BRPI0713105B1 - método para produzir um isoprenóide - Google Patents

Abstract

método para produzir um isoprenóide, e, célula hospedeira. a presente invenção fornece métodos para uma produção robusta de isoprenóides através de uma ou mais vias biossintéticas. a invenção também fornece ácidos nucleicos, enzimas, vetores de expressão e células hospedeiras geneticamente modificadas para realizar os métodos do objeto de estudo. a invenção também fornece métodos de fermentação para alta produtividade de isoprenóides a partir de células hospedeiras geneticamente modificadas.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM ISOPRENÓIDE” REFERÊNCIA CRUZADA

Este pedido reivindica prioridade para Pedido Provisório de Patente Norte-Americana Nos. 60/808.989, depositado em 26 de Maio 2006 e 60/870.592 depositado em 18 de Dezembro de 2006, que são incorporados neste lugar por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Isoprenóides são abundantes na natureza. Eles compreendem uma família diversa de mais de 40.000 produtos individuais, muitos dos quais são vitais para organismos vivos. Isoprenóides servem para manter fluidez celular, transporte de elétrons, e outras funções metabólicas. Um vasto número de isoprenóides naturais e sintéticos são úteis como produtos farmacêuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos e corantes, fungicidas, antisépticos, nutracêuticos, e intermediários de químicos finos.

Um produto de isoprenóide é tipicamente composto de cinco unidades repetidas de carbono isopentenil difosfato (IPP), embora isoprenóides irregulares e politerpenos tenham sido registrados. Na natureza, isoprenóides são sintetizados por condensações consecutivas de seu IPP precursor e seu isômero dimetilalil pirofosfato (DMAPP). Duas vias para estes precursores são conhecidas. Eucariotos, com a exceção de plantas, geralmente usam a via dependente de mevalonato (MEV) para converter acetil coenzima A (acetil-CoA) para IPP, que é subseqüentemente isomerizado para DMAPP. Procariotos, com algumas exceções, tipicamente empregam apenas a via independente de mevalonato ou desoxixilulose-5fosfato (DXP) para produzir IPP e DMAPP. Plantas usam tanto a via de MEV como a via de DXP. Veja Rohmer at al. (1993) Biochem. J. 295:517-524; Lange et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97(24):13 172-13177; Rohdich et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:1158-1163.

Petição 870180129461, de 12/09/2018, pág. 13/20

Tradicionalmente, isoprenóides foram fabricados por extração a partir de fontes naturais tal como plantas, micróbios, e animais. Entretanto, a produção por meio de extração normalmente é muito baixa devido a um número de limitações profundas. Primeiro, a maioria dos isoprenóides se 5 acumulam na natureza em apenas pequenas quantidades. Segundo, os organismos fonte em geral não são receptivos para o cultivo em larga escala que é necessário para produzir quantidades comercialmente viáveis de um isoprenóide desejado. Terceiro, o requerimento de certos solventes tóxicos para extração de isoprenóide necessita procedimentos especiais de 10 manipulação e descarte, e assim complicando a produção comercial de isoprenóides.

A elucidação das vias metabólicas MEV e DXP tomou produção biossintética de isoprenóides factível. Por exemplo, micróbios foram manipulados para superexpressar uma parte da ou a via inteira de 15 mevalonato para produção de um isoprenóide chamado amorfa 4,11-dieno (Patente Norte-Americana Nos. 7.172.886 e 7.192.751) Outros esforços foram focados em equilibrar a combinação de gliceraldeído-3-fosfato e piruvato, ou em aumentar a expressão de l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (dxs) e IPP isomerase (idi). Veja Farmer et al. (2001) Biotechnol. Prog. 17:57-61; 20 Kajiwara at al. (1997) Biochem. J. 324:421-426; and Kim at al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72:408-415.

