CN106916873A - 一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，具体步骤如下：步骤一，准备亚硝酸盐溶液，具体包括配置亚硝态氮NO₂‑N标准工作液或取含亚硝酸盐水产养殖水；步骤二，配置不同体积梯度硝化反应体系；步骤三；在25℃~35℃恒温箱，进行16~22小时硝化反应；步骤四，制备比色试剂；步骤五，比色检测；步骤六，比色结果和硝化效果评估。本发明方法操作简单、直观、实用，获得结果快速；可在养殖现场对硝化细菌的硝化效果进行直接快速检测，它不但可对硝化细菌有无硝化效果定性，还可定量硝化效果的高低水平，它对水产养殖水质监控和解决水产养殖存在的问题有指导意义。

Description

一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法

技术领域

本发明属于水产养殖领域，具体指一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法。

背景技术

硝化细菌是一种环境生态微生物，它在促进水域生态系统的氮循环和保持健康的水产养殖环境发挥着巨大的作用。近年来，随着水产养殖规模日益扩大和集约化程度不断提高，水质污染的问题也随之日益加重。在养殖水域形成的众多污染物中，亚硝酸盐尤其突出，也最为有害，它对养殖动物有显著毒性。如水体中的亚硝酸盐含量较高，预示水质状况恶化，会引起养殖动物中毒，许多疾病症状由此发生，严重者会导致死亡。一般的水产养殖规律是，在养殖的中后期，随着水体中残饵和排泄物增加和逐渐积累，并伴随着藻体突发死亡等因素，水体的亚硝态氮往往不能向硝态氮正常转化，硝化通道受阻，使得水体亚硝酸盐含量急剧升高。在居高不下的情况下，很容易使鱼虾等水产品在生长后期在将临近收获的时候发生亚硝酸盐中毒，从而造成巨大损失。所以解决好亚硝酸盐中毒问题，是水产养殖取得成功的一个关键。

目前，对于处理亚硝酸盐中毒的具体措施，虽然有物理方法或化学方法或生物学方法等多种多样，但比较安全也比较有效的措施，还是采用专业生态微生物硝化细菌，这是国内外水产养殖的共识，也是目前解决亚硝酸盐中毒采用的主要办法。硝化细菌的作用机理，主要是通过生物氧化通常称为硝化反应的转化途径，在一定温度环境和反应时间条件下，可将养殖水体中有毒的亚硝酸盐转化为无毒的硝酸盐，具体的生物化学反应步骤如图1所示。

在现有技术中，对于水体亚硝酸盐实际含量水平，可按国标GB/T 7493-1987水质亚硝基态氮的分光光度法进行测定，也可采用国内外生产的各种形式和规格的水质测定仪进行测定，但这些测定方法都不是直接测定硝化细菌硝化效果的方法。对所有水产养殖企业来说，如采用了硝化细菌来降低亚硝酸盐含量，最迫切需要知道的是，当产品在投入养殖水体后是不是有效、效果高低如何、能不能把水体中的亚硝酸盐降下来。因此希望能找到预测硝化效果的快速方法的同时，又能够检测出市场上各种硝化细菌产品的真正效果，一直是本领域技术人员有待解决的技术难题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，公开了一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，该方法采用多个有盖的塑料瓶或玻璃瓶作为硝化反应容器，建立亚硝酸盐底物溶液的不同梯度，分别加入1g或1ml单位硝化细菌，组成硝化反应液，形成硝化反应体系。然后在保证一定温度和反应时间的条件下，进行一系列的硝化反应。最后采用格利斯比色试剂比色，应用该比色系统对反应物亚硝酸盐显玫瑰红色，而对反应产物硝酸盐显无色这一特征反应，通过比色就可直接观察到亚硝酸盐的转化结果，并通过硝化反应所转化形成的无色体积，来具体量化硝化细菌在降低亚硝酸盐浓度的作用效果。

本发明是这样实现的，一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，具体步骤如下：

步骤一，准备亚硝酸盐溶液；

步骤二，配置亚硝酸盐硝化反应体系；

步骤三，硝化反应；

步骤四，制备比色试剂；

步骤五，比色检测；

步骤六，比色结果和硝化效果评估。

进一步，所述的亚硝酸盐溶液，具体指配置的亚硝基态氮标准工作液，或取含亚硝酸盐的水产养殖水。

进一步，所述的步骤二具体为：

2.1，采用有盖的容器作为硝化反应容器，将步骤一中一定浓度的亚硝酸盐溶液，在瓶中配置成不同体积梯度的反应底物溶液，反应容器包括塑料瓶或玻璃瓶；

2.2，再向各个不同体积梯度的反应底物溶液反应瓶中分别加入1g或1ml单位硝化细菌，形成不同体积梯度的硝化反应体系。可以根据需要选择反应底物量与菌种的比例确定检测范围；进一步，所述的步骤三具体为：

3.1，将上述硝化反应瓶盖紧，充分振摇，使硝化细菌溶出分散，与底物混合均匀；

3.2，把硝化反应瓶放入25℃～35℃的恒温箱，维持16～22小时进行硝化反应。

进一步，所述的步骤四具体为：

4.1，制备格利斯试剂Ⅰ：称取分析纯对氨基苯磺酸0.5g溶于150mL30％冰醋酸，避光保存；

4.2，制备格利斯试剂Ⅱ：称取分析纯α-萘胺0.5g加入50mL蒸馏水中，煮沸至刻度，然后缓缓加入30％冰醋酸溶液15mL，使α-萘胺完全溶解，过滤，0℃～10℃冰箱保存。

进一步，所述的步骤五具体为：

5.1，将各个硝化反应瓶中的硝化反应液以及不加硝化细菌作为对照的硝化反应底物溶液，分别加到各比色管25ml刻度处，按体积梯度从小到大排列；

5.2，对每个比色管各加入0.5ml格利斯试剂Ⅰ，后再加入0.5ml格利斯试剂Ⅱ，摇匀，静置，在比色后5～8分钟观察结果；

进一步，所述的步骤六具体为：，

6.1，第一种情况：若步骤5中所有硝化反应液的比色管都显示玫瑰红色，且色度与对应的对照管没有差异，显示硝化反应不产生硝化效果，可认为此硝化细菌无效，亚硝酸盐的去除率为0％；

6.2，第二种情况：若步骤5中有的硝化反应液的比色管没有红色生成，显示为无色，即表明这个硝化反应瓶中反应液所含的亚硝酸盐已经完全转化为硝酸盐，亚硝酸盐的去除率为100％；若在多个显示为无色的体积梯度硝化反应瓶中，取梯度中最大的无色体积表示硝化效果；

6.3，第三种情况：若步骤5中有的体积梯度硝化反应瓶对应的比色管还显红色，但与对照管的色度相比有明显差异，只需对色度最淡、最接近无色的硝化反应瓶溶液，采用与对照稀释液对比检测的方法确定硝化效果。具体操作过程如下：分别吸取作为对照液的亚硝酸盐底物溶液2.5mL或5mL或10mL或15mL或20mL到各比色管，各加水到25mL刻度稀释，然后再与硝化反应液的比色管同时比色对比，找到色度相同或最接近的两者，则可按如下公式计算出此硝化反应比色管对应的硝化反应瓶中亚硝酸盐去除率(％)：

然后再按如下公式计算出它的等同无色体积(ml)来表示它的硝化效果：

等同无色体积(ml)＝反应液体积(ml)×亚硝酸盐去除率(％)。

比较上述两种硝化效果表示，取其中最大无色体积或等同无色体积(ml计)表示此硝化细菌最高硝化效果，即当最大无色体积大于等同无色体积时，以最大无色体积表示此硝化细菌最高硝化效果；当等同无色体积大于最大无色体积时，则取等同无色体积表示此硝化细菌最高硝化效果。

本方法在上述中提到的硝化细菌最高硝化效果的含义，具体是指1毫升或1克单位硝化细菌，作用于一定浓度的亚硝酸盐底物溶液，通过硝化反应后，因硝化细菌具有转化溶液中亚硝酸盐为硝酸盐的功能，当采用格利斯试剂比色，基于其对亚硝酸盐显示红色，而对硝酸盐显示无色的特有反应，把硝化反应液比色后显示的无色作为硝化效果的特征标志，并取不同体积梯度硝化反应产生的最大无色体积或等同无色体积作为代来量化硝化细菌的最高硝化效果。

根据硝化细菌在硝化反应中所形成的最大无色(或等同无色)体积作为硝化效果的数据，可把硝化细菌产生的硝化效果划分为无效(无色或等同无色体积为0ml)、有效(无色或等同无色体积在0ml以上，500ml以下)、显效(无色或等同无色体积在500ml以上，1000ml以下)和高效(无色或等同无色体积在1000ml尽快以上)四种效果等级。

