CN106929439A - 一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用 - Google Patents

一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。本发明所述重组酿酒酵母实现了以酪氨酸为底物生产8‑二甲基异戊烯基柚皮素，在重组酿酒酵母菌株中，圆红冬孢酵母来源TAL基因、欧芹来源TAL基因、拟南芥来源CHS基因、蜜柑来源CHI基因和苦参来源N8DT基因组合具有高产8‑二甲基异戊烯基柚皮素的效果，实验表明8‑二甲基异戊烯基柚皮素产量可达36.7μg/L。利用本发明所述重组酿酒酵母菌株生产8‑二甲基异戊烯基柚皮素相对于植物提取和化学合成成本低、副产物少且污染小，为8二甲基异戊烯基柚皮素及其相关产物的生产提供了一种切实可行的方法，并为淫羊藿素、淫羊藿苷的生物合成打下基础。

Description

一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。
背景技术
黄酮类药物作为一种具有药用价值的天然化合物，因为其具有抗菌、抗炎、抗癌、解痉和利胆作用等方面的作用被广泛应用。8-二甲基异戊烯基柚皮素(8DN)作为生产黄酮类类药物淫羊藿苷的重要中间体，在医药合成领域有重大应用。目前，8DN的制备大多采用植物提取和化学合成的方法实现，但植物提取过程步骤多、收率低、副产物分离复杂，而化学合成则容易对环境造成污染，极大的限制了8DN的生产和应用。相较而言微生物合成以低成本、高产量和产品安全性等被认为是有前途的生产方法。
酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，遗传背景清楚、基因操作简单、可进行大规模发酵生产。8DN在酵母细胞中的合成，需要先进行生产柚皮素路径的构建，同时引入外源基因N8DT进而获得目标产物，在酿酒酵母中通过饲喂柚皮素的生物转化方法得到的8DN。已有的相关文献是Sasaki等人在2007年发现了苦参体内存在将柚皮素转化为8-二甲基丙烯基柚皮素的关键酶N8DT，2009年日本京都大学植物基因表达实验室的Yazaki课题组通过外源添加柚皮素，同时引入苦参来源的N8DT基因获得8二甲基异戊烯基柚皮素，产量为20μg/g。但该生产方式受限于原料柚皮素的高成本和柚皮素难以进入酵母细胞的低利用率。目前，还未发现在酿酒酵母中从初级氨基酸出发直接得到8DN的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种在酿酒酵母中从酪氨酸出发直接得到8-二甲基丙烯基柚皮素的重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种重组酿酒酵母菌株，包含经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因，所述TAL基因为圆红冬孢酵母来源TAL基因序列；所述4CL基因为欧芹来源TAL基因序列；所述CHS基因为拟南芥来源CHS基因序列；所述CHI基因为蜜柑来源CHI基因序列；所述N8DT基因为苦参来源N8DT基因序列。
优选的，所述经优化为经过酿酒酵母密码子优化并规避BsaI限制性内切酶酶切位点，同时在基因两端分别添加SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
优选的，所述TAL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述4CL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CHS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述N8DT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本发明还提供了所述重组酿酒酵母菌株的构建方法，将经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因整合到酿酒酵母底盘菌株基因组中。
其中，优选的，所述酿酒酵母底盘菌株为酿酒酵母CENpK2-1d。
进一步优选的，具体包含如下步骤：
步骤1、用酶切连接的方法将经优化的外源TAL、4CL、CHS和CHI基因分别构建到pRS415K-GPM1t-PGK1p-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-PGK1t和pRS414-PGK1t-HXT7p-CYC1t质粒中，采用醋酸锂法将上述质粒转化酿酒酵母底盘菌中，Sc-Leu,ura,his,trp固体培养基筛选转化子；
步骤2、将经酿酒酵母密码子优化的外源N8DT基因与pRS425K-ENO2t-PDC2p-GPM2t质粒连接，采用醋酸锂法转化到步骤2筛选得到的转化子菌株中采用Sc-LEU固体平板培养基筛选转化子。
本发明还提供了所述的重组酿酒酵母菌株在生产8-二甲基异戊烯基柚皮素中的应用。
进一步，本发明还提供了一种生产8-二甲基异戊烯基柚皮素的方法，将所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基活化；将活化后的菌株接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取8-二甲基异戊烯基柚皮素。
优选的，所述生产8-二甲基异戊烯基柚皮素的方法具体为将所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基在30℃、250rpm活化24h，转接至新鲜的种子培养基，在30℃、250rpm活化18h，转接至发酵培养基30℃、250rpm发酵96h，收集菌体提取8-二甲基异戊烯基柚皮素。
优选的，所述种子培养基为22g/L葡萄糖、6.7g/L YNB、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末，余量为水；所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/L酪氨酸，余量为水。
本发明所述重组酿酒酵母实现了以酪氨酸为底物生产8-二甲基异戊烯基柚皮素，在重组酿酒酵母菌株中，圆红冬孢酵母来源TAL基因、欧芹来源TAL基因、拟南芥来源CHS基因、蜜柑来源CHI基因和苦参来源N8DT基因组合具有高产8-二甲基异戊烯基柚皮素的效果，实验表明8-二甲基异戊烯基柚皮素产量可达36.7μg/L。利用本发明所述重组酿酒酵母菌株生产8-二甲基异戊烯基柚皮素相对于植物提取和化学合成成本低、副产物少且污染小，为8二甲基异戊烯基柚皮素及其相关产物的生产提供了一种切实可行的方法。而与已报道的饲喂柚皮素得到的8DN的生产方式相比，本发明实现了在酿酒酵母体内从氨基酸合成黄酮类药物8DN的全合成途径，利用了更经济的初级氨基酸原料，同时也克服了原料难以进入细胞的低利用率问题，在类药物的合成方面具有更大的生产潜力和更好的经济效益。并为淫羊藿素、淫羊藿苷的生物合成打下基础，同时对其他种微生物合成8-二甲基异戊烯基柚皮素具有指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组酿酒酵母合成8-二甲基异戊烯基柚皮素的路径图；
图2示酿酒酵母游离多拷贝质粒构建过程图；
图3示实施例1柚皮素标准曲线；
图4示重组酿酒酵母菌株5种来源CHS基因和6种来源CHI基因两两组合后的柚皮素摇瓶产量比较图；
图5示高产柚皮素菌株SyBE_Sc02050003中的模块酵母组装过程图；
图6示将带有N8DT基因的多拷贝质粒导入重组酵母后的8-二甲基异戊烯基柚皮素摇瓶发酵产量统计图。
具体实施方式
本发明公开了一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明以酿酒酵母CEN.PK2-1d为底盘菌株，分别选取5种和6种不同来源的且经优化的合成柚皮素的功能基因CHS和CHI，以及经优化的TAL，4CL基因，经模块化设计整合至酿酒酵母底盘菌基因组上，通过摇瓶发酵筛选酿酒酵母合成柚皮素最优的外源功能基因组合。再以筛选过后的菌株作为底盘，导入带有N8DT基因的PRS425K质粒，经过摇瓶发酵和HPLC检测，确定合成8-二甲基异戊烯基柚皮素最优的菌株。
其中，5种不同来源的CHS的基因来源包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、海洋细菌(Rhodopirellula baltica)、大豆(Glycine max)，依次简写为Sc_CHS1、Sc_CHS2、Sc_CHS3、Sc_CHS4、Sc_CHS7。6种不同来源的CHI基因包括大豆1(Glycine max)、大豆2(Glycine max)、蜜柑(Citrus unshiu)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、花生(Arachis hypogaea)等，依次简写为Sc_CHI1、Sc_CHI2、Sc_CHI4、Sc_CHI5、Sc_CHI6、Sc_CHI7。
所述TAL基因为圆红冬孢酵母来源TAL基因序列。所述4CL基因为欧芹来源TAL基因序列。
本发明所述重组酿酒酵母菌株中所述优化具体包含酿酒酵母密码子优化、规避BsaI限制性内切酶酶切位点和在基因两端额外添加核苷酸序列。