Contudo, dadas as quantidades muito altas de produto isoprenóides necessárias para muitas aplicações comerciais, permanece uma necessidade de sistemas de expressão e procedimentos de fermentação que 25 produzem ainda mais isoprenóides do que disponíveis com tecnologias atuais. Redireção ótima de metabolismo microbiano para produção de isoprenóide requer que a via biossintética introduzida seja apropriadamente manipulada tanto para canalizar carbono para produção de isoprenóide eficientemente como para prevenir aumento de níveis tóxicos de intermediários metabólicos por um período prolongado de tempo. A presente invenção se destina a esta necessidade e também fornece vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos para uma produção robusta de isoprenóides pelo uso de enzimas da via de isopentenil pirofosfato que estão sob o controle de pelo menos um regulador heterólogo ou condições de fermentação, ou sozinhos ou em combinação. Exemplos não limitantes de isoprenóides adequados incluem: hemiterpenos (derivados de 1 unidade de isopreno) tal como isopreno; monoterpenos (derivados de 2 10 unidades de isopreno) tal como mirceno; sesquiterpenos (derivados de 3 unidades de isopreno) tal como amorfa4,l I-dieno; diterpenos (derivados de quatro unidades de isopreno) tal como taxadieno; triterpenos (derivados de 6 unidades de isopreno) tal como esqualeno; tetraterpenos (derivados de 8 isoprenóides) tal como β-caroteno; e politerpenos (derivados de mais do que 8 15 unidades de isopreno) tal como poliisopreno.

Em um aspecto, um método de produzir um isoprenóide envolve as etapas de (a) obter uma pluralidade de células hospedeiras que compreendem uma via enzimática para fazer isopentenil pirofosfato caracterizado pelo fato de que todas as enzimas da via estão sob controle de 20 pelo menos um regulador transcricional heterólogo; e (b) cultivar as células hospedeiras em um meio em condições que são sub-ótimas se comparadas com condições que proveríam uma taxa máxima de crescimento específico para as células hospedeiras. Em algumas formas de realização, a via é a via de mevalonato. Em outras formas de realização, a via é a via de DXP. Em outras 25 formas de realização, a pelo menos uma seqüência reguladora transcricional heteróloga é induzível. Em outras formas de realização, as enzimas da via estão sob controle de um único regulador transcricional. Em outras formas de realização, as enzimas da via estão sob controle de múltiplos reguladores transcricionais heterólogos.

Em algumas formas de realização, a via compreende uma seqüência de ácidos nucleicos codificando uma enzima da via de mevalonato de um procarioto tendo uma via endógena de mevalonato. Procariotos exemplares tendo uma via endógena de mevalonato incluem, mas não são limitados ao gênero Enterococcus, o gênero Pseudotnonas, e o gênero Staphylococcus. Em uma forma de realização, a enzima da via de mevalonato é selecionada a partir de acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, e mevalonato quinase. Em outra forma de realização, a seqüência heteróloga de ácidos nucleicos codifica uma HMG-CoA redutase de Classe II.

Em outra forma de realização, as células hospedeiras são cultivadas em um meio caracterizado pelo fato de que o nível de nutriente e/ou temperatura é mantido em um nível baixo que proveria a taxa máxima de crescimento específico para as células hospedeiras. Em outra forma de realização, as células hospedeiras são cultivadas em um meio onde a fonte de carbono é mantida em um nível para prover menos do que cerca de 90%, 75%, 50%, 25%, 10%, ou qualquer lugar entre 90% e 10% da taxa máxima de crescimento específico. Em outra forma de realização, as células hospedeiras são cultivadas em um meio onde a fonte de nitrogênio é mantida em um nível para prover menos do que cerca de 90%, 75%, 50%, 25%, 10%, ou qualquer lugar entre 90% e 10% da taxa máxima de crescimento específico. Em outra forma de realização, as células hospedeiras são cultivadas em um meio onde a temperatura é mantida em um nível para prover menos do que cerca de 90%, 75%, 50%, 25%, 10% ou qualquer lugar entre 90% e 10% da taxa máxima de crescimento específico. Em outra forma de realização, a temperatura do meio é mantida pelo menos cerca de 2°C, 4°C, 5°C, 6°C, 8°C, 10°C, 15°C, ou 20°C abaixo da temperatura que proveria a taxa máxima de crescimento específico.

