CN101484584B - 类异戊二烯的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过一种或多种生物合成途径大量生产类异戊二烯的方法。本发明还提供用于实施所述方法的核酸、酶、表达载体和遗传修饰的宿主细胞。本发明还提供从遗传修饰的宿主细胞高产率地生产类异戊二烯的发酵方法。

Description

类异戊二烯的生产
交叉引用
本申请要求2006年5月26日提交的美国临时申请60/808,989和2006年12月18日提交的60/870,592的优先权，这些临时申请全文引入本文作为参考。 
发明背景
类异戊二烯在自然界中普遍存在。它们包括不同家族的超过40,000种个体产物，其中许多对于活生物体是至关重要的。类异戊二烯用来维持细胞流动性、电子传递和其它代谢功能。大量的天然和合成类异戊二烯可用作药物、化妆品、香料、色素和颜料、杀真菌剂、抗菌剂、营养品和精细化学中间体。 
类异戊二烯产物通常由重复的五碳异戊烯二磷酸(IPP)单元组成，尽管也曾报道了不规则的类异戊二烯和多萜。实际上，类异戊二烯是通过它们的前体IPP和其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)连续缩合而合成的。已知这些前体有两种途径。除植物以外，真核生物通常利用依赖于甲羟戊酸(MEV)的途径将乙酰辅酶A(乙酰-CoA)转化为IPP，然后IPP被异构化为DMAPP。除了部分例外以外，原核生物一般只利用不依赖于甲羟戊酸的途径或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径产生IPP和DMAPP。植物既利用MEV途径又利用DXP途径。参见Rohmer等人.(1993)Biochem.J.295：517-524；Lange等人.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(24)：13172-13177；Rohdich等人.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1158-1163。 
传统上，类异戊二烯通过从诸如植物、微生物和动物的天然来源中提取来生产。然而，由于许多严重的限制，提取的产率通常极低。首先，大多数类异戊二烯在自然中只少量积累。其次，来源生物体通 常不适合大规模培养，而大规模培养是商业生产有效量的所需类异戊二烯所必需的。第三，类异戊二烯提取需要某些有毒溶剂，这需要特殊的处理步骤，因此使类异戊二烯的商业生产变得复杂化。 
MEV和DXP代谢途径的阐明已经使得类异戊二烯的生物合成生产成为可行的。例如，已经将微生物工程化为过量表达甲羟戊酸途径的一部分或者全部，用于生产被称为紫穗槐-4，11-二烯的类异戊二烯(美国专利7,172,886和7,192,751号)。其它努力集中于平衡甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的集合，或者集中于提高1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)和IPP异构酶(idi)的表达。参见Farmer等人.(2001)Biotechnol.Prog.17：57-61；Kajiwara等人.(1997)Biochem.J.324：421-426；和Kim等人.(2001)Biotechnol.Bioeng.72：408-415。 
然而，鉴于许多商业应用需要极大量的类异戊二烯产物，仍然需要比现有技术产生更多类异戊二烯的表达系统和发酵方法。微生物代谢向类异戊二烯生产的最佳重定向需要将引入的生物合成途径适当地工程化，从而在持续的时间期限内既能使碳用于有效地产生类异戊二烯，又能阻止代谢中间体的毒性水平的建立。本发明满足了这一需要并且也提供了相关的优势。 
发明内容
本发明提供用于在单独的或者组合的至少一个异源调节物或发酵条件控制下利用异戊烯焦磷酸途径酶大规模生产类异戊二烯的组合物和方法。合适的类异戊二烯的非限定性的例子包括：半萜类(由1个异戊二烯单元衍生)如异戊二烯；单萜类(由2个异戊二烯单元衍生)如月桂烯；倍半萜类(由3个异戊二烯单元衍生)如紫穗槐-4，11-二烯；二萜类(由4个异戊二烯单元衍生)如紫杉二烯(taxadiene)；三萜类(由6个异戊二烯单元衍生)如鲨烯；四萜类(由8个类异戊二烯衍生)如β-胡萝卜素；和多萜类(由8个以上的异戊二烯单元衍生)如多异戊二烯。 
一个方面，一种生产类异戊二烯的方法包括以下步骤：(a)获得多个包含产生异戊烯焦磷酸的酶途径的宿主细胞，其中所有途径酶都在 至少一个异源转录调节物的控制之下；和(b)在与为宿主细胞提供最大比生长速率的条件相比为亚最佳的条件下，在培养基中培养该宿主细胞。在某些实施方案中，该途径是甲羟戊酸途径。在其它实施方案中，该途径是DXP途径。在其它实施方案中，该至少一种异源转录调节序列是可诱导的。在其它实施方案中，途径酶处于单个转录调节物的控制之下。在其它实施方案中，途径酶处于多个异源转录调节物的控制之下。 
在一些实施方案中，所述途径包括编码来自于具有内源甲羟戊酸途径的原核生物的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。示例性的具有内源甲羟戊酸途径的原核生物包括但不限于：肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)。在一个实施方案中，甲羟戊酸途径酶选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶。在另一实施方案中，异源核酸序列编码II类HMG-CoA还原酶。 
在另一实施方案中，宿主细胞在培养基中培养，其中营养物和/或温度水平保持在低于为宿主细胞提供最大比生长速率的水平上。在另一实施方案中，宿主细胞在一种培养基中培养，该培养基中碳源保持在提供低于最大比生长速率的大约90％、75％、50％、25％、10％或介于90％和10％之间的水平上。在另一实施方案中，宿主细胞在一种培养基中培养，该培养基中氮源保持在提供低于最大比生长速率的大约90％、75％、50％、25％、10％或介于90％和10％之间的水平上。在另一实施方案中，宿主细胞在培养基中培养，其中温度保持在提供最大比生长速率的低于大约90％、75％、50％、25％、10％或介于90％和10％之间的水平上。在另一实施方案中，培养基温度保持在比提供最大比生长速率的温度至少低约2℃、4℃、5℃、6℃、8℃、10℃、15℃或20℃。 
在又另一实施方案中，一种生产类异戊二烯或类异戊二烯前体的方法包括以下步骤：(i)进行包含发酵培养基和多个产生类异戊二烯的遗传修饰的宿主细胞的发酵反应，其反应条件使得(a)发酵培养基保持 在低于提供所述宿主细胞的最大比生长速率的温度的温度下；(b)发酵培养基中碳源的含量低于提供宿主细胞的最大比生长速率的量；和/或(c)发酵培养基中氮源的含量低于提供宿主细胞的最大比生长速率的量；(ii)回收在(a)至(c)所述的一个或多个条件下产生的类异戊二烯。在一个方面，类异戊二烯在(a)至(c)所述的至少两个条件下产生。在另一方面，类异戊二烯在(a)至(c)所述的所有条件下产生。 
引用参考
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，如果每一单独的出版物和专利申请具体且单独地引入本文作为参考。 
附图说明
图1A是产生异戊烯焦磷酸(＂IPP＂)的甲羟戊酸(＂MEV＂)途径的示意图。 
图1B是产生异戊烯焦磷酸(＂IPP＂)和二甲基烯丙基焦磷酸(＂DMAPP＂)的1-脱氧-D-木酮糖5-二磷酸(＂DXP＂)途径的示意图。Dxs是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也被称为IspC)；IspD是4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶；IspE是4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶；IspF是2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶；IspG是1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG)；ispH是异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。 
图2是异戊烯焦磷酸(＂IPP＂)和二甲基烯丙基焦磷酸脂(＂DMAPP＂)向香叶基焦磷酸(＂GPP＂)、法尼焦磷酸(＂FPP＂)和香叶基香叶基焦磷酸(＂GGPP＂)转化和各种类异戊二烯合成的示意图。 
图3显示表达质粒pMBIS-gpps的图谱。 
图4显示表达质粒pAM408的图谱。 
图5显示表达质粒pAM424的图谱。 
图6显示表达质粒pTrc99A-ADS、pTrc99A-FSA、pTrc99A- LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-GTS、pTrc99A-APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-TS、pTrc99A-CS、pTrc99A-SS和pAM373的图谱。 
图7A-C是质粒pAM489-pAM498的构建和pAM328的图示。 
图8显示与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)截短HMG-CoA还原酶(tHMGR)相比，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HMGR-CoA还原酶(HMGR)的较高的比活性和提高的稳定性。 
图9显示每升细胞干重(“DCW”)和OD600之间的相关性。 
图10A-B显示与携带酿酒酵母tHMGR和HMGS基因的宿主菌株相比，携带金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)HMGR和HMGS基因的宿主菌株的紫穗槐-4，11-二烯体积产率和比产率提高。 
图11A-B显示较低的温度对大肠杆菌宿主菌株的紫穗槐-4，11-二烯产率的影响。 
图12A-B显示降低的葡萄糖水平对大肠杆菌宿主菌株的紫穗槐-4，11-二烯产率的影响。 
图13A-B显示较低的温度和降低的葡萄糖水平对大肠杆菌宿主菌株的紫穗槐-4，11-二烯产率的联合影响。 
图14A-E和15A-E显示较低的温度和降低的葡萄糖水平和氮水平对大肠杆菌宿主菌株的紫穗槐-4，11-二烯产率的联合影响。 
图16显示大肠杆菌宿主菌株通过DXP途径产生紫穗槐-4，11-二烯。 
发明详述
定义 
除非另外定义，此处使用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在此参考大量定义为具有以下含义的术语： 
术语“任选的”或“任选地”意思是随后描述的特征或结构可以存在也可以不存在，或者随后描述的事件或状况可以存在也可以不存在， 并且这种描述包括存在具体特征或结构的情况和不存在该特征或结构的情况，或者发生该事件或状况的情况以及不发生该事件或状况的情况。 
此处使用的术语“代谢途径”是指分解代谢途径或合成代谢途径。合成代谢途径涉及由较小的分子构建较大的分子，这是需要能量的过程。分解代谢途径涉及较大分子的分解，通常释放能量。 
此处使用的术语“甲羟戊酸途径”或“MEV途径”是指将乙酰-CoA转化为IPP的生物合成途径。MEV途径在图1A中示意性地显示。 
此处使用的术语“脱氧木酮糖5-磷酸途径”或“DXP途径”是指将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸转化为IPP和DMAPP的途径。DXP途径在图1B中示意性地显示。 
词语“焦磷酸”在此处与“二磷酸”可以互换使用。 
术语“表达载体”或“载体”是指这样一种核酸，它转导、转化或感染宿主细胞，从而使细胞产生除细胞天然的核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质，或者以对于细胞而言非天然的方式表达核酸和/或蛋白质。 
术语“内源”是指自然存在的，例如在非重组宿主细胞中存在的物质或过程。 
术语“生成异戊烯焦磷酸的酶途径”是指任何能够产生异戊烯焦磷酸的途径，包括但不限于甲羟戊酸途径或DXP途径。 
术语“核酸”是指任意长度的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸，也可以是脱氧核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱或其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的、或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。 
术语“操纵子”是指两个或多个连续的核苷酸序列，其中每一个编码诸如RNA或蛋白质的基因产物，其表达被一个或多个控制元件(例如启动子)协同调节。 
术语“基因产物”是指由DNA编码的RNA(或者相反)，或者由 RNA或DNA编码的蛋白质，其中基因一般包含一个或多个编码蛋白质的核苷酸序列，并且也可以包含内含子和其它非编码核苷酸序列。 
术语“蛋白质”是指任意长度的氨基酸的聚合形式，可以包括编码的和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸和具有修饰的肽骨架的多肽。 
此处使用的术语“异源核酸”是指至少下述之一为事实的核酸：(a)核酸对于给定宿主细胞来说是外来的(“外源的”)(即不是自然存在的)；(b)该核酸包含在给定宿主细胞中自然发现的(即，“内源的”)核苷酸序列，但是该核苷酸序列在细胞中以非自然的(例如高于预期或者高于自然发现的)量产生；(c)该核酸包含在序列上不同于内源核苷酸序列的核苷酸序列，但是该核苷酸序列编码相同的蛋白质(具有相同或基本相同的氨基酸序列)并且在细胞中以非自然的(例如高于预期或者高于自然发现的)量产生；或者(d)该核酸包含两个或多个核苷酸序列，在自然中未发现这些序列彼此之间具有与此相同的关系(例如，核酸是重组的)。 
“转基因”是指外源导入宿主细胞中的基因。它可以包含内源或外源的或者异源的核酸。 
术语“重组宿主”(也被称为“遗传修饰的宿主细胞”或“遗传修饰的宿主微生物”)是指包含本发明的异源核酸的宿主细胞。 
术语“外源核酸”是指外源导入宿主细胞中的核酸，因此实际上在给定细胞中通常或自然地不存在和/或不产生。 
术语“调节元件”是指转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、多腺苷酸信号、终止子、蛋白质降解信号等等，它们提供和/或调节宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生。 
术语“转化”是指在导入新核酸后在细胞中诱导的持久的或瞬时的遗传改变。遗传改变(“修饰”)可以通过向宿主细胞基因组中掺入新DNA，或者通过瞬时或稳定地维持新DNA作为附加型元件(episomal element)来实现。在真核细胞中，永久的遗传改变通常通过向细胞基因组中导入DNA来实现。在原核细胞中，永久的遗传改 变可以被导入染色体中或者通过染色体外元件如质粒和表达载体导入，该染色体外元件可以含有一个或多个选择性标记来帮助它们保持在重组宿主细胞中。 
术语“有效连接”是指一种并列，其中这样描述的成分的关系允许它们以预期方式起作用。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则启动子与该核苷酸序列有效连接。 
术语“宿主细胞”和“宿主微生物”在此可以互换使用，是指任何古细菌(archae)、细菌或真核活细胞，其中可以或者已经插入了异源核酸。该术语也涉及原细胞的后代，由于自然的、意外的或故意的突变，它们在形态学上或者在基因组或总DNA互补上可能不一定与原亲本完全相同。 
术语“合成的”在用于核酸时是指化学合成的寡核苷酸结构单元退火，形成基因片段，然后通过酶装配，构建完整的基因。通过“化学方法”的核酸合成是指组成核苷酸在体外装配。 
术语“天然的”在用于核酸、细胞或生物体时，是指在自然中发现的核酸、细胞或生物体。例如，可以从自然来源中分离的并且没有在实验室中人工故意修饰的存在于非病原(非致病)生物体中的多肽或多核苷酸序列，是天然的。 
术语“天然存在的”在用于核酸、酶、细胞或生物体时，是指天然发现的核酸、酶、细胞或生物体。例如，可以从自然来源中分离的并且没有在实验室中人工故意修饰的存在于生物体中的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。 
术语“生物活性片段”在用于蛋白质、多肽或酶时，是指蛋白质或多肽或酶的功能部分。功能等价物可以具有变异的氨基酸序列，可能由于例如已知在核酸序列和这样编码的蛋白质内天然存在的密码子冗余和功能等价性而产生。或者，功能等价的蛋白质或肽可以通过应用DNA重组技术来构建，在该技术中基于对所交换的氨基酸性质的考虑，可以构建蛋白质结构的改变。 
术语“类异戊二烯”、“类异戊二烯化合物”、“类异戊二烯产物”、 “萜”、“萜化合物”、“类萜”和“类萜化合物”在此可互换使用。它们是指能够由IPP衍生的化合物。 
单数形式，如“一种”，包括复数的所指物，除非上下文中清楚地表明不是这样。因此，例如，提到“表达载体”包括一种表达载体以及多种表达载体，而提到“该宿主细胞”包括一种或多种宿主细胞，以此类推。进一步指出，权利要求可以撰写为不包括任何任选的组件。这样，该声明作为在描述权利要求组件时使用如“单独”、“仅仅”等排他性术语或者使用“负面”限制的前提基础。 
除非另外指出，本发明不限于特定序列、表达载体、酶、宿主微生物或方法，因为这些可能根据本发明所属领域的普通技术人员的理解考虑本文的教导而变化。此处使用的术语只是用于描述具体实施方案，而不是限制。 
宿主细胞 
任何合适的宿主细胞都可以在本发明的实施中使用。在一个实施方案中，宿主细胞是遗传修饰的宿主微生物，其中核酸分子已经插入、删除或修饰(即突变；例如，通过核苷酸的插入、删除、置换和/或倒置)，从而产生所需的类异戊二烯化合物或类异戊二烯衍生物，或者实现所需类异戊二烯化合物或类异戊二烯衍生物的提高的产率。在另一实施方案中，宿主细胞能够在液体生长培养基中生长。相反，“对照细胞”是实验中用于比较目的的替代实验对象或样品，一般是不含对相应宿主细胞所做的修饰的亲本细胞。 
合适的宿主细胞的说明性例子包括任何原始细胞(archaecell)、原核细胞或真核细胞。原始细胞的例子包括但不限于属于以下属的那些细胞：气热菌属(Aeropyrum)、古生球菌属(Archaeglobus)、盐杆菌属(Halobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)和热原体属(Thermoplasma)。原始细胞株的说明性例子包括但不限于：敏捷气 热菌(Aeropyrum pernix)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshii、噬酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)。 
原核细胞的例子包括但不限于属于以下属的那些细胞：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、项圈藻属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、色素菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席蓝细菌属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、Scenedesmun、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链球菌属(Strepromyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)。 
原核菌株的说明性例子包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacteriumimmariophilum、拜氏梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠杆菌、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、Mesorhizobium loti、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、Pseudomonas mevalonii、Pseudomonas pudica、荚膜红 杆菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。 
通常，如果使用细菌宿主细胞，则优选非病原菌株。非病原菌株的说明性例子包括但不限于：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、铜绿假单胞菌、Pseudomonas mevalonii、Pseudomonaspudita、球形红杆菌、Rodobacter capsulatus、深红红螺菌，等等。 
真核细胞的例子包括但不限于真菌细胞。真菌细胞的例子包括但不限于属于以下属的那些细胞：曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、金小孢子属(Chrysosporium)、Cryotococcus、镰孢属(Fusarium)、镰刀菌属(Kluyveromyces)、Neotyphodium、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、木霉属(Trichoderma)和Xanthophyllomyces(以前称为法夫酵母属(Phaffia)). 
真核菌株的说明性例子包括但不限于：构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、白假丝酵母(Candida albicans)、Chrysosporiumlucknowense、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、Fusariumvenenatum、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、Pichiafinlandica、Pichia kodamae、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia methanolica、Pichia opuntiae、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、栎毕赤酵母(Pichia quercuum)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia thermotolerans、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、树 干毕赤酵母(Pichia stipitis)、产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、Saccaromyces bayanus、Saccaromycesboulardi、酿酒酵母、杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomycesrameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、Trichoderma reesei和Xanthophyllomycesdendrorhous(以前称为Phaffia rhodozyma). 
