CN103146728B - 一种生产紫杉二烯的酵母菌及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产紫杉二烯的酵母菌及构建方法，一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法的步骤为：（1）载体SyBE_001173的构建；（2）载体SyBE_001187的构建；（3）将所述载体SyBE_001173、SyBE_001187导入到酿酒酵母W303-1A或酿酒酵母BY4742中，得到生产紫杉二烯的酵母菌。本发明的生产紫杉二烯的酵母菌相对于现有技术更为环保、成本低廉，为紫杉二烯的生产提供了一种可行的方法。

Description

一种生产紫杉二烯的酵母菌及构建方法

技术领域

本发明涉及一种生产紫杉二烯的酵母菌及构建方法。

背景技术

紫杉醇是一种有效的抗癌药物，传统的获得方法包括为对红豆杉进行植物提取，但红豆杉中不仅含量极低，且大量砍伐红豆杉树木为环境不友好行为；植物细胞培养的方法虽然解决了大规模砍伐红豆杉的问题，却因植物细胞生长周期较长，故获得紫杉醇的效率也并不高；化学合成法不仅合成步骤复杂，且每一步收率不高，若应用此法进行大规模生产势必产生大量污染废物，且成本昂贵。

人类健康、能源、环境等领域的重大需求也牵引着合成生物学的迅猛发展。将基因元件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成或含量极低的产物。

美国Croteau R教授的实验室在紫杉醇生物合成的研究中作了大量的、卓有成效的工作，经过十几年的努力，紫杉醇大部分生物合成途径已经明确。紫杉二烯作为紫杉醇合成途径中的关键前体，其产量的提升具有十分重大的意义。

华盛顿州立大学的Croteau教授是最早从事紫杉醇合成途径解析和相关基因克隆工作的，从上世纪90年代开始相继克隆了紫杉醇合成的多个基因，为微生物合成紫杉醇提供了物质基础。2001年，德克萨斯州农工的Scott等在大肠杆菌中首次实现了紫杉二烯的生物合成，产量为1.3mg/l。2004年西班牙巴塞罗那大学的Boronat等在拟南芥中实现了紫杉二烯的合成，产量为600ng/g DW。2005年德国Darmstadt技术大学的Jennewein等在酵母中合成了紫杉二烯，产量达到8.7mg/L。2006年，Croteau教授等在酵母菌实现了紫杉二烯-5α-醇的合成，约为25μg/L。2010年，麻省理工学院（MIT）的Stephanopoulos课题组在大肠杆菌中成功实现了紫杉二烯的合成，产量高达1020±80mg/L。虽然在大肠杆菌中紫杉二烯的产量已经达到较高水平，但当此课题组进行后续紫杉二烯-5α-醇的合成时，却只检测到很少量的产物，这可能由于P450酶在大肠杆菌的背景下难以有效地发挥其催化功能。因此，在酵母中进行紫杉二烯及后续前体的合成具有独到的优势和重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种紫杉二烯合酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种紫杉二烯合酶基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法。

本发明的第四个目的是提供一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法构建的酵母菌。

本发明的技术方案概述如下：

一种紫杉二烯合酶基因，是序列表SEQ ID NO:11所述的核苷酸序列。

上述一种紫杉二烯合酶基因编码的蛋白质，是序列表SEQ ID NO:12所述的氨基酸序列。

一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）载体SyBE_001173的构建：

①将启动子、GGPP合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindⅢ和ApaⅠ位点的片段，连接入游离型载体pRS425；

②将启动子、序列表SEQ ID NO:11所示的紫杉二烯合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacⅠ和HindⅢ位点的片段，连接入步骤①获得的载体，得到载体SyBE_001173；

（2）载体SyBE_001187的构建：

①将酵母组成型启动子、tHMGR基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来，得到两端包含XhoⅠ和ApaⅠ位点的片段，连接至整合型载体pRS403；

②将酵母组成型启动子、ERG20基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来，得到两端包含SacⅠ和XhoⅠ两个位点的片段，连接至步骤①获得的载体，得到载体SyBE_001187；

所述GGPP合酶基因是序列表SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列；所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列；所述ERG20基因是序列表SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列；