Em ainda outra forma de realização, um método de produzir um isoprenóide ou precursor de isoprenóide compreende as etapas de (i) realizar uma reação de fermentação compreendendo um meio de fermentação e uma pluralidade de células hospedeiras geneticamente modificadas que produzem o isoprenóide em condições de forma que (a) o meio de fermentação é mantido em uma temperatura menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico de ditas células hospedeiras; (b) o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono presente em uma quantidade que é menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico das células hospedeiras; e/ou (c) o meio de fermentação compreende uma fonte de nitrogênio em uma quantidade que é menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico das células hospedeiras; (ii) recuperar o isoprenóide produzido em uma ou mais condições apresentadas em (a) até (c). Em um aspecto, o isoprenóide é produzido em pelo menos duas das condições apresentadas em (a) até (c). Em outro aspecto, o isoprenóide é produzido em todas as condições apresentadas em (a) até (c).

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório são neste lugar incorporados por referência no mesmo nível como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figura IA é uma representação esquemática da via de mevalonato (MEV) para a produção de isopentenil pirofosfato (1PP).

Figura 1B é uma representação esquemática da via de 1-deóxiD-xilulose 5-difosfato (DXP) para a produção de isopentenil pirofosfato (IPP) e dimetilalil pirofosfato (DMAPP). Dxs é 1- deóxi-D-xilulose-5fosfato sintase; Dxr é l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (também conhecida como IspC); IspD é 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritrol sintase; IspE é 4-difosfocitidil- 2C-metil-D-eritrol sintase; IspF é 2C-metil-D-eritrol 2,4-ciclodifosfato sintase; IspG é 1- hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase (IspG); e ispH é isopentenil/dimetilalil difosfato sintase.

Figura 2 é uma representação esquemática da conversão de isopentenil pirofosfato (IPP) e dimetilalil pirofosfato (DMAPP) para geranil pirofosfato (GPP), famesil pirofosfato (FPP), e geranilgeranil pirofosfato (GGPP), e a síntese de vários isoprenóides.

Figura 3 mostra um mapa de plasmídeo de expressão pMBISgPPSFigura 4 mostra um mapa de plasmídeo de expressão pAM408.

Figura 5 mostra um mapa de plasmídeo de expressão pAM424.

Figura 6 mostra um mapa de plasmídeos de expressão pTrc99A-ADS, pTrc99A-FSA, pTrc99A-LLS, pTrc99ALMS, pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-TS, pTrc99A-CS, pTrc99ASS, e pAM373.

Figuras 7A-C são diagramas esquemáticos para a construção de plasmídeos pAM489-pAM498 e para pAM328.

Figura 8 mostra a maior atividade específica e estabilidade aumentada da HMGR-CoA redutase (HMGR) de Enterococcus faecalis comparada com a HMO-CoA redutase truncada (tHMGR) de Saccharomyces cerevisiae.

Figura 9 mostra a relação entre peso seco celular (DCW) por litro e OD₆₀₀.

Figuras 10A-B mostram a produtividade volumétrica e específica de amorfa-4,11-dieno aumentada de linhagens hospedeiras carregando a HMGR e genes de HMGS de Staphylococcus aureus comparada com linhagens hospedeiras carregando a tHMGR e genes de HMGS de Saccharomyces cerevistae.