其中，在一些实施方案中，所述基因5’端额外添加的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示(gcggccgcggtctcca)；3’端额外添加的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示(taaaggagaccgcggccgc)。
本发明筛选获得一种重组酿酒酵母菌株，包含经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因，所述TAL基因为圆红冬孢酵母来源TAL基因序列；所述4CL基因为欧芹来源TAL基因序列；所述CHS基因为拟南芥来源CHS基因序列；所述CHI基因为蜜柑来源CHI基因序列；所述N8DT基因为苦参来源N8DT基因序列。
在一些实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株中，所述TAL基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述4CL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CHS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述N8DT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，该菌株命名为SyBE_Sc02050032。
本发明还提供了所述重组酿酒酵母菌株的构建方法，将经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因整合到酿酒酵母底盘菌株基因组中。
在一些实施方案中，所述构建方法中所述酿酒酵母底盘菌优选为酿酒酵母CENpK2-1d。
在一些实施方案中，所述构建方法具体包含如下步骤：
步骤1、用酶切连接的方法将经优化的外源TAL、4CL、CHS和CHI基因分别构建到pRS415K-GPM1t-PGK1p-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-PGK1t和pRS414-PGK1t-HXT7p-CYC1t质粒中，采用醋酸锂法将上述质粒转化酿酒酵母底盘菌中，Sc-Leu,ura,his,trp固体培养基筛选转化子；
步骤2、将经酿酒酵母密码子优化的外源N8DT基因与pRS425K-ENO2t-PDC2p-GPM2t质粒连接，采用醋酸锂法转化到步骤2筛选得到的转化子菌株中采用Sc-LEU固体平板培养基筛选转化子。
利用本发明所述重组酿酒酵母菌株生产8-二甲基异戊烯基柚皮素，相对于植物提取和化学合成成本低、副产物少且污染小，为8二甲基异戊烯基柚皮素及其相关产物的生产提供了一种切实可行的方法，并为淫羊藿素，淫羊藿苷的生物合成打下基础。因此本发明提供了所述重组酿酒酵母菌株在生产8-二甲基异戊烯基柚皮素中的应用。
进一步本发明提供了一种生产8-二甲基异戊烯基柚皮素的方法，将所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基活化；将活化后的菌株接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取8-二甲基异戊烯基柚皮素。
在一些实施方案中，所述方法具体为将所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基在30℃、250rpm活化24h，转接至新鲜的种子培养基，在30℃、250rpm活化18h，转接至发酵培养基30℃、250rpm发酵96h，收集菌体提取8-二甲基异戊烯基柚皮素。
其中，所述种子培养基为22g/L葡萄糖、6.7g/L YNB、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末，余量为水；所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/L酪氨酸，余量为水。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。在本发明中所涉及的一些质粒载体、菌株均可由市场购得，pRS415K-GPM1t-PGK1p-GPD1t、pRS423-GPD1t-PGI1p-FBA1t、pRS416-FBA1t-TPI1p-PGK1t、pRS414-PGK1t-HXT7p-CYC1t和pRS425K-ENO2t-PDC2p-GPM2t质粒保存于天津大学元英进实验室，可在http://synbioml.org/免费获取。CENpK2-1d底盘菌株保存于天津大学合成生物学元英进课题组(孙明雪.代谢工程改造酿酒酵母生产(S)-芳樟醇[D].江南大学,2013)。
实施例1、生产柚皮素的重组酿酒酵母菌株的构建
1、外源功能基因元件的获得
外源基因为用于合成柚皮素的关键酶TAL，4CL，CHS和CHI基因：TAL基因来源为圆红冬孢酵母(R.toruloides)，简称为Sc_TAL。4CL基因来源为欧芹(petroselinumcrispum)，简称为Sc_4CL。CHS的基因来源包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、海洋细菌(Rhodopirellula baltica)、大豆(Glycine max)等，依次简写为Sc_CHS1、Sc_CHS2、Sc_CHS3、Sc_CHS4、Sc_CHS7，CHI的基因来源包括大豆1(Glycine max)、大豆2(Glycine max)、蜜柑(Citrus unshiu)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、花生(Arachis hypogaea)等，依次简写为Sc_CHI1、Sc_CHI2、Sc_CHI4、Sc_CHI5、Sc_CHI6、Sc_CHI7。具体基因序列见表1。上述基因均为经过酿酒酵母密码子优化并适当规避BsaI限制性内切酶酶切位点，在基因两端额外添加5’端gcggccgcggtctcca；3’taaaggagaccgcggccgc通过人工合成得到。
表1基因序列
基因名称和来源 编码序列
圆红冬孢酵母(R.toruloides)来源TAL基因序列(Sc_TAL) SEQ ID No:1
欧芹(petroselinum crispum)来源4CL基因序列(Sc_4CL) SEQ ID No:2
拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源CHS基因序列(Sc_CHS1) SEQ ID No:3
葡萄(Vitis vinifera)来源CHS基因序列(Sc_CHS2) SEQ ID No:4
虎杖(Polygonum cuspidatum)来源CHS基因序列(Sc_CHS3) SEQ ID No:5
海洋细菌(Rhodopirellula baltica)来源CHS基因序列(Sc_CHS4) SEQ ID No:6
大豆(Glycine max)来源CHS基因序列(Sc_CHS7) SEQ ID No:7
大豆1(Glycine max)来源CHI基因序列(Sc_CHI1) SEQ ID No:8
大豆2(Glycine max)来源CHI基因序列(Sc_CHI2) SEQ ID No:9
蜜柑(Citrus unshiu)来源CHI基因序列(Sc_CHI4) SEQ ID No:10
拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源CHI基因序列(Sc_CHI5) SEQ ID No:11
玉米(Zea mays)来源CHI基因序列(Sc_CHI6) SEQ ID No:12
花生(Arachis hypogaea)来源CHI基因序列(Sc_CHI7) SEQ ID No:13
2、构建生产柚皮素的重组酿酒酵母菌株
首先，将实验室模块库中pRS415K-GPM1t-PGK1p-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-PGK1t和pRS414-PGK1t-HXT7p-CYC1t质粒(可在http://synbioml.org/免费获取)及获得的外源TAL、4CL、CHS和CHI基因用酶切连接的方法进行构建，获得了圆红冬孢酵母(R.toruloides)来源TAL的pRS415K-GPM1t-PGK1p-GPD1t质粒，欧芹(petroselinum crisp um)来源4CL的pRS423-GPD1t-PGI1p-FBA1t，5种来源CHS的pRS416-F BA1t-TPI1p-PGK1t和6种来源的pRS414-PGK1t-HXT7p-CYC1t酿酒酵母重组游离型多拷贝质粒，采用醋酸锂法将这四种质粒同时转化到CENpK2-1d底盘菌株中(其中后两种质粒交叉组合，共30种)，用Sc-Leu,ura,his,trp的固体平板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖22g/L，2g/L缺异亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后进行菌落PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc02050001-SyBE_Sc02050030。其中，各菌株所含质粒如下：
