CN105087537B - 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法 - Google Patents
一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105087537B CN105087537B CN201510587330.XA CN201510587330A CN105087537B CN 105087537 B CN105087537 B CN 105087537B CN 201510587330 A CN201510587330 A CN 201510587330A CN 105087537 B CN105087537 B CN 105087537B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aca
- cpc
- immobilised enzymes
- type carrier
- epoxy type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 94
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 title claims description 78
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 25
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 10
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical class OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- -1 propylene glycol dimethyl propylene Olefin Chemical class 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N (7R)-7-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCC(O)=O)[C@@H]12 IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- HBGPNLPABVUVKZ-POTXQNELSA-N (1r,3as,4s,5ar,5br,7r,7ar,11ar,11br,13as,13br)-4,7-dihydroxy-3a,5a,5b,8,8,11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-2,3,4,5,6,7,7a,10,11,11b,12,13,13a,13b-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]chrysen-9-one Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C(C)(C)[C@@H]1[C@H](O)C[C@]([C@]1(C)C[C@@H]3O)(C)[C@@H]2CC[C@H]1[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@H]1C(=C)C HBGPNLPABVUVKZ-POTXQNELSA-N 0.000 description 1
- PFRGGOIBYLYVKM-UHFFFAOYSA-N 15alpha-hydroxylup-20(29)-en-3-one Natural products CC(=C)C1CCC2(C)CC(O)C3(C)C(CCC4C5(C)CCC(=O)C(C)(C)C5CCC34C)C12 PFRGGOIBYLYVKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1,1,1-trifluorobutane Chemical compound FC(F)(F)CCCBr DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- BBJLVBHQJYDCHY-UHFFFAOYSA-N C(C=C)(=O)O.CC(O)(C(CO)(CO)CO)C Chemical compound C(C=C)(=O)O.CC(O)(C(CO)(CO)CO)C BBJLVBHQJYDCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001241 Cyamelide Polymers 0.000 description 1
- SOKRNBGSNZXYIO-UHFFFAOYSA-N Resinone Natural products CC(=C)C1CCC2(C)C(O)CC3(C)C(CCC4C5(C)CCC(=O)C(C)(C)C5CCC34C)C12 SOKRNBGSNZXYIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGSVRQINSVGVTL-DOIPELPJSA-N [(2r,3r,4s,5r)-2,3,4,5-tetrakis(2-methylprop-2-enoyloxy)-6-oxohexyl] 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OC[C@@H](OC(=O)C(C)=C)[C@@H](OC(=O)C(C)=C)[C@H](OC(=O)C(C)=C)[C@@H](OC(=O)C(C)=C)C=O IGSVRQINSVGVTL-DOIPELPJSA-N 0.000 description 1