Figuras 11A-B mostram o efeito de temperatura inferior em produtividade de amorfa-4,11 -dieno de uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Figuras I2A-D mostram o efeito de níveis reduzidos de glicose em produtividade de amorfa-4,11-dieno de uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Figuras 13A-B mostram os efeitos combinados de temperatura inferior e níveis reduzidos de glicose em produtividade de amorfa4,l 1 -dieno de uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Figuras 14A-E e 15A-E mostram os efeitos combinados de temperatura inferior e níveis reduzidos de glicose e nitrogênio em produtividade de amorfa-4,11-dieno de uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Figura 16 mostra produção de amorfa-4,11-dieno através da via de DXP por uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

A menos que de outra maneira definidos, todos os termos técnicos e científicos usados neste lugar têm o mesmo significado que comumente compreendido por alguém de habitual verso na arte à qual a invenção pertence. Aqui é feito referência a diversos termos que devem ser definidos para ter os seguintes significados:

O termo “opcional ou opcionalmente significa que a característica ou estrutura subseqüentemente descrita pode ou não estar presente, ou que o evento ou circunstância subseqüentemente descrito pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui instâncias onde uma característica ou estrutura particular está presente e instâncias onde a característica ou estrutura está ausente, ou instâncias onde o evento ou circunstância ocorre e instâncias onde o evento ou circunstância não ocorre.

O termo via metabólica é usado neste lugar para se referir a uma via catabólica ou uma via anabólica. Vias anabólicas envolvem construir uma molécula maior a partir de moléculas menores, um processo requerendo energia. Vias catabólicas envolvem degradação de moléculas maiores, freqüentemente liberando energia.

O termo “via de mevalonato ou via de MEV é usado neste lugar para se referir à via biossintética que converte acetil-CoA to IPP. A via de MEV é ilustrada esquematicamente em Figura IA.

O termo “via de desoxixilulose 5-fosfato ou via de DXP é usado neste lugar para se referir à via que converte gliceraldeído-3-fosfato e piruvato para IPP e DMAPP. A via de DXP é ilustrada esquematicamente em Figura 113.

A palavra pirofosfato é usada permutavelmente neste lugar com difosfato.

Os termos vetor de expressão ou vetor se referem a um ácido nucleico que transduz, transforma, ou infecta uma célula hospedeira, com isso fazendo com que a célula produza ácidos nucleicos e/ou proteínas outros do que aqueles que são nativos para a célula, ou expresse ácidos nucleicos e/ou proteínas de uma maneira que não é nativa para a célula.

O termo “endógeno se refere a uma substância ou processo que ocorre naturalmente, e.g., em uma célula hospedeira não recombinante.

O termo via enzimática para fazer isopentenil pirofosfato se refere a qualquer via capaz de produzir isopentil pirofosfato, incluindo, sem limitação, ou a via de mevalonato ou a via de DXP.

O termo “ácido nucleico se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não é limitado a, DNA ou RNA de fita simples, dupla, ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos DNA-RNA, ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina ou outras bases de nucleotídeos naturais, quimicamente, ou bioquimicamente modificadas, não naturais, ou derivadas.

O termo “operon é usado para se referir a duas ou mais seqüências de nucleotídeos contíguas que cada uma codifica um produto de gene tal como um RNA ou uma proteína, e cujas expressões são reguladas coordenadamente por um ou mais elementos controladores (por exemplo, um promotor).

• 5 O termo “produto de gene se refere a RNA codificado por

DNA (ou vice versa) ou proteína que é codificada por um RNA ou DNA, *

onde um gene irá tipicamente compreender uma ou mais seqüências de nucleotídeos que codificam uma proteína, e também pode incluir íntrons e outras seqüências de nucleotídeos não codificantes.

O termo “proteína se refere a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, o que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos quimicamente ou bioquimicamente modificados ou derivados, e polipeptídeos tendo esqueletos peptídicos modificados.

O termo “ácido nucleico heterólogo como usado neste lugar se refere a um ácido nucleico caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos seguintes é verdade: (a) o ácido nucleico é externo (exógeno) para (isto é, não naturalmente encontrada em) uma dada célula hospedeira; (b) o ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada em (isto, é endógena para) uma dada célula hospedeira, mas a seqüência de nucleotídeos é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que esperada ou maior do que naturalmente encontrada) na célula; (c) o ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos que difere em seqüência de uma seqüência de nucleotídeos endógena, mas a seqüência de nucleotídeos codifica a mesma proteína (tendo a mesma ou substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos) e é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que esperada ou maior do que naturalmente encontrada) na célula; ou (d) o ácido nucleico compreende duas ou mais seqüências de nucleotídeos que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza (por exemplo, o ácido nucleico é recombinante).