（3）将所述载体SyBE_001173、SyBE_001187导入到酿酒酵母W303-1A或酿酒酵母BY4742中，得到生产紫杉二烯的酵母菌。

上述一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法构建的酵母菌。

本发明的生产紫杉二烯的酵母菌相对于现有技术更为环保、成本低廉，为紫杉二烯的生产提供了一种可行的方法。

附图说明

图1载体SyBE_001173（pRS425-TS-GGPPS）构建图谱。

图2载体SyBE_001187(pRS403-tHMGR-ERG20)构建图谱。

图3酵母中紫杉二烯合成途径。

图4发酵产物测定气相色谱图。

图5发酵产物中紫杉二烯质谱图。

图6功能菌株发酵细胞生长曲线及紫杉二烯的积累曲线。

图7浓缩纯化得到的紫杉二烯标准品气相图。

图8纯化得到的紫杉二烯标准品H-NMR谱图。

图9纯化得到的紫杉二烯标准品C-NMR谱图。

图10紫杉二烯GC-MS标准曲线。

具体实施方式

以下通过合成紫杉二烯的优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不限制本发明的范围。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所使用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其他启动子和表达载体，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。

实施例1：酵母中紫杉二烯合成途径相关基因的获得

A、tHMGR基因（酵母截短HMG-CoA还原酶基因）的获得

根据酵母HMG-CoA还原酶基因序列设计引物，SEQ ID NO:1tHM-F:5’-ATGGTTTTAACCAATAAAACAGTCATTTCT-3’及SEQ ID NO:2tHM-R：5’-TTAGGATTTAATGCAGGTGACG-3’，以W303-1A菌株基因组为模版，使用pfu酶进行PCR（95℃，3min；95℃，30s，57℃，35s，72℃，2min，32cycles；72℃，5min；4℃，+∞）扩增，得到1509bp片段。克隆至pMD18-T载体，进行测序，证实未发生突变。核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列SEQ ID NO:4。

B、ERG20基因（酵母FPP和GPP合酶基因）的获得

根据酵母ERG20基因序列设计引物，SEQ ID NO:5E20-F:5’-ATGGCTTCAGAAAAAGAAAT-3’及SEQ ID NO:6E20-R：5’-CTATTTGCTTCTCTTGTAAACTT-3’，以W303-1A菌株基因组为模版，使用pfu酶进行PCR（95℃，3min；95℃，30s，50℃，35s，72℃，75s，32cycles；72℃，5min；4℃，+∞）扩增，得到1059bp片段，克隆至pMD18-T载体，进行测序，证实未发生突变。核苷酸序列SEQ ID NO:7。氨基酸序列SEQ ID NO:8。

C、GGPP合酶基因（红豆杉源GGPP基因）的获得和优化

通过密码子优化，使红豆杉源GGPP基因的密码子具有酵母偏好性，并适当规避常用的限制性酶切位点。产生的优化基因序列为：SEQ ID NO:9，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。

D、紫杉二烯合成酶基因的获得与优化

通过密码子优化，使紫杉二烯合酶基因的密码子具有酵母偏好性，并适当规避常用的限制性酶切位点。产生的优化序列为：SEQ ID NO:11，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。

实施例2：载体的构建

A、载体SyBE_001187（截短的HMG-CoA合酶基因和ERG20基因的表达载体）的构建

①将酵母组成型启动子TDH3p、tHMGR基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来，得到两端包含XhoⅠ和ApaⅠ位点的片段，连接至整合型载体pRS403；

②将酵母组成型启动子TDH3p、ERG20基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来，得到两端包含SacⅠ和XhoⅠ两个位点的片段，连接至步骤①获得的载体，得到载体SyBE_001187（见图2）；

B、载体SyBE_001173（含优化后红豆杉源GGPP合酶基因和优化后紫杉二烯合酶基因表达载体）的构建：

①将启动子TDH3p（也可以选GAL1p等）、GGPP合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindⅢ和ApaⅠ位点的片段，连接入游离型载体pRS425；

②将启动子TDH3p（也可以选GAL1p等）、序列表SEQ ID NO:11所示的紫杉二烯合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacⅠ和HindⅢ位点的片段，连接入步骤①获得的载体，得到载体SyBE_001173（见图1）；