- ZCZFEIZSYJAXKS-UHFFFAOYSA-N [3-hydroxy-2,2-bis(hydroxymethyl)propyl] prop-2-enoate Chemical compound OCC(CO)(CO)COC(=O)C=C ZCZFEIZSYJAXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000045404 acyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Substances CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N oxiran-2-ylmethyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCC1CO1 RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- FBCQUCJYYPMKRO-UHFFFAOYSA-N prop-2-enyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC=C FBCQUCJYYPMKRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003698 tetramethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种7‑ACA固定化酶的制备及应用工艺，具体来说是一种耐用型7‑ACA固定化酶LK118的制备，及采用LK118酶裂解CPC，制备7‑ACA的工艺方法。本发明的7‑ACA固定化酶LK118，在生产7‑ACA时，能解决原有7‑ACA酰化酶寿命短、应用时CPC残留高、转化率低、产品7‑ACA颜色深等问题，本发明提供了一种耐用型固定化7‑ACA酰化酶的制备，及在7‑ACA中的应用新工艺。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体来说是一种7-ACA固定化酶LK118的制备及一步酶法制备7-ACA的新工艺。
背景技术
7-ACA(7-氨基头孢烷酸)是半合成头孢类抗生素的关键中间体，在医药行业中占有重要的地位，在传统的7-ACA生产工艺中，主要以化学法为主，化学法要用大量有毒试剂，污染极其严重。近些年来逐步转向为酶法生产。
而在酶法工艺中，有三步酶法、两步酶法。两步酶法制备7-ACA，即第一步用氨基酸氧化酶将CPC(头孢菌素C)转化为GL-7ACA，第二步利用GL-脱酰酶将GL-7ACA转化为7-ACA。
相比三步酶法和两步酶法，在酶法工艺中，一步酶法优势明显。一步酶法所采用的7-ACA酰化酶，通过使用改良的CPC酰基转移酶破坏第7位上的酰胺键，并去除其氨基己二酸侧链，直接将CPC转化为7-ACA。
在国内外有一些研究机构对一步酶法进行了研究。有文献提供了一种CPC酰化酶的突变体，并用其制备7-ACA，但其CPC酰化酶未采用固定化的7-ACA酰化酶。有文献提供了一种7-ACA酰化酶的来源，但未提供详细的7-ACA生产工艺。有文献提供了一种7-ACA酰化酶的来源，但未采用固定化酶，且未提供使用工艺。
综上所述，在现有技术中并没有提供一种制备固定化酶的方法，且采用一步酶法来制备7-ACA的工艺。基于此，本发明中公开了一种7-ACA固定化酶的制备方法，并提供了一种采用7-ACA固定化酶LK118一步法生产7-ACA的工艺。
发明内容
针对现有一步酶法7-ACA生产工艺中，酶使用寿命短、CPC残留高、转化率低、颜色深等问题，本发明提供了一种固定化7-ACA酰化酶，及制备7-ACA的新工艺。
采用固定化酶LK118一步法制备7-ACA的反应过程如下：
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
1，7-ACA固定化酶LK118的制备方法，具体步骤如下：
(1)环氧型载体的制备；
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备大孔吸附树脂环氧型载体；且大孔吸附树脂环氧型载体的环氧值在300μmol/g以上；浊度小于200；孔径大于50nm。
(2)环氧型载体的预处理；
将步骤(1)所制得的环氧型载体用磷酸缓冲溶液进行处理；
具体为将环氧型载体放至层析柱中，用10倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；
(3)CPC-酰化酶的固定化；
将游离型的CPC-酰化酶加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)处理过的环氧型载体加至溶有CPC-酰化酶的磷酸盐缓冲液中，在20-30℃下振荡15-40h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的CPC酰化酶，即7-ACA固定化酶LK118。
步骤(1)中，所述的环氧型载体是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂环氧型载体中的一种或两种组合；
所述的大孔吸附树脂环氧型载体在悬浮聚合中所选用的单体是甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、葡萄糖五甲基丙烯酸酯、葡萄糖四甲基丙烯酸酯、葡萄糖三甲基丙烯酸酯、葡萄糖二甲基丙烯酸酯中的一种或几种组合；
所述的大孔吸附树脂环氧型载体在悬浮聚合中所选用的交联剂是二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、衣康酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯、三聚异氰酸烯丙酯中的一种或多种组合；
步骤(3)中所述的游离型CPC酰化酶为假单胞菌(PseUdomonas sp.)来源的CPC酰化酶；
步骤(3)所得到的7-ACA固定化酶LK118的酶活力为80～150U/g。