SyBE_Sc02050001：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS1-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI1-CYC1t；
SyBE_Sc02050002：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS1-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI2-CYC1t；
SyBE_Sc02050003：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS1-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI4-CYC1t；
SyBE_Sc02050004：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS1-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI5-CYC1t；
SyBE_Sc02050005：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS1-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI6-CYC1t；
SyBE_Sc00080006：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS1-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI7-CYC1t
SyBE_Sc02050007：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS2-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI1-CYC1t；
SyBE_Sc02050008：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS2-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI2-CYC1t；
SyBE_Sc02050009：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS2-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI4-CYC1t；
SyBE_Sc02050010：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS2-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI5-CYC1t；
SyBE_Sc02050011：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS2-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI6-CYC1t；
SyBE_Sc02050012：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS2-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI7-CYC1t；
SyBE_Sc02050013：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS3-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI1-CYC1t；
SyBE_Sc02050014：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS3-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI2-CYC1t；
SyBE_Sc02050015：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS3-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI4-CYC1t；
SyBE_Sc02050016：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS3-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI5-CYC1t；
SyBE_Sc02050017：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS3-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI6-CYC1t；
SyBE_Sc02050018：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS3-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI7-CYC1t；
SyBE_Sc02050019：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS4-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI1-CYC1t；
SyBE_Sc02050020：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS4-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI2-CYC1t；
SyBE_Sc02050021：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS4-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI4-CYC1t；
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SyBE_Sc02050023：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS4-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI6-CYC1t；
SyBE_Sc02050024：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS4-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI7-CYC1t；
SyBE_Sc02050025：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS7-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI1-CYC1t；
SyBE_Sc02050026：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS7-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI2-CYC1t；
SyBE_Sc02050027：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS7-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI4-CYC1t；
SyBE_Sc02050028：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS7-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI5-CYC1t；
SyBE_Sc02050029：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS7-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI6-CYC1t；
SyBE_Sc02050030：pRS415K-GPM1t-PGK1p-Sc_TAL-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-Sc_4CL-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-Sc_CHS7-PGK1t，pRS414-PGK1t-HXT7p-Sc_CHI7-CYC1t。