通常，如果使用真核细胞，则优选非病原株。非病原株的说明性例子包括但不限于：禾本科镰孢、Fusarium venenatum、巴斯德毕赤酵母、Saccaromyces boulardi和酿酒酵母。 
另外，某些菌株已经被食品和药品管理局指定为GRAS或者通常被视为安全的。这些菌株包括：枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌和酿酒酵母。 
IPP途径 
本发明的宿主细胞包括利用MEV途径、DXP途径或这两种途径来合成IPP及其异构体DMAPP。通常，除植物以外的真核生物只利用MEV类异戊二烯途径将乙酰-CoA转化为IPP，IPP随后被异构化为DMAPP。除了几个例外以外，原核生物利用不依赖于甲羟戊酸的途径或DXP途径通过分支点分开产生IPP和DMAPP。通常，植物利用MEV和DXP两种途径来合成IPP。 
MEV途径 
MEV途径的示意图在图1A中显示。通常，该途径包括六步。 
第一步，两个乙酰辅酶A分子通过酶组合，形成乙酰乙酰-CoA。已知催化该步骤的一种酶是，例如，乙酰-CoA硫解酶(也被称为乙酰-CoA乙酰转移酶)。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于以下GenBank登录号和所述序列的来源生物：(NC_000913 REGION： 2324131..2325315；大肠杆菌)、(D49362；脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans))和(L20428；酿酒酵母)。 
MEV途径的第二步，乙酰乙酰-CoA与另外一个乙酰-CoA分子酶促缩合，生成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(NC_001145.互补19061..20536；酿酒酵母)、(X96617；酿酒酵母)、(X83882；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AB037907；Kitasatospora griseola)、(BT007302；人(Homo sapiens))和(NC_002758，基因座标签SAV2546，基因ID 1122571；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。 
第三步，HMG-CoA被酶促转化为甲羟戊酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，HMG-CoA还原酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、(NC_002758，基因座标签SAV2545，基因ID 1122570；金黄色葡萄球菌)、(NM_204485；红原鸡(Gallus gallus))、(AB015627；链霉菌属的种(Streptomycessp.)KO 3988)，(AF542543；Nicotiana attenuata)、(AB037907；Kitasatospora griseola)、(AX128213，提供编码截短HMGR的序列；酿酒酵母)和(NC_001145：互补(115734..118898；酿酒酵母)。 
第四步，甲羟戊酸被酶促磷酸化，生成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(L77688；拟南芥)和(X55875；酿酒酵母)。 
第五步，向甲羟戊酸5-磷酸上酶促添加第二个磷酸基团，生成甲羟戊酸5-焦磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF429385；巴西三叶胶(Hevea brasiliensis))、(NM_006556；人)和(NC_001145.互补712315..713670；酿酒酵母)。 
第六步，甲羟戊酸5-焦磷酸被酶促转化为IPP。已知催化该步骤的一种酶是，例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。核苷酸序列的说明性例 子包括但不限于：(X97557；酿酒酵母)、(AF290095；屎肠球菌(Enterococcus faecium))和(U49260；人)。 
如果IPP被转化为DMAPP，则需要第七步。已知催化该步骤的一种酶是，例如，IPP异构酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(NC_000913，3031087..3031635；大肠杆菌)和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。如果需要转化为DMAPP，则提高的IPP异构酶的表达确保了IPP向DMAPP的转化不是整个途径的限速步骤。 
DXP途径 
DXP途径的示意图显示在图1B中。通常，DXP途径包括七个步骤。第一步，丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合，生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF035440；大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签PP0527；恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2440)、(CP000026，基因座标签SPA2301；肠沙门氏菌Paratyphi，参见ATCC9150)、(NC_007493，基因座标签RSP_0254；球形红杆菌2.4.1)、(NC_005296，基因座标签RPA0952；血色红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009)、(NC_004556，基因座标签PD1293；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)Temeculal)和(NC_003076，基因座标签AT5G11380；拟南芥)。 
第二步，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AB013300；大肠杆菌)、(AF148852；拟南芥)、(NC_002947，基因座标签PP1597；恶臭假单胞菌KT2440)、(AL939124，基因座标签SCO5694；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2))、(NC_007493，基因座标签RSP_2709；球形红杆菌2.4.1)和(NC_007492，基因座标签Pf1_1107；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PfO-1)。 
第三步，2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸被转化为4-二磷酸胞苷酰- 2C-甲基-D-赤藓糖醇。已知催化该步骤的一种酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF230736；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_2835；球形红杆菌2.4.1)、(NC_003071，基因座标签AT2G02500；拟南芥)和(NC_002947、基因座标签PP1614；恶臭假单胞菌KT2440)。 
第四步，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇被转化为4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF216300；大肠杆菌)和(NC_007493，基因座标签RSP_1779；球形红杆菌2.4.1)。 
第五步，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF230738；大肠杆菌)、(NC_007493，基因座标签RSP_6071；球形红杆菌2.4.1)和(NC_002947，基因座标签PP1618；恶臭假单胞菌KT2440)。 
第六步，2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸被转化为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化该步骤的一种酶是，例如，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AY033515；大肠杆菌)、(NC_002947，基因座标签PP0853；恶臭假单胞菌KT2440)和(NC_007493，基因座标签RSP_2982；球形红杆菌2.4.1)。 
第七步，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被转化为IPP或其异构体DMAPP。已知催化该步骤的一种酶是，例如，异戊基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AY062212；大肠杆菌)和(NC_002947，基因座标签PP0606；恶臭假单胞菌KT2440)。 
在某些实施方案中，宿主细胞自身的代谢过程和本发明提供的IPP产生相关过程之间的“串扰”(或干扰)最小化或者完全消除。例 如，当宿主微生物只依赖DXP途径合成IPP并且引入MEV途径提供另外的IPP时，串扰被最小化或者完全消除。这种宿主生物将不能改变MEV途径酶的表达或者处理与MEV途径有关的中间体。仅仅或主要依赖于DXP途径的生物体包括，例如，大肠杆菌。 
在某些实施方案中，宿主细胞通过单独的MEV途径或MEV途径与DXP途径组合产生IPP。在其它实施方案中，宿主的DXP途径在功能上失能，因此宿主细胞只通过异源引入的MEV途径产生IPP。通过使基因表达失能或者灭活一种或多种DXP途径酶的功能，可以使DXP途径在功能上失能。 
C5化合物 
本发明的C5化合物通常由IPP或DMAPP衍生。这些化合物也被称为半萜，因为它们来自于一个异戊二烯单元(IPP或DMAPP)。 
异戊二烯
异戊二烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00161
在多种植物中发现。异戊二烯通过异戊二烯合成酶由IPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AB198190；银白杨(Populus alba))和(AJ294819；银白杨)。 
C10化合物 
本发明的C10化合物通常来源于由IPP与DMAPP缩合生成的香叶基焦磷酸(GPP)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，香叶基焦磷酸合成酶。这些C10化合物也被称为单萜，因为它们来源于两个异戊二烯单元。 
图2示意地显示了IPP和DMAPP如何生成GPP，GPP可进一步加工为单萜。 
香叶基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF513111；北美冷杉(Abies grandis))、(AF513112；北美冷杉)、 (AF513113；北美冷杉)、(AY534686；金鱼草(Antirrhinum majus))、(AY534687；金鱼草)、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，基因座AP11092；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；ATCC 14579)、(AJ243739；甜橙(Citrus sinensis))、(AY534745；Clarkia breweri)、(AY953508；Ips pini)、(DQ286930；番茄(Lycopersiconesculentum))、(AF182828；辣薄荷(Mentha x piperita))、(AF182827；辣薄荷)、(MPI249453；辣薄荷)、(PZE431697、基因座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens)、(AY866498；印度胡黄连(Picrorhiza kurrooa))、(AY351862；葡萄(Vitis vinifera))和(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis))。 
GPP然后被转化为多种C10化合物。C10化合物的说明性例子包括但不限于： 
蒈烯
蒈烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00171
在许多树(特别是松树)的树脂中发现。蒈烯通过蒈烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF461460，REGION 43..1926；欧洲云杉(Picea abies))和(AF527416，REGION：78..1871；Salvia stenophylla)。 
香叶醇
香叶醇(也被称为rhodnol)，其结构为 
是玫瑰油和掌玫油的主要成分。它也存在于天竺葵、柠檬和香茅中。香叶醇通过香叶醇合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明 性例子包括但不限于：(AJ457070；Cinnamomum tenuipilum)、(AY362553；罗勒(Ocimum basilicum))、(DQ234300；白苏(Perillafrutescens)1864株)、(DQ234299；Perilla citriodora1861株)、(DQ234298；Perilla citriodora4935株)和(DQ088667；Perillacitriodora)。 
芳樟醇
芳樟醇，其结构为 
Figure G2007800193534D00181
在许多花和香料植物如胡荽子中发现。芳樟醇通过芳樟醇合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AF497485；拟南芥)、(AC002294，基因座AAB71482；拟南芥)、(AY059757；拟南芥)、(NM_104793；拟南芥)、(AF154124；黄花蒿(Artemisia annua))、(AF067603；Clarkia breweri)、(AF067602；Clarkia concinna)、(AF067601；Clarkia breweri)、(U58314；Clarkiabreweri)、(AY840091；番茄)、(DQ263741；薰衣草(Lavandulaangustifolia))、(AY083653；柠檬留兰香(Mentha citrate))、(AY693647；罗勒)、(XM_463918；水稻(Oryza sativa))、(AP004078，基因座BAD07605；水稻)、(XM_463918、基因座XP_463918；水稻)、(AY917193；Perilla citriodora)、(AF271259；白苏)、(AY473623；欧洲云杉)、(DQ195274；西特喀云杉(Piceasitchensis))和(AF444798；回回苏(Perilla frutescens var.crispa)栽培变种79号)。 
苧烯
苧烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00182
在柑桔类水果和薄荷的外皮中发现。苧烯通过苧烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(+)-苧烯合成酶(AF514287，REGION：47..1867；柠檬(Citrus limon))和(AY055214，REGION：48..1889；藿香(Agastache rugosa))和(-)-苧烯合成酶(DQ195275，REGION：1..1905；西特喀云杉)、(AF006193，REGION：73..1986；北美冷杉)和(MHC4SLSP，REGION：29..1828；留兰香(Menthaspicata))。 
月桂烯
月桂烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00191
在多种植物(包括月桂树、马鞭草和由其得名的月桂)的精油中发现。月桂烯通过月桂烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(U87908；北美冷杉)、(AY195609；金鱼草)、(AY195608；金鱼草)、(NM_127982；拟南芥TPS10)、(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)、(AF271259；白苏)、(AY473626；欧洲云杉)、(AF369919；欧洲云杉)和(AJ304839；冬青栎(Quercus ilex))。 
罗勒烯
α-和β-罗勒烯，其结构分别为 
Figure G2007800193534D00192
和
Figure G2007800193534D00193
在多种植物和水果(包括罗勒)中发现，并且是通过罗勒烯合成酶由GPP生成的。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AY195607；金鱼草)、(AY195609；金鱼草)、(AY195608；金鱼草)、(AK221024；拟南芥)、(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_117775；拟南芥ATTPS03)、(NM_001036574；拟南芥ATTPS03)、(NM_127982；拟南芥TPS10)、(AB110642；Citrus unshiu CitMTSL4)和(AY575970；百脉根(Lotus corniculatus)japonicus变种)。
α-蒎烯
α-蒎烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00201
在松树和桉树中发现。α-蒎烯通过α-蒎烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(+)α-蒎烯合成酶(AF543530，REGION：1..1887；火炬松(Pinus taeda))、(-)α-蒎烯合成酶(AF543527，REGION：32..1921；火炬松)和(+)/(-)α-蒎烯合成酶(AGU87909，REGION：6111892；北美冷杉)。 
β-蒎烯
β-蒎烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00202
在松树、迷迭香、欧芹、莳萝、罗勒和玫瑰中发现。β-蒎烯通过β-蒎烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(-)β-蒎烯合成酶(AF276072，REGION：1..1749；黄花蒿)和(AF514288，REGION：26..1834；柠檬)。 
桧萜
桧萜，其结构为 
Figure G2007800193534D00203
在黑胡椒、胡萝卜子、鼠尾草和茶树中发现。桧萜通过桧萜合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自药用鼠尾草(Salvia officinalis)的AF051901，REGION：26..1798。 
γ-萜品烯
γ-萜品烯，其结构为
是柑桔类水果的精油的一种成分。在生物化学上，γ-萜品烯通过γ-萜品烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括：(来自柠檬的AF514286，REGION：30..1832)和(来自Citrus unshiu的AB110640，REGION1..1803)。 
萜品油烯
萜品油烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00212
在黑醋栗、柏树、番石榴、荔枝、番木瓜、松树和茶中发现。萜品油烯通过萜品油烯合成酶由GPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自花旗松(Pseudotsuga menziesii)的AY906866，REGION：10..1887。 
C15化合物 
本发明的C15化合物通常来源于通过两分子IPP与一分子DMAPP缩合生成的法尼基焦磷酸(FPP)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，法尼基焦磷酸合成酶。这些C15化合物也被称为倍半萜，因为它们来源于三个异戊二烯单元。 
图2示意地显示了IPP和DMAPP如何组合生成FPP，其可以进一步加工成倍半萜。 
法尼基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(ATU80605；拟南芥)、(ATHFPS2R；拟南芥)、(AAU36376；黄花蒿)、(AF461050；黄牛(Bos taurus))、(D00694；大肠杆菌K-12)、(AE009951，基因座AAL95523；具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.nucleatum)ATCC 25586)、(GFFPPSGEN；藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi))、(CP000009，基因座AAW60034；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)621H)、(AF019892；向日葵(Helianthus annuus))、(HUMFAPS；人(Homo sapiens))、(KLPFPSQCR；乳酸克鲁维酵母)、(LAU15777；白羽扇豆(Lupinusalbus))、(LAU20771；白松(Lupinus albus))、(AF309508；小鼠(Mus musculus))、(NCFPPSGEN；粗糙脉孢菌)、(PAFPS1；银胶菊(Parthenium argentatum))、(PAFPS2；银胶菊)、(RATFAPS；大鼠(Rattus norvegicus))、(YSCFPP；酿酒酵母)、(D89104；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、(CP000003，基因座AAT87386；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、(CP000017，基因座AAZ51849；酿脓链球菌)、(NC_008022，基因座YP_598856；酿脓链球菌MGAS10270)、(NC_008023，基因座YP_600845；酿脓链球菌MGAS2096)、(NC_008024，基因座YP_602832；酿脓链球菌MGAS10750)和(MZEFPS；玉米(Zea mays))。 
可替代地，FPP也可以通过将IPP添加至GPP生成。编码能够进行该反应的酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(AE000657，基因座AAC06913；Aquifex aeolicus VF5)、(NM_202836；拟南芥)、(D84432，基因座BAA12575；枯草杆菌(Bacillus subtilis))、(U12678，基因座AAC28894；大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110)、(BACFDPS；Geobacillus stearothermophilus)、(NC_002940，基因座NP_873754；杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)35000HP)、(L42023，基因座AAC23087；流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)Rd KW20)、(J05262；人)、(YP_395294；Lactobacillussakeisubsp.sakei23K)、(NC_005823，基因座YP_000273；肾脏钩端螺旋体血清型(Leptospirainterrogans serovar)Copenhageni str.FiocruzL1-130)、(AB003187；藤黄微球菌(Micrococcus luteus))、(NC_002946，基因座YP_208768；淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)FA 1090)、(U00090，基因座AAB91752；根瘤菌属的种 (Rhizobiumsp.)NGR234)、(J05091；酿酒酵母)、(CP000031，基因座AAV93568；Silicibacter pomeroyi DSS-3)、(AE008481，基因座AAK99890；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6)和(NC_004556，基因座NP 779706；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)Temeculal)。 
FPP然后被转化为多种C15化合物。C15化合物的说明性例子包括但不限于： 
紫穗槐二烯
紫穗槐二烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00231
是Artemisia anna产生的青蒿素的前体。紫穗槐二烯通过紫穗槐二烯合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的一个说明性例子是美国专利7,192,751的SEQ ID NO.37。 
α-法尼烯
α-法尼烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00232