Um transgene se refere a um gene que é exogenamente introduzido em uma célula hospedeira. Ele pode compreender um ácido nucleico endógeno ou exógeno, ou heterólogo.

O termo “hospedeiro recombinante (também referido como a célula hospedeira geneticamente modificada ou microorganismo hospedeiro geneticamente modificado) significa uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico heterólogo da invenção.

O termo “ácido nucleico exógeno se refere a um ácido nucleico que é exogenamente introduzido em uma célula hospedeira, e, portanto não é normalmente ou naturalmente encontrado em e/ou produzido por uma dada célula na natureza.

O termo “elemento regulador se refere a seqüências de controle transcricional e traducional, tal como promotores, acentuadores, sinais de poliadenilação, terminadores, sinais de degradação de proteína, e os semelhantes, que sustentam e/ou regulam expressão de uma seqüência de codificação e/ou produção de um polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira.

O termo “transformação se refere a uma mudança genética permanente ou transiente induzida em uma célula seguindo introdução de ácido nucleico novo. Mudança genética (modificação) pode ser realizada ou por incorporação de novo DNA no genoma da célula hospedeira, ou por manutenção transiente ou estável do novo DNA como um elemento epissômico. Em células eucarióticas, uma mudança genética permanente é geralmente atingida por introdução do DNA no genoma da célula. Em células procarióticas, uma mudança genética permanente pode ser introduzida no cromossomo ou através de elementos extracromossômicos tal como plasmídeos e vetores de expressão, que podem conter um ou mais marcadores selecionáveis para auxiliar na sua manutenção na célula hospedeira recombinante.

O termo “operacionalmente ligado se refere a uma justaposição caracterizada pelo fato de que os componentes assim descritos estão em uma relação permitindo que eles funcionem em sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotídeos se o promotor afeta a transcrição ou expressão da seqüência de nucleotídeos.

Os termos “célula hospedeira e microorganismo hospedeiro são usados permutavelmente neste lugar para se referir a qualquer célula arqueobacteriana, bacteriana, ou eucariótica viva na qual um ácido nucleico heterólogo pode ser ou foi inserido. O termo também se refere à progênie da célula original, que não necessariamente precisa ser completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total ao genitor original, devido a mutação natural, acidental, ou deliberada.

O termo “sintético se usado em referência a ácidos nucléicos significa o anelamento de blocos de construção de oligonucleotídeo quimicamente sintetizados para formar segmentos gênicos, que são então enzimaticamente unidos para construir o gene inteiro. Síntese de ácidos nucléicos através de meios químicos significa que os nucleotídeos componentes foram unidos in vitro.

O termo “natural se aplicado a um ácido nucleico, uma célula, ou um organismo, se refere a um ácido nucleico, célula, ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou seqüência de polinucleotídeos que está presente em um organismo não patológico (não doente) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado por um homem no laboratório é natural.

O termo “naturalmente ocorrente se aplicado a um ácido nucleico, uma enzima, uma célula, ou um organismo, se refere a um ácido nucleico, enzima, célula, ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou seqüência de polinucleotídeos que está presente em um organismo que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado por um homem no laboratório é naturalmente ocorrente.

O termo “fragmento biologicamente ativo se aplicado a uma proteína, polipeptídeo ou enzima se refere a porção(Ões) funcional(is) das proteínas ou polipeptídeo ou enzima. Funcionalmente equivalentes podem ter seqüências de aminoácidos variantes podem surgir, e.g., como uma conseqüência de redundância de códons e equivalência funcional que são conhecidos por ocorrerem naturalmente dentro de seqüências de ácidos nucleicos e as proteínas assim codificadas. Proteínas ou peptídeos funcionalmente equivalentes podem ser altemativamente construídos através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante, na qual mudanças na estrutura protéica podem ser manipuladas, baseado em considerações das propriedades dos aminoácidos sendo trocados.

Os termos isoprenóide, composto isoprenóide, produto isoprenóide, terpeno, composto de terpeno, terpenóide, e composto terpenóide são usados permutavelmente neste lugar. Eles se referem a compostos que são capazes de serem derivados de 'PP.

As formas singulares um, uma, e o incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Assim, por exemplo, referência a um vetor de expressão inclui um único vetor de expressão assim como uma pluralidade de vetores de expressão, e referência a a célula hospedeira inclui referência a uma ou mais células hospedeiras, e assim por diante. Adicionalmente é observado que as reivindicações podem ser traçadas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta frase é pretendida para servir como base antecedente para uso de tal terminologia exclusiva como somente, apenas e os semelhantes em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou uso de uma limitação negativa.

A menos que de outra maneira indicado, esta invenção não é limitada a seqüências, vetores de expressão, enzimas, microorganismos hospedeiros, ou processos particulares, como tais podem variar em conformidade com o entendimento daqueles de habitual verso nas artes às quais esta invenção pertence em vista da instrução neste lugar. Terminologia usada neste lugar é para propósitos de descrever formas de realização particulares apenas e não é pretendida para ser limitante.

Células Hospedeiras

Qualquer célula hospedeira adequada pode ser usada na prática da presente invenção. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é um microorganismo hospedeiro geneticamente modificado no qual moléculas de ácido nucleico foram inseridas, deletadas ou modificadas (i.e., mutadas; e.g., por inserção, deleção, substituição, e/ou inversão de nucleotídeos), ou para produzir o composto isoprenóide ou derivado de isoprenóide desejado, ou efetuar uma produção aumentada do composto isoprenóide ou derivado de isoprenóide desejado. Em outra forma de realização, a célula hospedeira é capaz de ser cultivada em meio de crescimento líquido. Em contraste, uma célula de controle é um sujeito ou amostra alternativa usada em um experimento para propósito de comparação, e é tipicamente uma célula parental que não contém a(s) modificação(ões) feitas a uma célula hospedeira correspondente.

Exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas incluem qualquer célula arqueobacteriana, procariótica, ou eucariótica. Exemplos de uma célula arqueobacteriana incluem, mas não são limitados àquelas pertencendo aos gêneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus, e Thermoplasma. Exemplos ilustrativos de linhagens arqueobacterianas incluem, mas não são limitados a: Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus,

Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Thermoplasma acidophilunt, Thermoplasma volcanium.

Exemplos de uma célula procariótica incluem, mas não são limitados àquelas pertencendo aos gêneros: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Metilobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter,

Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus, e Zymomonas.

Exemplos ilustrativos de linhagens procarióticas bacterianas incluem, mas não são limitados a: Bacillus subtilis, Bacillus 15 amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loci, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella 20 enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella jlexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, e os semelhantes.

Em geral, se uma célula hospedeira bacteriana é usada, uma linhagem não patogênica é preferida. Exemplos ilustrativos de linhagens não patogênicas incluem, mas não são limitados a: Bacillus subtilis, Escherichia 25 coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudita, Rhodobacter sphaeroides, Rodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, e as semelhantes.

Exemplos de células eucarióticas incluem, mas não são limitados a células fungicas. Exemplos de célula fungica incluem, mas não são limitados àqueles pertencendo aos gêneros: Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotococcus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penicillium, Pichia, Saccharomyces, Trichoderma e Xanthophyllomyces (anteriormente Phaffia).