3、比较菌株SyBE_Sc02050001-SyBE_Sc02050030的柚皮素摇瓶产量
试验材料：菌株SyBE_Sc02050001-SyBE_Sc02050030
试验方法：
一级、二级种子培养基：20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB(Yeast Nitrogen Base)、2g/L缺异亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末。
发酵培养基：20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB(Yeast Nitrogen Base)、2g/L缺异亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末、0.5g/L酪氨酸。
将上述菌株SyBE_Sc02050001-SyBE_Sc02050030接种于2mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于二级种子培养基中，在30℃、250rpm培养12h，再以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)，发酵96小时结束，取600μL菌液提取柚皮素。
柚皮素提取方法：取600μL发酵液，加入等体积的乙酸乙酯和石英砂，置于涡旋振荡器上5000rpm震荡30min后，以10000rpm的速度离心10min，用枪头吸出上清液放置在干净的EP管中，重复3次。将收集好的上清液进行氮吹蒸发，大约20min后确认无液体残留停止，获得浅黄色固体。加入600μL色谱甲醇溶解，用2μm有机滤膜过滤后使用高效液相色谱(HPLC)检测柚皮素含量，流动相为甲醇和0.1％甲酸，比例随时间梯度变化，流速为0.2mL/min，检测波长290/310nm，柱温30℃，进样量10μL，结果见表2和图3。
表2高效液相色谱(HPLC)检测柚皮素摇瓶产量结果
由表2及图3菌株SyBE_Sc02050001-SyBE_Sc02050030的柚皮素产量来看，发酵96小时，SyBE_Sc02050003的产量最高，达到24.66mg/L。由此可知，拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源CHS基因Sc_CHS1和蜜柑(Citrus unshiu)来源CHI基因序列Sc_CHI4对于重组酿酒酵母生产柚皮素有积极意义。
4、将高产柚皮素菌株SyBE_Sc02050003中的模块进行酵母组装
通过比较柚皮素产量，选择最高产的酿酒酵母菌株SyBE_Sc02050003的基因组合TAL，4CL，CHS1，CHI4，分别将连接4个基因的模块质粒提取出来，用NotI内切酶进行酶切后得到的4个片段进行酵母组装，用YPD的固体平板(蛋白胨20g/L，葡萄糖22g/L，10g/L酵母粉，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后进行菌落PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为SyBE_Sc02050031。
实施例2、外源基因N8DT在重组酿酒酵母中表达合成8-二甲基异戊烯基柚皮素
1、外源功能基因元件N8DT的获得
外源基因为用于8-二甲基异戊烯基柚皮素的关键酶N8DT：选取的是来自苦参(Sophora flavescens)体内的柚皮素异戊烯基转移酶(N8DT)，具体基因序列如SEQ ID No:14所示。上述基因为经过酿酒酵母密码子优化通过人工合成得到。
2、构建生产8-异戊烯基柚皮素的重组酿酒酵母菌株
将获得的外源N8DT基因经BsaI酶切后利用T4连接酶连接到模块库pRS425K-ENO2t-PDC2p-GPM2t质粒(可在http://synbioml.org/免费获取)上，采用醋酸锂法将重组质粒转化到SyBE_Sc02050031底盘菌株中，采用Sc-LEU固体平板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取质粒进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并分别命名为syBE_Sc02050032。
3、测定菌株syBE_Sc02050032的8-二甲基异戊烯基柚皮素产量
试验材料：菌株syBE_Sc02050032
试验方法：一级、二级种子培养基：22g/L葡萄糖、6.7g/L YNB(Yeast NitrogenBase)、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末；
发酵培养基：20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB(Yeast Nitrogen Base)、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/L酪氨酸。
将上述菌株syBE_Sc02050032接种于5mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于二级种子培养基中，在30℃、250rpm培养18h，再以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD600)，发酵96小时结束，取600μL菌液提取8二甲基异戊烯基柚皮素。
8-二甲基异戊烯基柚皮素提取与测量方法和柚皮素相同，按照实施例1的提取并测量。
试验结果：由图5的8DN产量来看，发酵96小时，在导入N8DT基因的菌株syBE_Sc02050032能够实现由酪氨酸合成8二甲基异戊烯基柚皮素，产量为36.7μg/L。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用
<130> MP1702515
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2189
<212> DNA
<213> 圆红冬孢酵母
<400> 1
gcggccgcgg tctccaaaaa tggctccatc attggattct atttctcact ctttcgcaaa 60
cggtgtcgct tctgctaagc aagctgtcaa tggtgcatct actaacttgg cagtcgctgg 120
atctcatttg ccaacaactc aagttacaca agttgatatt gttgagaaga tgttagcagc 180
tccaactgat tcaacattgg aattagatgg ttactctttg aacttgggtg atgtcgtctc 240
tgcagctaga aagggtaggc cagtcagagt caaggattct gatgagataa gatctaaaat 300
tgacaagtct gttgaatttt tgagatcaca attatctatg tcagtctacg gtgttactac 360
tggtttcggt ggttctgcag acacaaggac agaagatgct atttctttac aaaaagcttt 420
gttggagcat cagttgtgtg gtgtcttgcc atcttcattt gactcattca ggttgggtag 480
aggtttggaa aactctttgc cattggaggt cgtcaggggt gctatgacaa ttagggttaa 540
ctctttgact agaggtcact cagctgtcag gttggttgtc ttggaggcat tgactaattt 600
tttgaaccat ggtattacac ctattgtccc tttaagaggt actatttctg catctggtga 660
tttgtctcca ttgtcttaca ttgcagctgc tatatcaggt caccctgact ctaaggtcca 720
cgtcgtccat gaaggtaagg aaaaaatttt gtatgcaaga gaagcaatgg ctttgttcaa 780
cttggagcca gtcgtcttgg gtcctaagga gggtttgggt ttggtcaacg gtacagctgt 840
ctctgcttca atggctacat tagcattgca cgatgctcat atgttatctt tgttatctca 900
atctttgaca gctatgacag tcgaagctat ggtcggtcac gctggttctt ttcatccttt 960
cttgcatgat gttacaagac cacatccaac acaaattgaa gttgcaggta atattagaaa 1020
attattagag ggttctagat tcgcagttca ccatgaggaa gaagttaaag tcaaggatga 1080
tgagggtata ttgaggcagg acaggtaccc attaaggaca tctccacagt ggttgggtcc 1140
attggtttca gatttaattc atgctcatgc tgttttaact atagaagctg gtcaatctac 1200