D、表达载体的鉴定

将构建好的上述表达载体分别转化入大肠杆菌DH-5α中，提质粒，进行单、双酶切以及测序的鉴定，以确保目的片段连接入质粒相应位置，且碱基序列未发生突变。

实施例3：生产紫杉二烯的酵母菌的获得

采用醋酸锂法进行载体的酵母转化。其中整合型质粒预先进行线性化，以整合入酿酒酵母BY4742基因组相应位点，游离型质粒则直接转化入酿酒酵母BY4742中。转化后酵母采用SD-drop固体培养基（去氨基酵母氮源，6.7g/l；葡萄糖，20g/l；Dropout mix，0.2％；固体补加2％的琼脂粉）进行筛选，得到的转化子转移至液体培养基中培养36h，提取酵母质粒或基因组作为模板，进行PCR验证，以排除假阳性的干扰。确认正确的阳性菌株，平板划线或甘油菌保存。

利用酵母自身存在的MVA途径，对该途径涉及的关键基因HMG-CoA还原酶基因（HMGR）和FPP合酶基因（ERG20）进行上调，同时引入GGPP合酶基因与紫杉二烯合酶基因，获取具备生产紫杉二烯功能的酿酒酵母菌株（路线图见图3）。

实施例4：酵母发酵培养

验证正确的阳性转化子，接菌入3ml SD-drop液体培养基中培养30h，转接入50ml YPD（1%酵母浸粉；2%蛋白胨；2%葡萄糖）。使初始OD600值为0.05，30℃，200rpm培养70h。

也可转接至SD-Drop（去氨基酵母氮源，6.7g/l；葡萄糖，20g/l；Dropout mix，0.2％）培养基中进行发酵。

实施例5：酵母发酵产物的定性与定量

A、产物的定性

取400ul发酵液至1.5ml离心管中，加入等体积正己烷，超声波处理20min，混合涡旋20min。4℃离心5min。取上层正己烷层，进行GC-MS检测。得到谱图见图4和图5。

B、标准品的获得

在3L发酵罐中，进行2L体系的发酵罐发酵。每4-12h取样一次，测定细胞生长曲线及产物紫杉二烯积累曲线（图6）。经过66h发酵后，在发酵罐中加入300ml正己烷，密封发酵罐搅动4h，静置1h。取上层正己烷层，进行旋转蒸发以浓缩。浓缩液通过硅胶柱进行分离纯化。最终得到纯度95%以上的紫杉二烯标准品（GC结果见图7；核磁结果见图8及图9）。

C、发酵产物的定量

将分离纯化得到的标品配置浓度梯度，运用GC绘制标准曲线，确定线性范围为10mg/L-100mg/L(图10）。功能菌株发酵后萃取得到的样品进行测定，按拟合曲线公式计算产量，得到功能菌株产量78.6mg/L。

所获得菌株进行过多次发酵实验，由于菌株自身质粒稳定性等原因，紫杉二烯产量处于50.5-102.3mg/L之间。

将载体SyBE_001173、SyBE_001187导入到酿酒酵母W303-1A中，得到生产紫杉二烯的酵母菌。实验证明：所生产的紫杉二烯的产量高于现有技术，在25.2-45.6mg/L左右。

Claims (3)

1.一种紫杉二烯合酶基因，其特征是它是序列表SEQ ID NO:11所述的核苷酸序列。

2.一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)载体SyBE_001173的构建：

①将启动子、GGPP合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含HindⅢ和ApaⅠ位点的片段，连接入游离型载体pRS425；

②将启动子、序列表SEQ ID NO:11所示的紫杉二烯合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含SacⅠ和HindⅢ位点的片段，连接入步骤①获得的载体，得到载体SyBE_001173；

(2)载体SyBE_001187的构建：

①将酵母组成型启动子、tHMGR基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来，得到两端包含XhoⅠ和ApaⅠ位点的片段，连接至整合型载体pRS403；

②将酵母组成型启动子、ERG20基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来，得到两端包含SacⅠ和XhoⅠ两个位点的片段，连接至步骤①获得的载体，得到载体SyBE_001187；

所述GGPP合酶基因是序列表SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列；所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列；所述ERG20基因是序列表SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列；

(3)将所述载体SyBE_001173、SyBE_001187导入到酿酒酵母W303-1A或酿酒酵母BY4742中，得到生产紫杉二烯的酵母菌。

3.权利要求2的一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法构建的酵母菌。