在包括但不限于蚂蚁杜氏腺的多种生物来源和苹果和梨皮的外层中发现。α-法尼烯通过α-法尼烯合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自西洋梨(Pyrus communis)d′Anjou栽培变种的DQ309034(梨；基因名称AFS1)和来自Malus domestica的AY182241(苹果；基因AFS1)。Pechouus等人，Planta219(1)：84-94(2004)。 
β-法尼烯
β-法尼烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00233
在包括但不限于蚜虫和例如来自薄荷的精油的多种生物来源中发 现。在有些植物如野生马铃薯中，β-法尼烯作为天然驱虫剂合成。β-法尼烯通过β-法尼烯合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自辣薄荷的GenBank登录号AF024615(薄荷；基因Tspa11)和来自黄花蒿的AY835398。Picaud等人，Phytochemistry66(9)：961-967(2005)。 
法尼醇
法尼醇，其结构为 
Figure G2007800193534D00241
在包括昆虫和例如来自cintronella、橙花油、仙客来、柠檬草、晚香玉和玫瑰的精油的多种生物来源中发现。法尼醇通过羟化酶如法尼醇合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自玉米(Zea mays)的GenBank登录号AF529266和来自酿酒酵母的YDR481C(基因Pho8)。Song，L.，Applied Biochemistry andBiotechnology 128：149-158(2006)。 
橙花叔醇
橙花叔醇，其结构为 
也被称为苦橙花醇，在包括例如来自橙花油、姜、茉莉、熏衣草、茶树和柠檬草的精油的多种生物来源中发现。橙花叔醇通过羟化酶如橙花叔醇合成酶由FPP生成。合适的核苷酸序列的一个说明性例子包括但不限于来自玉米的AF529266(玉米；基因tps1)。 
薄荷醇
薄荷醇，其结构为 
Figure G2007800193534D00243
也被称为绿叶醇，是绿叶刺蕊草(Pogostemon patchouli)的精油 的一种成分。薄荷醇是通过薄荷醇合成酶由FPP生成的。合适的核苷酸序列的一个说明性例子包括但不限于来自广藿香(Pogostemoncablin)的AY508730 REGION：1..1659。 
瓦伦烯
瓦伦烯，其结构为 
Figure G2007800193534D00251
是橙子的味道和香味的主要化学成分之一，并且在橙皮中发现。瓦伦烯是通过诺卡酮合成酶由FPP生成的。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于来自甜橙(Citrus sinensis)的AF441124REGION：1..1647和来自白苏的AY917195 REGION：1..1653。 
C20化合物 
本发明的C20化合物通常来源于通过三分子IPP与一分子DMAPP缩合生成的香叶基香叶醇焦磷酸(GGPP)。已知催化该步骤的一种酶是，例如，香叶基香叶基焦磷酸合成酶。这些C20化合物也被称为二萜，因为它们由四个异戊二烯单元形成。 
图2示意性地显示了IPP和DMAPP如何组合产生GGPP，其可以进一步加工为二萜，或者可以进一步加工产生类胡萝卜素。 
香叶基香叶基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(ATHGERPYRS；拟南芥)、(BT005328；拟南芥)、(NM_119845；拟南芥)、(NZ_AAJM01000380，基因座ZP_00743052；苏云金枯草芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)，ATCC 35646sq1563)、(CRGGPPS；长春花(Catharanthus roseus))、(NZ_AABF02000074，基因座ZP_00144509；具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii)，ATCC 49256)、(GFGGPPSGN；藤仓赤霉)、(AY371321；白果(Ginkgo biloba))、(AB055496；巴西三叶胶)、(AB017971；人)、(MCI276129；卷枝毛霉(Mucor circinelloides)f.lusitanicus)、(AB016044；小鼠(Mus muscuhus))、(AABX01000298，基因座NCU01427；粗糙脉孢菌)、(NCU20940；粗糙脉孢菌)、(NZ_AAKL01000008，基因座ZP_00943566；Ralstonia solanacearum UW551)、(AB118238；大鼠(Rattus norvegicus))、(SCU31632；酿酒酵母)、(AB016095；细长聚球蓝细藻(Synechococcus elongates)、(SAGGPS；白芥子(Sinapisalba))、(SSOGDS；噬酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))、(NC_007759，基因座YP_461832；Syntrophus aciditrophicus SB)和(NC_006840，基因座YP_204095；芬氏弧菌(Vibrio fischeri)ES114)。 
可替代地，GGPP也可以通过向FPP添加IPP形成。编码能够催化该反应的酶的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(NM_112315；拟南芥)、(ERWCRTE；成团泛菌(Pantoea agglomerans))、(D90087，基因座BAA14124；菠萝泛菌(Pantoea ananatis))、(X52291，基因座CAA36538；荚膜红杆菌)、(AF195122，基因座AAF24294；球形红杆菌)和(NC_004350，基因座NP_721015；变异链球菌UA159)。 
GGPP然后进一步转化为多种C20类异戊二烯。C20化合物的说明性例子包括但不限于： 
香叶基香叶醇
香叶基香叶醇，其结构为 
是来自香椿(Cedrela toona)的木油和亚麻籽油的一种成分。例如，可以通过向表达构建体的GGPP合成酶基因之后添加磷酸酶基因制成香叶基香叶醇。 
松香二烯
松香二烯包括以下异构体：
Figure G2007800193534D00271
和
Figure G2007800193534D00272
在诸如北美冷杉的树中发现。松香二烯是通过松香二烯合成酶生成的。合适的核苷酸序列的说明性例子包括但不限于：(U50768；北美冷杉)和(AY473621；欧洲云杉)。 
C20+化合物 
C20+化合物也在本发明的范围内。这些化合物的说明性例子包括二倍半萜类(由5个异戊二烯单元形成的C25化合物)、三萜类(由6个异戊二烯单元形成的C30化合物)和四萜类(由8个异戊二烯单元形成的C40化合物)。这些化合物使用此处所述的类似方法并替换或增加合适的合成酶的核苷酸序列而制成。 
工程化途径 
本发明利用工程化MEV和/或DXP途径实现在宿主细胞中高水平地生产类异戊二烯。该途径一般通过重组DNA技术，通过表达编码至少一个这样的途径中的酶的异源序列进行工程化。 
所述核苷酸可以被一个或多个载体表达。例如，一个表达载体可以包含至少两个、三个、四个、五个或者全部编码全部MEV或DXP途径酶的异源序列。一个或多个载体的选择取决于异源序列的大小和载体的容量，将主要取决于当在选择的宿主细胞中表达时载体能够提供的给定类异戊二烯的总产率。所述载体可以附加地保持复制性，或者作为宿主细胞基因组的必需的部分。通常，为使宿主细胞持续增殖，优选后者。 
在某些宿主细胞中，一种或多种编码MEV或DXP途径酶的异源序列可以被一个或多个操纵子控制。在某些情况中，两个或三个操纵子系统比单操纵子系统提供更高的类异戊二烯产率。 
需要时，可以修饰所述核酸序列以反映所选宿主细胞的密码子偏 好(codon preference)，以实现这些序列在宿主细胞中的较高的表达。例如，在某些实施方案中将针对酵母密码子偏好修饰所述核苷酸序列。参见，例如，Bennetzen和Hall(1982)J：Biol.Chem.257(6)：3026-3031。作为另一个非限制性例子，在其它实施方案中将针对大肠杆菌密码子偏好修饰核苷酸序列。参见，例如，Gouy和Gautier(1982)Nucleic Acids Res.10(22)：7055-7074；Eyre-Walker(1996)Mol.Biol.Evol.13(6)：864-872。参见Nakamura等人.(2000)Nucleic AcidsRes.28(1)：292。可以获得多种生物的密码子应用表，可以用作设计本发明序列的参考。使用给定宿主微生物常用的密码子通常会提高翻译的可能性，因而提高所需序列的表达水平。 
核酸的制备可以利用多种常规重组技术和合成方法进行。简要地说，核酸可以是制备的基因组DNA片段、cDNA和RNA，所有这些都可以直接从细胞中提取或者通过包括但不限于PCR和rt-PCR的多种扩增方法重组产生。 
核酸的直接化学合成一般包括向正在延长的核苷酸聚合链的末端5’-羟基上连续添加3’-封端的和5’-封端的核苷酸单体，其中每次添加都是通过在添加的单体的3’-位上对正在延长的链的末端5’-羟基进行亲核攻击而实现的，该添加的单体一般是磷衍生物，如磷酸三酯、亚磷酰胺或类似物。这种方法是本领域普通技术人员已知的，并且在恰当的文本和文献中描述(例如，Matteuci等人.(1980)Tet.Lett.521：719；Caruthers等人的美国专利No.4,500,707；和Southern等人的美国专利Nos.5,436,327和5,700,637)。 
宿主微生物中核酸的转录水平可以通过多种方法提高。例如，可以通过提高编码酶的核苷酸序列的拷贝数来实现(例如，通过使用较高拷贝数的包含编码酶的核苷酸序列的表达载体，或者通过向宿主微生物的基因组中引入额外拷贝的编码酶的核苷酸序列，例如，通过recA-介导的重组，使用“自杀”载体，使用λ噬菌体重组酶的重组，和/或通过转座子或转座元件插入)。另外，也可以通过以下方式实现：改变操纵子的多顺反子mRNA上的编码区的顺序，或者将操纵子分裂为 单个基因，每个均具有其自身的控制元件，或者提高有效连接酶编码区的启动子(转录启动或转录控制序列)的强度(例如，在大肠杆菌宿主微生物中使用共有的阿拉伯糖或乳糖诱导型启动子代替修饰的乳糖诱导型启动子，例如在pBluescript和pBBR1MCS质粒中发现的)，或者使用诱导型启动子，以及通过向生长培养基中添加化学物质诱导诱导型启动子。宿主微生物中核苷酸序列的翻译水平可以利用多种方法提高，包括但不限于提高mRNA的稳定性，修饰核糖体结合位点的序列，改变核糖体结合位点和酶编码序列的起始密码子之间的距离或序列，修饰位于酶编码区的起始密码子5’侧“上游”或与之相邻的整个顺反子间区域，使用发夹和特化序列稳定mRNA转录物的3’-末端，改变酶的密码子应用，改变在酶生物合成中使用的稀有密码子tRNA的表达，和/或提高酶的稳定性，例如，通过其编码序列的突变。优选密码子和稀有密码子tRNA的确定可以基于对来源于宿主微生物的基因的序列分析。 
宿主中MEV、DXP或异戊烯转移酶的活性可以用多种方法改变，包括但不限于表达显示在宿主细胞中的溶解度提高的修饰形式的酶，表达缺乏抑制酶活性的区域的改变形式的酶，表达对底物具有较高Kcat或较低Km的修饰形式的酶，或者表达不受该途径中另一分子的反馈或前馈调节影响的改变形式的酶。这种变异酶也可以通过对较宽特异性酶进行随机诱变来分离，如下所述，编码这种变异酶的核苷酸序列可以从表达载体表达或者从整合到宿主微生物基因组内的重组基因表达。 
可以构建所述载体以产生所需水平的编码酶拷贝数。在某些实施方案中，所述载体产生至少10个、10-20个、20-50个、或者甚至高于100个拷贝的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶或此两者。低拷贝数质粒通常提供每个细胞少于大约20个质粒拷贝；中拷贝数质粒通常提供每个细胞大约20个质粒拷贝至每个细胞大约50个质粒拷贝，或者每个细胞大约20个质粒拷贝到大约80个质粒拷贝；高拷贝数质粒通常提供每个细胞大约80个质粒到每个细胞大约200个质粒，或 者更多。 
用于大肠杆菌的合适的低拷贝表达载体包括但不限于pACYC184、pBeloBacl1、pBR332、pBAD33、pBBR1MCS及其衍生物、pSC101、SuperCos(粘粒)和pWE15(粘粒)。用于大肠杆菌的合适的中拷贝表达载体包括但不限于pTrc99A、pBAD24和含有ColE1复制起点的载体及其衍生物。用于大肠杆菌的合适的高拷贝数表达载体包括但不限于pUC、pBluescript、pGEM和pTZ载体。用于酵母的合适的低拷贝(着丝粒)表达载体包括但不限于pRS415和pRS416(Sikorski和Hieter(1989)Genetics 122：19-27)。酵母中的合适的高拷贝2微米表达载体包括但不限于pRS425和pRS426(Christainson等人.(1992)Gene110：119-122)。备选的2微米表达载体包括不可选择的2微米表达载体的变体(Bruschi & Ludwig(1988)Curr.Genet.15：83-90)或携带表达盒的完整的2微米质粒(如美国专利申请20050084972中举例说明的)或者携带缺陷选择性标记的2微米质粒如LEU2d(Erhanrt等人.(1983)J.Bacteriol.156(2)：625-635)或URA3d(Okkels(1996)Annals of the New York Academy of Sciences 782(1)：202-207)。 
也可以将调节元件(包括，例如，启动子和操纵子)工程化，从而通过提高在确定类异戊二烯总产率中起重要作用的一个或多个基因的表达，提高MEV或DXP途径的代谢通量。启动子是通过RNA聚合酶启动和控制核酸序列转录的核苷酸序列。操纵子是与启动子相邻的核苷酸序列，用来控制所需核酸序列的转录。操纵子含有蛋白质结合域，在此处可以结合特定的阻抑蛋白。在不存在合适的阻抑蛋白时，通过启动子启动转录。在存在合适的阻抑蛋白时，阻抑蛋白与操纵子结合，并且由此抑制从启动子开始的转录。启动子和操纵子也被称为转录调节物。 
在本发明的一些实施方案中，在表达载体中使用的启动子是诱导型启动子。在其它实施方案中，在表达载体中使用的启动子是组成型启动子。在某些实施方案中，一个或多个核酸序列与诱导型启动子有效连接，一个或多个其它核酸序列与组成型启动子有效连接。
用于原核宿主细胞的合适的启动子的非限制性例子包括噬菌体T7RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如，lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子，等等；araBAD启动子；体内调节的启动子，如ssaG启动子或相关启动子(参见，例如，美国专利申请20040131637)、pagC启动子(Pulkkinen和Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(21)：10079-83)、nirB启动子(Harborne等人.(1992)Mol.Micro.6：2805-2813)，等等(参见，例如，Dunstan等人.(1999)Infect.Immun.67：5133-5141；McKelvie等人.(2004)Vaccine 22：3243-3255；和Chatfield等人.(1992)Biotechnol.10：888-892)；sigma70启动子，例如，共有sigma70启动子(参见，例如，GenBank登录号AX798980、AX798961和AX798183)；稳定期启动子，例如，dps启动子、spv启动子，等等；来源于致病岛的启动子SPI-2(参见，例如，WO96/17951)；actA启动子(参见，例如，Shetron-Rama等人.(2002)Infect.Immun.70：1087-1096)；rpsM启动子(参见，例如，Valdivia和Falkow(1996)Mol.Microbiol.22：367378)；tet启动子(参见，例如，Hillen等人.(1989)In Saenger W.and Heinemann U.(eds)Topics inMolecular and Structural Biology，Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan，London，UK，Vol.10，pp.143-162)；SP6启动子(参见，例如，Melton等人.(1984)Nucl.Acids Res.12：7035-7056)；等等。 
在某些实施方案中，与相应途径中的其它酶相比在类异戊二烯总产率上起较大作用的异源MEV或DXP酶的总活性通过从强启动子表达酶而提高。用于大肠杆菌的合适的启动子包括但不限于Trc、Tac、T5、T7、和Pλ。在本发明的另一实施方案中，一种或多种MEV途径酶在宿主中的总活性通过从高拷贝数质粒上的强启动子表达该酶来提高。用于大肠杆菌的合适的例子包括但不限于使用Trc、Tac、T5、T7和PLambda启动子与pBAD24、pBAD18、pGEM、pBluescript、pUC和pTZ载体。
用于真核宿主细胞的合适的启动子的非限制性例子包括但不限于：CMV直接早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期或晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。 
用于原核宿主细胞的合适的组成型启动子的非限制性例子包括sigma70启动子(例如，共有sigma70启动子)。用于细菌宿主细胞的合适的诱导型启动子的非限制性例子包括噬菌体λ的pL；Plac；Ptrp；Ptac(Ptrp-lac杂合启动子)；异丙基-β-D44半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)-诱导型启动子，例如，lacZ启动子；四环素诱导型启动子；阿拉伯糖诱导型启动子，例如，PBAD(参见，例如，Guzman等人.(1995)J.Bacteriol.177：4121-4130)；木糖诱导型启动子，例如，Pxyl(参见，例如，Kim等人.(1996)Gene181：71-76)；GAL1启动子；色氨酸启动子；lac启动子；醇诱导型启动子，例如，甲醇诱导型启动子、乙醇诱导型启动子；棉子糖诱导型启动子；热诱导型启动子，例如，热诱导型λPL启动子；由热敏感阻抑物控制的启动子(例如，CI857-阻抑的基于λ的表达载体；参见，例如，Hoffmann等人.(1999)FEMSMicrobiol Lett.177(2)：327-34)；等等。 
用于酵母宿主细胞中的合适的组成型启动子的非限制性例子包括ADH1、ADH2、PGK或LEU2启动子。用于酵母宿主细胞中的合适的诱导型启动子的非限制性例子包括但不限于，分歧半乳糖-诱导型启动子如GAL1或GAL10启动子(West等人.(1984)Mol.Cell.Biol.4(11)：2467-2478)或CUP1启动子。需要时，所述载体包含比天然大肠杆菌Lac启动子更强的启动子。 
用于细菌宿主细胞中的操纵子的非限制性例子包括乳糖启动子操纵子(LacI阻遏蛋白当与乳糖接触时改变了构象，从而阻止LacI阻遏蛋白与操纵子结合)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸络合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；在没有色氨酸时，TrpR阻遏蛋白具有不结合操纵子的构象)，和tac启动子操纵子(参见，例如，deBoer等人.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25.)。 
表达载体中的基因一般也编码核糖体结合位点，以引导任何编码 的mRNA基因产物的翻译(即，合成)。关于用于大肠杆菌中的合适的核糖体结合位点，参见Shine等人.(1975)Nature 254：34和Steitz，inBiological Regulation and Development：Gene Expression(ed.R.F.Goldberger)，vol.1，p.349，1979，Plenum Publishing，N.Y。在编码序列上游插入核糖体结合位点编码核苷酸序列5’-AAAACA-3’促进了酵母宿主微生物中的有效翻译(Looman等人.(1993)Nuc.Ac.Res.21：4268-4271；Yun等人.(1996)Mol.Microbiol.19：1225-1239)。 
可以在表达载体中使用的其它调节元件包括转录增强子元件和转录终止子。参见，例如，Bitter等人.(1987)Methods in Enzymology，153：516-544。 
表达载体可能适合在特定类型的宿主微生物中使用，而不是在其它微生物中使用。然而，本领域普通技术人员通过常规实验可以容易地确定一种具体表达载体是否适合于特定宿主微生物。例如，可以将表达载体导入宿主生物中，然后监测该宿主生物的存活力以及该载体中所含的任何基因的表达。 
表达载体也可以含有一种或多种选择性标记基因，该基因在表达后提供一种或多种表型性状，该表型性状可以用于筛选或以其它方式鉴定携带该表达载体的宿主细胞。用于真核细胞的合适的选择性标记的非限制性例子包括二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。用于原核细胞的合适的选择性标记的非限制性例子包括四环素、氨苄青霉素、氯霉素、羧苄青霉素和卡那霉素抗性。 
对于工业规模的类异戊二烯生产，使用需要向发酵培养基中添加抗生素的选择性标记可能是不切实际的或者成本太高。因此，本发明的某些实施方案采用不需要使用提供抗生素抗性的选择性标记的宿主细胞，来确保质粒(表达载体)的保持。在本发明的这些实施方案中，表达载体含有质粒保持系统，如60-kb IncP(RK2)质粒，任选地还含有RK2质粒复制和/或隔离系统，以便在没有抗生素选择的情况下实现质粒保持(参见，例如，Sia等人.(1995)J.Bacteriol.177：2789-97；Pansegrau等人.(1994)J.Mol.Biol.239：623-63)。用于该目的的合适 的质粒保持系统由RK2的parDE操纵子编码，它编码稳定的毒素和不稳定的抗毒素。抗毒素可以通过直接蛋白质-蛋白质相互作用抑制毒素的致死作用。丢失携带parDE操纵子的表达载体的细胞快速失去不稳定的抗毒素，产生稳定的毒素，然后导致细胞死亡。RK2质粒复制系统由trfA基因编码，其编码DNA复制蛋白。RK2质粒隔离系统由parCBA操纵子编码，其编码用来分解可能由DNA复制产生的质粒多聚体的蛋白质。 
可以利用多种建立的技术将所述载体稳定地或瞬时地导入宿主细胞内。例如，一种方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀法引入表达载体。其它盐，例如磷酸钙，也可以按照类似的方法使用。另外，也可以采用电穿孔法(即，施加电流来提高细胞对核酸的通透性)。其它转化方法包括显微注射、DEAE葡聚糖介导的转化和在醋酸锂存在下的热休克。也可以利用脂复合物、脂质体和树状聚体(dendrimer)转染宿主微生物。 
在转化后，可以实施多种方法来确定已经导入了所述载体的宿主细胞。一种示例性的筛选方法包括亚培养个体细胞以形成单个菌落，然后检测所需基因产物的表达。另外一种方法需要根据表达载体内所含选择性标记基因的表达提供的表型性状筛选被转化的宿主细胞。本领域技术人员可以利用本领域可以使用的这些或其它方法确定遗传修饰的宿主细胞。 
本发明的各种途径序列向宿主细胞内的导入可以通过诸如PCR、Southern印迹法或Northern印迹杂交的方法证实。例如，可以由得到的宿主细胞制备核酸，并且可以使用目标序列特异性引物通过PCR扩增特定目标序列。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，然后用溴化乙锭、SYBR绿溶液或类似物染色，或者利用紫外线检测方法检测DNA。或者，可以在杂交反应中使用目标序列特异性核酸探针。通过反转录联合PCR、Northern印迹杂交检测相应mRNA，或者通过使用可与编码基因产物反应的抗体的免疫测定，可以确定特定基因序列的表达。示例性的免疫测定包括但不限 于ELISA、放射性免疫测定和夹心免疫测定。 
给定途径酶的酶活性可以通过本领域已知的多种方法测定。通常，酶活性可以根据产物的形成或研究中的酶反应底物的转化来确定。反应可以在体外或体内发生。例如，细胞中HMG-CoA还原酶和HMG-CoA合成酶的相对活性可以根据细胞中HMG-CoA的稳态水平来测定。HMG-CoA可以用三氯乙酸(TCA)提取，然后通过液相色谱法/质谱法分析提取的物质。甲羟戊酸激酶的活性可以根据甲羟戊酸5-磷酸的形成来证明。甲羟戊酸激酶和HMG-CoA还原酶的相对活性可以根据甲羟戊酸的稳态水平来确定，甲羟戊酸的稳态水平可以通过气相色谱法/质谱法来确定。参见，例如，WO05033287，引入本文作为参考。 
经由此处公开的一种或多种代谢途径的类异戊二烯的产率可以通过抑制将中间体转向脱离类异戊二烯产物形成性生产步骤的反应来加强。非生产性反应的抑制可以通过降低涉及一个或多个非生产性反应的酶的表达和/或活性来实现。这些反应包括TCA循环的副反应，它们导致脂肪酸生物合成、丙氨酸生物合成、天冬氨酸超途径、糖异生、血红素生物合成和/或谷氨酸生物合成，其水平影响了类异戊二烯的总产率。另外，在磷酸转乙酰酶的作用下乙酰-CoA向乙酸的转化是非生产性副反应的另一个例子。因此，需要时，为了提高类异戊二烯的产率，也可以进行“敲除”或“抑制(knock down)”编码磷酸转乙酰酶的pta基因。根据特定的目标类异戊二烯，本领域技术人员可以选择针对额外的非生产性步骤。例如，当类胡萝卜素是选择的类异戊二烯时，人们可以选择“敲除”或“抑制”一个或多个选自gdhA、aceE、fdhF、yjiD、hnr or yjfP、ackA、appY、aspC、clp、clpP、clpXP、crcB、csdA、cyaA、evgS、fdhA、fdhD、feoB、fumA、glnE、glxR、gntK、hycI、lipB、lysU、modA、moeA、nadA、nuoC、nuoK、pflB、pitA、pst、pstC、pta、p-yjiD、sohA、stpA、yagR、yaiD、ybaS、ycfZ、ydeN、yebB、yedN、yfcC、ygiP、yibD、yjfP、yjhH或yliE基因或任何其它单独的或组合的基因的基因，该基因的 抑制将导致较高的类胡萝卜素产率，如美国专利申请20060121558所述，在此引入作为参考。 