2，利用7-ACA固定化酶LK118催化CPC制备7-ACA的方法，具体步骤如下：
(1)将底物CPC浓缩液稀释至效价为25000-40000U/mL，并将7-ACA固定化酶LK118，加入至上述CPC浓缩液中，用质量分数为2-10％的氨水溶液调节上述反应液的pH值为8.2-8.4，控制温度为10-15℃，反应40-100min，直至CPC残留效价为0-200U/mL，结束反应；
(2)将步骤(1)所得的混合液，通过筛网，分离出产物和固定化酶；
(3)将步骤(2)所得到的产物降温至0-10℃，用5-6mol/L的盐酸溶液调pH值至5.0-5.6，养晶，洗涤，干燥，即得产品7-ACA。
步骤(1)中所述的7-ACA固定化酶LK118在反应体系中的酶活用量为7～12U/mL；
关于本发明的创新点，可以通过下述方面阐述：
(1)7-ACA固定化酶LK118的研制中，采用了一种环氧型载体。这种载体环氧值高，采用共价键进行酶的固定化，酶的稳定性好，酶不易脱落和衰减。因为载体强度好，不易破碎，生产中流失少。载体孔径大，有利于底物和产物的扩散，能提高CPC转化率，减少杂质对酶的污染。
(2)目前7-ACA生产中，固定化酶的使用寿命在200-500批，而本发明采用了7-ACA固定化酶LK118，连接载体和酶的共价键牢固，LK118酶的载体强度好，不易破碎流失，耐污染。因此，固定化酶LK118能稳定催化1000批以上，大幅降低了7-ACA的生产成本。
(3)现有7-ACA生产中，酶法裂解液中CPC残留在200U/mL以上，而采用7-ACA固定化酶LK118催化后，裂解中CPC残留低于200U/mL，既减少了产品中的杂质，也提高了CPC转化率。
(4)现有7-ACA生产中，产品7-ACA的色级在2#以上，而7-ACA固定化酶LK118能在低温下催化，减少了色素的产生，产品颜色更浅，色级为1#。
综上所述，本发明利用7-ACA固定化酶LK118，采用一步法制备了产物7-ACA。该法提高了CPC的转化率，使得成本降低，而且所制得的产品性能优良。
附图说明
图1为7-ACA固定化酶LK118催化时残留的CPC随批次的变化关系；
图2为某市售固定化7-ACA酰化酶催化时残留的CPC随批次的变化关系。
具体实施方式
本发明通过图表对比和实施例来阐明本发明，但不以任何形式限制本发明。
7-ACA固定化酶LK118的制备方法，具体步骤如下：
(1)环氧型载体的制备；
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备大孔吸附树脂环氧型载体；且大孔吸附树脂环氧型载体的环氧值在300μmol/g以上；浊度小于200；孔径大于50nm。
(2)环氧型载体的预处理；
将步骤(1)所制得的环氧型载体用磷酸缓冲溶液进行处理；
(3)CPC-酰化酶的固定化；
将游离型的假单胞菌(PseUdomonas sp.)来源的CPC酰化酶加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)处理过的环氧型载体加至溶有CPC-酰化酶的磷酸盐缓冲液中，在20-30℃下振荡15-40h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的CPC酰化酶，即7-ACA固定化酶LK118，所得到的7-ACA固定化酶LK118的酶活力为80～150U/g。
利用上述制备的7-ACA固定化酶LK118实施下述实施例。
实施例一
在酶裂解反应器中，加入5000U(酶活力100U/g，50g)的7-ACA固定化酶LK118至500mL的CPC浓缩液(效价30000U/mL)中，开启搅拌。加入质量分数为5％的氨水，保持反应pH值在8.2-8.4，控制反应温度为10℃，反应60min。反应完后，所得的产物，通过筛网，分离出产物和7-ACA固定化酶LK118。反应产物降温至5-10℃，用5-6mol/L的盐酸溶液调pH值至5.2，养晶，洗涤，干燥，即得产品7-ACA。
实施例二
在酶裂解反应器中，加入3500U(酶活力80U/g，43.75g)的7-ACA固定化酶LK118至500mL的CPC浓缩液(效价28000U/mL)中，开启搅拌。加入质量分数为2％的氨水，保持反应pH值在8.2-8.4，控制反应温度为12-13℃，反应65min。反应完后，所得的产物，通过筛网，分离出产物和7-ACA固定化酶LK118。反应产物降温至8℃，用5.5mol/L的盐酸溶液调pH值至5.2，养晶，洗涤，干燥，即得产品7-ACA。
实施例三
在酶裂解反应器中，加入5000U(酶活力150U/g，33.33g)的7-ACA固定化酶LK118至500mL的CPC浓缩液(效价38000U/mL)中，开启搅拌。加入质量分数为6％的氨水，保持反应pH值在8.2-8.4，控制反应温度为13-14℃，反应80min。反应完后，所得的产物，通过筛网，分离出产物和7-ACA固定化酶LK118。反应产物降温至5-10℃，用5-6mol/L的盐酸溶液调pH值至5.2，养晶，洗涤，干燥，即得产品7-ACA。
实施例四
在酶裂解反应器中，加入6000U(酶活力120U/g，50g)的7-ACA固定化酶LK118至500mL的CPC浓缩液(效价35000U/mL)中，开启搅拌。加入质量分数为7％的氨水，保持反应pH值在8.2-8.4，控制反应温度为11-12℃，反应90min。反应完后，所得的产物，通过筛网，分离出产物和7-ACA固定化酶LK118。反应产物降温至5-10℃，用5-6mol/L的盐酸溶液调pH值至5.2，养晶，洗涤，干燥，即得产品7-ACA。
实验例
对实施例一～四所得的7-ACA产品进行性能测试
纯度、CPC残留主要用HPLC检测；色级主要检测方法为中国药典的方法。
对7-ACA产品进行检测，结果如下表所示：
| 收率％ | 纯度％ | 残留CPC％ | 色级 | |
| 实施例一 | 60.2 | 99.2 | 0.12 | 1# |
| 实施例二 | 60.3 | 99.3 | 0.08 | 1# |