aacagataac ccattgattg atgttgagaa caaaacttct caccatggtg gtaacttcca 1260
ggcagcagca gttgctaata ctatggaaaa aacaagatta ggtttggctc aaataggtaa 1320
gttgaacttc actcaattga cagaaatgtt gaacgctggt atgaatagag gattgccttc 1380
atgcttggct gctgaggacc catcattgtc ttatcattgc aaaggtttag acattgctgc 1440
tgctgcatac acatctgagt tgggacactt ggcaaaccca gtcactactc acgtccaacc 1500
agctgagatg gctaaccagg ctgtcaactc tttggcatta atatctgcta gaagaactac 1560
tgagtctaat gatgtcttat ctttgttatt agcaacacat ttgtattgcg tcttacaagc 1620
tattgatttg agagcaattg aatttgaatt taagaaacag tttggtccag caattgtttc 1680
attgattgac caacattttg gttcagctat gactggttct aacttgagag acgagttggt 1740
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<211> 1749
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<213> 欧芹
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 3
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ccaaagagca gatggtccag caggtatatt agcaatcggt actgctaatc cagaaaacca 120
tgttttgcaa gcagaatacc ctgattacta cttcagaatc accaactccg aacacatgac 180
tgatttgaag gaaaagttca agagaatgtg tgacaagagt acaataagaa agagacatat 240
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tttgggtatt tccgactgga acagtttgtt ctggatagca catccaggtg gtcctgccat 960
cttggatcaa gttgaaatca agttgggttt aaaggaagaa aagatgagag caacaagaca 1020
cgttttgtct gaatatggta atatgtcttc agcctgcgtc ttgttcatat tggatgaaat 1080
gagaagaaag tcagccaaag acggtgtcgc taccactggt gaaggtttgg aatggggtgt 1140
attatttggt ttcggtccag gtttaactgt agaaacagtc gtattgcatt cagttccttt 1200
ataaaggaga ccgcggccgc 1220
<210> 4
<211> 1214
<212> DNA
<213> 葡萄
<400> 4
gcggccgcgg tctccaatgg tatccgtagc agaaatcaga aaagcccaaa gagcagaagg 60
tccagccaca gtattagcaa tcggtacagc aactccagcc aattgtgttt atcaagcaga 120
ttacccagac tactacttca gaatcactaa ctccgaacat atgacagaat tgaaggaaaa 180
gttcaagaga atgtgtgaaa agtcaatgat caacaagaga tacatgcact tgactgaaga 240
aatcttgaag gaaaacccaa acgtttgcgc atacatggcc ccttctttag atgctagaca 300
agacatggtt gtcgtagaag tcccaaagtt gggtaaagaa gctgcagcca aggcaattaa 360
agaatggggt caacctaagt ctaagatcac acatttggtc ttttgcacta catcaggtgt 420
agatatgcca ggtgccgact atcaattaac caagttgtta ggtttgaagc cttctgtcaa 480
aagattgatg atgtaccaac aaggttgttt cgctggtggt actgtattga gattggctaa 540
ggatttggca gaaaataacg ccggttccag agtattggtt gtctgcagtg aaataaccgc 600
tgttactttt agaggtccat ccgatacaca tttagacagt ttggttggtc aagccttatt 660
cggtgatggt gctgcagccg tcattatagg tgctgatcca gacaccaaga tagaaagacc 720
tttattcgaa ttggtttccg ctgcacaaac tattttgcct gatagtgaag gtgcaataga 780
cggtcattta agagaagtcg gtttgacttt ccacttgttg aaggatgtac caggtttaat 840
ctctaagaac atcgaaaagt cattggttga agctttcaca cctatcggta tttctgattg 900
gaactcatta ttctggatcg ctcatccagg tggtcctgca attttggacc aagttgaatt 960
gaagttgggt ttgaaggaag aaaagttgag agcaaccaga cacgtattgt cagaatatgg 1020
taacatgtct tcagcctgtg ttttgttcat cttggatgaa atgagaaaaa agtctatcga 1080
agagggtaaa ggttcaacag gtgaaggttt agaatggggt gttttgtttg gtttcggtcc 1140
aggtttaaca gttgaaaccg tagttttgca ttccgtcagt gctcctgccg ctcactaaag 1200
gagaccgcgg ccgc 1214
<210> 5
<211> 1214
<212> DNA
<213> 虎杖
<400> 5
gcggccgcgg tctccaatgg caccatccgt ccaagaaata agaaaggcac aaagagcaga 60
aggtccagca acagttttag caatcggtac agcaacccca ccaaattgta tttatcaagc 120
tgattaccca gactattact ttagagttac caactcagaa catatgactg atttgaagga 180
aaagttcaga agaatgtgtg acaaatccat gatcgaaaag agatatatgc acttgactga 240
agaaatattg aaggaaaacc aaaacatgtg cgcatacatg gcctcttcat tggattcaag 300
acaagacatg gttgtctccg aagttccaag attgggtaaa gaagctgcac aaaaagctat 360
taaggaatgg ggtcaaccta agagtaagat cactcatgta atcatgtgta ctacatctgg 420
tgttgatatg ccaggtgcag actaccaatt gacaaagttg ttgggtttaa gaccttctgt 480
taagagattc atgatgtacc aacaaggttg cttcgctggt ggtacagcat tgagattagc 540
caaagatttg gctgaaaata ccaagggtgc cagagtctta gtagtttgta gtgaaatcac 600
agctatttgc tttagaggtc caacagatac ccacttggac tctatggttg gtcaagcctt 660
attcggtgat ggtgccggtg ctgttattat aggtgctgat ccagacttgt caatcgaaag 720
acctatcttc gaattggttt ggactgctca aacaatatta cctgattccg aaggtgcaat 780
cgacggtcat ttgagagaag tcggtttaac cttccacttg ttaaaagatg taccaggttt 840
aatctccaag aacatcgaaa agagtttgac tgaagcattc tctcctttga acatctctga 900