有多种方法可用于敲除或抑制目标基因。例如，基因表达的降低可以通过缺失、突变和/或基因重排来实现。也可以利用反义RNA、siRNA、miRNA、核糖体、三链DNA和转录和/或翻译抑制剂来进行。另外，可以利用转座子破坏基因表达，例如，通过将其插入启动子和编码区之间或两个相邻基因之间，以将一个或两个基因灭活。 
类异戊二烯化合物的高产率 
本发明提供利用异戊烯焦磷酸途径酶大量生产类异戊二烯的组合物和方法，所述酶在至少一个异源调节物或发酵条件的控制下，单独的或者是组合的利用异源调节物和发酵条件。 
一方面，一种生产类异戊二烯的方法包括以下步骤：(a)获得多个含有生成异戊烯焦磷酸的酶途径的宿主细胞，其中所有途径酶都在至少一个异源转录调节物的控制下；和(b)在与为宿主细胞提供最大比生长速率的条件相比为亚最佳的条件下，在培养基中培养宿主细胞。在某些实施方案中，该途径是甲羟戊酸途径。在其它实施方案中，该途径是DXP途径。在其它实施方案中，该至少一个异源转录调节序列是可诱导的。在其它实施方案中，途径酶处于单转录调节物的控制下。在其它实施方案中，途径酶在多个异源转录调节物的控制之下。 
在某些实施方案中，该途径包含编码来自具有内源甲羟戊酸途径的原核生物的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。合适的原核生物的非限制性例子包括来自以下属的生物：游动放线菌属(Actinoplanes)、古生球菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、疏螺旋体属(Borrelia)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属、利斯特氏菌属(Listeria)、Oceanobacillus、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、热原体属和弧菌属。具体菌株的非限制性例子包括：闪烁古生球菌、食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus；)、粪肠球 菌(Enterococcus faecalis)、屎粪肠球菌(Enterococcus faecium)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸乳球菌、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、Oceanobacillusiheyensis、Paracoccus zeaxanthinifaciens、Pseudomonas mevalonii、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、出血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、Streptomyces griseolosporeus、变异链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌、酿脓链球菌；噬酸热原体、火山热原体、Thermoplasma Vibrio cholerae；副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。 
在另一实施方案中，编码甲羟戊酸途径酶的核酸序列选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的编码序列。在另一实施方案中，编码甲羟戊酸途径酶的核酸序列选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的编码序列，并且来自属于肠球菌属或假单胞菌属或葡萄球菌属的原核生物。在另一实施方案中，编码甲羟戊酸途径酶的核酸序列选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的编码序列，并且来自粪肠球菌或者来自金黄色葡萄球菌。 
在另一实施方案中，编码甲羟戊酸途径酶的核酸序列是II类HMG-CoA还原酶的编码序列。HMG-CoA还原酶通常被分为两类，它们可根据序列同源性和/或酶的性质来区分(参见，例如，Hedl，等人，J.Bacteriology，1927-1932，2004，和Bochar，等人，Molec.Genet.Metab.，66，122-127，1999)。 
II类HMG-CoA还原酶的部分特征是对包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀的他汀类药物的低敏感性。在某些实施方案中，II类HMG-CoA还原酶显示大于1微摩尔、10微摩尔或100微摩尔的他汀药物抑制常数。在其它实施方案中，II类HMG-CoA还原酶对洛伐他汀的抑制常数比I类 HMG-CoA至少高大约10、100、1000或10,000倍。在其它实施方案中，II类HMG-CoA还原酶对洛伐他汀的抑制常数比从人体分离的I类HMG-CoA至少高大约10、100、1000或10,000倍。在其它实施方案中，II类HMG-CoA还原酶来自原核生物。在其它实施方案中，II类HMG-CoA还原酶来自古细菌。 
原型II类HMG-CoA还原酶来源于Pseudomonas mevalonii。本发明也涉及变异的II型HMG-CoA还原酶，与P.mevalonii HMG-CoA还原酶氨基酸序列相比，其显示至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％或95％的同一性。本发明进一步包括具有与人HMG-CoA还原酶相比低于约40％、35％、30％、25％、20％或更低的同一性的变体。氨基酸序列的同一性可以按照Bochar，等人，Molec.Genet.Metab.，66，122-127，1999所述的方法确定。 
II类HMG-CoA还原酶的非限制性例子包括来源于来自以下微生物的HMG-CoA还原酶的那些：闪烁古生球菌(NC_000917)；食菌蛭弧菌(BX842650)；布氏疏螺旋体(AE001169)；橙色绿屈挠菌(AJ299212)；粪肠球菌(AAO81155)；屎肠球菌(AF290094)；约氏乳杆菌(AE017204)；植物乳杆菌；乳酸乳球菌(AE006387)；无害利斯特氏菌(CAC96053)；单核细胞增生利斯特氏菌(AE017324)；Oceanobacillus iheyensis(NC_000917)；Paracoccus zeaxanthinifaciens(AJ431696)；Pseudomonasmevalonii(M24015)；金黄色葡萄球菌(AF290086)；表皮葡萄球菌(AF290090)；出血性葡萄球菌(AF290088)；无乳链球菌(CAD47046)；Streptomyces griseolosporeus(AB037907)；变异链球菌(AAN58647)；肺炎链球菌(AF290098)；酿脓链球菌(AF290096)；噬酸热原体(CAC11548)；火山热原体(AL935253)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(AAF96622)；副溶血弧菌(BAC62311)；和创伤弧菌(AAO07090)。 
此处所述的发酵方法涉及调节宿主细胞的比生长速率。通常用参数μ表示，比生长速率表示每单位时间每单位生物量的细胞生长速率。比生长速率的单位为时间的倒数(1/t)。细胞在培养基中的最大比 生长速率涉及底物浓度对生长速率的影响。通常，细胞将在低底物水平下缓慢生长，并且随着培养基中底物水平的升高，细胞生长速率也增加。然而，细胞生长速率不会无限期地持续上升，在高水平底物下，给定的底物量将产生越来越小的细胞生长速率增长。因此，生长速率最终达到极限，该极限通常被称为最大比生长速率。培养物中的生长速率之间的关系的理论是本领域技术人员周知的，被称为Monod方程。参见，例如，Pirt，Principles of Microbe and Cell Cultivation，Wiley，NY，1975，第4-10页。在该理论中，最大比速率是永远不会达到的渐近的极限，除非底物达到无限水平。然而实际上，当所研究的条件(例如底物水平或温度)支持最快的初始生长速率时，可以认为获得了最大比生长速率。例如，在补料分批反应器中，过量提供营养物的初始条件被看作最大生长速率的条件。参见，例如，Lee等人.(1996)Trends Biotechnol.14：98-105和Korz等人.(1995)JBiotechnology 39：59-65。添加底物以支持最大比生长速率的条件有时也被称为无限制生长。另外，Monod方程描述了渐近地接近最大比速率的底物的理论速率性质，对于许多底物来说，并不是接近该值，在添加更多底物时，在达到最大速率后在较高底物水平时看到速率的降低，即达到最大比生长速率后生长速率降低。 
最大比生长速率也可以是关于温度以及底物的。通常，生物在低温下将缓慢生长，当温度升高到特定点时将以较快的速率生长，之后，生长速率下降。生长速率处于最大水平时的温度是达到最大生长速率时的温度。我们发现通过使温度降低到支持最大比生长速率的温度以下可以提高类异戊二烯的产量。 
最大比生长速率也可以是关于除底物以外的其它发酵添加剂的。例如，对于营养物、维生素和矿物质来说，在这些成分为低含量时可能处于低速率，当成分浓度升高时速率将升高，然后，在某些情况下，在甚至更高的成分浓度时，速率将降低。当成分浓度支持最高速率时获得最大比生长速率。 
培养基中细胞的最大比生长速率通常在发酵开始阶段在被终产物 或中间物、细胞拥挤或其它引起生长速率下降的因素抑制之前测定。例如，通常在对数生长期而不是在延滞期、减速期或稳定期测定最大生长速率。最大比生长速率的概念也通过考虑适当的变量应用于后一发酵阶段。 
因此，在某些实施方案中，宿主细胞在使得生长低于最大比生长速率的大约90％的条件下培养。在其它实施方案中，宿主细胞在使得生长低于最大比生长速率的大约80％、75％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、10％、5％或1％或更低的条件下培养。 
在其它实施方案中，宿主细胞在比提供最大比生长速率的温度至少低约2℃、4℃、5℃、6℃、8℃、10℃、15℃或20℃的培养基温度下培养。降低温度使生长减缓，这又减少了培养基中有毒副产物的形成和代谢热的产生。降低培养温度也减少了细胞的氧需求，能够获得较高的细胞密度。 
可以达到宿主细胞的最大比生长速率的温度取决于所选择的宿主细胞的类型。这可以如下确定：使宿主细胞在各种温度下生长限定的一段时间，以获得相关生长曲线。支持最大比生长速率的温度可以通过比较各自曲线的生长斜率来确定。对于大肠杆菌，最大比生长速率的温度为大约37℃。相应地，如果大肠杆菌是用于发酵生产类异戊二烯的宿主细胞，则发酵温度低于37℃。如果使用酿酒酵母，则最大比生长速率的温度为大约30℃。相应地，如果酿酒酵母是用于发酵生产类异戊二烯的宿主细胞，则发酵温度低于30℃。典型地，理想的温度比可以实现宿主细胞的最大比生长速率的温度低大约2℃、4℃、5℃、6、8、10℃、15℃和20℃。 
在其它实施方案中，宿主细胞在发酵培养基中培养，该培养基中的碳源含量低于提供最大比生长速率的含量。在特定实施方案中，宿主细胞在培养基中培养，该培养基中碳源保持在提供最大比生长速率的不到大约90％、80％、75％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、10％、5％、1％或更低的水平上。可以使用任何可被微生物消化的含碳来源。非限制性例子包括碳水化合物，如单糖、寡糖和多 糖，有机酸，如乙酸、丙酸；和醇，如乙醇和丙醇，和多元醇如甘油。 
在某些实施方案中，碳源主要包括单糖或寡糖。在其它实施方案中，碳源基本由单糖和二糖组成。在再另外的实施方案中，碳源基本不含纤维素。 
单糖是用作碳水化合物的结构单元的简单的糖。它们根据碳(C)原子的骨架分类：丙糖类具有三个碳原子，丁糖类具有四个碳原子，戊糖类具有五个碳原子，己糖类具有六个碳原子，庚糖类具有七个碳原子。碳原子与氢原子~(H)、羟基~(OH)和羰基~(C＝O)键合，它们的组合、顺序和构型允许存在大量的立体异构体。戊糖类包括在木质材料中发现的木糖；在来自针叶树的树胶中发现的阿拉伯糖；核糖，RNA和几种维生素的一种成分，和脱氧核糖，一种DNA成分。己糖类的例子包括葡萄糖、半乳糖和果糖。单糖类彼此结合以及与其它基团组合，形成多种二糖和寡糖。寡糖是含有少量(一般3-10个)单糖的糖聚合物。它们通常在蛋白质或脂质部分中与合适的氨基酸侧链O-连接或N-连接。本发明发酵反应中使用的优选寡糖是二糖，包括例如蔗糖，或三糖，如棉子糖。 
当希望使用纤维素、聚糖、淀粉或其它多糖作为最终碳源时，这些多糖可以首先通过化学方法或者通过酶法转化为单糖。例如，纤维素可以通过纤维素酶转化为葡萄糖。相应地，如果使用在生物质(包括，例如，芸苔、紫花苜蓿、稻米、黑麦、高粱、向日葵、小麦、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、柑橘类树、可可、茶、诸如香蕉、无花果、菠萝、番石榴、芒果的水果、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物或针叶树)中发现的诸如纤维素的多糖作为最终碳源，它可以被纤维素酶消化，产生单糖用于本发明的发酵过程。在某些实施方案中，在多糖分解后，单糖和/或寡糖至少占碳源的大约50％重量(在发酵开始时测定)。在其它实施方案中，单糖和/或寡糖至少占碳源的约80％或者甚至90％重量(在发酵开始时测定)，这样，发酵培养基基本不含纤维素。
在其它实施方案中，宿主细胞在氮源含量低于提供最大比生长速率的含量的发酵培养基中培养。不被任何特定理论所束缚，已知改变细胞可以利用的成分如氮的水平可以改变通过细胞内各个化学途径的相对通量。我们已经发现通过限制微生物可以利用的氮的水平，微生物产生的类异戊二烯如紫穗槐二烯的产量提高。本发明的氮水平的例子包括支持最大比生长速率的大约90％、80％、75％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、10％、5％、1％或更低的量。 
氮的限制可以分阶段进行。在某些实施方案中，在发酵开始时提供氨形式的氮支持初始生长，但是随后向发酵中的添加物中不含氮，或者除使用氨溶液将发酵pH维持在7所需的氨水平以外不含氮。对于大多数发酵，氮水平保持在低于支持最大比生长速率的量的水平。该量例如可以是支持最大比生长速率的至少约90％、80％、75％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、10％、5％或1％或更低的水平。本发明的发酵具有高于10mM的初始氮水平(在发酵培养基中测定)，以支持初始生长，随后发酵培养基中的氮水平低于50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或4mM。 
可以在合适的发酵反应混合物中使用的可同化氮的来源包括但不限于简单氮源、有机氮源和复合氮源。这些氮源包括无水氨、无机酸或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵、其它含氮化合物和动物、植物和/或微生物来源的物质。也可以使用氨基酸作为氮源，包括亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，或者它们的混合物。 
可以利用任何已知的给发酵反应提供底物的方法将底物水平保持在提供最大比生长速率的水平以下。说明性例子包括：分批法，其中所有发酵底物都在发酵反应开始时加入；连续进料法；可变进料速率法，例如，当发酵进行时提供含量逐渐提高的底物，以支持培养基中细胞浓度的升高。通常采用这三种方法的组合。例如，通常开始时在发酵中存在一定量的底物，以使微生物消耗此初始量的底物，然后在使用初始量的底物后连续地加入底物，或者可变地加入。本发明的一个方面给发酵培养基中的细胞提供初始量的底物(可能以相对高水平 存在)，以使宿主细胞基本上用完初始底物，然后通过连续或可变进料速率以相比支持最大生长速率的量而言为亚最佳的水平给宿主细胞提供底物。本领域技术人员应当理解，由于细胞可以以指数速率生长，为了保持底物量相对于宿主细胞水平恒定，以指数速率改变进料速率可能是有利的。因此在某些实施方案中，底物添加采用指数增加的方式，但是其水平低于提供最大比生长速率的水平。 
在某些实施方案中，相对于提供最大比生长速率的碳进料，发酵反应具有减少的碳源进料。不被特定理论所限制，可知改变细胞可以利用的营养物水平将改变通过细胞内各种化学途径的相对通量。例如，有些酶是可诱导的，只有当存在特定营养物时才具有活性。我们已经观察到降低给微生物的碳源进料速率可以提高发酵产生的类异戊二烯的量。实际上，在开始时可以按照足以支持宿主细胞初始生长的量提供碳源，直到这种初始碳源基本上耗尽，之后以指数速率加入碳源，但是该速率低于支持宿主细胞最大比生长的速率。例如，在本发明的一种方法中，以支持最大比生长速率的大约90％、80％、75％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或更低的量加入碳源。 
在其它实施方案中，给发酵反应提供足以以最大比生长速率或接近最大比生长速率生长(无限制生长)的初始量的碳源，然后对于剩余的发酵，以低于支持最大比生长速率所需水平的水平降低进料速率。在某些情况中，降低碳源进料速率的点是达到预定进料速率的点。在某些实施方案中，以大约15g/L/hr的进料速率给微生物提供足够的碳源以使其指数生长，之后进料速率降至5.7g/L/hr，并且剩余的发酵以该速率保持恒定。 
在某些实施方案中，一种或多种异源甲羟戊酸或DXP途径酶是可诱导的，并且在碳源进料速率降至低于最大比生长所需水平的水平后诱导。例如，如果工程化微生物含有诱导型启动子，首先通过加入碳源达到指数生长进行发酵，但是添加水平低于支持最大比生长的水平，然后对于剩余的发酵，将碳源进料速率降至更低的水平，降低碳 源进料速率后加入诱导剂。在某些实施方案中，在开始减慢的碳源进料后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导微生物。 
在其它实施方案中，以避免积累可降低细胞生长速率的有毒物质的方式进行发酵反应。例如，已知当向培养基中加入太多的葡萄糖时，诸如乙酸的有毒产物可能在生物中积累。参见，例如，Kortz等人.(1995)J.Biotechnol.39：59-65。因此通过以支持最大生长速率(无限生长)的量提供高水平的碳源，细胞初始生长可能较高，但是由于毒性物质积累导致生长停滞。低于毒性不积累的水平的碳源加入水平被称为临界水平或抑制性阈值。因此在某些实施方案中，进行发酵反应，使得碳源保持低于有毒物质积累的临界水平。本领域技术人员应当理解，物质的临界浓度将随使用的菌株和培养基而不同。 
有效的发酵反应混合物也可以包含其它化合物，如无机盐、维生素、痕量金属或生长促进剂。这样的其它化合物也可以存在于有效反应混合物的碳源、氮源或矿物质源中，或者可以特别地添加到反应混合物中。本发明的一个实施方案包括为了提高类异戊二烯产量，以与支持宿主细胞最大生长速率的水平相比为亚最佳的水平提供这些化合物。 
发酵反应混合物也可以含有合适的磷酸盐源。这样的磷酸盐源包括无机和有机磷酸盐源。磷酸盐源的非限制性例子包括但不限于：磷酸盐，如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸钾、磷酸铵、聚磷酸盐及其混合物。合适的发酵反应混合物也可以含有镁源。在某些实施方案中，镁为生理学可接受的盐形式，如七水合硫酸镁，尽管也可以使用贡献类似镁量的浓度的其它镁源。进一步地，在某些情况中，可能希望使发酵反应混合物在发酵过程中消耗镁源。在某些实施方案中，以相比支持最大比生长速率的量为亚最佳的量提供磷源。 
发酵反应混合物也可以包含生物学可接受的螯合剂，如柠檬酸三钠的二水合物和乙二胺四乙酸。发酵反应混合物在开始时也可以包含生物学可接受的酸或碱以维持发酵反应混合物所需的pH。生物学可接受的酸包括但不限于，盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及其混合物。生物 学可接受的碱包括但不限于，氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物。 
发酵反应混合物也可以包含生物学可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。发酵反应混合物也可以包含氯化钠。发酵反应混合物还可以含有痕量金属。这些痕量金属可以作为储备溶液加入到发酵反应混合物中，为了方便，可以与发酵反应混合物的其它部分分开制备。合适的痕量金属溶液包括但不限于硒酸钠、七水合硫酸铁、五水合硫酸铜、七水合硫酸锌、二水合钼酸钠、氯化亚钴、硒或铬溶液六水合物和一水合硫酸锰。盐酸可以加到储备溶液中以保持溶液中的痕量金属盐。 
如果向发酵培养基中添加途径中间体或可以转化为途径中间体的化合物，则该中间体或化合物一般过量存在。 
发酵可以在厌氧(缺乏氧气)或需氧(充氧)条件下进行。在需氧条件下，微生物可以将糖分解为终产物如CO2和H2O。在厌氧条件下，宿主细胞利用替代途径产生CO2和乙醇。发酵也可以指微生物在生长培养基上的大量生长，其中，需氧和厌氧代谢之间没有区别。通常，为了生产类异戊二烯而进行需氧发酵。 
本发明的发酵可以以分批、补料分批或连续方法进行。分批方法一般是封闭方法，其中所有原材料在发酵开始时加入。补料分批方法一般是一种封闭方法，其中碳源和/或其它物质在整个过程中递增地加入。补料分批方法允许较好地控制培养基和微生物的生长。连续方法可以被认为是一种开放系统，其中连续加入培养基并且同时取出产物。也可以采用介于这些类型之间的方法。例如，在一个实施方案中，发酵以补料分批方法开始，使有机层如十二烷与发酵培养基接触，而继续发酵过程。将类异戊二烯(在有机培养基中一般比在水性发酵培养基中具有更高的溶解度)从发酵培养基提取到有机层中。当类异戊二烯产生超过饱和点并形成可与培养基分离的层时，可以通过排出或吸收不同相层进行简单分离。由于从培养基中移出产物和发酵的进行，该方法具有补料分批方法和连续方法两者的特征。补料分批 方法和连续方法允许在发酵过程中控制发酵成分的添加。在实施本发明时通常优选补料分批、连续方法或这两种方法的组合。这些方法允许随着时间变化较好地控制添加物料和其它发酵成分的速率。在发酵过程中移出产物可能是有利的，特别是在积累的产物导致生产途径抑制时。 
每升发酵液中微生物的量或者微生物的密度可以通过测量从给定体积的发酵培养基中分离的微生物的重量来测定。一个常用的量度是每升发酵培养基的细胞的干重。可以用来监测进行中的发酵的另外一种方法是通过测量培养基的光密度。一种常用的方法是测量600nm波长时的光密度，称为OD600或OD。OD可以与特定培养基内生物的特定类型相关，但是OD和每体积中的微生物量之间的特定关系在所有培养基类型中的所有生物类型之间通常是不适用的。通过在一定范围的细胞密度上测量OD和细胞干重可以形成校准曲线。在某些情况中，相同或相似的微生物在相同或相似培养基中的不同发酵可以使用这些相关性。 
另一方面，本发明提供一种方法，包括以下步骤：(i)在以下条件下进行包括发酵培养基和多种遗传修饰的宿主细胞的发酵反应，所述遗传修饰的宿主细胞产生类异戊二烯，其反应条件使得(a)发酵培养基保持在低于为宿主细胞提供最大比生长速率的温度的温度下；(b)发酵培养基中碳源的含量低于提供宿主细胞的最大比生长速率的含量；和/或(c)发酵培养基中氮源的含量低于提供宿主细胞的最大比生长速率的含量；(ii)在(a)至(c)中所述的一个或多个条件下回收类异戊二烯。在一个实施方案中，发酵反应在条件(a)下进行。在另一实施方案中，发酵反应在条件(a)和(b)下进行。在另一实施方案中，发酵反应在(a)、(b)和(c)的条件下或者在它们的任意其它组合下进行。 
利用此处所述的方法，宿主细胞产生每升发酵反应混合物大约10克以上的类异戊二烯(10g/L)。在其它实施方案中，产生大约15g/L以上、大约20g/L以上、25g/L以上，或者产生大约30g/L以上的类异戊二烯。
在另一实施方案中，宿主细胞产生每克干宿主细胞大约50毫克以上的类异戊二烯(50毫克/克细胞干重)。在其它实施方案中，产生每克干宿主细胞大约100毫克以上、每克干宿主细胞大约150毫克以上、每克干宿主细胞大约200毫克以上、每克干宿主细胞大约250毫克以上、每克干宿主细胞大约500毫克以上、每克干宿主细胞大约750毫克以上、或者每克干宿主细胞大约1000毫克以上的类异戊二烯。 
在其它实施方案中，无论是以克每升计还是以毫克每克细胞干重计，生产水平都在不到大约150小时内实现，优选在不到大约96小时，或者甚至不到大约72小时内实现。 
合适的类异戊二烯的非限制性例子包括：半萜类(由1个异戊二烯单元衍生)，如异戊二烯；单萜类(由2个异戊二烯单元衍生)，如月桂烯；倍半萜类(由3个异戊二烯单元衍生)，如紫穗槐-4，11-二烯；二萜类(由4个异戊二烯单元衍生)，如紫杉二烯；三萜类(由6个异戊二烯单元衍生)，如鲨稀；四萜类(由8个类异戊二烯衍生)，如β-胡萝卜素；和多萜类(由8个以上的异戊二烯单元衍生)，如多异戊二烯。在某些实施方案中，类异戊二烯不是类胡萝卜素。在其它实施方案中，类异戊二烯是C5-C20类异戊二烯。 
尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但是上述描述只是用于说明，而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和改变对于本发明所属领域的技术人员来说是显而易见的。 
实施例
除非另外说明，本发明的实施可以使用生物合成工业等的常规技术，这些技术在本领域技术之内。这些技术在此没有充分描述，可以在科学文献中找到大量的参考。 
在下面的实施例中，尽力在使用的数字方面(例如含量、温度等)确保精确性，但是可以包括变化和偏离，如果此处记载的数字中存在笔误，本发明所属领域的技术人员能够根据本文其余的公开内容 推断出正确的量。除非另外说明，温度以摄氏度表示，压力处于或接近海平面处的大气压。除非另外说明，所有试剂都可以商购获得。下面的实施例只是用于说明目的，不是限制本发明的范围。 
实施例1
该实施例描述了制备表达质粒的方法，该表达质粒编码酶，包括在操纵子中组织的来自酿酒酵母的MEV途径的酶。 