| 实施例三 | 60.2 | 99.4 | 0.07 | 1# |
| 实施例四 | 60.4 | 99.2 | 0.09 | 1# |
使用批次的考察实验：模拟生产过程进行小试反应，每批反应结束后，从酶反应器的筛网分离出固定化酶和产物。放出产物，固定化酶留在反应器中继续用于下一批的催化反应中。从投加底物至放出反应产物，为固定化的一个使用批次。使用固定化酶进行催化实验，初始时间短，随着批次的增多，酶逐渐衰减，需要延长反应时间确保产物的质量。实验中以反应时间超过240min视为酶的寿命终点。达到酶的寿命终点时，固定化酶共循环套用批次的量，为酶的寿命或酶能使用的批次数。
从实施例和附图对比来看：本发明所得产品，使用批次多，稳定性好，产品质量好，颜色浅，收率高。从附图1和图2可知，LK118酶催化时，使用批次更多，能达1000批以上；CPC残留比某市售酶残留低，CPC转化率高。
Claims (5)
1.一种利用7-ACA固定化酶LK118催化CPC制备7-ACA的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)环氧型载体的制备；
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备大孔吸附树脂环氧型载体；且大孔吸附树脂环氧型载体的环氧值在300μmol/g以上；浊度小于200；孔径大于50nm；
(2)环氧型载体的预处理；将步骤(1)所制得的环氧型载体用
磷酸缓冲溶液进行处理；
(3)CPC-酰化酶的固定化；
将游离型的CPC-酰化酶加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)处理过的环氧型载体加至溶有CPC-酰化酶的磷酸盐缓冲液中，在20-30℃下振荡15-40h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的CPC酰化酶，即7-ACA固定化酶LK118；
具体步骤如下：
1)将底物CPC浓缩液稀释至效价为25000-40000U/mL，并将7-ACA固定化酶LK118，加入至上述CPC浓缩液中，用质量分数为2-10％的氨水溶液调节上述反应液的pH值为8.2-8.4，控制温度为10-15℃，反应40-100min，直至CPC残留效价为0-200U/mL，结束反应；
2)将步骤1)所得的混合液，通过筛网，分离出产物和固定化酶；
3)将步骤2)所得到的产物降温至0-10℃，用5-6mol/L的盐酸溶液调pH值至5.0-5.6，养晶，洗涤，干燥，即得产品7-ACA。
2.如权利要求1所述的利用7-ACA固定化酶LK118催化CPC制备7-ACA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的环氧型载体是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂环氧型载体中的一种或两种组合。
3.如权利要求1所述的利用7-ACA固定化酶LK118催化CPC制备7-ACA的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的游离型CPC酰化酶为假单胞菌(PseUdomonas sp.)来源的CPC酰化酶。
4.如权利要求1所述的利用7-ACA固定化酶LK118催化CPC制备7-ACA的方法，其特征在于，步骤(3)所得到的7-ACA固定化酶LK118的酶活力为80～150U/g。
5.如权利要求1所述的利用7-ACA固定化酶LK118催化CPC制备7-ACA的方法，其特征在于，步骤1)中所述的7-ACA固定化酶LK118在反应体系中的酶活用量为7～12U/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510587330.XA CN105087537B (zh) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510587330.XA CN105087537B (zh) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105087537A CN105087537A (zh) | 2015-11-25 |
| CN105087537B true CN105087537B (zh) | 2018-09-28 |
Family
ID=54568871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510587330.XA Active CN105087537B (zh) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105087537B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434616A (zh) * | 2016-12-19 | 2017-02-22 | 山东思科新材料有限公司 | 一种白酒用固定化增酯酶的制备及应用方法 |
| CN111876402A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-11-03 | 伊犁川宁生物技术有限公司 | 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102827912A (zh) * | 2012-08-31 | 2012-12-19 | 山东鲁抗立科药业有限公司 | 两酶一步法制备医药中间体d-7-aca的工艺 |
| CN103436517A (zh) * | 2013-09-05 | 2013-12-11 | 北京科技大学 | 一种制备固定化头孢菌素c酰化酶的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100530299B1 (ko) * | 2003-08-11 | 2005-11-22 | 산도즈 게엠베하 | 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ 제조방법 |