ttggaactca ttgttctgga ttgcacatcc aggtggtcct gccatattag atcaagttga 960
agcaaagttg ggtttaaagg aagaaaagtt gaaggccaca agacaagtct tgaacgatta 1020
cggtaacatg tccagtgcat gtgtattgtt catcatggac gaaatgagaa aaaagtcatt 1080
agaaaacggt catgccacca ctggtgaagg tttggattgg ggtgttttat ttggtttcgg 1140
tccaggtttg gctgtcgaaa ccgtcgtatt acactctgtt cctgtcgcac atcactaaag 1200
gagaccgcgg ccgc 1214
<210> 6
<211> 1136
<212> DNA
<213> 海洋细菌
<400> 6
gcggccgcgg tctccaatga ctgctcaaat cttatctatc gccacagccc aaccaaccca 60
caaagccgac ttagccttct caacacactg cgctcaatct atgtcttgtg aagatgaatc 120
acaagccgtc aaattggcta agttatacag aagaacaggt gtagatacca gaggttccgt 180
tttagtcgaa aaaggtgacg ctggtgaatt gactcaatca ttttatccac ctatgcaaga 240
tggttgtgac agaggtccaa ccatggctac tagaaatgaa agattcgcag aagaagcccc 300
tgctttagca tgcagagcag gtcaaggtgc cttggatggt tcaggtattt cttcagatga 360
cgtaactcat gttgtcaccg ttacttgtac aggttttaca gctccaggta tcgatgttca 420
attgatagac aagttgggtt tacctatcac tacacaaaga atccaagtcg gtttcatggg 480
ttgccatggt ttggtaaacg ctttaagaac tgcaagaggt ttagttgctg cagattccga 540
cgccgtagtt ttgattgtct gtatcgaatt gtgcagtttg cactaccaat acggttatga 600
tgctcaaaga attgtttctg gttcattatt tgccgacggt tctgctggtt tgatagtagc 660
aggtgatgac tgtccagcct caggtgttga tacaccttta ggtgaaatcg tatccgttgg 720
tagttgcttg attagagatt ctcacgacgc tatgacctgg agaataggtg ataacggttt 780
catcatgact ttggaagcat ctgttccagg tttcatcgaa acaaacttga gagaattctt 840
agttccttgg ttggcaaaat ccggtttgga tttagacagt ataggtggtt gggccgttca 900
tccaggtggt gtcagaatct tgcaatctgt tgaaaccgcc ttggaattac cttctggtgc 960
tttagatgtc tcaagagaag tattgagaga acacggtaat atgtccagtg caacattagg 1020
tttcgttttg caaaagttcc aacaaagaaa cgtcccaggt ccttggttga tgttaggttt 1080
tggtccaggt ttggaaattg aagttgctgt cgtaagataa aggagaccgc ggccgc 1136
<210> 7
<211> 1199
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 7
gcggccgcgg tctccaatgg tatcagtaga agaaataaga aaggcacaaa gagcagaagg 60
tccagcaaca gtaatggcta tcggtacagc aacccctcca aactgtgttg atcaatctac 120
ttacccagac tactacttca gaataactaa ctcagaacat atgacagaat tgaaggaaaa 180
gttcaagaga atgtgtgata agtctatgat aaaaaagaga tacatgtact tgaacgaaga 240
aatcttgaag gaaaacccat ctgtttgcgc ctacatggct ccttcattgg atgcaagaca 300
agacatggtt gtcgtagaag tcccaaagtt gggtaaagaa gctgcaacca aggccattaa 360
agaatggggt caacctaagt ccaagatcac tcacttgatt ttctgtacta caagtggtgt 420
tgatatgcca ggtgcagact accaattgac aaagttgttg ggtttaagac cttcagtcaa 480
gagatacatg atgtaccaac aaggttgttt cgctggtggt accgtattga gattagcaaa 540
ggatttggcc gaaaataaca aaggtgctag agtcttagtt gtctgctccg aaattactgc 600
agtaacattt agaggtccaa cagataccca tttggacagt ttagttggtc aagcattgtt 660
cggtgatggt gccgctgcag tcattgtagg ttccgaccca ttacctgttg aaaagccatt 720
gtttcaatta gtctggaccg cacaaactat tttgcctgat agtgaaggtg ccatagacgg 780
tcatttgaga gaagttggtt taacattcca cttgttaaaa gatgtcccag gtttaatctc 840
caagaacatc gaaaaggctt tggttgaagc attccaacct ttgggtatct ccgattacaa 900
cagtattttc tggatagccc atccaggtgg tcctgctata ttggaccaag ttgaagccaa 960
attgggttta aagccagaaa aaatggaagc tactagacac gtattatctg aatacggtaa 1020
catgtcttca gcttgtgttt tgttcatctt ggatcaaatg agaaaaaagt caatagaaaa 1080
cggtttgggt accactggtg aaggtttgga ttggggtgtt ttatttggtt tcggtcctgg 1140
tttaacagta gaaaccgtag ttttgagatc agttacatta taaaggagac cgcggccgc 1199
<210> 8
<211> 689
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 8
gcggccgcgg tctccaatgg caacaatctc agcagtccaa gtcgaatttt tagaatttcc 60
agccgtcgtc acatcaccag catcaggtaa aacatacttc ttaggtggtg ctggtgaaag 120
aggtttgacc atcgaaggta agttcatcaa gttcactggt attggtgtct atttggaaga 180
taaggctgta ccatccttag ctgcaaaatg gaagggcaag actagtgaag aattggttca 240
tacattgcac ttctacagag acatcatctc tggtccattc gaaaagttga tcagaggttc 300
aaagatcttg cctttggctg gtgcagaata ctccaaaaag gttatggaaa actgtgttgc 360
ccatatgaaa agtgttggta cttacggtga tgctgaagcc gctgcaattg aaaagtttgc 420
cgaagctttc aaaaatgtaa actttgcacc aggtgcctct gttttctata gacaatcacc 480
tgatggtatt ttgggtttat ctttttcaga agacgcaaca attcctgaaa aggaagccgc 540
tgtcatagaa aacaaagccg tttctgcagc cgtcttggaa accatgattg gtgaacatgc 600
agtttcacca gacttgaaaa gatccttagc tagtagattg cctgcagttt tatcccacgg 660
tatcattgtc taaaggagac cgcggccgc 689
<210> 9
<211> 713
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 9
gcggccgcgg tctccaatgg ctacacctgc ttctattaca aacgtcacag ttgaattttt 60
acaatttcct gccttagtta cccctcctgg ttctacaaag tcatactttt tgggtggtgc 120
aggtgtcaga ggtttaaaca tacaagaaga attcgtcaag ttcaccggta taggtgtata 180
cttggaagat aaagccgttt cttcattagc tgcaaaatgg aagggtaaat ctgccgctga 240
attgttagat tcattggact tctacagaga tatcatcaag ggtccattcg aaaagttgat 300
cagaggttct aagttgagaa ctttagacgg tagagaatac gttagaaaag tctcagaaaa 360
ctgtgtagct catatgcaat ctgttggtac atactcagat gaagaagaaa aggctatcga 420
agaattcaga aacgcattca aggaccaaaa ctttccacct ggttccacag ttttctacaa 480
gcaaagtcca actggtacat tgggtttatc ctttagtaaa gatgaaacca taccagaaca 540
tgaacacgcc gtcatcgaca ataaaccttt gtccgaagct gtattagaaa ccatgatcgg 600
tgaaattcca gtttcccctg cattgaaaga aagtttagcc actagattcc accaattttt 660
caaggaattg gaagcaaacc ctaacattga aaactaaagg agaccgcggc cgc 713
<210> 10
<211> 701
<212> DNA
<213> 蜜柑
<400> 10
gcggccgcgg tctccaatga atccatcccc atccgtcacc gaattacaag tagaaaatgt 60
caccttcact ccatcagtcc aacctcctgg ttccactaaa tcccatttct tgggtggtgc 120
aggtgaaaga ggtttagaaa tagaaggtaa gttcgtcaag ttcaccgcca taggtgtata 180
tttggaagat gacgccgttc cattgttagc tggtaaatgg aagggtaaaa ctgcagaaga 240
attgacagaa tcagttgaat ttttcagaga tgttgtcaca ggtccattcg aaaagttcat 300
gaaggttacc atgattttgc ctttaactgg tgctcaatat tccgaaaagg tcgcagaaaa 360
ctgtatcgcc atctggaagt ttttcggtat ctacactgat gccgaagcta aggcaatcga 420
aaagttcaca gaagttttca aggacgaaat ctttccacct ggttcttcaa ttttgttcac 480
acaatctcca ggttcattaa ccatatcctt tagtaaggat ggtagtatcc ctaaagacgg 540
tgtagccgtt attgaatcca atttgttaag tgaagctgtc ttggaatcta tgattggtaa 600
aaacggtgta tctcctgctg caaaaaagtc attggctgaa agattatccg cattgttaaa 660
cgttacttct gataagatga aataaaggag accgcggccg c 701
<210> 11
<211> 773
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 11
gcggccgcgg tctccaatgt cctcctcaaa cgcttgtgct tccccttccc cattccctgc 60
tgttactaag ttgcatgtag attctgtcac cttcgtccca tccgttaagt ctccagcatc 120
ttcaaatcct ttgtttttag gtggtgccgg tgtaagaggt ttggatatac aaggtaagtt 180
cgttatcttc actgttatcg gtgtctattt ggagggtaac gctgtaccat ctttatcagt 240
taaatggaag ggcaagacta cagaagaatt gactgaatct atcccatttt tcagagaaat 300
cgtcacaggt gcattcgaaa agttcatcaa agtaacaatg aaattgccat taaccggtca 360
acaatattca gaaaaggtca ccgaaaattg tgtagccatt tggaaacaat tgggtttata 420
cactgactgc gaagctaagg cagttgaaaa gttcttggaa atcttcaagg aagaaacatt 480
tccacctggt tccagtattt tgttcgcttt atctccaacc ggttcattaa ctgttgcatt 540
ttccaaagat gacagtattc ctgaaacagg tatcgcagtt attgaaaata agttgttagc 600
cgaagctgtc ttggaatcta ttataggtaa aaacggtgtt tctcctggta ccagattatc 660
agtcgccgaa agattgtccc aattgatgat gaagaacaag gatgaaaagg aagtttccga 720
ccatagtttg gaagaaaagt tggctaagga aaactaaagg agaccgcggc cgc 773
<210> 12
<211> 857
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 12
gcggccgcgg tctccaatgg tttcattaag attccctaca gcagcaattc caagattacc 60
tccttcccaa gcccctaacg gtgtcgctat cgcagccaca gtagctgcag ttgccgctgc 120
agccgctgca gtcgcagcta gtttgacttt aactggtaaa tctacaggta gaccagttcc 180
tcatccagct cctttatggg catccttgag tttagcagat gcagccgctc catcttcagt 240
cgaacctaga accggtgcta cttttccaac agaagcagcc gttggtagaa gattgttagg 300
tatcggtttg agaaaaacct cagttttggg tttaaagtcc attgatgtat atgcctttgg 360
tgtttacgct gatgacaatg acttgaagca acaattgaag gaaaagtact caaagttctc 420
tgtttcagaa ttgaagggta acggtgaatt gataaacgat gcattagaaa gagacatacc 480
aatgaccgtc agattgcaaa tagtatacgg tagattatcc atcagaagtg taagatctgc 540
ttttgaaaag tcagttggtt ccagattgca aaaattcggt ggtcaagata ctaaggaatt 600
gttgcaatct ttcgttgctg tcttcaagga tgaatacaag ttgcctaagg gttctgtcat 660
cgaattgagt agagaatcta accatgtatt gaagatatgt atagaaggtg aagaagttgg 720
ttcaatccaa tccaagttgt tgtgcaagtc attgttggat ttgtacatcg gtgatgactc 780
cttcgatgaa aatgcaaaag acggtattca cgaaaacatc gccagtattt tgaagtctta 840
aaggagaccg cggccgc 857
<210> 13
<211> 662
<212> DNA
<213> 花生
<400> 13
gcggccgcgg tctccaatgg catcagaaac tgttatggtt gacgaaatct cctatccttc 60
cactattact actactaagc ctttgtcttt gttgggtcac ggtatcaagg atatggaaat 120
acatttcttg caggttaagt tctacaccat tggtgtctac ttggacccag aaatagttaa 180