表达质粒pMevT是通过将MevT操纵子(SEQ ID NO：1)插入到pBAD33载体中产生的。MevT操纵子编码一组MEV途径酶，这些酶一起将普遍存在的前体乙酰-CoA转化为(R)-甲羟戊酸，即乙酰乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶。MevT操纵子通过从大肠杆菌基因组DNA PCR扩增atoB基因的编码序列(GenBank登录号NC_000913 REGION：2324131..2325315)(编码乙酰乙酰-CoA硫解酶)、从酿酒酵母基因组DNA扩增ERG13基因的编码序列(GenBank登录号X96617，REGION：220..1695)(编码HMG-CoA合成酶)、以及从酿酒酵母基因组DNA扩增HMG1基因编码区的片段(GenBank登录号M22002，REGION：1660..3165)(编码截短的HMG-CoA还原酶(tHMGR))而产生。用于扩增HMG1基因片段的上游PCR引物包含人工起始密码子。扩增的片段利用重叠延伸(SOEing)剪接在一起，在此过程中在atoB和ERG13编码序列之后引入加工核糖体结合位点。添加3’A突出端后，将MevT操纵子连接到TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)内并测序，以确保精确性。然后将MevT操纵子连接到载体pBAD33(Guzman等人.(1995)J.Bacteriol.177(14)：4121-4130)的XmaI PstI限制酶切位点内。为了将操纵子置于PLac启动子的控制之下，将pBAD33的araC-PBADNsiI-XmaI片段替换为pBBR1MCS的NsiI-XmaI片段，产生表达质粒pMevT(参见美国专利号7,192,751)。 
表达质粒pAM36-MevT66是通过将MevT66操纵子插入到pAM36载体中而产生的。通过将含有AscI-SfiI-AsiSI-XhoI-PacI-FsIl-PmeI限制酶切位点的寡核苷酸盒插入 到pACYC184载体(GenBank登录号XO6403)中并且除去pACYC184中的tet抗性基因产生载体pAM36。使用核苷酸序列SEQ ID NO：1作为模板合成产生MevT66操纵子，其含有来自大肠杆菌的atoB基因(GenBank登录号NC_000913 REGION：2324131..2325315)、来自酿酒酵母的ERG13基因(GenBank登录号X96617，REGION：220..1695)和截短形式的来自酿酒酵母的HMG1基因(GenBank登录号M22002，REGION：1777..3285)，所有这些三种序列都针对在大肠杆菌中表达进行了密码子优化。合成产生的MevT66操纵子的侧翼为5’EcoRI限制酶切位点和3’Hind III限制酶切位点，并且因此能够被克隆到克隆载体如标准pUC或pACYC来源的载体的相匹配的限制酶切位点中。从该构建体PCR扩增MevT66操纵子，其具有侧翼SfiI和AsiSI限制酶切位点，使用SfiI和AsiSI限制酶消化扩增的DNA片段至完全，反应混合物通过凝胶电泳分离，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Valencia，CA)凝胶提取大约4.2kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到pAM36载体的SfiI AsiSI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM36-MevT66。 
表达质粒pAM25是通过将MevT66操纵子插入到pAM29载体内而产生的。通过将来自pZS24-MCS1(Lutz和Bujard(1997)NuclAcids Res.25：1203-1210)的p15A复制起点和kan抗性基因与寡核苷酸产生的lacUV5启动子装配产生载体pAM29。包含MevT66操纵子(见上)的DNA合成构建体使用EcoRI和Hind III限制酶消化完全，将反应混合物通过凝胶电泳分离，凝胶提取4.2kb DNA片段，将分离的DNA连接到pAM29的EcoRI HindIII限制酶切位点内，产生表达质粒pAM25。 
表达质粒pMevB-Cm是通过将MevB操纵子插入到pBBR1MCS-1载体内而产生的。MevB操纵子编码一组一起将(R)-甲羟戊酸转化为IPP的酶，即甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸羧化酶。MevB操纵子的产生是通过从酿酒酵母基因组DNA中PCR扩增ERG12基因的编码序列(GenBank登录号X55875，REGION：580..1911)(编码甲羟戊酸激酶)、ERG8基因(GenBank登录号Z49939， REGION：3363..4718)(编码磷酸甲羟戊酸激酶)和MVD1基因(GenBank登录号X97557，REGION：544..1734)(编码甲羟戊酸焦磷酸羧化酶)，利用重叠延伸(SOEing)将PCR片段剪接在一起。通过选择合适的引物序列，在扩增过程中将ERG12和ERG8的终止密码子从TAA改变为TAG，以引入核糖体结合位点。在添加3’A突出端后，将MevB操纵子连接到TA克隆载体pCR4(Invitrogen，Carlsbad，CA)内。通过用PstI限制酶消化克隆构建体切下MevB操纵子至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.2kb DNA片段，并且将分离的DNA片段连接到载体pBBR1MCS-1(Kovach等人，Gene166(1)：175-176(1995))的PstI限制酶切位点内，产生表达质粒pMevB-Cm。 
表达质粒pMBI是通过将MBI操纵子插入到pBBR1MCS-3载体内而产生的。MBI操纵子编码与MevB操纵子相同的酶，以及将IPP转化为DMAPP的异戊烯焦磷酸酶异构酶。MBI操纵子的产生是通过使用在5′末端含有XmaI限制酶切位点的引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增idi基因的编码序列(GenBank登录号AF119715)，使用XmaI限制酶消化扩增的DNA片段至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取0.5kb片段，并且将分离的DNA片段连接到表达质粒pMevB-Cm的XmaI限制酶切位点内，从而将idi置于MevB操纵子的3′末端。将MBI操纵子亚克隆到载体pBBR1MCS-3(Kovach等人，Gene166(1)：175-176(1995))的SalI和SacI限制酶切位点内，产生表达质粒pMBI(参见美国专利7,192,751)。 
表达质粒pMBIS是通过将ispA基因插入到pMBI内而产生的。ispA基因编码催化两分子IPP与一分子DMAPP缩合生成法尼焦磷酸(FPP)的法尼焦磷酸合成酶。使用含有SacH限制酶切位点的正向引物和含有SacI限制酶切位点的反向引物从大肠杆菌基因组DNA中PCR扩增ispA基因的编码序列(GenBank登录号D00694，REGION：484..1383)。用SacII和SacI限制酶消化扩增的PCR产物至完全，反应混合物通过凝胶电泳分离，凝胶提取0.9kb DNA片段。将分离的DNA片段连接到pMBI的SacII SacI限制酶切位点内，从而将ispA基 因置于idi和MevB操纵子的3’，并且产生表达质粒pMBIS(参见美国专利7,192,751)。 
表达质粒pMBIS-gpps来源于表达质粒pMBIS，是通过将ispA编码序列置换为编码香叶基二磷酸合成酶(“gpps”)的核苷酸序列而产生的。含有编码香叶基二磷酸合成酶的核苷酸序列的DNA片段使用为了在大肠杆菌中表达而进行了密码子优化的拟南芥gpps基因的编码序列(GenBank登录号Y17376，REGION：52..1320)作为模板通过合成方法产生。该核苷酸序列的侧翼为前导SacII限制酶切位点和末端SacI限制酶切位点，并且可以被克隆到克隆载体如标准pUC或pACYC来源的载体的相匹配的限制酶切位点内。合成产生的香叶基二磷酸合成酶序列通过用SacH和SacI限制酶消化DNA合成构建体至完全而分离，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约1.3kb DNA片段，并将分离的DNA片段连接到表达质粒pMBIS的SacH SacI限制酶切位点内，产生表达质粒pMBIS-gpps(质粒图见图3)。 
表达质粒pAM45是通过将MBIS操纵子插入到pAM36-MevT66内并在两个操纵子之前添加lacUV5启动子而产生的。使用包含5’XhoI限制酶切位点和3’PacI限制酶切位点的引物从pMBIS PCR扩增MBIS操纵子。用XhoI和PacI限制酶消化扩增的PCR产物至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取5.4kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到pAM36-MevT66的XhoI PacI限制酶切位点内，产生质粒pAM43。由寡核苷酸合成含有编码lacUV5启动子的核苷酸序列的DNA片段，并亚克隆到pAM43的AscI SfiI和AsiSI XhoI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM45。 
实施例2
该实施例描述了制备表达载体的方法，该表达载体编码酶，包括在操纵子中组织的来自金黄色葡萄球菌的MEV途径酶。 
表达质粒pAM41来源于表达质粒pAM25，是通过将编码酿酒酵母HMG-CoA还原酶的HMG1基因的编码序列置换为金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶的mvaA基因的编码序列(GenBank登录号 BA000017，REGION：2688925..2687648)而产生的。使用引物4-49mvaA SpeI(SEQ ID NO：2)和4-49mvaAR XbaI(SEQ ID NO：3)，从金黄色葡萄球菌金黄亚种(ATCC70069)基因组DNA PCR扩增mvaA基因的编码序列，用SpeI限制酶消化扩增的DNA片段至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约1.3kb DNA片段。通过用HindIII限制酶消化质粒至完全从pAM25中分离出HMG1编码序列。得到的线性DNA片段的末端突出端用T4DNA聚合酶变成平端。然后用SpeI限制酶部分消化该DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.8kb DNA片段。将分离的DNA片段与SpeI-消化的mvaAPCR产物连接，产生表达质粒pAM41。pAM41中所含的atoB(opt)：ERG13(opt)：mvaA操纵子的核苷酸序列为SEQ ID NO：41。 
表达质粒pAM52来源于表达质粒pAM41，是通过将编码酿酒酵母HMG-CoA还原酶的ERG13基因的编码序列置换为金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶的mvaS基因的编码序列(GenBank登录号BA000017，REGION：2689180..2690346)而产生的。ERG13也被称为HMGS或HMG-CoA合成酶。使用引物HMGS5’Sa mvaS-S(SEQ IDNO：4)和HMGS3’Sa mvaS-AS(SEQ ID NO：5)从金黄色葡萄球菌金黄亚种(ATCC 70069)基因组DNA PCR扩增mvaS基因的编码序列，按照Geiser等人的方法(BioTechniques 31：88-92(2001))，使用扩增的DNA片段作为PCR引物，代替pAM41中的HMG1基因的编码序列，产生表达质粒pAM52。pAM52中所含的atoB(opt)：mvaS：mvaA操纵子的核苷酸序列为SEQ ID NO：42。 
表达质粒pAM97来源于表达质粒pAM45，是通过将MevT66操纵子置换为表达质粒pAM52的(atoB(opt)：mvaS：mvaA)操纵子而产生的。用AsiSI和SfiI限制酶消化表达质粒至完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取缺乏MevT66操纵子的8.3kb DNA片段。使用引物19-25atoB SfiI-S(SEQ ID NO：6)和19-25mvaA-AsiSI-AS(SEQ ID NO：7)PCR扩增pAM52的(atoB(opt)：mvaS：mvaA)操纵子，用SfiI和AsiSI限制酶消化PCR产物至完全，通过凝胶电泳分离反应 混合物，凝胶提取3.7kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到表达质粒pAM45的AsiSI SfiI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM97。 
表达质粒pAM97-MBI来源于表达质粒pAM97和pAM45，是通过将pAM97的MBIS操纵子替换为pAM45的MBI操纵子而产生的。使用引物9-70C(SEQ ID NO：8)和26-39B(SEQ ID NO：9)从pAM45PCR扩增MBI操纵子，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取4.5kb DNA片段，分离的DNA片段用SacI和XhoI限制酶消化完全。表达质粒pAM97用SacI和XhoI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取7.6kb片段，将分离的DNA片段与MBI操纵子PCR产物连接，产生表达质粒pAM97-MBI。 
表达质粒pAM97-MevB来源于表达质粒pAM97和pAM45，是通过将pAM97的MBIS操纵子替换为pAM45的MevB操纵子而产生的。使用引物9-70C(SEQ ID NO：8)和26-39A(SEQ ID NO：10)从pAM45PCR扩增MevB操纵子，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取3.9kb DNA片段，分离的DNA片段用SacI和XhoI限制酶消化完全。表达质粒pAM97用SacI和XhoI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取7.6kb片段，将分离的DNA片段与MevB操纵子PCR产物连接，产生表达质粒pAM97-MevB。 
表达质粒pAM128是通过将表达质粒pAM97的(atoB(opt)：mvaS：mvaA)和MBIS操纵子插入到含有RK2质粒复制、隔离和保持系统的载体内而产生的，其避免了对宿主细胞转化体的抗生素筛选的连续需要。RK2质粒用PstI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶分离含有整个par基因座的大约6.3kb DNA片段，将分离的DNA片段亚克隆到mini RK2复制子pRR10(Roberts等人.(1990)J Bacteriol.172(11)：6204-6216)的PstI限制酶切位点内，产生载体pAM132。表达质粒pAM97用AscI和Sacl限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约9.4kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到pAM132的MluI SacI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM128。
实施例3
该实施例描述了制备表达载体的方法，该表达载体编码酶，包括在操纵子中组织的来自粪肠球菌的MEV途径的酶。 
质粒pAM16是通过将粪肠球菌的mvaE基因的编码序列(GenBank登录号AF290092 REGION：1479..3890)(编码乙酰-CoA乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶(HMGR))插入到pBlueScripII-KS(+)载体中而产生的。使用5’磷酸化引物4-40mvaEF BamHI(SEQ ID NO：11)和4-40mvaERHindIII(SEQ ID NO：12)从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802)PCR扩增mvaE基因的编码序列。(注意引物4-40mvaEF BamHI把扩增的PCR产物中mvaE基因的起始密码子从TTG改变为ATG)。将得到的PCR产物连接到pBlueScripII-KS(+)(Stratagene，La Jolla，CA)的SmaI限制酶切位点，产生表达质粒pAM16。 
质粒pAM18是通过将粪肠球菌mvaS基因的编码序列(GenBank登录号AF290092 REGION：142..1293)(编码HMG-CoA合成酶(HMGS))插入到pBlueScripII-KS(+)载体中而产生的。使用5’磷酸化引物4-40mvaSF BglII(SEQ ID NO：13)和4-39mvaSR BamHI(SEQID NO：14)由粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802)PCR扩增mvaS基因的编码序列，将PCR产物连接到pBlueScripII-KS(+)(Stratagene，LaJolla，CA)的SmaI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM18。 
表达质粒pAM22是通过将表达质粒pAM16的mvaE基因的编码序列插入到pZE21-PL-lacO1载体内而产生的。载体pZE21-PL-lacO1是载体pZE21-MCS-1的衍生物，其中tet启动子被置换为PL-lacO1启动子(Lutz和Bujard(1997)Nucl Acids Res.25：1203-1210)。表达质粒pAM16用BamHI和HindIII限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有mvaE编码序列的大约2.4kb DNA片段，将分离的DNA片段插入到pZE21-PL-lacO1的BamHI HindIII限制酶切位点内，产生表达质粒pAM22。 
表达质粒pAM33是通过将表达质粒pAM18的mvaS基因的编码 序列插入到表达质粒pAM22中而产生的。表达质粒pAM18用BglII和BamHI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有mvaS基因的编码序列的大约1.2kb DNA片段，将分离的DNA片段插入到表达质粒pAM22的BamHI位点内，产生表达质粒pAM33。 
表达质粒pAM34是通过将表达质粒pAM33的mvaS-mvaE操纵子插入到载体pAM29内而产生的。通过用EcoRI限制酶部分消化pAM33分离mvaS-mvaE操纵子，用MluI限制酶消化得到的线性DNA片段，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约3.6kbDNA片段。通过用MluI和EcoRI限制酶将表达载体pAM25消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，并且凝胶提取大约2.1kb DNA片段，由此获得pAM29的载体骨架。连接两条分离的DNA片段，产生表达质粒pAM34。 
实施例4
该实施例描述了制备表达质粒的方法，该表达质粒编码酶，包括在操纵子中组织的来自大肠杆菌的DXP途径酶。 
表达质粒pAM408是通过将编码“上”DXP途径酶的基因插入到pAM29载体内而产生的。“上”DXP途径的酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(由大肠杆菌dxs基因编码)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(由大肠杆菌dxr基因编码)、4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(由大肠杆菌ispD基因编码)和4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(由大肠杆菌ispE基因编码)，它们一起将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变为4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。含有编码“上”DXP途径的酶的核苷酸序列的DNA片段是如下产生的：使用SEQ ID NOS：15-18所示的PCR引物从大肠杆菌DH1株(ATCC#33849)PCR扩增dxs(GenBank登录号U00096 REGION：437539..439401)、dxr(GenBank登录号U00096 REGION：193521..194717)、ispD(GenBank登录号U00096 REGION：2869803..2870512)和ispE(GenBank登录号U00096 REGION 1261249..1262100)基因的编码序列，其中添加有最佳Shine Dalgarno序列和5’和3’限制酶切位点。PCR产物通过凝胶电泳分离，用Qiagen(Valencia，CA)凝胶纯化试剂盒凝胶提取，用适当的限制酶(XhoI和KpnI用于含有dxs基因的PCR产物；KpnI和ApaI用于含有dxr基因的PCR产物；ApaI和NdeI用于含有ispD基因的PCR产物；NdeI和MluI用于含有ispE基因的PCR产物)消化完全，并用Qiagen(Valencia，CA)PCR纯化试剂盒纯化。然后将大致等摩尔量的各种PCR产物添加到连接反应中，将各基因装配为操纵子。从该连接反应中取1μl反应混合物PCR扩增2个单独的基因盒，即dxs-dxr和ispD-ispE基因盒。dxs-dxr基因盒用引物67-1A-C(SEQ ID NO：15)和67-1D-C(SEQ ID NO：18)PCR扩增，ispD-ispE基因盒用67-1E-C(SEQ ID NO：19)和67-1H-C(SEQ ID NO：22)引物PCR扩增。两种PCR产物通过凝胶电泳分离，并且凝胶提取。含有dxs-dxr基因盒的PCR产物用XhoI和ApaI限制酶消化完全，含有ispD-ispE基因盒的PCR产物用ApaI和MluI限制酶消化完全，纯化两种PCR产物。载体pAM29用SalI和MluI限制酶消化完全，将两种消化的含有“上”DXP途径操纵子的PCR产物连接到pAM29载体的SalI MluI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM408(质粒图见图4)。 
表达质粒pAM409是通过将编码“下”DXP途径的酶的基因插入到pAM369载体内而产生的。“下”DXP途径的酶包括2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合成酶(由大肠杆菌ispF基因编码)，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶(由大肠杆菌ispG基因编码)和异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶(由大肠杆菌ispH基因编码)，它们一起将4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸转变为IPP和DMAPP。IPP也通过异戊基二磷酸异构酶(由大肠杆菌idi基因编码)的活性被转化为DMAPP。DMAPP可以通过法尼基二磷酸合成酶(由大肠杆菌ispA基因编码)的活性进一步转化为FPP。编码“下”DXP途径的酶以及异戊基二磷酸异构酶和法尼基二磷酸合成酶的操纵子是如下产生的：使用适当的PCR引物从大肠杆菌DH1株(ATCC #33849) PCR扩增ispF(GenBank登录号U00096 REGION：2869323..2869802)、ispG(GenBank登录号U00096 REGION：2638708..2639826)、ispH(GenBank登录号U00096 REGION：26277..27227)、idi(GenBank登录号AF119715)和ispA(GenBank登录号D00694 REGION：484..1383)基因，它们添加有最佳SD序列和5’和3’限制酶切位点。PCR产物通过凝胶电泳分离，凝胶提取，用适当的限制酶消化(BamHI和ApaI用于包含ispF基因的PCR产物；KpnI和ApaI用于包含ispG基因的PCR产物；SalI和KpnI用于包含ispH基因的PCR产物；SalI和HindIII用于包含idi基因的PCR产物；HindIII和NcoI用于包含ispA基因的PCR产物)，并纯化。然后将大致等摩尔量的各种PCR产物添加到连接反应中，将各基因装配为操纵子。从该连接反应中取1μl反应混合物PCR扩增2个单独的基因盒，即ispF-ispG和the ispH-idi-ispA基因盒。ispF-ispG基因盒用引物67-2A-C(SEQ ID NO：23)和67-2D-C(SEQ ID NO：26)PCR扩增，ispH-idi-ispA基因盒用67-2E-C(SEQ ID NO：27)和67-2J-C(SEQ IDNO：32)引物PCR扩增。两种PCR产物通过凝胶电泳分离，并且凝胶提取。含有ispF-ispG基因盒的PCR产物用BamHI和KpnI限制酶消化完全，含有ispH-idi-ispA基因盒的PCR产物用KpnI和NcoI限制酶消化完全，纯化两种PCR产物。通过装配来自pAM29的p15A复制起点和来自pZE12-luc(Lutz和Bujard(1997)NuclAcids Res.25：1203-1210)的用于氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因与寡核苷酸产生的lacUV5启动子，产生载体pAM369。载体pAM369用BamHI和NcoI限制酶消化完全，将两种含有“下”DXP途径操纵子的分离的PCR产物连接到pAM369载体的BamHI NcoI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM409。 
表达质粒pAM424是表达质粒pAM409的一种衍生物，含有宽宿主范围的RK2复制起点，它是通过将pAM409的lacUV5启动子和ispFGH-idi-ispA操纵子转移到pAM257载体内而产生的。载体pAM257如下产生：使用引物9-156A(SEQ ID NO：33)和9-156B (SEQ ID NO：34)从RK2质粒DNA(Meyer等人.(1975)Science190：1226-1228)PCR-扩增RK2par基因座，2.6kb PCR产物用AatII和XhoI限制酶消化完全，将DNA片段连接到含有来自载体pZA31-luc(Lutz和Bujard(1997)NuclAcids Res.25：1203-1210)的p15复制起点和氯霉素抗性基因的质粒内，产生质粒pAM37-par；pAM37-par用限制酶SacI和HindIII消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有RK2par基因座和氯霉素抗性基因的DNA片段，将分离的DNA片段连接到mini-RK2复制子pRR10(Roberts等人.(1990)JBacteriol.172：6204-6216)的SacI HindIII位点内，产生载体pAM133；pAM133用BglII和HindIII限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约6.4kb的缺乏氨苄青霉素抗性基因和oriT接合起点的DNA片段，将分离的DNA片段与合成产生的DNA片段连接，该DNA片段含有多克隆位点，其中含有PciI和XhoI限制酶切位点，产生载体pAM257。表达质粒pAM409用XhoI和PciI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约4.4kb DNA片段。载体pAM257用限制酶XhoI和PciI消化完全，将含有lacUV5启动子和ispFGH-idi-ispA操纵子的分离的DNA片段连接到pAM257载体的XhoI PciI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM424(质粒图见图5)。 
实施例5
该实施例描述了制备编码将FPP转化为GPP的酶的表达质粒的方法。 
表达质粒pTrc99A-ADS是通过将编码紫穗槐-4，11-二烯合成酶(“ADS”)的核苷酸序列插入到载体pTrc99A内而产生的。紫穗槐-4，11-二烯合成酶序列通过合成产生，因此在翻译后其氨基酸序列与Merke等人.(2000)Ach.Biochem.Biophys.381：173-180所述的相同，因此编码紫穗槐-4，11-二烯合成酶的核苷酸序列为了在大肠杆菌中表达而优化，并且核苷酸序列的侧翼为5’NcoI和3’XmaI限制酶切位点(参见美国专利7,192,751)。核苷酸序列用NcoI和XmaI限制酶消化完全， 通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取大约1.6kb DNA片段，将分离的DNA片段插入到pTrc99A载体(Amman等人.(1985)Gene40：183-190)的NcoI XmaI限制酶切位点内，产生表达质粒pTrc99A-ADS(质粒图见图6)。 
表达质粒pAM113是pTrc99A-ADS的氯霉素抗性衍生物。它是如下产生的：使用5’-磷酸化引物19-137cml-pAM37-AS(SEQ ID NO：35)和19-137cml-pAM37-S(SEQ ID NO：36)从载体pZA31-luc(Lutz和Bujard(1997)NuclAcids Res.25：1203-1210)PCR扩增氯霉素抗性基因，并将920bp PCR产物插入到表达质粒pTrc99A-ADS的FspI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM113。 
表达质粒pC9是通过将含有nudF基因编码序列和上游基因组序列的枯草杆菌6051的基因组DNA片段(GenBank登录号Z99116REGION：49364..48548)插入到载体pTrc99A(Amann等人.(1988)Gene 69：301-315)内而产生的。表达质粒pNudF-H是通过将枯草杆菌6051 nudF基因的编码序列(GenBank登录号Z99116 REGION：49105..48548)插入到载体pTrc99A内而产生的。表达质粒pyhfR是通过将枯草杆菌6051 yhfR基因的编码序列(GenBank登录号Z99109REGION：97583..97002)插入到载体pTrc99A内而产生的。 
表达质粒pAM373是通过将为了在大肠杆菌中表达而进行了密码子优化的、编码黄花蒿的β-法尼烯合成酶(“FSB”)的核苷酸序列(GenBank登录号AY835398)插入到pTrc99A载体内而产生的。通过合成产生编码β-法尼烯合成酶的核苷酸序列，并且使用适当的引物通过PCR从其DNA合成构建体扩增。为了在含有β-法尼烯合成酶编码序列的PCR产物中产生前导NcoI限制酶切位点，将5’PCR引物(SEQ ID NO：37)中编码原多肽序列中的第二氨基酸的密码子(编码丝氨酸的TCG)替换为编码天冬氨酸的密码子(GAC)。得到的PCR产物用NcoI限制酶部分消化，并且用SacI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有β-法尼烯合成酶编码序列的大约1.7kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到pTrc99A载体的NcoI SacI限制酶切位点内，产生表达质粒pAM373(质粒图见图6)。 
表达质粒pTrc99A-FSA、pTrc99A-GTS、pTrc99A-PS、pTrc99A-TS是通过将含有编码α-法尼烯合成酶(“FSA”)、γ-萜品烯合成酶(“GTS”)、α-蒎烯合成酶(“APS”)或萜品油烯合成酶(“TS”)的核苷酸序列的DNA片段插入到pTrc99A载体中而产生的。DNA片段插入片段是合成产生的，例如，使用欧洲云杉的α-法尼烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AY473627，REGION：24..1766)、黄花蒿的β-法尼烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AY835398)、柠檬的γ-萜品烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AF514286 REGION：30..1832)、北美冷杉(GenBank登录号U87909，REGION：6..1892)或火炬松(Pinus taeda)(GenBank登录号AF543530 REGION：1..1887)的α-蒎烯合成酶基因的编码序列、或罗勒(GenBank登录号AY693650)或花旗松(Pseudotsuga menziesii)(GenBank登录号AY906866REGION：10..1887)或北美冷杉(GenBank登录号AF139206)的萜品油烯合成酶基因的编码序列作为模板，所有核苷酸序列都为了在大肠杆菌中表达进行了密码子优化。用于FSA的DNA片段使用引物序列SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40从其DNA合成构建体PCR扩增。得到的PCR产物使用NcoI和SacI限制酶消化完全，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有α-法尼烯合成酶编码序列的大约1.7kbDNA片段，将分离的DNA片段连接到pTrc99A载体的NcoI SacI限制酶切位点内，产生表达质粒pTrc99A-FSA(质粒图见图6)。用于GTS、APS和TS的DNA片段设计为侧翼为前导XmaI限制酶切位点和末端XbaI限制酶切位点，并且克隆到克隆载体如标准pUC或pACYC来源的载体的相匹配的限制酶切位点内，它们可以通过用XbaI和XmaI限制酶将DNA合成构建体消化完全再次从中释放，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取编码1.7-1.9萜合成酶的DNA片段。将分离的DNA片段连接到载体pTrc99A(Amman等人，Gene40：183-190(1985))的XmaI XbaI限制酶切位点内，产生质粒pTrc99A-GTS、pTrc99A-APS或pTrc99A-TS(质粒图见图6)。
表达质粒pRS425-FSA和pRS425-FSB是通过将编码α-法尼烯合成酶(“FSA”)或β-法尼烯合成酶(“FSB”)的核苷酸序列分别插入到pRS425-Gall载体(Mumberg等人.(1994)Nucl.Acids.Res.22(25)：5767-5768)内而产生的。核苷酸序列插入片段是合成产生的，例如使用欧洲云杉的α-法尼烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AY473627，REGION：24..1766)或黄花蒿的β-法尼烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AY835398)作为模板，并且为了在酿酒酵母中表达进行了密码子优化。合成产生的核苷酸序列的侧翼为5’BamHI位点和3’XhoI位点，因此能够被克隆到克隆载体如标准pUC或pACYC来源的载体的相匹配的限制酶切位点内。合成产生的核苷酸序列通过使用BamHI和XhoI限制酶将DNA合成构建体消化完全进行分离，通过凝胶电泳分离反应混合物，凝胶提取含有α-法尼烯合成酶或β-法尼烯合成酶编码序列的大约1.7kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到pRS425-Gall载体的BamHI XhoI限制酶切位点内，分别产生表达质粒pRS425-FSA或pRS425-FSB。 
表达质粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS是通过将编码芳樟醇合成酶(“LLS”)、苧烯合成酶(“LMS”)、β-蒎烯合成酶(“BPS”)、β-水芹烯(“PHS”)、蒈烯合成酶(“CS”)或桧烯(sabinine)合成酶(“SS”)的核苷酸序列插入到pTrc99A载体内而产生的。核苷酸序列插入片段是合成产生的，例如，使用黄花蒿的芳樟醇合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AF154124，REGION：13..1764)、北美冷杉的苧烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AF006193REGION：73..1986)、黄花蒿的β-蒎烯合成酶的编码序列(GenBank登录号AF276072 REGION：1..1749)、北美冷杉的β-水芹烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AF139205REGION：34..1926)、Salvia stenophylla的蒈烯合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AF527416 REGION：78..1871)、或药用鼠尾草的桧萜合成酶基因的编码序列(GenBank登录号AF051901REGION：26..1798)作为模板。编码β-蒎烯、桧烯和β-水芹烯合成酶 的核苷酸序列的侧翼为前导XmaI限制酶切位点和末端XbaI限制酶切位点，编码芳樟醇和蒈烯合成酶的核苷酸序列的侧翼为前导NcoI限制酶切位点和末端XmaI限制酶切位点，编码苧烯合成酶的核苷酸序列的侧翼为前导NcoI限制酶切位点和末端PstI限制酶切位点。DNA合成构建体用XmaI和XbaI(用于β-蒎烯、桧烯和β-水芹烯合成酶构建体)、NcoI和XmaI限制酶(用于芳樟醇和蒈烯合成酶构建体)或XbaI和PstI限制酶(用于苧烯合成酶构建体)消化完全。反应混合物通过凝胶电泳分离，凝胶提取大约1.7-1.9kb DNA片段，将分离的DNA片段连接到pTrc99A载体的XmaI XbaI限制酶切位点(用于β-蒎烯、桧烯和β-水芹烯合成酶插入片段)、NcoI XmaI限制酶切位点(用于芳樟醇和蒈烯合成酶插入片段)或XbaI PstI限制酶切位点(用于苧烯合成酶插入片段)内，产生表达质粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS和pTrc99A-SS(质粒图见图6)。 
实施例6
该实施例描述了在本发明中有用的大肠杆菌宿主菌株的产生。 
如表1所述，通过用一种或多种实施例1至5的表达质粒转化化学感受态大肠杆菌亲本细胞产生宿主菌株。 
表1.大肠杆菌宿主菌株 
Figure G2007800193534D00621
Figure G2007800193534D00631
在含有如表1详述的抗生素的Luria Bertoni(LB)琼脂上筛选宿主细胞转化体。将单菌落从LB琼脂转移到含有5mL LB液体培养基和抗生素的培养管中。B003、B617、B618、B619、B650、B651、B652和B653宿主细胞转化体在30℃下在250rpm旋转摇床上温育 30小时。所有其它宿主细胞转化体在37℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到生长达到稳定期。通过用含有0.8％葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培养基(M9-MOPS培养基的组成见表2)将细胞连续传代4-5轮，使细胞适应基本培养基。将细胞以由400uL无菌50％甘油和600uL液体培养物组成的1mL储备液等份在冷冻管中贮存在-80℃下。 
表2-M9-MOPS培养基的组成 
  
成分 量(每L)
Na2HPO47H2O 12.8g
KH2PO4 3g
NaCl 0.5g
NH4Cl 1g
MgSO4 2mmol
CaCl2 0.1mmol
硫胺 0.1ug
MOPS缓冲液pH7.4 100mmol
(NH3)6Mo7O244H2O 3.7ug
H3BO4 25ug
CoCl2 7.1ug
CuSO4 2.4ug
MnCl2 16ug
ZnSO4 2.9ug
FeSO4 0.28mg
实施例7
该实施例证实了在不含抗生素的条件下表达质粒在携带包含RK2质粒复制、隔离和保持系统的表达质粒的大肠杆菌宿主菌株中的稳定性。 
通过将菌株的储备液等份添加到含有40mL M9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并 且使培养物生长过夜，建立宿主菌株B255的种子培养物。 
在初始OD600为大约0.05时，用种子培养物接种两个各自含有40mL M9-MOPS培养基、2％葡萄糖和0.5％酵母提取物的250mL摇瓶。1号培养物还含有100ug/mL羧苄青霉素和34ug/mL氯霉素。2号培养物不接受任何抗生素。两种培养物都在37℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD600，此时通过向培养基中加入40uL1M IPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4，11-二烯的产生。诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖层，以捕获紫穗槐-4，11-二烯。在总共72小时的时间内定时采样。2个培养物中宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯如实施例10所述通过GC/MS证实。 
为了评价质粒在两种细胞培养物中的稳定性，在72小时时取每种培养物的样品，在LB琼脂平板(不含抗生素)上划线。在37℃下过夜温育后，将来自每个培养物的50个菌落复制接种到LB琼脂+抗生素(34ug/mL氯霉素、100ug/mL羧苄青霉素)平板上和LB琼脂减抗生素(不含抗生素)平板上。在37℃下再过夜温育后，LB琼脂+抗生素和LB琼脂减抗生素平板均发现含有大约50个菌落，表明在培养基中存在和不存在抗生素的情况下，质粒保留均接近100％。 
实施例8
该实施例证实了在大肠杆菌宿主菌株中粪肠球菌HMGR比酿酒酵母tHMGR提高的比活性和稳定性。 
宿主菌株B61和B62的种子培养物如下建立：将每个菌株的储备液等份加入到含有20mL M9-MOPS培养基、0.8％葡萄糖和如表5所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长至饱和。种子培养物以1:100稀释到500mL烧瓶中的140mL新鲜培养基中，再生长到OD550大约为0.1，此时向每个培养物中加入140uL1M IPTG诱导紫穗槐-4，11-二烯的产生。在诱导后4、12、20、28、36和49小时，从每个培养物中采样，离心沉淀细胞。细胞沉淀物在干冰上骤冻，然后贮存在-80℃。 
为了进行酶测定，在冰上融化细胞沉淀物，然后用含有蛋白酶抑 制剂混合物#3(Calbiochem，San Diego，CA)、benzonase(20μL oer5mL bugbuster；Novagen，Madison，WI)和溶菌酶(30ug/mL)的Bugbuster(Novagen，Madison，WI)裂解。酿酒酵母tHMGR的酶活性在50mMTris HCl(pH7.5)、0.2mM NADPH(Sigma，St.Louis，MO)和0.3mMDL-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)钠盐(Sigma，St.Louis，MO)中测定。通过加入细胞裂解液开始测定，根据340nM处的吸光度监测NADPH的消失。为了说明NADPH的非特异性消失，从试验样品中获得的结果中减去缺乏HMG-CoA的对照试验中获得的结果。类似地测定粪肠球菌HMGR的酶活性，不同之处在于测定缓冲液含有100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)、0.4mM NADPH、1.0mM EDTA和100mM KCl。 
蛋白质测定利用Bradford((1976)AnalBiochem.72：248-254)的方法进行。比活性计算为Δnmol NADPH/min/mg蛋白质。 
如图8所示，与酿酒酵母tHMGR相比，粪肠球菌HMGR显示较高的比活性和提高的稳定性。 
实施例9
该实施例描述了用细胞干重(“DCW”)对OD600的校正。 
为了获得DCW和OD600之间的关系，代表性菌株B32在类似于实施例10-14中所述的高细胞密度过程中生长。在整个运行期间采样，测定每个样品的OD600和DCW。为了确定DCW，将细胞沉淀并弃去上清液。细胞沉淀物用水洗一次，然后在80℃烤箱中干燥至少3天。将含有细胞沉淀物的试管称重，从称得的重量中减去试管的重量，剩余的重量除以每个样品的初始体积(0.0015L)，得到DCW。 
图9显示在这些实验中测量的DCW和OD600之间的关系。 
实施例10
该实施例证实了紫穗槐-4，11-二烯在表达金黄色葡萄球菌HMGR和HMGS的大肠杆菌宿主菌株中比在表达酿酒酵母tHMGR和HMGS的宿主菌株中的产量增加。 
通过将每个菌株的储备液等份加入到含有25mL M9-MOPS培养 基、0.8％葡萄糖和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜，由此建立宿主菌株B32、B153、B210、B282、B292、B86、B255和B256的种子培养物。 
在初始OD600大约为0.05时用种子培养物接种单独的含有40mLM9-MOPS培养基、2％葡萄糖和抗生素的250mL摇瓶。培养物在30℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD600，此时通过向培养基中加入40uL1M IPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4，11-二烯的产生。在培养物上覆盖8mL的有机覆盖层(例如，十二烷、油酸甲酯或肉豆蔻酸异丙酯)。有机覆盖层和培养液的样品每天采样一次，共72小时。利用培养液样品测量OD600。通过将5uL有机覆盖层转移到含有500uL掺有作为内标的β-或反式丁香烯的乙酸乙酯的干净玻璃瓶中，测定紫穗槐-4，11-二烯的浓度。 
有机覆盖物/乙酸乙酯样品在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上分析，只扫描两种离子：分子离子(204m/z)和189m/z离子，如Martin等人.(2001)Biotechnol.Bioeng.75：497-503所述。为了加快运行时间，改变温度程序和柱基质以达到最佳峰值分辨率和最短的总运行时间。利用DB-XLB柱(获自Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)和氦载气在GC上分离1μL样品。用于分析的温度程序如下：100℃0.75分钟，以60℃/分钟升高温度至300℃，于300℃保持0.5分钟。解析的样品用监测离子189和204m/z的Hewlett-Packard5973型质量选择检测器分析。以前的质谱证实紫穗槐-4，11-二烯合成酶的产物是紫穗槐-4，11-二烯，使用该GC方案，紫穗槐-4，11-二烯的保留时间为3.7分钟。使用β-或反式丁香烯作为定量的内标。基于纯化的紫穗槐-4，11-二烯(0.63-10mg/L KJF17-109-3)在加有丁香烯的乙酸乙酯中的定量校准曲线，利用内标与紫穗槐-4，11-二烯峰面积的比例，计算紫穗槐-4，11-二烯的滴度。 
如图10A和10B所示，与表达酿酒酵母tHMGR和HMGS的B32、B210、B255、B256和B292株相比，表达金黄色葡萄球菌HMGR和HMGS的B153和B282菌株产生水平升高的紫穗槐-4，11-二 烯。 
实施例11
该实施例证实了在亚最佳温度下生长的大肠杆菌宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯增多。 
将菌株的0.5mL储备液等份加入到含有50mL M9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且使培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上生长过夜。由此建立宿主菌株B32的种子培养物。 
在初始OD600大约为0.05时用种子培养物接种4个250mL摇瓶，每个均含有40mL发酵分批培养基(培养基组成见表6)、100mM MOPS缓冲液pH7.1和抗生素。培养物在30℃或37℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到0.18-0.22的OD600，此时通过向培养基中加入40uL1M IPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4，11-二烯的产生。在诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获紫穗槐-4，11-二烯。每天采样一次，如实施例10所述分析。 
如图11A和11B所示，30℃的发酵不影响细胞生长，但是导致大肠杆菌宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯的比产率增长接近50％。 
实施例12
该实施例证实了在限制碳源条件下生长的大肠杆菌宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯增多。 
用于发酵运行050608-1和050629-1的宿主菌株B32的种子培养物如下建立：将0.25uL菌株储备液等份加入到含有50mL M9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到OD600达到1-2。 
用于发酵运行060403-3的宿主菌株B32的种子培养物如下建立：将菌株的储备液等份加入到含有50mL M9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上温育过夜。在初始OD600约为1时用种子培养物接种含有50mL M9-MOPS培养基和抗生素的250mL摇瓶，培养物再次 在37℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到OD600达到3-5。 
对于所有发酵过程，KH2PO4、K2HPO43H2O、EDTA、柠檬酸和(NH4)2SO4都在生物反应器(2L Applikon Bioconsole ADI 1025s，具有ADI1010控制器，Applikon Biotechnology，Foster City，CA)中加热灭菌。将其余的培养基成分过滤除菌作为储备溶液，并且通过磁头板注射。表3显示了用于发酵运行050608-1和050629-1的最终的培养基组成。表4显示了用于发酵运行060403-3的最终的培养基组成。运行050608-1的开始体积为0.8L，050629-1的开始体积为1.2L，060403-3的开始体积为1L。所有运行都通过经磁头板注射50mL种子培养物进行接种。 
表3-用于发酵运行050608-1和050629-1的发酵培养基的组成 
  
成分 分批培养基(每L) 料液(每L)
葡萄糖 5g 590-650g
KH2PO4 4.2g -
K2HPO43H2O 15.7g -
柠檬酸 1.7g -
(NH4)2SO4 2g -
MgSO47H2O 1.2g 12g
EDTA 8.4mg 13g
CoCl26H2O 0.25mg 0.4mg
MnCl24H2O 1.5mg 2.35mg
CuCl22H2O 0.15mg 0.25mg
H3BO4 0.3mg 0.5mg
Na2MoO42H2O 0.25mg 0.4mg
Zn(CH3COO)22H2O 1.3mg 1.6mg
水合柠檬酸铁(III) 10.0mg 4.0mg
硫胺HCl 4.5mg -
羧苄青霉素 100ug 100ug
四环素 5ug 5ug
氯霉素 34ug 34ug
[0354] 表4-用于发酵运行060403-3的发酵培养基的组成 
  
成分 分批培养基(每L) 料液(每L)
葡萄糖 15g 650g
KH2PO4 4.2g -
K2HPO43H2O 15.7g -
柠檬酸 1.7g -
(NH4)2SO4 2g -
MgSO47H2O 1.2g 12g
EDTA 8.4mg 13mg
CoCl26H2O 2.5mg 4mg
MnCl24H2O 15mg 23.5mg
CuCl22H2O 1.5mg 2.5mg
H3BO4 3mg 5mg
Na2MoO42H2O 2.5mg 4mg
Zn(CH3COO)22H2O 13mg 16mg
水合柠檬酸Fe(III) 100mg 40mg