-
2015
- 2015-09-16 CN CN201510587330.XA patent/CN105087537B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102827912A (zh) * | 2012-08-31 | 2012-12-19 | 山东鲁抗立科药业有限公司 | 两酶一步法制备医药中间体d-7-aca的工艺 |
| CN103436517A (zh) * | 2013-09-05 | 2013-12-11 | 北京科技大学 | 一种制备固定化头孢菌素c酰化酶的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Characteristic of immobilized cephalosporin C acylase and its application in one-step enzymatic conversion of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid;Xiangwei Zhu 等;《World J Microbiol Biotechnol》;20100810;第27卷;第823-829页,尤其是题目、摘要、第824页左栏第二段、第824页右栏Immobilization of CPC acylase onto epoxy supports部分、第825页左栏最后一段到右栏第一段、826页右栏第二段到第828页左栏第二段、第827页Fig.3-5 * |
| 固定化酶技术及其在医药上的应用新进展;杨杰 等;《药学生物技术》;20131231;第20卷(第4期);第553-556页 * |
| 酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展;芮菊 等;《2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集》;20081231;第545-550页 * |
| 酶法转化头孢菌素C成为7-氨基头孢烷酸的研究进展;刘福强 等;《山东食品发酵》;20091231;第17-20页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105087537A (zh) | 2015-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ghose et al. | Rapid ethanol fermentation in immobilized yeast cell reactor | |
| Guerrero et al. | Repeated-batch operation for the synthesis of lactulose with β-galactosidase immobilized by aggregation and crosslinking | |
| CN108004291B (zh) | 一种用于水解d,l-泛解酸内酯的产酶微生物及其应用和筛选方法 | |
| CN105087537B (zh) | 一种7-aca固定化酶lk118的制备及其使用方法 | |
| CN107312768B (zh) | 一种固定化单宁酶及其制备方法和应用 | |
| CN104928340A (zh) | 一种酶法合成头孢丙烯的工艺 | |
| CN109576256B (zh) | 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 | |
| Luo et al. | Microenvironmental pH changes in immobilized cephalosporin C acylase during a proton-producing reaction and regulation by a two-stage catalytic process | |
| Godoy et al. | Changes on enantioselectivity of a genetically modified thermophilic lipase by site-directed oriented immobilization | |
| CN106929439A (zh) | 一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用 | |
| Sundaramoorthi et al. | Production and immobilization of L-asparaginase from marine source | |
| Attique et al. | Enzyme immobilization approaches | |
| Ahlawat et al. | Variability in intra-specific and monosporous isolates of Volvariella volvacea based on enzyme activity, ITS and RAPD | |
| CN104830940A (zh) | 一种酶法合成阿莫西林的工艺 | |
| CN107034206B (zh) | 一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法 | |
| CN104711248A (zh) | 一种消除底物毒性的方法 | |
| CN115786418A (zh) | 一种固定化酶催化的高纯度(s)-降烟碱的合成方法 | |
| CN107446906A (zh) | 一种复合酶及其应用以及酶解几丁质的方法 | |