本发明相对于现有技术的有益效果在于：

1)本发明的快速检测方法，可广泛用于水产养殖领域。亚硝酸盐中毒是水产养殖中经常发生的严重问题，尤其是养虾业。目前解决这个问题的最有效措施主要是及时向中毒养殖水域投放有效硝化细菌，尽早地使养殖水的亚硝酸盐浓度降下来，尽快产生解毒效果。但是目前大多数水产养殖企业还不能鉴别硝化细菌产品的真伪和测定硝化细菌硝化效果的高低。本发明的快速检测方法不但可对硝化细菌有无硝化效果作出定性判断，还可通过对不同体积梯度硝化反应液的比色结果可以定量硝化细菌硝化效果的高低水平，可以事先预测投放硝化细菌产生的硝化效果，确定降低亚硝酸盐含量的最佳投菌量，使降毒取得成效。本发明的快速检测方法，操作简单、直观、实用，获得结果快速，可在养殖现场对硝化细菌的硝化效果进行直接检测，并可估测养殖水的亚硝酸盐含量，它对水产养殖水质的监控和解决水产养殖生产中出现的问题有指导意义。

2)本发明的快速检测方法，也成为了硝化细菌菌种筛选和发酵工艺条件优化不可缺少的研究工具。硝化细菌的硝化效果可以综合反映硝化细菌产品的有效菌的数量和菌种活性两方面的情况，是最重要的质量指标，利用硝化效果的快速检测方法可以及时了解研究结果，它可应用于硝化细菌选育研究的全过程。

附图说明

图1为本发明一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法的背景技术中生化反应过程；

图2为本发明一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法的实施例中温度对硝化效果的影响图。

具体实施方式

本发明提供一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚，明确，以及参照附图并举实例对本发明进一步详细说明。应当指出此处所描述的具体实施仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的具体检测方法如下：

1)首先，配置亚硝酸钠溶液：精确称取1g分析纯亚硝酸钠NaNO₂，于100mL容量瓶中，加洁净水到刻度，完全溶解后，可得到2020ppm亚硝基态氮NO₂-N标准母液。然后，精确量取1mL标准母液用洁净水稀释至1000mL，得到浓度为2.02ppm亚硝态氮NO₂-N标准工作液。

2)配置亚硝酸盐硝化反应体系

使用600mL的矿泉水空瓶若干个，加入2.02ppm亚硝基态氮标准工作液，每瓶分别装入100mL、200mL、300mL、400mL、500mL和600mL，形成不同体积梯度的硝化反应底物溶液，然后分别加入1mL或1g单位硝化细菌，组成硝化反应液，形成不同梯度硝化反应体系。这里，反应底物量对菌种的比例，最大比达到了600，如加菌种为0.5mL或0.5g，最大比可达到1200，提高了一倍，因此本法的检测范围可根据需要随意扩大或缩小。

3)硝化反应

将步骤2中各不同体积梯度的硝化反应瓶加盖震摇，使硝化细菌溶出分散，与底物溶液混合均匀，然后放入25℃～35℃的恒温箱,维持恒温硝化反应16～22小时。

4)制备比色试剂

A：格利斯试剂Ⅰ：称取分析纯对氨基苯磺酸0.5g溶于150mL30％冰醋酸，保存于具磨口的棕色瓶中。

B：格利斯试剂Ⅱ：称取分析纯α-萘胺0.5g加入50mL蒸馏水中，煮沸至刻度，然后缓缓加入30％冰醋酸溶液15mL，使α-萘胺完全溶解，过滤到具磨口棕色瓶中于0℃～10℃冰箱保存。

5)比色检测

比色检测原理：在弱酸性条件下，当亚硝酸盐溶液中的亚硝态氮与格利斯试剂Ⅰ中的对氨基苯磺酸相遇，将产生重氮盐，形成的重氮盐再与格利斯试剂Ⅱ中的α-萘胺相偶联，就会产生从淡红色至玫瑰红，再至橙棕色的显色反应，其中显玫瑰红的色度在比色后一定时间内，与亚硝酸盐中亚硝态氮NO₂-N的含量成正比。本比色的检验条件对硝酸盐溶液不显色，为无色。

比色方法的操作：将上述各瓶硝化反应液以及不加硝化细菌作为对照的硝化反应底物溶液，分别加到比色管至25mL刻度，比色时先向每支比色管加入0.5mL格利斯试剂Ⅰ，然后加入0.5mL格利斯试剂Ⅱ，摇匀，在比色开始后5-8分钟时间内观察。

比色结果和硝化效果评估，比色的结果有下列三种情况：

第一种情况：若加入硝化细菌的硝化反应液瓶对应的比色管都显示玫瑰红色，且色度与作为对照的硝化反应溶液比色管没有差异，显示硝化反应不产生硝化效果，可确定此硝化细菌无效，亚硝酸盐的去除率为0％；

第二种情况：若加入硝化细菌的硝化反应液瓶对应的比色管都没有红色生成，显示为无色，即表明此管对应瓶中的反应液所含的亚硝酸盐已经完全转化为硝酸盐，亚硝酸盐的去除率为100％；若在多个显示为无色的梯度硝化反应瓶中，取梯度中最大的无色体积表示硝化效果；

第三种情况：若有的体积梯度硝化反应瓶对应的比色管还显红色，但与对照管的色度相比有明显差异，仅需对色度最淡、最接近无色的硝化反应瓶溶液，采用与对照稀释液对比检测的方法确定硝化效果。具体操作过程如下：分别吸取亚硝酸盐溶液2.5mL或5mL或10mL或15mL或20mL到各比色管，各加水到25mL刻度稀释，然后把各稀释后的对照比色管与需要测定硝化反应液的比色管同时比色对比，找到色度相同或最接近的两者，此时即按公式计算出此硝化反应比色管对应的反应瓶中亚硝酸盐去除率(％)，然后再计算出它的等同无色体积(ml)来表示它的硝化效果，计算公式如下：

等同无色体积(ml)＝反应液体积(ml)x亚硝酸盐去除率(％)。

取上述中最大无色体积或等同无色体积(ml计)表示此硝化细菌最高硝化效果

实施例1

对现场养殖水亚硝基态氮NO₂-N含量估测：

首先按制备浓度为2ppm的亚硝基态氮标准工作液，然后用纯净水逐步进行了50％的稀释，得到2ppm、1ppm、0.5ppm、0.25ppm和0.125ppm5个不同浓度的亚硝基态氮标准液，比色后可以得到不同亚硝基态氮浓度的比色管图谱。

同时，当取待检测的养殖水与上述5个配置的标准工作液同时比色，根据显色的对比，可以得知养殖水的浓度在0.5ppm和0.25ppm之间。为进一步确定浓度范围，再把0.5ppm的标准工作液用水稀释成0.3ppm和0.4ppm的标准稀释液，再与养殖水同时比色比较，养殖水比色管的色度十分接近0.4ppm稀释标准比色管，因而可确定此养殖水的亚硝基态氮的浓度是0.4ppm。

实施例2

硝化细菌对于亚硝基态氮标准工作液硝化效果的快速检测试验：

使用矿泉水空瓶6个，每瓶分别加入100、200、300、400、500和600mL的2.02ppm的亚硝基态氮标准工作液，然后向每瓶加入1mL的硝化细菌，充分混匀，组成硝化反应体系，随即放进恒温箱，调25℃，静置，维持22小时，进行硝化反应。反应结束后进行比色检测和硝化效果评估，结果显示500mL以前各瓶硝化反应液在比色后都显示无色，唯600mL反应瓶比色后呈微红色，此瓶经采用标准工作液稀释管比色法比对检测，计算确定此瓶的亚硝酸盐去除率为90％，由此计算它的等同无色体积为600mL×90％＝540mL，为本例硝化细菌硝化反应梯度中达到的最大等同无色体积，硝化效果评定为显效。

实施例3

硝化细菌对待检测养殖水的硝化效果快速检测试验

取养殖水，水质测定仪测定其亚硝基态氮为2.95ppm，用硝化细菌对此养殖水进行降亚硝酸盐效果试验：使用矿泉水空瓶6个，分别加入养殖水100mL、200mL、300mL、400mL、500mL和600mL，然后向每瓶加入1g硝化细菌，充分混匀，组成不同体积梯度硝化反应体系。然后放进恒温箱，调35℃恒温，静置，进行硝化反应达16小时。比色检验的结果显示：100mL、200mL和300mL的硝化反应瓶反应液均为无色，400mL的硝化反应瓶的反应液显粉红色，500mL和600mL的硝化反应瓶反应液显较深红色，色度接近对照液，对它不须作进一步检测。仅对400mL采用养殖水稀释管显色比对，此瓶反应液的亚硝酸盐的去除率为60％，它的等同无色体积是400mL x 60％＝240mL，它不是本例最大无色(或等同无色)体积，而是取梯度中300mL反应液所显示的无色结果为本例的最大无色体积，它的硝化效果评定为有效。

实施例4

水体温度对硝化效果影响的试验

本实验以亚硝酸钠配成2.02ppm的亚硝基态氮溶液，取体积分别为100～600mL溶液作为硝化反应底物溶液，然后，分别加入1mL硝化细菌，置于8℃、15℃、20℃、23℃、30℃、35℃，进行20h硝化反应。通过比色无色显示获得了各设置温度下最大无色体积，计算每ml硝化菌原露菌种液每小时硝化反应可转化亚硝基态氮的量，以μg/ml·h为单位表示硝化活性。如图2所示，实验的结果是：10℃以下硝化活性很低，到8℃时每mL菌种每小时只能转化4μg；上升到15℃可转化12μg，较8℃提高3倍；20℃可转化36μg；23℃可转化59μg；在25℃～35℃期间，硝化活性继续上升可转化达到最高值61μg。

结果表明，水体温度对硝化细菌的硝化活性有显著影响，以25℃～35℃为硝化反应的最佳温度范围。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一，准备亚硝酸盐溶液；

步骤二，配置亚硝酸盐硝化反应体系；

步骤三，硝化反应；

步骤四，制备比色试剂；

步骤五，比色检测；

步骤六，比色结果和硝化效果评估。

2.根据权利要求1所述的一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤一中的亚硝酸盐溶液包括配置的亚硝基态氮标准工作液，或取含亚硝酸盐的养殖水。

3.根据权利要求1所述的一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤二具体为：

2.1，采用有盖的容器作为硝化反应容器，将步骤一中准备的亚硝酸盐溶液在瓶中配置成不同体积梯度的硝化反应底物溶液；

2.2，再向各个不同体积梯度的硝化反应底物溶液瓶分别加入1g或1ml单位的硝化细菌，组成硝化反应溶液，形成梯度硝化反应体系。

4.根据权利要求3所述的一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，

所述的步骤三具体为：

3.1，将上述不同体积梯度的硝化反应瓶盖紧，充分振摇，使硝化细菌溶出分散，与底物混合均匀；

3.2，把硝化反应瓶放入25℃～35℃的恒温箱，维持16～22小时进行硝化反应。

5.根据权利要求1所述的一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，

所述的步骤四具体为：

4.1，制备格利斯试剂Ⅰ：称取分析纯对氨基苯磺酸0.5g溶于150mL30％冰醋酸，避光保存；

4.2，制备格利斯试剂Ⅱ：称取分析纯α-萘胺0.5g加入50mL蒸馏水中，煮沸至刻度，然后缓缓加入30％冰醋酸溶液15mL，使α-萘胺完全溶解，过滤，0℃～10℃冰箱保存。

6.根据权利要求5所述的一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，

所述的步骤五具体为：

5.1，将各个不同梯度硝化反应瓶中的硝化反应液以及不加硝化细菌作为对照的硝化反应底物溶液，分别加到各比色管25mL刻度处；

5.2，对每个比色管各加入0.5ml格利斯试剂Ⅰ、后再加入0.5ml格利斯试剂Ⅱ，摇匀，静置，在比色后5～8分钟内观察结果。

7.根据权利要6所述的一种硝化细菌硝化效果的快速检测方法，其特征在于，

所述的步骤六具体为：

6.1，第一种情况：若步骤5中所有梯度硝化反应瓶对应的比色管都显示玫瑰红色，且色度与作为对照的硝化反应的底物溶液比色管没有差异，显示硝化反应不产生硝化效果，可确定此硝化细菌无效，亚硝酸盐的去除率为0％；

6.2，第二种情况：若步骤5中有的体积梯度硝化反应瓶对应的比色管没有红色生成，显示为无色，即表明这个硝化反应瓶中的硝化反应液所含的亚硝酸盐已经完全转化为硝酸盐，亚硝酸盐的去除率为100％；若梯度中有多个显示为无色体积硝化反应瓶溶液，取梯度中转化形成最大的无色体积表示硝化效果；

6.3，第三种情况：若步骤5中有的体积梯度硝化反应瓶对应的比色管还显红色，但与对照管的色度相比有明显差异，只需对色度最淡、最接近无色的硝化反应瓶溶液，采用与对照稀释液对比检测的方法确定硝化效果；具体操作过程如下：分别吸取作为对照液的亚硝酸盐底物溶液2.5mL或5mL或10mL或15mL或20mL到各比色管，各加水到25mL刻度稀释，然后再与此硝化反应液的比色管同时比色对比，找到色度相同或最接近的两者，此时可按找到的稀释对照比色管按如下公式计算出此硝化反应比色管对应硝化反应瓶中溶液的亚硝酸盐去除率(％)：

其等同无色体积(ml)表示硝化效果，计算公式如下：

等同无色体积(ml)＝硝化反应液体积(ml)×亚硝酸盐去除率(％)；

最后比较上述最大无色体积和等同无色体积(以ml计)，取体积数据较大的表示此硝化细菌的最高硝化效果。