硫胺HCl 4.5mg -
羧苄青霉素 100ug 100ug
四环素 5ug 5ug
氯霉素 34ug 34ug
对于发酵运行050608-1(过量的碳)，在诱导时开始进料，手动调节进料速度，以提供图12C所示浓度的葡萄糖。对于发酵运行050629-1(碳限制)，根据表5所示的方案将物料运送到发酵罐中。对于发酵运行060403-3(最少的碳)，当初始葡萄糖丸(15g)耗尽并且溶解氧达到峰值时，自动开始进料。可达27.6g/hr的最大值，根据以下方程计算进料速度：
m s ( t ) = S ( t 0 ) μe μ ( t - t 0 )
μ＝0.12 
S(t0)＝15g 
其中t0是初始葡萄糖被消耗的时间。在达到最大速率时，葡萄糖进料限制为9.5g/hr的速率，并且在剩余的运行中保持恒定在该速率。 
表5-发酵运行050629-1的进料方案 
  
运行时间(小时) 葡萄糖进料速度(g/hr)
0 0
7 0.37
10 0.74
12 1.11
14 1.48
16 2.22
18 2.96
20 3.69
22 4.80
24 5.91
31 7.39
33 5.54
47 3.69
运行050608-1和050629-1在37℃下进行。生物反应器中的气流设置为1-2L/min；使用氢氧化铵和/或氢氧化钠将pH保持在7；开始的搅拌为500-600rpm；用止泡剂B(Sigma-Aldich，St.Louis，MO)控制泡沫；利用搅拌级联使溶解氧水平保持高于30％。培养5-6小时后，通过向运行050608-1加入0.8mL1M IPTG，以及向050629-1运行加 入1.2mL IPTG，诱导宿主细胞产生紫穗槐-4，11-二烯。诱导时，培养温度降至30℃。 
运行060403-3在30℃下进行。生物反应器中的气流设置为1-2L/min；使用氢氧化铵将pH保持在7。利用搅拌级联和氧富集使溶解氧水平保持高于30％。在OD600接近28时(接种19小时后)，通过加入1mL1M IPTG诱导宿主细胞产生紫穗槐-4，11-二烯。 
按照两个不同的方案捕获和提取紫穗槐-4，11-二烯。对于运行050608-1和050629-1，使废气通过含有200mL庚醇的气体洗涤器排出，由此捕获废气中存在的挥发性的紫穗槐-4，11-二烯。然后将庚醇稀释到乙酸乙酯中，直到样品中紫穗槐-4，11-二烯的浓度介于0.63mg/L和20mg/L之间。对于运行060403-3，在诱导时向发酵罐中加入200mL有机覆盖物在生物反应器中捕获紫穗槐-4，11-二烯。产物浓度如下测定：合并25uL培养液加有机覆盖物和975uL乙腈，在Fisher Vortex Genie2TM混合器(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY)上以最大速度振摇样品至少3分钟，通过离心从样品中除去细胞，用乙酸乙酯稀释乙腈溶液，直到样品中紫穗槐-4，11-二烯的浓度介于0.63和20mg/L之间。如实施例10所述通过GC/MS分析乙酸乙酯样品。 
如图12A和12B所示，发酵运行050608-1(过量的碳)分别导致低最大细胞密度和低紫穗槐-4，11-二烯产量，这至少部分与乙酸水平的相对快速增长有关(图12D)。相比而言，发酵运行050629-1(碳限制)导致紫穗槐-4，11-二烯产量提高(图12B)和乙酸产生的出现延迟。这些结果符合过量葡萄糖进料导致快速乙酸产生和早期细胞死亡的假说。 
发酵运行060403-3(最低碳)达到的进一步的葡萄糖限制导致超过100小时的低乙酸产生(图12D)，和显著较高的最大细胞密度和紫穗槐-4，11-二烯产量(图12A和12B)。 
实施例13
该实施例证实了在限制碳源条件下和亚最佳温度下生长的大肠杆 菌宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯增多。 
宿主菌株B153的种子培养物如下建立：将菌株储备液等份加入到含有50mL M9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到OD600达到3.5-4.5。 
建立2升的生物反应器(Biocontroller ADI 1010，具有BioconsoleADI1025，Applikon Biotechnology，Foster City，CA)，对于运行060403-3，除了菌株和诱导时间不同以外，以与实施例12所述相同的方式运行。 
通过向培养基中加入1mL1M IPTG诱导宿主细胞中紫穗槐-4，11-二烯的产生。在图13A所示的发酵运行中，在OD600接近2时诱导紫穗槐-4，11-二烯合成，而发酵罐仍然含有过量的葡萄糖。在图13B所示的发酵运行中，在OD600接近33时诱导紫穗槐-4，11-二烯合成，这在开始葡萄糖限制进料之后。 
按照两个不同的方案捕获和提取紫穗槐-4，11-二烯。对于图13A所示的发酵运行，使废气通过含有200mL庚醇的气体洗涤器排出，由此捕获废气中存在的挥发性的紫穗槐-4，11-二烯。然后用乙酸乙酯稀释庚醇，直到样品中紫穗槐-4，11-二烯的浓度介于0.63mg/L和20mg/L之间。对于图13B所示的发酵运行，通过在诱导时向发酵罐中加入200mL有机覆盖物捕获紫穗槐-4，11-二烯。 
从培养基中提取紫穗槐-4，11-二烯，包括合并25uL培养液和975uL乙腈，在Fisher Vortex Genie2TM混合器(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY)上以最大速度振摇样品至少3分钟，通过离心从样品中除去细胞，用乙酸乙酯稀释乙腈溶液，直到样品中紫穗槐-4，11-二烯的浓度介于0.63和20mg/L之间。如实施例10所述通过GC/MS分析乙酸乙酯样品。对于图13A所示的发酵运行，紫穗槐-4，11-二烯的总量是通过将废气中存在的量加上培养基中存在的量并用总和除以发酵罐体积而获得的。 
图13A中所示的发酵达到93的最大OD600和3.2g/L的最大紫穗 槐-4，11-二烯浓度。相反，图13B中所示的发酵达到245的最大OD600和15g/L的最大紫穗槐-4，11-二烯浓度。对于在两个培养中发现的培养生长和紫穗槐-4，11-二烯产生水平的差异，一种可能的解释是在图13A所示的发酵运行中，在消耗过量的葡萄糖之前诱导紫穗槐-4，11-二烯产生，并且由于甲羟戊酸途径中间物的毒性水平能够积累，未限制的葡萄糖可获得性导致了细胞死亡。在图13B所示的发酵运行中，葡萄糖输送后发生的诱导受到限制，这阻止了途径中间物的积累，导致更高的细胞密度和紫穗槐-4，11-二烯产生水平。 
实施例14
该实施例证实了在限制碳源和氮源条件下和亚最佳温度下生长的大肠杆菌宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯增多。 
宿主菌株B86的种子培养物如下建立：将菌株储备液等份加入到含有50mL M9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的250mL摇瓶中，并且将培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上温育，次日早晨在OD600接近1时亚培养到相同的培养基中，并在37℃和250rpm下再次生长，直到OD600为3-5. 
建立4个2L生物反应器(Biocontroller ADI1010，具有Bioconsole ADI 1025，Applikon Biotechnology，Foster City，CA)，对于运行060403-3，除了限制氮的运行在物料中不含硫酸铵以外，以与实施例12所述相同的方式运行。 
当开始时的葡萄糖丸(15g)耗尽并且溶解氧达到峰值时，自动启动具有6小时加倍时间的指数葡萄糖进料。最高达30.4g/hr的最大值，根据以下方程计算进料速度： 
m s ( t ) = S 0 μe μ ( t - t 0 )
μ＝0.12min-1
S0＝15g 
其中μ是比生长速率，t0是最初的葡萄糖丸被消耗的时间。在达到最大速率时，葡萄糖进料降为11.4g/hr的速率，并且在剩余的运行中保持恒定在该速率。在发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)中，当氨限制导致培养基中葡萄糖积累时，进一步减少 葡萄糖进料。 
发酵在降低的温度30℃下进行。生物反应器中的气流设置为1vvm；开始的搅拌为700rpm；用止泡剂B(Sigma-Aldich，St.Louis，MO)控制泡沫；利用搅拌级联(700-1,200rpm)和富氧使溶解氧水平保持在40％。在发酵运行060327-3(碳限制)中，用20％NH4OH使pH保持在7；在发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)中，开始时使用20％NH4OH，从72小时开始使用2.5N NaOH和10N NH4OH的50/50混合物，使pH保持在7，以进一步限制通往发酵罐的氨的量。 
在OD600接近30时通过向培养基中加入1mL1M IPTG诱导宿主细胞中产生紫穗槐-4，11-二烯。 
通过在培养基上覆盖10％(v/v)的有机覆盖物捕获紫穗槐-4，11-二烯。然后通过合并25uL培养液和975uL甲醛，在Fisher VortexGenie2TM混合器(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，NY)上以最大速度振摇样品至少15分钟，通过离心从样品中除去细胞，并向990uL含有10uL/L反式丁香烯的乙酸乙酯中加入10uL甲醇溶液，提取紫穗槐-4，11-二烯。 
如实施例10所述通过GC/MS分析样品。 
图14A-E显示来自发酵运行060327-3(碳限制)的数据。发酵产生16g/L的紫穗槐-4，11-二烯最大浓度(图14A)。宿主菌株的最大体积生产率大于200mg/L/h(图14B)。宿主菌株的最大比生产率>2mg/L/h/OD600(图14C)。培养基中氨的浓度在发酵运行开始时大约为30mM，在指数生长期加入料液后上升到大约76mM，运行的其余时间保持高于60mM(图14D)。达到的最大OD600大约为290(图14D)，对应于116g DCW/L。培养基中葡萄糖的浓度在不到20小时内从15g/L下降至低于1g/L，并且保持低水平(图14E)。乙酸水平在整个发酵过程中都很低(图14E)。 
图15A-E显示发酵运行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)的数据。发酵产生的紫穗槐-4，11-二烯最大浓度为约20g/L 至30g/L(图15A)。在所有三个发酵运行中，宿主菌株的最大体积生产率大于400mg/L/h(图15B)，这显著高于在不限制氮的发酵中获得的最大体积生产率(图14B)。对于所有运行，宿主菌株的最大比生产率>2mg/L/h/OD600，并且在整个运行中保持高水平(图15C)。在发酵运行开始时培养基中氨的浓度为大约35mM至50mM，在指数生长过程中加入料液后下降，在运行的其余时间保持低于10mM(图15D)。(氨水平低于发酵运行060327-3(图14D)是由于在料液中缺少氨，并且在用来保持pH的碱中氨减少。发酵运行060710-4和060619-5在运行结束时显示氨浓度峰值，但是峰值出现在紫穗槐-4，11-二烯大量生产之后)。达到的最大OD600为170-220(图15D)，对应于68g-88g DCW/L。培养基中葡萄糖的浓度在不到20小时内从15g/L下降至低于1g/L，并且保持低水平(图15E)。乙酸水平在整个发酵过程中都很低(图15E)。 
实施例15
该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中通过DXP途径产生紫穗槐-4，11-二烯。 
宿主菌株B003、B617、B618和B619的种子培养物如下建立：将每种菌株的储备液等份加入到含有25mL M9-MOPS培养基和如表1所详述的抗生素的单独的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。 
在初始OD600接近0.05时用种子培养物接种单独的250mL摇瓶，每个摇瓶均含有40mL M9-MOPS培养基、45ug/mL硫胺、微量营养物、1.00E-5mol/L FeSO4、0.1M MOPS、0.5％酵母提取物、20g/L D-葡萄糖和抗生素。培养物在30℃下在250rpm潮湿温育摇床上温育，直到OD600达到0.2-0.3，此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导紫穗槐-4，11-二烯的产生。 
在诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获紫穗槐-4，11-二烯。在不同的时间点采样，提取紫穗槐-4，11-二烯，并如实施例10所述通过GC/MS分析。每个宿主菌株用2个独立的克隆进行实验，结果取平均值。发现样品之间的偏差小于10％。
如图16所示，含有编码完全工程化的DXP途径酶的核苷酸序列的大肠杆菌宿主菌株B619产生大约45mg/g DCW的紫穗槐-4，11-二烯。 
实施例16
该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中产生3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇。 
宿主菌株B286、B287、B288和B291的种子培养物如下建立：用每个菌株的储备液等份在含有如表1详述的抗生素的LB琼脂上划线。每个菌株挑取三个独立的菌落，每个菌落接种到7mL含有抗生素的LB培养基中。培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上生长过夜，直到对数晚期。然后在OD600接近0.05时将培养物接种到含有40ml M9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物和抗生素的250mL摇瓶中。培养物在37℃下在250rpm旋转摇床上生长过夜，直到它们达到大约0.2的OD600，此时加入40uL1M IPTG诱导。培养物在30℃下在250rpm旋转摇床上生长72小时。每天1-2次，测量每个培养物的OD600，取700uL样品。为了从培养液中提取3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇，向300uL每个取出的样品中加入600uL乙酸乙酯。然后将样品涡旋振荡15分钟，将400uL上层的乙酸乙酯相转移到干净玻璃瓶中进行分析。 
样品在Hewlett-Packard6890气相色谱/质谱仪(GC/MS)上分析。用DB-5柱(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)和氦载气在GC上分离1uL样品。用于分析的温度程序如下：60℃3分钟，以60℃/分钟升高温度至300℃，于300℃保持2分钟。总运行时间为9分钟。解析的样品用Hewlett-Packard5973型质量选择检测器分析。以前的质谱证实，使用该GC方案，3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯-1-醇的保留时间为2.067分钟。为了集中检测3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇，采用只监测3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇中的离子56和68的选择性离子监测方法。
实施例17
该实施例描述了酿酒酵母宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯。 
宿主菌株EPY224的产生在Ro等人.(Nature440：940-943；2006)和PCT专利公开WO2007/005604中描述。宿主菌株EPY224由表达质粒pRS425ADS通过在YPD培养基中生长而复原(Methods in YeastGenetics：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual，2005ed.，ISBN 0-87969-728-8)，将单菌落接种到YPD琼脂上，然后将单菌落转印(patching)到CSM-Met His琼脂和CSM-Met Leu琼脂上。在CSM-Met His琼脂上生长但在CSM-Met Leu琼脂上不生长的克隆复原(即，已经失去了质粒pRS425ADS)。一个这样的克隆被命名为EPY300。用表达质粒pRS425-ADS-LEU2d转化EPY300，这是一种除了含有LEU2d选择性标记而不是LEU2以外与pRS425-ADS完全相同的质粒(Erhart和Hollenberg(1983)J.Bacteriol.156：625-635)，产生宿主菌株Y185。 
在含有2％葡萄糖和除组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸的合成确定成分培养基(CSM-葡萄糖；MP Biomedicals，Solon，OH)上筛选Y185宿主细胞转化体。宿主菌株EPY300对于亮氨酸生物合成来说是营养缺陷的(leu2)，但是Y185中的表达质粒pRS425-ADS-LEU2d恢复了亮氨酸原养型(LEU2)。将单菌落转印到选择性培养基上(CSM-葡萄糖-组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)，生长2天。从平板上刮下细胞，并转移到冻存管中的1mL25％(v/v)甘油中。将悬浮液混合，然后贮存在-80℃。 
宿主菌株Y185的种子瓶如下建立：将菌株的储备液等份加入到含有25mL CSM-葡萄糖、缺少亮氨酸和甲硫氨酸的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。在初始OD600接近0.05时用培养物接种含有40mL缺少亮氨酸的合成确定成分培养基并且含有0.2％葡萄糖、1.8％半乳糖和1mM甲硫氨酸的250mL带有档板的摇瓶。培养物在30℃下在200rpm的旋转摇瓶上温育。由于培养基中存在葡萄糖阻止了半乳糖对GAL1启动子的诱导，紫穗槐-4，11-二烯产生不能被诱导，直到 细胞用完了培养基中的葡萄糖并且切换为使用半乳糖作为其主要碳源。在接种时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获紫穗槐-4，11-二烯。在72小时时通过将5uL有机溶剂层转移到含有500uL乙酸乙酯的干净玻璃瓶中采样，其中含有已知浓度的β-或反式丁香烯作为内标。 
如实施例10所述，有机覆盖物/乙酸乙酯样品在Hewlett-Packard6890气相/质谱仪(GC/MS)上分析。 
生长72小时后，发现3个酵母培养物产生60.68、54.48和59.25mg/L的紫穗槐-4，11-二烯。 
实施例18
该实施例描述了酿酒酵母宿主菌株产生紫穗槐-4，11-二烯，其中该宿主菌株包含天然甲羟戊酸途径以及处于异源调节控制之下的异源甲羟戊酸途径。 
酵母株CEN.PK2-1C(Y002)(MATA；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)和CEN.PK2-1D(Y003)(MATalpha；ura3-52；trp1-289；1eu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)(J.P.vanDijken等人，Enzyme MicrobTechnol 26，706(Jun1，2000)在标准丰富培养基(YPD)中或在缺少允许筛选整合转化体、质粒保持和减数分裂后代的适当营养物的确定成分合成培养基(.D.Rose，F.Winston，P.Heiter，Methods inyeast genetics：alaboratory course manual.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1990)中培养。 
DNA-介导的向酿酒酵母中的转化用如R.H.Schiestl，R.D.Gietz，Curr Genet16，339(Dec，1989)所述的醋酸锂法进行。所有基因破坏和替换都通过表型分析、菌落聚合酶链反应(“PCR”)和对扩增的基因组DNA进行测序来证实。质粒pAM489-pAM498用pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad CA)构建，并且在图7A-C和表6中显示。HISMX标记序列在M.S.Longtine等人，Yeast14，953(Jul，1998)中描述。质粒DNA的扩增在大肠杆菌DH5α株中进行。
表6 
  
菌株 5’HR 基因#1 Crick 启动子 Watson启动子 基因#2 遗传标记 3’HR
pAM489 TRP1 tHMGR GAL1 GAL10 ERG20 TRP1 TRP1
pAM490 TRP1 tHMGR CUP1 CUP1 ERG20 TRP1 TRP1
pAN491 URA3 tHMGR GAL1 GAL10 ERG13 URA3 URA3
pAM492 URA3 IDI1 CUP1 CUP1 tHMGR URA3 URA3
pAM493 ADE1 tHMGR GAL1 GAL10 IDI1 ADE1 URA3
pAM494 ADE1 tHMGR CUP1 CUP1 IDI1 ADE1 ADE1
pAM495 HIS3 ERG12 GAL1 GAL10 ERG10 HISMX HIS3
pAM496 HIS3 ERG12 CUP1 CUP1 ERG10 HISMX HIS3
pAM497 LEU2 ERG19 GAL1 GAL1 ERG8 HISMX LEU2
pAM498 LEU2 ERG19 CUP1 CUP1 ERG8 HISMX LEU2
如下制备酿酒酵母株Y002和Y003用于引入可诱导的甲羟戊酸途径基因。通过使用与天然ERG9启动子具有45个碱基对的同源性的引物50-56-pw100-G(SEQ ID NO：44)和50-56-pw101-G(SEQ IDNO：45)PCR扩增pAM328的KanMX-PMET3区(SEQ ID NO：43)，将ERG9启动子替换为酿酒酵母MET3启动子。使用40％w/w聚乙二醇3350(Sigma-Aldrich St Louis，MO)、100mM醋酸锂(Sigma)、10μg鲑精DNA(Invitrogen)将10μg得到的PCR产物转化到指数生长的Y002和Y003株中，在30℃温育30分钟，然后于42℃热休克30分钟(如Schiestl&Gietz，Curr.Genet.16：339(1989)所述)。阳性重组子根据它们在含有0.5μg/ml遗传霉素(Invitrogen Co，Carlsbad，CA)的丰富培养基上生长的能力进行确定，并且通过诊断PCR证实。得到的克隆命名为Y93(MAT A)和Y94(MATα)。然后，将ADE1开放阅读框替换为光滑念珠菌(Candida glabrata)LEU2基因(CgLEU2)。使用与ADE1开放阅读框(ORF)有50个碱基对侧翼同源性的引物61-67-CPK066-G(SEQ ID NO：46)和61-67-CPK067-G(SEQ ID NO：47)，由 光滑念珠菌基因组DNA(ATCC，Manassas，VA)扩增3.5KB CgLEU2基因组基因座。将10μg得到的PCR产物转化到指数生长的如上所述的Y93和Y94内。为了在不存在亮氨酸添加的条件下生长，选择adel-株，并通过诊断PCR证实。得到的克隆命名为Y176(MAT A)和Y177(MAT α)。 
为了产生酿酒酵母株Y188，分别用PmeI(New England Biolabs，Beverly，MA)消化2μg来自pAM491(SEQ ID NO：48)和pAM495(SEQ ID NO：49)的质粒DNA过夜，并且导入指数生长的如上所述的Y176内。为了在缺乏尿嘧啶和组氨酸的培养基中生长，选择阳性重组子。向正确的基因组基因座中的整合通过诊断PCR证实。 
为了产生酿酒酵母株Y189，分别用PmeI消化2μg来自pAM489(SEQ ID NO：50)和pAM497(SEQ ID NO：51)的质粒DNA过夜，并且导入指数生长的如上所述的Y177内。为了在缺乏色氨酸和组氨酸的培养基中生长，选择阳性重组子。向正确的基因组基因座中的整合通过诊断PCR证实。 
大约1X107来自Y188和Y189的细胞在室温下在YPD培养基平板上混合6小时，以允许繁殖。然后将混合的细胞培养物接种到缺乏组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培养基上，以对二倍体细胞的生长进行选择。用PmeI消化2μg来自pAM493(SEQ ID NO：52)的质粒DNA过夜，并且导入指数生长的如上所述的二倍体细胞内。为了在缺乏腺嘌呤的培养基中生长，选择阳性重组子。向正确的基因组基因座中的整合通过诊断PCR证实。得到的菌株被命名为Y238。 
为了产生含有导入基因的完全互补体的单倍体菌株，Y238在2％乙酸钾和0.02％棉子糖液体培养基中生成孢子。采用SingerInstruments MSM300系列显微操作器(Singer Instrument Co，LTD.Somerset，UK)分离大约200个遗传四分体(四分体是生成四个孢子的减数分裂产物)。含有所引入的遗传物质的适当互补体的独立的遗传分离株根据它们在缺乏腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的条件下生长的能力来确定。所有引入的DNA的整合都通过诊断PCR来证实。得 到的菌株被命名为Y210(MAT A)和Y211(MAT α)。 
将2μg来自pAM426的质粒DNA(SEQ ID NO：53)导入指数生长的如上所述的Y210和Y211内，该质粒DNA含有从酿酒酵母GAL10启动子表达的酿酒酵母密码子优化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)。根据它们在不存在亮氨酸补充的条件下生长的能力筛选含有pAM426质粒的酿酒酵母株。得到的菌株命名为Y225(MAT A)和Y227(MATα)。 
将2μg来自pAM322的质粒DNA(SEQ ID NO：54)导入指数生长的如上所述的Y210和Y211内，该质粒DNA含有从酿酒酵母GAL1表达的酿酒酵母密码子优化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)和细胞色素P450单加氧酶(AMO)和从酿酒酵母GAL10启动子表达的细胞色素P450氧化还原酶(CPR)。根据它们在不存在亮氨酸补充的条件下生长的能力筛选含有pAM322质粒的酿酒酵母株。得到的菌株命名为Y222(MAT A)和Y224(MAT α)。 