| US11969717B2 (en) | Organophosphorus degrading enzyme based multifunctional catalyst and preparation method and use thereof | |
| CN111607584A (zh) | 一种树脂固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法 | |
| Hanefeld et al. | CAL-B catalyzed enantioselective synthesis of cyanohydrins-A facile route to versatile building blocks | |
| CN101787356B (zh) | 一种glyA基因工程菌构建和固定化使用方法 | |
| CN117327685B (zh) | 一种提高酶催化活性的方法及应用 | |
| Isanapong et al. | Utilization of organic wastes for laccase production by Pleurotus ostreatus | |
| Lu et al. | Linker-peptide-mediated one-step purification and immobilization of α-L-rhamnosidase from Bacteroides thetaiotaomicron for direct biotransformation from epimedin C to icariin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 272073 Shandong city of Jining province high tech Zone Shixian Road No. 1688 Applicant after: AMICOGEN (CHINA) BIOPHARM CO.,LTD. Address before: 272073 Shandong city of Jining province high tech Zone Shixian Road No. 1688 Applicant before: SHANDONG LUKANG RECORD PHARMACEUTICALS Co.,Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Preparation and application of a 7-ACA immobilized enzyme lk118 Effective date of registration: 20200730 Granted publication date: 20180928 Pledgee: Jining City branch of the China Co truction Bank Corp. Pledgor: AMICOGEN (CHINA) BIOPHARM Co.,Ltd. Registration number: Y2020980004549 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20211115 Granted publication date: 20180928 Pledgee: Jining City branch of the China Co truction Bank Corp. Pledgor: AMICOGEN (CHINA) BIOPHARM CO.,LTD. Registration number: Y2020980004549 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Preparation of 7-ACA immobilized enzyme lk118 and its application method Effective date of registration: 20211201 Granted publication date: 20180928 Pledgee: Jining City branch of the China Co truction Bank Corp. Pledgor: AMICOGEN (CHINA) BIOPHARM CO.,LTD. Registration number: Y2021980013624 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20221115 Granted publication date: 20180928 Pledgee: Jining City branch of the China Co truction Bank Corp. Pledgor: AMICOGEN (CHINA) BIOPHARM CO.,LTD. Registration number: Y2021980013624 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Preparation and application of 7-ACA immobilized enzyme LK118 Effective date of registration: 20221117 Granted publication date: 20180928 Pledgee: Jining City branch of the China Co truction Bank Corp. Pledgor: AMICOGEN (CHINA) BIOPHARM CO.,LTD. Registration number: Y2022980022253 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |