucanase.

Meios e Soluções

O meio LB foi composto por litro de 10 g de triptona, 5 g deextrato de levedura e 5 g de cloreto de sódio,

O meio LB ampicilina foi composto por litro de 10 g detriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio e 50 μg deampicilina por ml (esterilizado por filtração, adicionado depois daautoclavagem).

As placas de LB ampicilina foram compostas por litro de meioLB ampicilina e 15 g de bacto ágar.

O meio YEG foi composto de 0,5% de extrato de levedura e2% de glicose.

O meio YPD foi composto de 1% de extrato de levedura, 2%de peptona e esterilizado por filtração 2% de glicose adicionados depois daautoclavagem.

O meio YPM foi composto de 1% de extrato de levedura, 2%de peptona e esterilizado por filtração 2% de maltodextrina adicionadosdepois da autoclavagem.

O meio SC-URA com galactose foi composto por litro de 100ml de IOX sais Basais, 28 ml de casaminoácidos a 20% sem vitaminas, 10 mlde triptofano a 1%, 3,6 ml de treonina a 5% (esterilizada por filtração,adicionada depois da autoclavagem) e 100 ml de galactose a 20% (esterilizadapor filtração, adicionada depois da autoclavagem).

O meio SC-URA com glicose foi composto por litro de 100 mlde 10X solução de sais Basais, 28 ml de casaminoácidos a 20% semvitaminas, 10 ml de triptofano a 1%, 3,6 ml de treonina a 5% (esterilizada porfiltração, adicionada depois da autoclavagem) e 100 ml de glicose a 20%(esterilizada por filtração, adicionada depois da autoclavagem).

A solução 10X sais Basais foi composta por litro de 75 g debase de nitrogênio de levedura, 113 g de ácido succínico e 68 g de NaOH.

SC-ágar foi composto por litro de meio SC-URA (com glicoseou galactose como indicado) e 20 g de ágar.

As placas com 0,1% de AZCL HE celulose SC ágar comgalactose foram compostas por litro de meio SC-URA com galactose, 20 g deágar e 0,1% de AZCL HE celulose (Megazyme, Wcklow, Irlanda).O meio PD com celulose foi composto por litro de 24 gramasde dextrose de batata (Difco) e 30 gramas de Solcafloc (Diacel disponível daDicalie-Europe-Nord, Gent, Bélgica)

O meio de dextrose de batata foi composto por litro de 39 gramas de dextrose de batata (Difco).

As placas de FDA foram compostas por litro de 39 gramas dedextrose de batata ágar.

O meio MDU2BP foi composto por litro de 45 g de maltose, 1g de MgSO4.7H2O, 1 g de NaCl, 2 g de K2SO4, 12 g de KH2PO4, 7 g de extrato de levedura, 2 g de uréia e 0,5 ml de solução de metais traço AMG,pH ajustado para 5,0.

A solução de metais traço AMG foi composta por litro de 14,3g de ZnSO4.7H2O, 2,5 g de CuSO4.5H2O, 0,5 g de NiCl2.6H20, 13,8 g deFeSo4.7H2O, 8,5 g de MnSO4-H2O e 3 g de ácido cítrico. As placas COVE foram compostas por litro de 342,3 g de

sacarose, 20 ml de solução salina de COVE5 10 ml de acetamida 1 M, 10 mlde CsCl2 1,5 M e 25 g de Noble ágar.

A solução salina de COVE foi composta por litro de 26 g deKCl5 26 g de MgSO4.7H2O, 76 g de KH2PO4 e 50 ml de solução de metais traço COVE.

A solução de metais traço COVE foi composta por litro de0,04 g de Na2B4O7-IOH2O, 0,4 g de CuSO4.5H2O, 1,2 g de FeSO4JH2O, 0,7 gde MnSO4-H2O5 0,8 g de Na2Moo2.2H2O e 10 g de ZnSO4.7H2O.

A solução de metais traço foi composta por litro de 41,2 mg de FeCl3.6H2O, 11,6 mg de ZnSO4JH2O, 5,4 mg de MnSO4-H2O5 2,0 mg deCuSO4.5H2O, 0,48 mg de H3BO3 e 67,2 mg de ácido cítrico.

O meio SOC foi composto de 2% de triptona, 0,5% de extratode levedura, 10 mM de NaCl5 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM deMgSO4 e esterilizado por filtração glicose a 20 mM, adicionados depois daautoclavagem.

O meio de congelamento foi composto de 60% de meio SOC e40% de glicerol.

O meio 2X YT foi composto por litro de 16 g de triptona, IOgde extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de Bacto ágar.

O TE foi composto de 10 mM de Tris pH 7,4 e 0,1 mM deEDTA.

Exemplo 1: Extração de DNA genômico de Thielavia terrestris NRRL8126

Thielavia terrestris NRRL 8126 foi cultivada em 25 ml demeio YEG a 37°C e 250 rpm por 24 horas. Micélios foram depois coletadospela filtração através Miracloth® (CalBiochem, La Jolla, CA, USA) e lavadouma vez com 25 ml de tampão de 10 mM de Tris-I mM de EDTA (TE). Otampão em excesso foi drenado da preparação de micélios, que foisubseqüentemente congelada em nitrogênio líquido. A preparação de micélioscongelados foi triturada a um pó fino em um moedor de café elétrico e o pófoi adicionado a um tubo de centrífuga plástico descartável contendo 20 ml detampão de TE e 5 ml de 20% p/v de dodecil sulfato de sódio (SDS). A misturafoi suavemente invertida várias vezes para garantir a mistura e extraída duasvezes com um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1v/v/v). Acetato de sódio (solução 3 M) foi adicionada à amostra extraída auma concentração final de 0,3 M seguida por 2,5 volumes de etanol geladopara precipitar o DNA. O tubo foi centrifugado a 15.000 χ g por 30 minutospara pelotizar o DNA. A pelota de DNA foi deixada secar ao ar por 30minutos antes da recolocação em suspensão em 0,5 ml de tampão TE. Aribonuclease A isenta de Dnase foi adicionada à pelota de DNA recolocadaem suspensão a uma concentração de 100 μg por ml e a mistura foi depoisincubada a 37°C por 30 minutos. A proteinase K (200 μg/ml) foi adicionada eo tubo foi incubado um adicional de uma hora a 37°C. Finalmente, a amostrafoi centrifugada por 15 minutos a 12.000 χ g e o sobrenadante foi aplicado aum tubo de distribuição Qiaprep® 8 (QIAGEN Inc., Valencia, CA5 USA). Ascolunas foram lavadas duas vezes com 1 ml de PB (QLAGEN Inc., Valencia,CA, USA) e 1 ml de PE (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) sob vácuo. ODNA isolado foi eluído com 100 μΐ de TE, precipitado com etanol, lavadocom 70% de etanol, secado sob vácuo, recolocado em suspensão in tampãoTE e armazenado a 4°C.

Para gerar o DNA genômico para a amplificação pela PCR,Thielavia terrestris NRRL 8126 foi cultivada em 50 ml de meio NNCYPsuplementado com 1% de glicose em um frasco agitado com defletor a 42°C e200 rpm por 24 horas. Os micélios foram colhidos pela filtração, lavado duasvezes em TE (10 mM de Tris-I mM de EDTA) e congelado sob nitrogêniolíquido. Um pedaço do tamanho de uma ervilha de micélios congelados foicolocado em suspensão em 0,7 ml de dodecil sulfato de lítio a 1% em TE erompidos pela agitação com um volume igual de pérolas de zirconia/sílica de0,1 mm (Biospec Products, Inc,, Bartlesville, OK, USA) por 45 segundos emum FastPrep FP120 (ThermoSavant, Holbrook. NY, USA). Os escombrosforam removidos pela centrifugação a 13.000 χ g por 10 minutos e osobrenadante depurado foi levado a 2,5 M de acetato de amônio e incubadosem gelo por 20 minutos. Depois do período de incubação, os ácidos nucleicosforam precipitados pela adição de 2 volumes de etanol. Depois dacentrifugação por 15 minutos em uma microcentrífuga a 4°C, a pelota foilavada em 70% de etanol e secada ao ar. O DNA foi recolocado em suspensãoem 120 μl de 0,1 X TE e incubados com 1 μΐ de RNase A isento de DNase a37°C por 20 minutos. Acetato de amônio foi adicionado a 2,5 M e o DNA foiprecipitado com 2 volumes de etanol. A pelota foi lavada em etanol a 70%,secada ao ar e recolocada em suspensão em tampão TE.

Exemplo 2: A amplificação pela PCR de um fragmento de gene cel6b deDNA genômico de Thielavia terrestris NRRL 8126Os iniciadores foram planejados com base nos motivosconservados encontrados em outras glicosil hidrolases da Família 6. Asseqüências de peptídeo específicas usadas para planejar o iniciador foram:EPDSLANLVT (correspondente aos aminoácidos de 167 a176 da SEQ ID NO: 2)

W[I, V]KPGGE[C,S] (aminoácidos de 343 a 350 da SEQ IDNO: 2)

A estratégia CODEHOP foi utilizada (Rose et ai, 1998, Nucleic Acids Res.26: 1628-1635) para planejar os seguintes iniciadores:Iniciador de Sentido:

5'-AGCCCGACTCCCTGGCNAAYCTGGINAC-3' (SEQ ID NO: 5)Iniciador de Anti-sentido:

5'-GCACTCGCCGCCNGGYTTNAYCCA-3' (SEQ ID NO: 6)

A amplificação foi realizada em um volume de 30 μΐ contendotampão IX AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 2,5unidades de AmpliTaq® DNA polimerase (Applied Biosystems, Foster City,CA, USA), 1 μΜ de cada iniciador de sentido e anti-sentido eaproximadamente 1 μg de DNA genômico de Thielavia terrestris. Aamplificação foi realizada em um Robocicler® (Stratagene, La Jolla, CA,USA) programado por 1 ciclo a 96°C por 3 minutos e 72°C por 3 minutos(durante o que a DNA polimerase foi adicionada); e 35 ciclos cada um a 94°Cpor 45 segundos, 58°C por 45 segundos e 12°C por 1 minuto; seguidos poruma extensão final a 72°C por 7 minutos.

Os produtos da reação foram fracionados em um gel deagarose a 1,6% usando 40 mM de tampão Tris base-20 mM de acetato desódio-1 mM de EDTA dissódico (TAE): e uma faixa de aproximadamente 800pares de base foi excisada, purificada usando um Kit de Extração em GelQIAEX® II (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) e subclonada usando um KitTOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O plasmídeo de umtransformante da Ε. coli foi seqüenciado e descoberto conter um inserto de789 pares de base que codifica uma proteína da Família 6 (CEL6B). Esteplasmídeo foi designado pPH23 (Figura 1).

Exemplo 3: Construção e triagem de biblioteca de DNA genômico deThielavia íerrestris NRRL 8126

Uma biblioteca de DNA genômico de Thielavia íerrestrisNRRL 8126 foi construída usando o vetor de clonagem de bacteriófagohZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) com células Y1090ZLda E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) como um hospedeiropara plaqueamento e purificação de bacteriofago recombinante e E. coliDHlOBzip (Life Technologies: Gaithersburg, MD, USA) para a excisão declones pZLl individuais contendo o gene cel6b.

DNA genômico de Thielavia íerrestris NRRL 8126 preparadocomo descrito no Exemplo 1 foi parcialmente digerido com Tsp 5091 efracionados por tamanho em géis de agarose a 1% usando tampão TAE. Osfragmentos de DNA que migram na faixa de tamanho de 3 a 7 kb foramexcisados e eluídos a partir do gel usando reagentes Prep-a-Gene (BioRadLaboratories; Hercules, CA, USA). Os fragmentos de DNA eluídos foramligados com ramos do vetor AZipLox clivados e desfosforilados com Eco RI(Life Technologies, Gaithersburg; MD, USA) e as misturas de ligação foramembaladas usando extratos de embalagem comerciais (Stratagene, La Jolla,CA, USA). As bibliotecas de DNA embaladas foram plaqueadas eamplificadas em células Y1090ZL da E. coli. A biblioteca de DNA genômiconão amplificada conteve 3,1 X IO6 pfu/ml (títulos de fundo sem nenhum DNAforam 2.0 X IO4 pfu/ml.

Um fragmento de sonda celób de Thielavia íerrestris foiamplificado a partir de pPH23 usando iniciadores homólogos ao vetor TOPOe Herculase® DNA Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA, USA): comomostrado abaixo.5 '-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTA-3' (SEQ ID NO: 7)5 '-ATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGAT-3' (SEQ ID NO: 8)

Cinqüenta picomoles de cada um dos iniciadores foram usadosem uma reação de PCR contendo 10 ng de pPH23, IX Tampão deAmplificação Herculase® (Stratagene: La Jolla, CA: USA), 1 μl de mistura a10 mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP e 2,5 unidades de Herculase® DNAPolymerase em um volume final de 50 μl. A amplificação foi realizada emum Robociclor® programado para 1 ciclo a 94°C por 1 minuto; e 20 cicloscada um a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto.O bloco de aquecimento depois foi para um ciclo de embebeção a 4°C.

O produto da reação foi isolado em um gel de agarose a 1,0%usando tampão TAE onde uma faixa de produto de 0,8 kb foi excisada a partirdo gel e purificada usando um Kit de Extração em Gel QIAquick® (QIAGENInc., Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Umaamostra de vinte e cinco ng do fragmento foi radiorrotulada com P usandoum Kit Prime-It® II (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Aproximadamente 90.000 placas da biblioteca foram tríadaspela hibridização de placa usando o fragmento de PCR rotulado como asonda. O DNA foi reticulado sobre membranas (Hybond N+, Amersham,Arlington Heights, LL, USA) usando um UV Stratalinker® (Stratagene, LaJolla, CA. USA). O fragmento de gene radiorrotulado com P foi desnaturadopela adição de hidróxido de sódio a uma concentração final de 0,1 Meadicionado a uma solução de hibridização contendo 6X SSPE, 7% de SDS auma atividade de aproximadamente 1 χ IO6 cpm por ml de solução dehibridização. A mistura foi incubada durante a noite a 65°C em um banho deágua sob agitação. A seguir da incubação, as membranas foram lavadas trêsvezes por cinqüenta minutos em 0,2X SSC com 0,1% de SDS a 65°C. Asmembranas foram secadas em mata-borrão por 15 minutos, enroladas emSaranWrap® e expostas à película de raio X durante a noite a 70°C com telasintensificadoras (Kodak: Rochester, NY, USA).

Com base na produção de sinais de hibridização fortes com asonda celób descrita acima, diversas placas foram escolhidas para outroestudo. As placas foram purificadas duas vezes em células E. coli Y1090ZL eos genes inseridos e o plasmídeo pZLl foram subseqüentemente excisados dovetor AZipLox como derivados de pZLl (D'Alessio et al., 1992, Focus® 14:76) usando a excisão in vivo pela infecção de células E. coli DHl OBZL (LifeTechnologies, Gaithersburg, MD, USA). As colônias foram inoculadas emtrês ml de meio LB ampicilina e cultivadas durante a noite a 37°C. O DNAMiniprep foi preparado a partir de cada uma destas culturas usando umBioRobot 9600 (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), Um clone designadopPH47 foi mostrado pelo seqüenciamento de DNA conter o gene de tamanhonatural para celób.

A cepa da E. coli PaHa47 contendo o plasmídeo pPH47 foidepositada com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois,61604, como NRRL B-30898, com uma data de depósito de 23 de fevereirode 2006.

Exemplo 4: Caracterização da seqüência genômica de Thielavia terrestrisNRRL 8126 que codifica uma CEL6B endoglucanase

O seqüenciamento de DNA do clone genômico celób daThielavia terrestris NRRL 8126 foi realizado com um Seqüenciador de DNAAutomatizado Modelo 3700 da Applied Biosystems usando a versão 3.1 doquímica de terminador Big-Dye® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA,USA) e química dGTP (Applied Biosystems, Inc,, Foster City, CA, USA) e aestratégia de caminhante de iniciador. Os dados da seqüência de nucleotídeoforam escrutinizados quanto a qualidade e todas as seqüências foramcomparadas entre si com a assistência do software PHRED/PHRAP(University of Washington, Seattle, WA, USA).Um modelo de gene para a seqüência de DNA genômico deThielavia terrestris celób foi construída com base na similaridade com osgenes da endoglucanase homóloga de Fusatium oxisporum e Chrysosporiumlucknowense (Número de acesso XP383804 e AAQ38151,1,respectivamente).

A seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 2) do gene celób da Thielavia terrestrissão mostrados na Figura 2. A seqüência codificadora tem 1505 pares de baseincluindo o códon de parada e é interrompida pelos introns de 77, 127 e 110pares de base. A proteína prognosticada codificada tem 396 aminoácidos, A%de G + C da seqüência codificadora do gene (incluindo introns) é de 64,9% deG + C e a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro é de 64,6%. Usandoo programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), umpeptídeo de sinal de 18 resíduos foi prognosticada. A proteína maduraprognosticada contém 378 aminoácidos com uma massa molecular de 40,6kDa e um pH isoelétrico de 5,01.

Um alinhamento global aos pares comparativo de seqüênciasde aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementadono programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene daThielavia terrestris que codifica o polipeptídeo CEL6B tendo atividade deendoglucanase compartilha 85% e 82% de identidade (excluindo osintervalos) com a seqüência de aminoácido deduzida de duas proteínas deglicosil hidrolase Família 6 de Chrysosporium lucknowense e Neurosporacrassa, respectivamente (números de acesso AAQ38151 e Q7RXI7,respectivamente).

Exemplo 5: Clonagem e expressão de um cDNA Thielavia terrestrisNRRL 8126 que codifica uma endoglucanase CEL6C

A Thielavia terrestris NRRL 8126 foi cultivada em 200 ml demeio PD com celulose a 30°C por cinco dias a 200 rpm. Micélios dos frascosde cultura agitados foram colhidos pela filtração dos conteúdos através de umfunil revestido com Miracloth®. Os micélios foram depois intercalados entredois pedaços de Miracioth® e manchados secos com toalhas de papelabsorventes. A massa micelial foi depois transferida para tubos de centrífugaplásticos Falcon® 1059 e congelados em nitrogênio líquido. Os micélioscongelados foram armazenados em um congelador a -80°C até o uso.

A extração de RNA total foi realizada com tiocianato deguanidínio seguido pela ultracentrifiigação através de uma almofada de CsCla 5,7 Mea isolação de poli(A)+RNA foi realizada pela cromatografia deafinidade em oligo(dT)-celulose, usando os procedimentos descritos na WO94/14953.

O cDNA de filamento duplo foi sintetizado a partir de 5 μg depoli(A)+ RNA pelo método da RNase H (Gubler e Hoffman, 1983, Gene 25:263-269, Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A labotatory manual,Cold Spring Harbor Iab., Cold Spring Harbor, NY. USA). A poli(A)+ RNA (5μg em 5 μl de água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila a 0,1 %)) foiaquecida a 70°C por 8 minutos em um tubo de Eppendorf® pré siliconizado,isento de RNase, extinto em gelo e combinado em um volume final de 50 μΐcom composto de tampão de transcriptase reversa de 50 mM de Tris-HCl, pH8,3, 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol (DTT) (BethesdaResearch Laboratories, Bethesda, MD, USA). 1 mM de dATP, dGTP e dTTPe 0,5 mM de 5-metil-dCTP (Pharmacia, Uppsala, Suécia), 40 unidades deinibidor da ribonuclease placentária humana (RNasin, Promega, Madison, WI,USA), 1,45 μg de iniciador oligo(dT)]0-iVoí I (Pharmacia, Uppsala, Suécia) e1000 unidades de transcriptase reversa SuperScript® II RNase H (BethesdaResearch Laboratories, Bethesda, MD, USA). O cDNA do primeiro filamentofoi sintetizado incubando-se a mistura de reação a 450C por 1 hora. Depois dasíntese, a mistura híbrida de mRNAxDNA foi filtrada em gel através de umacoluna giratória MicroSpin 5-400 HR (Pharmacia, Uppsala, Suécia) de acordocom as instruções do fabricante.

Depois da filtração em gel, os híbridos foram diluídos em 250μl de tampão do segundo filamento (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 90 mM deKCl, 4,6 mM de MgCl2, 10 mM de (NH4)2SO4, 0,16 mM de NAD) contendo200 μΜ de cada dNTP, 60 unidades de DNA polimerase 1 da E. coli(Pharmacia. Uppsala, Suécia), 5,25 unidades de RNase H (Promega, Madison,WI, USA) e 15 unidades de DNA ligase da E. coli (Boehringer Mannheim,Manheim, Alemanha). A síntese de cDNA do segundo filamento foi realizadaincubando-se o tubo de reação a 16°C por 2 horas e um adicional de 15minutos a 25°C. A reação foi interrompida pela adição de EDTA a umaconcentração final de 20 mM seguido pelas extrações com fenol eclorofórmio.

O cDNA de filamento duplo foi precipitado a -20°C por 12horas pela adição de 2 volumes de 96% de etanol e 0,2 volume de acetato deamônio 10 M, recuperado pela centrifugação a 13.000 χ g, lavado em etanol a70%, secado: e recolocado em suspensão em 30 μΐ de tampão de nuclease defeijão Mung (30 mM de acetato de sódio pH 4,6, 300 mM de NaCl, 1 mM deZnSO4, 0,35 mM de DTT, 2% de glicerol) contendo 25 unidades de nucleasede feijão Mung (Pharmacia, Uppsala, Suécia). O DNA de grampo de cabelode filamento único foi aparado pela incubação da reação a 3 O0C por 30minutos, seguida pela adição de 70 μΐ de 10 mM de Tris-HCl-I mM de EDTApH 7,5, extração com fenol e precipitação com 2 volumes de etanol a 96% e0,1 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 em gelo por 30 minutos.

Os cDNAs de filamento duplo foram recuperados pelacentrifugação a 13.000 χ g e terminados abrupto em 30 μΐ de tampão de T4DNA polimerase (20 mM de Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM de acetato demagnésio, 50 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT) contendo 0,5 mMde cada dNTP e 5 unidades de T4 DNA polimerase (New England Biolabs,Ipswich, MA, USA) pela incubação da mistura de reação a 16°C por 1 hora.A reação foi interrompida pela adição de EDTA a uma concentração final de20 mM, seguida pelas extrações com fenol e clorofórmio e precipitação por12 horas a -20°C pela adição 2 volumes de etanol a 96% e 0,1 volume deacetato de sódio 3 M pH 5,2.

Depois da reação de enchimento, os cDNAs foramrecuperados pela centrifugação a 13.000 χ g, lavados em etanol a 70% esecados. A pelota de cDNA foi recolocada em suspensão em 25 μΐ de tampãode ligação (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT,0,5 mM de ATP) contendo 2,5 μg de adaptadores Bst XI não palindrômicos(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mostrados abaixo e 30 unidades de T4ligase (Promega, Madison, WI, USA) e depois incubados a 16°C por 12horas. A reação foi interrompida aquecendo-se a 65°C por 20 minutos edepois esfriado em gelo por 5 minutos.

5'-CTTTCCAGCACA-3' (SEQ ID NO: 9)

3'-GAAAGGTC-5"

O cDNA adaptado foi digerido com Not I, seguido pelaincubação por 2,5 horas a 37°C. A reação foi interrompida aquecendo-se a65°C por 10 minutos. Os cDNAs foram fracionados por tamanho pelaeletroforese em gel em um gel de agarose de temperatura de fusão baixaSeaPlaque® GTG a 0,8% (Cambrex Corporation, East Rutherford. NJ, USA)em 44 mM de Tris Base, 44 mM de ácido bórico, 0,5 mM de tampão deEDTA (TBE) para separar adaptadores não ligados e cDNAs pequenos. OcDNA foi selecionado por tamanho com um corte a 0,7 kb e recuperados dogel pelo uso de beta-agarose (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) deacordo com as instruções do fabricante e precipitado por 12 horas a -20°Cpela adição de dois volumes de etanol a 96% e 0,1 volume de acetato de sódio3 M pH 5,2.

O cDNA direcional, selecionado por tamanho foi recuperadopela centrifugação a 13.000 x g, lavado em etanol a 70%, secado e depoisrecolocado em suspensão em 30 μl de 10 mM de Tris-HCl-1 mM de EDTApH 7,5. Os cDNAs foram dessalinizados pela filtração em gel através de umacoluna giratória MicroSpin S300 HR de acordo com as instruções dofabricante. Três ligações de teste foram realizadas em 10 μl de tampão deligação (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT5 0,5mM de ATP) contendo 5 μl de cDNA de filamento duplo (tubos de reação # 1e #2), 15 unidades de T4 ligase (Promega, Madison, WI, USA) e 30 ng (tubo#1), 40 ng (tubo #2) e 40 ng (tubo #3, o controle de fundo do vetor) do vetorpYES2.0 clivado com Bst XI-Not I (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA). Asreações de ligação foram realizadas pela incubação a 16°C por 12 horas,depois aquecimento a 70°C por 20 minutos e finalmente adicionando 10 μl deágua a cada tubo. Um μl de cada mistura de ligação foi submetido àeletroporação em 40 μl de células de E. coli DH10B eletrocompetentes(Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, USA) como descrito porSambrook et al., 1989, supra.

A biblioteca de cDNA de Thielavia terrestris NRRL 8126 foiestabelecida como reuniões na E. coli DHlOB. Cada reunião foi feitaespalhando-se placas de E. coli em LB ampicilina transformadas, produzindo15.000 a 30.000 colônias/placa depois da incubação a 37°C por 24 horas.Vinte ml de meio de LB ampicilina foram adicionados às placas e as célulasforam colocadas em suspensão neste. A suspensão de célula foi agitada a 100rpm em um tubo de 50 ml por 1 hora a 37°C.

A biblioteca de cDNA de Thielavia terrestris NRRL 8126resultante consistiu de aproximadamente 10^6 clones individuais, com umfundo de vetor de 1%. O DNA plasmídico de algumas das reuniões dabiblioteca foi isolado usando um Kit Plasmid Midi (QIAGEN Inc., Valencia,CA. USA) de acordo com as instruções do fabricante e armazenado a -20°C.

Alíquotas de um ml de DNA plasmídico purificado (100ng/ml) de algumas das reuniões da biblioteca (Exemplo 1) foramtransformadas em Saccharomyces eerevisiae W3124 pela eletroporação(Becker e Guarante, 1991, Methods Enzymol. 194: 182-187) e ostransformantes foram plaqueados em ágar SC contendo 2% de glicose eincubados a 30°C. No total, 50 a 100 placas contendo 250 a 400 colônias delevedura foram obtidas a partir de cada reunião.

Depois de 3 a 5 dias de incubação, as placas de ágar SC foramplaqueadas em réplica em um conjunto de placas de 0,1% de AZCL HEcelulose SC URA ágar com galactose. As placas foram incubadas por 2 a 4dias a 30°C e as colônias positivas em endoglucanase foram identificadascomo colônias circundadas por um halo azul.

Exemplo 6: Caracterização da seqüência de cDNA de Thielavia terrestrisNRRL 8126 que codifica uma CEL6C endoglucanase

As colônias de levedura que expressam a endoglucanase foraminoculadas em 20 ml de meio YPD em tubos de teste de vidro de 50 ml. Ostubos foram agitados a 200 rpm por 2 dias a 30°C. As células foram colhidaspela centrifiigação por 10 minutos a 3000 rpm em uma centrífuga HeraeusMegafuge 1,0R com um rotor 75002252 (Hanau, Alemanha).

O DNA foi isolado de acordo com a WO 94/14953 edissolvido em 50 μΐ de água deionizada. O DNA foi transformado em célulasE. eoli DH10B pelos procedimentos padrão de acordo com Sambrook et al.,1989, supra. Um transformante da E. eoli subseqüentemente mostrado contero gene celóc da Thielavia terrestris NRRL 8126 foi designado pCIBG146(Figura 3) e usado como material para depósito de material biológico. A cepapCIBG146 da E. eoli foi depositada como E. eoli NRRL B-30901 em 23 defevereiro de 2006.

O DNA plasmídico foi isolado dos transformantes de E. eoliusando procedimentos padrão de acordo com Sambrook et al., 1989, supra. Aseqüência de cDNA de tamanho natural do gene celóc da Thielavia terrestrisNRRL 8126 foi seqüenciada com um Kit Tag DyeDeoxi Terminator CycleSeqüencing (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA) e iniciadores deoligonucleotídeo sintético usando um Seqüenciador de DNA AppliedBiosystems ABI PRISM® 377 (ABI, Foster City, CA, USA) de acordo com asinstruções do fabricante.

A seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 4) do gene celóc da Thielavia terrestrissão mostrados na Figura 4. A seqüência codificadora tem 1203 pares de baseincluindo o códon de parada. A proteína prognosticada codificada tem 400aminoácidos. A% G + C da seqüência codificadora do gene é de 60,0% e daseqüência que codifica o polipeptídeo maduro é de 60,0%. Usando oprograma SignalP (Nielsen et al., 1997, supra), um peptídeo de sinal de 19resíduos foi prognosticado. A proteína madura prognosticada contém 381aminoácidos com uma massa molecular de 42,1 kDa e pl de 6,76.

Um alinhamento global aos pares comparativo de seqüênciasde aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programaNeedle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de 10,penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz EBLOSUM62, Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene deThielavia terrestris que codifica o polipeptídeo CEL6C compartilha 50%,49% e 48% de identidade (excluindo os intervalos) com a seqüência deaminoácido deduzida de três proteínas da glicosil hidrolase da Família 6 deNeurospora Grasse, Magnaporthe grisea e Agaricus bisporus,respectivamente (números de acesso Q87B5, XP 368004 e P49075,respectivamente).

Exemplo 7: Construção do vetor de expressão pAILo2O vetor de expressão pAlLol foi construído modificando-sepBANeó (Patente U.S. N2 6.461.837), que compreende um híbrido dospromotores dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triosefosfato isomerase de Aspergillus oryzae (promotor NA2-tpi), a seqüênciaterminadora da amiloglucosidase de Aspergillus niger (terminador AMG) e ogene da acetamidase de Aspergillus nidulans (amdS). Todas as etapas demutagênese foram verificadas pelo seqüenciamento usando a química doterminador Big-Dye® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). Amodificação de pBANe6 foi realizada eliminando-se primeiro três sítios derestrição Nco I nas posições de 2051, 2722 e 3397 pares de base a partir domarcador de seleção amdS pela mutagênese direcionada ao sítio. Todas asmudanças foram planejadas serem "silenciosas" deixando a seqüência deproteína real do produto de gene amdS inalterada. A remoção destes três sítiosfoi realizada simultaneamente com um Kit de mutagênese direcionada ao sítioin vitro GeneEditor® (Promega, Madison, WI, USA) de acordo com asinstruções do fabricante usando os seguintes iniciadores (o nucleotídeosublinhado representa a base trocada):AMDS3NcoMut (2050):

5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3' (SEQ ID NO: 10)AMDS2NcoMut (2721):

5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3' (SEQ ID NO: 11)AMDSl NcoMut (3396):

5-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3' (SEQ ID NO: 12)

Um plasmídeo compreendendo todas as três mudanças deseqüência esperadas foi depois submetido à mutagênese direcionada ao sítio,usando um Kit de Mutagênese direcionada ao sítio QuickChange®(Stratagene, La Jolla, CA, USA), para eliminar o sítio de restrição Nco I naextremidade do terminador AMG na posição 1643. Os seguintes iniciadores(o nucleotídeo sublinhado representa a base trocada) foram usados para amutagênese:

Iniciador Superior para mutagenizar a seqüência terminadora de AMG:5'-C ACCGTG AAAGCC ATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACC AGACAG-3" (SEQ ED NO: 13)

Iniciador Inferior para mutagenizar a seqüência terminadora de AMG:

5' -CTGGTCTTCTAC ACGAAGGAMGAGC ATGGCTTTC ACGGTGTCTG-3' (SEQ ID NO: 14)

A última etapa na modificação de pBANeó foi a adição de umnovo sítio de restrição Nco I no começo do poliligador usando um Kit deMutagênese direcionada ao sítio QuickChange® e os seguintes iniciadores (osnucleotídeos sublinhados representam as bases mudadas) para produzirpAlLol (Figura 5).

Iniciador Superior para mutagenizar o promotor NA2-tpi:5' -CTATATAC AC AACTGG ATTTACC ATGGGCCCGCGGCCGC AGATC-3' (SEQ ID NO: 15)

Iniciador Inferior para mutagenizar o promotor NA2-tpi:5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCC ATGGT AAATCC AGTTGTGT ATATAG-3' (SEQ ID NO: 16)

O gene amdS de pAlLol foi trocado com o gene pyrGAspergillus nidulans. O plasmídeo pBANelO (Figura 6) foi usado como umafonte para o gene pyrG como um marcador de seleção. A análise da seqüênciade pBANelO mostrou que o marcador pyrG foi contido dentro de umfragmento de restrição Nsi I e não contém os sítios de restrição Nco 1 ou PacI. Visto que o amdS também é flanqueado pelos sítios de restrição Nsi I aestratégia para mudar o marcador de seleção foi uma troca simples defragmentos de restrição Nsi I. O DNA plasmídico de pAlLol e pBANelO foidigerido com a enzima de restrição Nsi I e os produtos purificados pelaeletroforese em gel de agarose. O fragmento de Nsi I de pBANelO contendo ogene pyrG foi ligado à cadeia principal de pAlLol para substituir o fragmentode DNA de Nsi I original contendo o gene amdS. Os clones recombinantesforam analisados pela digestão com enzima de restrição para determinar queeles tiveram o inserto correto e também a sua orientação. Um clone com ogene pyrG transcrito na direção anti-horária foi selecionado. O novoplasmídeo foi designado pAlLo2 (Figura 7).

Exemplo 8: Expressão do gene da endoglucanase celób de Thielaviaterrestris NRRL 8126 em Aspergillus oryzae

Dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos, mostradosabaixo, foram planejados para amplifica pela PCR a matriz de leitura abertade tamanho natural do plasmídeo pPH47 que codifica uma CEL6Bendoglucanase. Um Kit de Clonagem In-Fusion (BD Biosciences, Palo Alto,CA, USA) foi usado para fabricar o fragmento diretamente no pAlLo2.Iniciador Avançado In-Fusion:

5'-ACTGGATTACCATGAAGCTCTCGCAGTCG-3' (SEQ IDNO 17) Iniciador Reverso In-Fusion:

5'-AGTCACCTCTAGTTAGAACGACGGCACGGC-3' (SEQ ID NO: 18)As letras em negrito representam a seqüência codificadora. A seqüênciaremanescente contém identidade de seqüência comparada com os sítios deinserção de pAlLo2.

Cinqüenta picomoles de cada um dos iniciadores acima foramusados em uma reação de PCR contendo 50 ng de DNA pPH47, Tampão deAmplificação IX Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 6 μΐ de mistura a 10mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 2,5 unidades de Platinum Pfx DNAPolimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 μΐ de MgS04 a 50 mM e 5 μΐ desolução realçadora IOX pCRx (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um volume finalde 50 μl. A amplificação foi realizada em um Eppendorf® Mastercicler® 5333(Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY, USA) programado por 1 ciclo a98°C por 2 minutos e 35 ciclos cada um a 94°C por 30 segundos, 65°C por 30segundos e 68°C por 1,5 minutos. Depois dos 35 ciclos, a reação foi incubadaa 68°C por 10 minutos e depois esfriada a IO0C até processada mais adiante.Um produto da reação de PCR de 1,5 kb foi isolado em um GTG a 0,8%-gelde agarose (Cambrex Bioproducts, East Rutherford, NJ, USA) usando tampãoTAE e 0,1 μβ de brometo de etídio por ml. A faixa de DNA foi visualizadacom a ajuda de um Dark Reader® (Clare Chemical Research, Dolores, CO,USA) para evitar as mutações induzidas por UV. A faixa de DNA de 1,5 kbfoi excisada com uma lâmina de barbear descartável e purificada usando umKit de Extração em Gel QIAquick® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) deacordo com as instruções do fabricante.

O vetor pAlLo2 foi linearizado pela digestão com Nco I e PacI (usando as condições especificadas pelo fabricante). O fragmento foipurificado pela eletroforese em gel e um Kit de Extração em Gel QIAquickcomo descrito acima. A clonagem do fragmento de PCR purificado no vetorpAlLo2 linearizado purificado foi realizado com um Kit de Clonagem In-Fusion. A reação (20 μΐ) conteve Tampão IX In-Fusion (BD Biosciences,Palo Alto, CA. USA), IX BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), 1 μΐde enzima In-Fusion (diluído 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA),160 ng de pAlLo2 digerido com Neo I e Pae I e 50 ng do produto de PCRpurificado de celób de Thielavia terrestris. A reação foi incubada natemperatura ambiente por 30 minutos. Uma amostra de 1 μΐ da reação foiusada para transformar células XLlO SoloPac® Gold da E. eoli (Stratagene,La Jolla, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Depois do períodode recuperação, duas alíquotas de 100 μΐ da reação de transformação foramplaqueadas em placas 2X YT de 150 mm suplementadas com 100 μg deampicilina por ml. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. Umconjunto de oito clones recombinantes putativos foi selecionadoaleatoriamente a partir das placas de seleção e o DNA plasmídico foipreparado a partir de cada uma usando um BioRobot 9600. Os clones foramanalisados pela digestão de restrição com Eeo RI. Dois clones que tiveram opadrão de digestão de restrição esperado foram depois seqüenciados paraconfirmar que não houve nenhuma mutação no inserto clonado. Um dosclones teve a seqüência correta e foi selecionado e designado pEJG105(Figura 8).

Os protoplastos de Aspergillus oryzae Jal250 (WO 99/61651)foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988,Bio/Technology 6: 1419-1422. Cinco microgramas de pEJG105 (assim comopAlLo2 como um controle de vetor) foram usados para transformarprotoplastos JAL250 de Aspergillus oryzae.

A transformação de Aspergillus oryzae Jal250 com pEJG105produziu cerca de 100 transformantes. Cinco transformantes foram isoladosem placas de PDA individuais e incubadas por cinco dias a 34°C.

As placas de esporo confluentes foram lavadas com 5 ml deTween 80 a 0,01% e a suspensão de esporo foi usada para inocular 25 ml demeio MDU2BP em frascos agitados de 125 ml. as culturas de transformanteforam incubadas a 34°C com agitação constante a 200 rpm. No dia cinco apósa inoculação, uma alíquota de cada cultura foi centrifugada a 12000 χ g.Cinco μl de cada sobrenadante foram misturados com um volume igual de 2Xtampão de carga (10% de beta-mercaptoetanol) e carregado em um gel deSDS-PAGE de 1,5 mm 8%-16% de Tris-Glicina e tingido com SimplyBlue®SafeStain (lnvitrogen, Carlsbad, CA). Os perfis de SDS-PAGE dos caldos decultura mostraram que quatro dos cinco transformantes tiveram uma novafaixa de proteína de aproximadamente 40 kDa. O transformante de número 1foi selecionado para estudos adicionais e designado EJG105 de Aspergillusoryzae.

Exemplo 9: Expressão do gene da endoglucanase celóc de Thielaviaterrestris NRRL 8126 em Aspergillus oryzae

O gene cel6c de Thielavia terrestris NRRL 8126 foi excisadodo vetor pYES2.0 usando Bam HI e Xba I e ligado no vetor de expressão deAspergillus pHD414 (EP 238 023, WO 93/11249) usando métodos padrão(Sambrook et al., 1989, supra). O vetor de expressão de Aspergillus pHD414é um derivado de p775 (EP 238 023). O plasmídeo resultante foi designadopA2BG146 (Figura 9).

Os protoplastos de Aspergillus oryzae HowB 104 forampreparados como descrito na WO 95/02043. Cem microlitros de suspensãoforam misturados com 5 a 25 μg de pA2BG146 em 10 μΐ de STC compostode 1,2 M de sorbitol, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de CaCl2) e aindamisturado com 5 a 25 μg de p3SR2, um gene amdS de Aspergillus nidulansque carrega o plasmídeo (Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422). A mistura foi deixada na temperatura ambiente por 25 minutos.

Duzentos microlitros de 60% de PEG 4000 (BDH, Poole, Inglaterra)(polietileno glicol, peso molecular 4.000), 10 mM de CaCl2 e 10 mM de Tris-HCl pH 7,5 foram adicionados e suavemente misturados e finalmente 0,85 mlda mesma solução foi adicionado e suavemente misturado. A mistura foideixada na temperatura ambiente por 25 minutos, centrifugada a 2.500 χ g por15 minutos e a pelota foi recolocada em suspensão em 2 ml de sorbitol 1,2 M.Este processo de sedimentação foi repetido e os protoplastos foramespalhados em placas COVE. Depois da incubação por 4 a 7 dias a 37°C osesporos foram escolhidos e espalhados de modo a isolar colônias únicas. Esteprocedimento foi repetido e os esporos de uma única colônia depois dasegunda re-isolação foram armazenados.

Cada um dos transformantes foi inoculado em 10 ml de meioYPM. Depois de 2 a 5 dias de incubação a 3 0°C, 200 rpm, o sobrenadante foiremovido. A atividade de endoglucanase foi identificada aplicando-se 20 μΐde caldo de cultura a furos de 4 mm de diâmetro perfurados em uma placa a0,1% AZCL HE celulose SC-ágar e incubação durante a noite a 30°C. Apresença de atividade de endoglucanase produziu um halo azul em torno deuma colônia. Vários caldos transformantes tiveram atividade deendoglucanase que foi significantemente maior do que o caldo de um controlede fundo de Aspergillus oryzae não transformado, que demonstrou expressãoeficiente da CEL6C endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 emAspergillus oryzae.

Exemplo 10: Culturas de frasco agitado grande de Aspergillus oryzaeJal250 contendo o gene celób

Aspergillus oryzae Jal250 contendo esporos pEJG105 foramespalhados sobre uma placa de PDA e incubados por cinco dias a 34°C. Aplaca de esporo confluente foi lavada duas vezes com 5 ml de 0,01% deTween 80 para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão deesporo foi depois usada para inocular 500 ml de meio MDU2BP em umfrasco de Fernbach de dois litros. A cultura foi incubada a 34°C com agitaçãoconstante (200 rpm). No dia cinco após o inóculo, o caldo de cultura foicoletado pela filtração em uma unidade de filtração de náilon de 500mililitros, 75 mm com um tamanho de poro de 0,45 μηι com um pré filtro defibra de vidro (Nalgene Nunc International, Rochester, NY, USA). Umaamostra de 5 μΐ do caldo foi analisada pela SDS-PAGE como descrito noExemplo 9 para confirmar que o padrão de proteína foi o mesmo como aqueleobtido antes. O caldo foi mostrado conter uma faixa de proteína de 40 kDa.Exemplo 11: Hidrólise de carboximetilcelulose pelas endoglucanases deThielavia terrestris CEL6B e Thielavia terrestris CEL6C

O sal de sódio de carboximetilcelulose (CMC, tipo 7L2) comgrau médio de substituição (DS) de 0,7 foi obtido da Aqualon Division ofHercules Inc. (Wilmington, DE, USA). Uma solução de 6,25 mg por ml deCMC em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 foi preparada adicionando-selentamente CMC a um tampão vigorosamente agitado, seguido peloaquecimento a aproximadamente 60°C sob agitação contínua até a dissoluçãocompleta.

As endoglucanases de Thielavia terrestris CEL6B e Thielaviaterrestris CEL6C (ambas expressadas em Aspergillus oryzae Jal250 comodescrito nos Exemplos 8 e 9, respectivamente) foram concentradas edessalinizadas/trocadas para 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 usando umfiltro centrífugo Centricon® Plus-20 com uma membrana 5000 NMWLBiomax-50 (Millipore, Bedford, MA, USA). As soluções de enzimaconcentradas e dessalinizadas foram armazenadas a -20°C. A concentração deproteína nas soluções de enzima foi determinada por um Ensaio deMicroplaca BCA usando um Kit de Reagente de Ensaio de Proteína BCA deacordo com as instruções do fabricante (Pierce Chemical Co., Rockford. IL,USA).

A hidrólise de CMC foi realizada em Placas Eppendorf®DeepWell 96 (1,2 ml, EppendorfNorth America, Inc., Westbury, NY, USA)seladas por um selador de placa ALPS-300® (ABgene Inc., Rochester, NY,USA). Todas as reações foram conduzidas em 50 mM de acetato de sódio pH5,0 em um volume de 1 ml sem agitação a 50°C. A concentração de substratoinicial foi de 5 mg por ml. Ambas as enzimas foram usadas em quatroconcentrações diferentes. Correspondendo a diluições de enzima em 50 mMde acetato de sódio pH 5,0 foram preparadas frescas antes da hidróliseenzimática de soluções de estoque de enzima.

Depois de 70 horas de hidrólise, 40 alíquotas foramtransferidas das reações de hidrólise para uma microplaca de 96 reservatóriosde fundo chato (Corning Inc., Corning: NY, USA) e misturados com 160 μΐde Na2CO3 128 mM-NaHC03 72,5 mM para terminar as reações. As amostrasdiluídas foram analisadas quanto ao açúcar redutor (RS) usando um ensaio demicroplaca de hidróxido do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) como descritoabaixo.

Uma alíquota de 90 μΐ da amostra diluída foi colocada emcada reservatório de uma microplaca de fundo cônico de 96 reservatórios(Corning Inc., Corning, NY, USA). O ensaio foi iniciado pela adição de 60 μΐde PHBAH a 1,25% em 2% de hidróxido de sódio a cada reservatório. Aplaca não coberta foi aquecida em um bloco de aquecimento fabricado deencomenda por 10 minutos a 95°C. Depois a microplaca foi esfriada até atemperatura ambiente, 35 μΐ de água deionizada foram adicionados a cadareservatório. Uma alíquota de 100 μΐ foi removida de cada reservatório etransferida para uma microplaca de 96 reservatórios de fundo chato (CorningInc., Corning, NY, USA). A absorbância a 410 nm (A410) foi medida usandouma Leitora de Microplaca SpectraMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale,CA, USA). O valor A410 foi traduzido em equivalentes de glicose usandouma curva padrão.

A curva padrão foi obtida usando seis padrões de glicose(0,005, 0,010, 0,025, 0,050, 0,075 e 0,100 mg/ml), que foram tratadossimilarmente às amostras.

Os padrões de glicose foram preparados diluindo-se 10 mg/mlde solução de estoque de glicose com água deionizada.

O grau de conversão de carboximetilcelulose para açúcaresredutores (rendimento de hidrólise,%) foi calculado usando a seguinteequação:

Rendimento de RS i%) = RS {mg/m\). x 100 χ 162 / (CMC (mg/mi). χ 180) =RS (mg/mi). XlOO/ (CMC (mg/ml). X 1,111)

Nesta equação, RS é a concentração de açúcares redutores emsolução medida em equivalentes de glicose (mg/ml) e o fator 1,111 reflete oganho de peso na conversão de celulose para glicose.

Os resultados de ensaio demonstraram que depois de 70 horasde hidrólise as endoglucanases de Thielavia terrestris CEL6B e Thielaviaterrestris CEL6C foram capazes de hidrolisar de 2 a 4% das ligaçõesglicosídicas disponíveis na carboximetilcelulose.Depósito de Material Biológico

O seguinte material biológico foi depositado sob os termos doTratado de Budapest com o Agricultural Research Service Patent CultureCollection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street,Peoria, Illinois, 61604 e dados os seguintes números de acesso:Depósito Número de Acesso Data de Depósito

E. coli PaHa47 (pPH47) NRRL B-30898 23 de Fevereiro de 2006

E. coli (pCIBG146) NRRLB-30901 23 de Fevereiro de 2006

As cepas foram depositadas sob condições que garantem que o acesso àsculturas estarão disponíveis durante a pendência deste pedido de patente auma pessoa determinada pelo Comissário de Patentes e Marcas a serdesignado para este sob 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. Os depósitosrepresentam culturas substancialmente puras das cepas depositadas. Osdepósitos estão disponíveis como requerido pelas leis de patentes estrangeirasem países em que as contrapartes do pedido objeto ou a sua progênie sãodepositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de umdepósito não constitui uma licença para a prática da invenção objeto emdetrimento dos direitos de patente outorgados por ação governamental.

A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitadano escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, visto que estes aspectossão intencionados como ilustrações de diversos aspectos da invenção.Quaisquer aspectos equivalentes são intencionados a estar dentro do escopodesta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelasmostradas e aqui descritas tornar-se-ão evidentes para aqueles de habilidadena técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também sãointencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso deconflito, a presente divulgação incluindo as definições controlarão.

Várias referências são aqui citadas, as divulgações das quaissão incorporadas por referência em suas totalidades.