tcacttaacc caatggaaag gtactccacc taaggaattg gaagaaaagg aagaattttt 240
cgatggtgtt atcgctgcac ctgtagaaaa ggttataaga ttggttgtca taaaggaaat 300
caagggtgct caatatggtg tccaaattga aacagcagta agagatagat tggccgctga 360
tgacaaatac gaagatgaag aagaagcaga attagaaaag atagttgaat ttttccaatc 420
taagtacttc aaaaagaatt cagttataac ataccatttc ccagcaaact ctcctaccgc 480
cgaaatcgta gtttccttgg aaggcaagga agattctaag ttcgtcgtag aaaacgctaa 540
cgttgtcgaa actattaaaa agtggtactt gggtggttct tcagccatat ctccatcaac 600
aatctccagt ttggctacta cattctccca agaattaagt aaataaagga gaccgcggcc 660
gc 662
<210> 14
<211> 1265
<212> DNA
<213> 苦参
<400> 14
gcggccgcgg tctccaatgg gttctatgtt gttagcatca tttccaggtg cctcttcaat 60
tactacaggt ggttcctgtt tgcgtagtaa gcaatacgct aagaattacg atgcatccag 120
ttatgttacc acttcttggt acaaaaagag aaagatccaa aaggaacatt gtgctgcaat 180
attctcaaag cataacttga agcaacacta caaggttaat gaaggtggtt ccactagtaa 240
cacatcaaag gaatgcgaaa agaaatacgt tgtcaatgct atttccgaac aaagttttga 300
atacgaacca caaacaagag atcctgaatc tatttgggac tcagtcaacg atgccttaga 360
cattttctat aagttctgca gaccatacgc tatgttcaca attgttttgg gtgccacctt 420
taagtctttg gttgctgtcg aaaagttgtc tgatttgtca ttggctttct ttataggttg 480
gttacaagta gttgtcgcag ttatatgtat ccatatattc ggtgtcggtt tgaaccaatt 540
gtgcgatatc gaaatcgaca aaattaacaa gccagatttg cctttagcat ccggtaaatt 600
gagtttcaga aacgtagtta ttatcacagc atcttcattg atcttaggtt tgggttttgc 660
ctggattgtt gactcttggc cattgttttg gactgtcttc atttcctgta tggtagccag 720
tgcttacaac gttgatttgc cattgttgag atggaaaaag taccctgttt tgaccgctat 780
caacttcatt gcagacgtag ccgttactag atctttgggt ttctttttgc acatgcaaac 840
atgtgttttt aaaagaccta caaccttccc aagaccttta attttctgta ctgcaatcgt 900
ctctatctac gccattgtaa tagctttgtt caaggatatc ccagacatgg aaggtgacga 960
aaagttcggt atacaatctt tgtcattgag attgggtcct aagagagtat tttggatctg 1020
tgtttcattg ttggaaatga cctacggtgt cactatatta gtaggtgcta cttctccaat 1080
cttgtggtca aagatcataa cagtattggg tcatgctgtt ttggcatccg tcttatggta 1140
ccacgcaaaa tccgttgatt tgaccagtaa cgtcgtattg cattcattct acatgttcat 1200
atggaagttg cacactgccg aatacttttt gatcccttta ttcagataaa ggagaccgcg 1260
gccgc 1265
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcggccgcgg tctcca 16
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
taaaggagac cgcggccgc 19

Claims (10)

1.一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于，包含经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因，所述TAL基因为圆红冬孢酵母来源TAL基因序列；所述4CL基因为欧芹来源TAL基因序列；所述CHS基因为拟南芥来源CHS基因序列；所述CHI基因为蜜柑来源CHI基因序列；所述N8DT基因为苦参来源N8DT基因序列。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述经优化为经过酿酒酵母密码子优化并规避BsaI限制性内切酶酶切位点，同时在基因两端分别添加SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
3.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述TAL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述4CL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CHS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述N8DT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
4.权利要求1-3任一项所述重组酿酒酵母菌株的构建方法，将经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因整合到酿酒酵母底盘菌株基因组中。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母底盘菌株为酿酒酵母CENpK2-1d。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，具体包含如下步骤：
步骤1、用酶切连接的方法将经优化的外源TAL、4CL、CHS和CHI基因分别构建到pRS415K-GPM1t-PGK1p-GPD1t，pRS423-GPD1t-PGI1p-FBA1t，pRS416-FBA1t-TPI1p-PGK1t和pRS414-PGK1t-HXT7p-CYC1t质粒中，采用醋酸锂法将上述质粒转化酿酒酵母底盘菌中，Sc-Leu,ura,his,trp固体培养基筛选转化子；
步骤2、将经酿酒酵母密码子优化的外源N8DT基因与pRS425K-ENO2t-PDC2p-GPM2t质粒连接，采用醋酸锂法转化到步骤2筛选得到的转化子菌株中采用Sc-LEU固体平板培养基筛选转化子。
7.权利要求1-3任一项所述的重组酿酒酵母菌株在生产8-二甲基异戊烯基柚皮素中的应用。
8.一种生产8-二甲基异戊烯基柚皮素的方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基活化；将活化后的菌株接种于发酵培养基中发酵培养，发酵培养后收集菌体细胞提取8-二甲基异戊烯基柚皮素。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，具体为将权利要求1-3任一项所述的重组酿酒酵母菌株接入种子培养基在30℃、250rpm活化24h，转接至新鲜的种子培养基，在30℃、250rpm活化18h，转接至发酵培养基30℃、250rpm发酵96h，收集菌体提取8-二甲基异戊烯基柚皮素。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述种子培养基为22g/L葡萄糖、6.7g/LYNB、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末，余量为水；所述发酵培养基为20g/L葡萄糖、6.7g/L YNB、2g/L缺异亮氨酸的混合氨基酸粉末、0.5g/L酪氨酸，余量为水。
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