实施例19
该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中产生α-法尼烯或β-法尼烯。 
宿主菌株B552和B592的种子培养物如下建立：将每个菌株的储备液等份加入到含有25mL M9-MOPS、0.8％葡萄糖、0.5％酵母提取物和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。 
在初始OD600接近0.05时用种子培养物接种含有40mL M9-MOPS培养基、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物和抗生素的250mL摇瓶。培养物在30℃下在250rpm潮湿温育摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD600，此时通过加入40uL1M IPTG在宿主细胞中诱导α-法尼烯或β-法尼烯的产生。诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物，以捕获α-法尼烯。每24小时通过将2-10uL有机溶剂层转移到含有加有作为内标的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的干净玻璃瓶中，采样一次。另外，离心培养物的1mL等份，将细胞沉淀物重悬浮在250uL无菌水中，将细胞悬浮液转移到含有掺有作为内标的反式 丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整个培养液样品通过涡旋振荡玻璃瓶10分钟用乙酸乙酯萃取，之后将600uL乙酸乙酯萃取物转移到干净的玻璃瓶中。 
有机覆盖物/乙酸乙酯样品和乙酸乙酯萃取的整个培养液样品在装备有Agilent 5975质谱仪的Agilent 6890N气相色谱仪(GC/MS)上以全扫描模式(50-500m/z)分析。为了加快运行时间，改变温度程序和柱基质以达到最佳峰值分辨率和最短的总运行时间。利用HP-5MS柱(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)和氦载气分离1μL样品。用于分析的温度程序如下：150℃保持3分钟，以25℃/分钟升高温度至200℃，以60℃/分钟升高温度至300℃，于300℃保持1分钟。以前的质谱证实β-法尼烯合成酶的产物是β-法尼烯，使用该GC方案，β-法尼烯的保留时间为4.33分钟。通过比较产生的峰面积和纯化β-法尼烯(Sigma-Aldrich Chemical Company，St.Louis，MO)在加有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校准曲线，计算法尼烯的滴度。 
宿主株B592在120小时时产生大约400mg/L的β-法尼烯(平均3个以上的独立克隆)，并且具有约46mg/L/OD600的最大比生产率。宿主菌株B552在120小时时产生大约1.1g/L的β-法尼烯(平均3个以上的独立克隆)，并且具有约96mg/L/OD600的最大比生产率(1个代表克隆)。 
实施例20
该实施例描述了大肠杆菌宿主菌株中通过DXP途径产生β-法尼烯。 
宿主菌株B650、B651、B652和B653的种子培养物如下建立：将每个菌株的储备液等份加入到单独的含有25mL M9-MOPS和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。 
在初始OD600接近0.05时用种子培养物接种含有40mLM9-MOPS基本培养基、45ug/mL硫胺、微量营养物、1.00E-5mol/LFeSO4、0.1M MOPS、0.5％酵母提取物、20g/L D-葡萄糖和抗生素的单独的250mL摇瓶。培养物在30℃下在潮湿温育摇床上250rpm 温育，直到它们的OD600达到0.2-0.3，此时向培养基中加入40uL1M IPTG诱导在宿主细胞中产生β-法尼烯。诱导时，在培养物上覆盖8mL的有机覆盖物以捕获β-法尼烯。在不同时间点通过将100uL有机覆盖上层的样品转移到干净试管中采样。离心该试管以分离出任何剩余的细胞或培养基，并将10uL有机覆盖层样品转移到干净玻璃GC瓶中的加入β-或反式丁香烯作为内标的500uL乙酸乙酯中。将混合物涡旋振荡30秒，然后如实施例18所述分析。大肠杆菌宿主菌株B653产生大约7mg/g DCWβ-法尼烯。 
实施例21
该实施例描述了酿酒酵母宿主菌株中α-法尼烯或β-法尼烯的产生。 
菌株EPY300的产生是通过在丰富培养基中培养而从酿酒酵母EPY224株中除去表达质粒(Ro等人.(2006)Nature440：940-943；PCT专利公开WO2007/005604)。然后用表达质粒pRS425-FSA或pR425-FSB转化菌株EPY300，分别产生宿主菌株Y166和Y164。 
宿主细胞转化体在含有2％葡萄糖和除亮氨酸以外的所有氨基酸的合成的确定成分培养基(SM-glu)上筛选。宿主菌株EPY300对于亮氨酸生物合成来说是营养缺陷的(leu2)，但是表达质粒pRS425-FSA或pRS425-FSB恢复了亮氨酸原养型(LEU2)。将单菌落转移到含有5mL缺乏亮氨酸的液体SM-glu的培养瓶中。培养物通过在30℃振摇温育，直到生长达到稳定期。细胞以由400μL50％甘油和600μL液体培养物组成的1mL冷冻等份，在冻存管中贮存于-80℃。 
种子培养物如下建立：将储备液等份加入到含有25mL缺乏亮氨酸的SM-glu的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。在OD600约为0.05时用种子培养物接种含有40mL缺乏亮氨酸的合成的确定成分培养基、0.2％葡萄糖和1.8％半乳糖的250mL带档板的摇瓶中。培养物在30℃下在200rpm的旋转摇床上温育。由于培养基中存在葡萄糖阻止了半乳糖对Gall启动子的诱导，法尼烯的产生不能被诱导，直到细胞用完了培养基中的葡萄糖并且切换为使用半乳糖作为其主要 碳源。在培养物上覆盖8mL的油酸甲酯或豆蔻酸异丙酯。每24小时通过将2-10uL有机溶剂层转移到含有500uL乙酸乙酯的干净玻璃瓶中采样，该乙酸乙酯中掺有已知浓度的β-或反式丁香烯作为内标。另外，将整个培养液的0.5mL等份加入到含有掺有作为内标的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整个培养液样品通过涡旋振荡玻璃瓶10分钟用乙酸乙酯中萃取，之后将600uL乙酸乙酯萃取物转移到干净的玻璃瓶中。 
宿主株Y166在120小时时产生大约9.8mg/L的α-法尼烯(平均超过3个独立克隆)，并且具有大约3mg/L/OD600的最大比生产率(1个代表性克隆)。宿主菌株Y164在120小时时产生大约56mg/L的β-法尼烯(平均超过3个独立克隆)，并且具有大约20mg/L/OD600的最大比生产率(1个代表性克隆)。 
实施例22
该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中产生γ-萜品烯、α-蒎烯和萜品油烯。 
用于产生γ-萜品烯(大肠杆菌DH1-T1r[pMevT，pMevB-Gpps，pAM445])、α-蒎烯(大肠杆菌DH1-T1r[pMevT，pMevB-Gpps，pAM443或pAM442])或萜品油烯(大肠杆菌DH1-T1r[pMevT，pMevB-Gpps，pAM444]的宿主菌株的种子培养物通过将每种菌株的贮备液等份加入到单独的含有25mL M9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物和如表1所详述的抗生素的125mL摇瓶中，并且通过将培养物生长过夜至对数后期而建立。 
种子培养物用来以大约0.05的初始OD600接种含有40mLM9-MOPS、2％葡萄糖、0.5％酵母提取物和抗生素的250mL摇瓶。在接种时，培养物上也覆盖有4mL十六烷。培养物在200-250rpm的旋转摇床上30℃温育，直到它们达到大约0.2的OD600，此时添加40uL1M IPTG诱导在宿主细胞中产生目标化合物。每天通过将200uL十六烷层转移到0.6mL微量离心管中采样一次，共96小时。为进行分析，在1.8mL GC瓶中将十六烷层用掺有作为内标的反式丁香烯 的乙酸乙酯1:1或1:10稀释。另外，离心每份1mL的培养物，将细胞沉淀物重悬浮在250uL无菌水中，并将细胞悬浮液转移到加有作为内标的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。通过涡旋振荡玻璃瓶15分钟将细胞沉淀物在乙酸乙酯中提取，之后将500uL乙酸乙酯提取物转移到干净的玻璃瓶中。 
十六烷/乙酸乙酯样品和乙酸乙酯提取的细胞沉淀物样品在全扫描模式(50-500m/z)的装备有Agilent 5975质谱仪的Agilent 6890N气相色谱仪(GC/MS)上分析。为了加快运行时间，改变温度程序和柱基质以达到最佳峰值分辨度和最短的总运行时间。分成1μL样品(基于样品浓度选择1:2至1:50的分配比)，然后用HP-5MS柱(AgilentTechnologies，Inc.，Palo Alto，CA)和氦载气分离。用于分析的温度程序如下：75℃保持3分析，以20℃/分钟升高温度至115℃，以60℃/分钟升高温度至300℃，于300℃保持0.5分钟。各种产物，γ-萜品烯、α-蒎烯和萜品油烯，分别在5.4、4.1、5.4和5.9分钟时观察。通过将产生的峰面积与纯化标准在加有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校准曲线比较，计算滴度。 
实施例23
该实施例描述了在大肠杆菌宿主菌株中生产芳樟醇、苧烯、β-蒎烯、β-水芹烯、蒈烯或桧烯。 
种子培养物如下建立：将每种菌株的储备液等份加入到含有25mLM9-MOPS培养基、0.5％酵母提取物、2％葡萄糖和如表1所详述的抗生素的单独的125mL摇瓶中，并且使培养物生长过夜。 
在初始OD600接近0.05时用种子培养物接种250mL带有档板的摇瓶，每个摇瓶均含有40mL M9-MOPS培养基、0.5％酵母提取物，2％葡萄糖和抗生素。培养物在30℃下在250rpm旋转摇床上温育，直到它们达到大约0.2的OD600，此时通过向培养基中加入40uL1MIPTG在宿主细胞中诱导目标化合物的产生。通过溶剂-溶剂萃取从培养基中分离目标化合物，或者如果目标化合物的滴度大到足以使培养基饱和并且形成第二相，则通过沉降和滗析分离目标化合物。
序列表 
SEQIDNO：1 
MevT66操纵子 
Figure G2007800193534D00871
Figure G2007800193534D00881
SEQ ID NO：2 
引物4-49mvaA SpeI 
Figure G2007800193534D00882
SEQ ID NO：3 
引物4-49mvaAR XbaI 
Figure G2007800193534D00883
SEQ ID NO：4 
引物HMGS 5’Sa mvaS-S 
Figure G2007800193534D00884
SEQ ID NO：5 
引物HMGS3’Sa mvaS-AS 
Figure G2007800193534D00885
SEQ ID NO：6 
引物19-25atoB SfiI-S 
Figure G2007800193534D00891
SEQ ID NO：7 
引物19-25 mvaA-AsiSI-AS 
SEQ ID NO：8 
引物9-70C 
Figure G2007800193534D00893
SEQ ID NO：9 
引物26-39B 
Figure G2007800193534D00894
SEQ ID NO：10 
引物26-39A 
Figure G2007800193534D00895
SEQ ID NO：11 
引物4-40mvaEF BamHI 
Figure G2007800193534D00896
SEQ ID NO：12 
引物4-40mvaER HindIH 
Figure G2007800193534D00897
SEQ ID NO：13 
引物4-40mvaSF BglII 
Figure G2007800193534D00898
SEQ ID NO：14 
引物4-39mvaSR BamHI 
Figure G2007800193534D00899
SEQ ID NO：15 
用于PCR扩增dxs基因的编码序列的引物67-1A-C 
Figure G2007800193534D008910
SEQ ID NO：16
用于PCR扩增dxs基因的编码序列的引物67-1B-C 
SEQ ID NO：17 
用于PCR扩增dxr基因的编码序列的引物67-1C-C 
Figure G2007800193534D00902
SEQ ID NO：18 
用于PCR扩增dxr基因的编码序列的引物67-1D-C 
Figure G2007800193534D00903
SEQ ID NO：19 
用于PCR扩增ispD基因的编码序列的引物67-1E-C 
Figure G2007800193534D00904
SEQ ID NO：20 
用于PCR扩增ispD基因的编码序列的引物67-1F-C 
Figure G2007800193534D00905
SEQ ID NO：21 
用于PCR扩增ispE基因的编码序列的引物67-1G-C 
Figure G2007800193534D00906
SEQ ID NO：22 
用于PCR扩增ispE基因的编码序列的引物67-1H-C 
Figure G2007800193534D00907
SEQ ID NO：23 
用于PCR扩增ispF基因的编码序列的引物67-2A-C 
Figure G2007800193534D00908
SEQ ID NO：24 
用于PCR扩增ispF基因的编码序列的引物67-2B-C 
Figure G2007800193534D00909
SEQ ID NO：25 
用于PCR扩增ispG基因的编码序列的引物67-2C-C 
Figure G2007800193534D009010
SEQ ID NO：26 
用于PCR扩增ispG基因的编码序列的引物67-2D-C 
Figure G2007800193534D009011
SEQ ID NO：27 
用于PCR扩增ispH基因的编码序列的引物67-2E-C 
Figure G2007800193534D00911
SEQ ID NO：28 
用于PCR扩增ispH基因的编码序列的引物67-2F-C 
Figure G2007800193534D00912
SEQ ID NO：29 
用于PCR扩增idi基因的编码序列的引物67-2G-C 
Figure G2007800193534D00913
SEQ ID NO：30 
用于PCR扩增idi基因的编码序列的引物67-2H-C 
Figure G2007800193534D00914
SEQ ID NO：31 
用于PCR扩增ispA基因的编码序列的引物67-2I-C 
Figure G2007800193534D00915
SEQ ID NO：32 
用于PCR扩增ispA基因的编码序列的引物67-2J-C 
Figure G2007800193534D00916
SEQ ID NO：33 
用于PCR扩增RK2par基因座的引物9-156A 
Figure G2007800193534D00917
SEQ ID NO：34 
用于PCR扩增RK2par基因座的引物9-156B 
SEQ ID NO：35 
引物19-137cml-pAM37-AS 
Figure G2007800193534D00919
SEQ ID NO：36 
引物19-137cml-pAM37-S 
SEQ ID NO：37 
用于PCR扩增编码β-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物 
Figure G2007800193534D00921
SEQ ID NO：38 
用于PCR扩增编码β-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物 
Figure G2007800193534D00922
SEQ ID NO：39 
用于PCR扩增编码α-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物 
SEQ ID NO：40 
用于PCR扩增编码α-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物 
Figure G2007800193534D00924
SEQ ID NO：41 
atoB(opt)：HMGS(opt)：mvaA操纵子 
Figure G2007800193534D00925
Figure G2007800193534D00931
SEQ ID NO：42 
atoB(opt)：mvaS(opt)：mvaA操纵子 
Figure G2007800193534D00932
Figure G2007800193534D00951
SEQ ID NO：43 
pAM328-ERG9-KANMX-MET3启动子-ERG9(不包括载体骨架) 
Figure G2007800193534D00952
Figure G2007800193534D00961
SEQ ID NO：44 
Figure G2007800193534D00962
SEQ ID NO：45 
Figure G2007800193534D00963
SEQ ID NO：46 
Figure G2007800193534D00964
SEQ ID NO：47 
SEQ ID NO：48 
pAM491序列(不包括载体骨架) 
Figure G2007800193534D00966
Figure G2007800193534D00971
Figure G2007800193534D00981
SEQ ID NO：49 
pAM492序列(不包括载体骨架) 
Figure G2007800193534D00982
Figure G2007800193534D01001
SEQ ID NO：50 
pAM489序列(不包括载体骨架) 
Figure G2007800193534D01002
Figure G2007800193534D01021
SEQ ID NO：51 
pAM497序列(不包括载体骨架) 
Figure G2007800193534D01022
Figure G2007800193534D01041
SEQ ID NO：52 
pAM493序列(不包括载体骨架) 
Figure G2007800193534D01051
Figure G2007800193534D01061
SEQ ID NO：53 
pAM426序列 
Figure G2007800193534D01062
Figure G2007800193534D01071
Figure G2007800193534D01081
Figure G2007800193534D01091
SEQ ID NO：54 
pAM322序列 
Figure G2007800193534D01092
Figure G2007800193534D01111
Figure G2007800193534D01121
Figure G2007800193534D01131

Claims (40)

1.一种生产类异戊二烯的方法，包括：
(a)获得多个细菌或真菌宿主细胞，该宿主细胞包含编码用于生成异戊烯焦磷酸的甲羟戊酸途径的一种或多种酶的异源核酸，其中所有的途径酶的表达在至少一个异源转录调节物的控制下，其中所述甲羟戊酸途径包括(i)将两个乙酰辅酶A分子组合以形成乙酰乙酰-CoA的酶，(ii)缩合乙酰乙酰-CoA和乙酰-CoA以生成HMG-CoA的酶，(iii)将HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶，(iv)使甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶，(v)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶，和(vi)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的酶；和
(b)在其中碳源受到限制以使得培养基提供75％或更低的细菌或真菌宿主细胞最大比生长速率的培养基中培养所述细菌或真菌宿主细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种异源转录调节物是可诱导的。
3.权利要求1的方法，其中所述甲羟戊酸途径酶在单个转录调节物的控制下。
4.权利要求1的方法，其中所述甲羟戊酸途径酶在多个转录调节物的控制下。
5.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞包含编码甲羟戊酸途径的所有酶的异源核酸。
6.权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞是大肠杆菌。
7.权利要求1的方法，其中所述异源核酸包含编码来自具有内源甲羟戊酸途径的真菌的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。
8.权利要求1的方法，其中所述真菌宿主细胞是酿酒酵母。
9.权利要求1的方法，其中所述异源核酸包含编码来自具有内源甲羟戊酸途径的原核生物的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。
10.权利要求9的方法，其中所述原核生物是选自肠球菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属的属。
11.权利要求10的方法，其中所述异源核酸包含编码选自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。
12.权利要求1的方法，其中所述异源核酸包含编码II类HMG还原酶的核酸序列。
13.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在培养基中培养，其中营养物和温度两者的水平保持低于提供该宿主细胞的最大比生长速率的水平。
14.权利要求1的方法，其中培养基的温度至少比提供最大比生长速率的温度低2℃。
15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞在至少比提供最大比生长速率的温度低5℃的温度下培养。
16.权利要求14的方法，其中培养基的温度至少比提供最大比生长速率的温度低10℃。
17.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提供最大比生长速率的60％或更低。
18.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提供最大比生长速率的50％或更低。
19.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提供最大比生长速率的40％或更低。
20.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提供最大比生长速率的25％或更低。
21.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提供最大比生长速率的75％-10％。
22.权利要求1的方法，其中所述培养基是氮限制的。
23.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯以大于每升培养基10克的量产生。
24.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯以高于每克细胞干重50mg的量产生。
25.权利要求23或24任一项的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到150小时的时间内产生。
26.权利要求23或24任一项的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到96小时的时间内产生。
27.权利要求23或24任一项的方法，其中所述类异戊二烯的量在不到72小时的时间内产生。
28.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯选自半萜、单萜、二萜、三萜、四萜和多萜。
29.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯是倍半萜。
30.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯是C5-C20类异戊二烯。
31.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-法尼烯、β-法尼烯、法尼醇、香叶醇、香叶基香叶醇、异戊二烯、芳樟醇、苧烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、薄荷醇、β-蒎烯、桧萜、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯。
32.权利要求13的方法，其中所述营养物包括碳源和氮源。
33.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是α-法尼烯。
34.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是β-法尼烯。
35.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是紫穗槐二烯。
36.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是法尼醇。
37.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是橙花叔醇。
38.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是薄荷醇。
39.权利要求29的方法，其中所述倍半萜是瓦伦烯。
40.权利要求1的方法，其中所述一种或多种酶是原核生物酶。
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