Claims (53)

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que tematividade de endoglucanase, selecionado do grupo que consiste de:(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com o polipeptídeo maduroda SEQ ED NO: 2 ou pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 4;(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência com (i) aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. (ii) aseqüência de cDNA contida na seqüência que codifica o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii) ou sobcondições de pelo menos estringência média com (i) a seqüência que codificao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de DNA genômicoque compreende a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);(c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou 60% de identidade com a seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 3; e(d) uma variante que compreende uma substituição, deleçãoe/ou inserção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido tendopreferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelomenos 95% de identidade e o mais preferivelmente pelo menos 97% deidentidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; ou uma seqüênciade aminoácido tendo preferivelmente pelo menos 60% de identidade, maispreferivelmente pelo menos 65% de identidade, ainda mais preferivelmentepelo menos 70% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 75%de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% de identidade,ainda mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade, o maispreferivelmente pelo menos 90% de identidade e ainda mais preferivelmentepelo menos 95% de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ou consiste da seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; ou um fragmento deste tendo atividade deendoglucanase.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que compreende ou consiste da seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sobcondições de pelo menos alta estringência com (i) a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de cDNA contida naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii) ou preferivelmente sob condições depelo menos estringência média, mais preferivelmente condições deestringência média-alta e o mais preferivelmente condições de estringênciaalta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:-3, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreende a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii),

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que compreende umaseqüência de nucleotídeo tendo preferivelmente pelo menos 90% deidentidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade e o maispreferivelmente pelo menos 97% de identidade com a seqüência que codificao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; ou uma seqüência de nucleotídeotendo preferivelmente pelo menos 60% de identidade, mais preferivelmentepelo menos 65% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 70%de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 75% de identidade,ainda mais preferivelmente pelo menos 80% de identidade, ainda maispreferivelmente pelo menos 85% de identidade, o mais preferivelmente pelomenos 90% de identidade e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3.

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou queconsiste da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; ou uma subseqüência destasque codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase.

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou queconsiste da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo quecompreende ou que consiste da seqüência que codifica o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante que compreendeuma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é codificado pelo polinucleotídeo contido noplasmídeo pPH47 que está contido na E. coli NRRL B-30898 ou plasmídeopCIBG146 que está contido na E. coli NRRL B-30901.

13. Polipeptídeo de acordo com as reivindicações 1, 2, 5 ou 11,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos dea 396 da SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos de 20 a 400 da SEQ ED NO: 4.

14. Polipeptídeo de acordo com as reivindicações 1 6, 7 ou 10,caracterizado pelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 110al557 da SEQ ID NO: 1 ou os nucleotídeos de 58a 1200 da SEQ ID NO: 3.

15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que tem ainda atividadede enzima voltada para um ou mais substratos selecionados do grupo queconsiste de xilano, xiloglicano, arabinoxilano, 1,4-beta-D-manana egalactomanana.

16. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.

17. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ IDNO: 3, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO: 4, respectivamente.

18. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 110 a 1557 da SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos de 58 a-1200 da SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 19 a-396 da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos de 20 a 400 da SEQ ID NO: 4.

19. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 16a 18 operavelmente ligado a uma ou mais seqüências decontrole que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro deexpressão.

20. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definido nareivindicação 19.

21. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 19.

22. Método para produzir um polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagemproduz o polipeptídeo, sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

23. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreenda umaconstrução de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeoque codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

24. Método para produzir um mutante de uma célulaprecursora, caracterizado pelo fato de que compreende romper ou deletar umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, que resulta no mutante produzindomenos do polipeptídeo do que a célula precursora.

25. Célula mutante, caracterizada pelo fato de que é produzidapelo método como definido na reivindicação 24.

26. Célula mutante de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene que codifica umaproteína nativa ou heteróloga.

27. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar a célula mutante de acordo com areivindicação 26 sob condições condutivas para a produção da proteína; e (b)recuperar a proteína.

28. Polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 a 18, caracterizado pelo fato de que é obtido pela (a)hibridização de uma população de DNA sob condições de pelo menos altaestringência com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQID NO: 1, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii) ou preferivelmente sob condições de pelo menos estringênciamédia, mais preferivelmente condições de pelo menos estringência média-altaou o mais preferivelmente condições de pelo menos estringência alta com (i) aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo hibridizante, que codifica umpolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase.

29. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de IlOa 1557 da SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos de 58 a1200 da SEQ ID NO: 3.

30. Método para produzir um polinucleotídeo que compreendeuma seqüência de nucleotídeo mutante que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase, caracterizado pelo fato de que compreende: (a)introduzir pelo menos uma mutação na seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, em que a seqüência denucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consiste do polipeptídeomaduro da SEQ ED NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; e (b) recuperar opolinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeo mutante.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 110 a 1557 da SEQ ID NO: 1 ou nucleotídeos de 58 a 1200da SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 19 a 396 daSEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos de 20 a 400 da SEQ ID NO: 4.

32. Polinucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de que éproduzido pelo método como definido nas reivindicações 30 ou 31.

33. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar uma célula que compreenda opolinucleotídeo mutante como definido na reivindicação 32 que codifica opolipeptídeo sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b)recuperar o polipeptídeo.

34. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada auma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal quecompreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 18 da SEQ ID NO: 2 ouaminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4, em que o gene é estranho para aseqüência de nucleotídeo.

35. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definido nareivindicação 34.

36. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definido nareivindicação 34.

37. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante comodefinida na reivindicação 36 sob condições condutivas para a produção daproteína e (b) recuperar a proteína.

38. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de I a 15, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta quecompreendam um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo;e (b) recuperar o polipeptídeo.

39. Planta transgênica, parte de planta ou célula de planta,caracterizadas pelo fato de que foram transformadas com um polinucleotídeoque codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15.

40. Método para degradar ou converter um material celulósico,caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico comuma composição que compreenda uma quantidade eficaz de um polipeptídeotendo a atividade de endoglucanase de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15 ou a célula hospedeira como definida nareivindicação 20.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a composição compreende ainda uma quantidade eficaz deuma endo-1,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase e/ou beta-D-glucosidase.

42. Método de acordo com as reivindicações 40 ou 41,caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo queconsiste de uma hemicelulase, esterase, protease, lacase e peroxidase.

43. Método de acordo com as reivindicações 40 a 42,caracterizado pelo fato de que o método é um processo de pré-tratamento;uma etapa em um processo de sacarificação e fermentação simultâneo (SSF);ou uma etapa em um processo de hidrólise e fermentação híbrido (HHF).

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-40 a 43, caracterizado pelo fato de que ainda compreende recuperar o materialcelulósico degradado ou convertido.

45. Método para produzir uma substância, caracterizado pelofato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com umacomposição que compreenda uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15 ou a célula hospedeira como definida nareivindicação 20, (b) fermentar o material celulósico sacarificado da etapa (a)com um ou mais microorganismos de fermentação; e (c) recuperar asubstância da fermentação.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que a composição compreende ainda uma quantidade eficaz deendo-l,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase, e/ou beta-D-glucosidase.

47. Método de acordo com as reivindicações 45 ou 46,caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo queconsiste de uma hemicelulase, esterase, protease, lacase e peroxidase.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-45 a 47, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadassimultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-45 a 48, caracterizado pelo fato de que a substância é um álcool, ácidoorgânico, cetona, aminoácido ou gás.

50. Método para inibir a expressão de um polipeptídeo em umacélula, caracterizado pelo fato de que compreende administrar à célula ouexpressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), emque o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de umpolinucleotídeo que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ouSEQ ID NO. 4.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizadopelo fato de que o dsRNA é de cerca de 15, 16, 17: 18, 19, 20,21, 22,23, 24,-25 ou mais nucleotídeos duplex no comprimento.

52. Molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) para inibira expressão de um polipeptídeo em uma célula, caracterizada pelo fato de quea dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de um polinucleotídeoque codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

53. Molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) de acordocom a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que tem cerca de 15, 16,-17, 18, 19, 20. 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex nocomprimento.