Exemplos ilustrativos de linhagens eucarióticas incluem, mas não são limitados a: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida albicans, Chrysosporium lucknawense, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Pichia angusta, Pichia finlandica, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia opuntiae, Pichia pastoris, Pichia pijperi, Pichia quercuum, Pichia salictaria, Pichia thermotolerans, Pichia trehalophila, Pichia, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Saccaromyces bayanus, Saccaromyces boulardi, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus, Trichoderma reesei e Xanthophyllomyces dendrorhous (anteriormente Phaffia rhodozyma).

Em geral, se uma célula eucariótica é usada, uma linhagem não patogênica é preferida. Exemplos ilustrativos de linhagens não patogênicas incluem, mas não são limitados a: Fusarium grarninearum, Fusarium venenatum, Pichia pastoris, Saccaromyces boulardi, e Saccaromyces cerevisiae.

Em adição, certas linhagens foram designadas pela Food and Drug Administration como GRAS ou Geralmente Consideradas Como Seguras. Estas linhagens incluem: Bacillus subtilis, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, e Saccharomyces cerevisiae.

Vias de IPP

As células hospedeiras da presente invenção compreendem ou utilizam a via de MEV, a via de DXP ou ambas para sintetizar IPP e seu isômero, DMAPP. Em geral, eucariotos outros do que plantas usam o isoprenóide da via de MEV exclusivamente para converter acetil-CoA to IPP, que é subsequentemente isomerizado para DMAPP. Procariotos, com algumas exceções, usam a via independente de mevalonato ou de DXP para produzir 1PP e DMAPP separadamente através de um ponto de ramificação. Em geral, plantas usam tanto a via de MEV como via de DXPs para síntese de IPP.

Via de MEV

Uma representação esquemática da via de MEV é descrita em Figura 1 A. Em geral, a via compreende seis etapas.

Na primeira etapa, duas moléculas de acetil-coenzima A são enzimaticamente combinadas para formar acetoacetil.- Co A. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, acetil-CoA tiolase (também conhecida como acetilCoA acetiltransferase). Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados aos seguintes números de acesso de GenBank e ao organismo a partir do qual as seqüências foram derivadas: (NC...000913 REGIÃO: 2324131..2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), e (L20428; Saccharomyces cerevisiae).

Na segunda etapa da via de MEV, acetoacetil-CoA é enzimaticamente condensada com outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (NC_001145. complemento 19061..2053 6; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), e (NC_002758, Locus tag SAV2546, GenelD 1122571; Staphylococcus aureus).

Na terceira etapa, HMG-CoA é enzimaticamente convertida para mevalonato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA redutase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GenelD 1122570; Staphylococcus aureus), (NM_204485; Gallus genus), (ABO 15627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; Nicotiana attenuate), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AXI28213, fornecendo a seqüência codificando uma HMGR truncada; Saccharomyces cerevisiae), e (NC_001145: complemento (115734.. 118898; Saccharomyces cerevisiae).

Na quarta etapa, mevalonato é enzimaticamente fosforilado para formar mevalonato 5-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (L77688; Arabidopsis thaliana), e (X55875; Saccharomyces cerevisiae).

Na quinta etapa, um segundo grupo de fosfato é enzimaticamente adicionado a mevalonato 5-fosfato para formar mevalonato 5-pirofosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, fosfomevalonato lcmase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (A1’4293 8); Heveabrasiliensis), (NM 006556; Homo sapiens), e (NQ001145. complemento 712315.313670; Saccharomyces cerevisiae).

Na sexta etapa, mevalonato 5-pirofosfato é enzimaticamente convertido em IPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato pirofosfato descarboxilase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), e (U49260;

Homo sapiens).

Se IPP é para ser convertido para DMAPP, então uma sétima etapa é requerida. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, IPP isomerase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (NC 000913, 3031087..3031635; Escherichia coli), e (AF082326; Haematococcus pluvialts). Se a conversão para DMAPP é requerida, uma expressão aumentada de IPP isomerase assegura que a conversão de IPP em DMAPP não representa uma etapa que limita a taxa na via geral.

Via de DXP

Uma representação esquemática da via de DXP é descrita em Figura IS. Em geral, a via de DXP compreende sete etapas. Na primeira etapa, piruvato é condensado com D-gliceraldeído 3-fosfato para fazer 1-deóxi-Dxilulose-5-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (AF035440; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella enterica Paratyphi, veja ATCC 9150), (NC_007493, locus tag RSP_0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC_004556, locus tag PD 1293; Xylella fastidiosa Temeculal), e (NC_003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana).

Na segunda etapa, I -deóxi-D-xilulose-5-fosfato é convertido para 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 1-deóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (A13013300; Escherichia coil), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, locus tag PPI 597; Pseudomonas putida KT2440), (A 1,939124, locus tag SCO5694; Streptomyces coelicolor A3(2)), (NC_007493, locus tag RSP 2709; Rhodabacter sphaeroides 2.4.1), e (NC_007492, locus tag Pfl_l 107; Pseudomonas fluorescens PfO-1).

Na terceira etapa, 2C-metil-D-eritrol-4-fosfato é convertido para 4-difosfocitidil-2C-metil-Deritritol. Uma enzima conhecida por catalisar 5 esta etapa é, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-Deritritol sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (AF230736; Escherichia coli), (NC_007493, locus_tag RSP_2835; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_003071, locus_tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana), e (NC_002947, locus_tag PPI614;

Pseudomonas putida KT2440).

Na quarta etapa, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritrol é convertido para 4-difosfocitidil-2Cmetil-D-eritrol-2-fosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 4- difosfocitidil-2C-metilD-eritrol quinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos 15 incluem, mas não são limitados a: (AF216300; Escherichia coli) e (NC_007493, locus_tag RSP_1779; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)..

Na quinta etapa, 4-difosfocitidil-2C-metil-D₇eritritol-2-fbsfato é convertido para 2C-metil-Deritritol 2, 4-ciclodifosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, 2C-metil-Deritritol 2, 420 ciclodifosfato sintase: Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (AF230738; Escherichia (NC_007493, locus_tag RSP_6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC_002947, locus_tag PP 1618; Pseudomonas putida KT2440).

Na sexta etapa, 2C-metil-D-eritrol 2, 4-ciclodifosfato é 25 convertido para l-hidróxi-2-metil-2-(E)- butenil-4-difosfato. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, I-hidróxi-2-metil-2-(E)butenil-4-difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem, mas não são limitados a: (AY033515; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0853; Pseudomonas putida KT2440), e (NC_007493, locustag RSP_2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1).

Na sétima etapa, l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butertil-4-difosfato é convertido ou em IPP ou seu isômero, DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, isopentil/dimetilalil difosfato sintase.

Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AY062212; Escherichia coli) e (NC_002947, locus_tag PP0606; Pseudomonas putida KT2440).

Em algumas formas de realização, linha cruzada (ou interferência) entre os processos metabólicos da própria célula hospedeira e • 10 aqueles processos envolvidos com a produção de IPP como fornecidos pela presente invenção são minimizados ou eliminados inteiramente. Por exemplo, linha cruzada é minimizada ou eliminada inteiramente quando o microorganismo hospedeiro conta exclusivamente na via de DXP para sintetizar IPP, e uma via de MEV é introduzida para fornecer IPP adicional.

Um tal organismo hospedeiro não estaria equipado para alterar a expressão das enzimas da via de MEV ou processar os intermediários associados com a via de MEV. Organismos que contam exclusivamente ou predominantemente com a via de DXP incluem, por exemplo, Escherichia coli.

Em algumas formas de realização, a célula hospedeira produz

IPP através da via de MEV, ou exclusivamente ou em combinação com a via de DXP. Em outras formas de realização, uma via de DXP de hospedeiro é funcionalmente desativada de forma que a célula hospedeira produz IPP exclusivamente através de uma via de MEV heterologamente introduzida. A via de DXP pode ser desativada funcionalmente desativando expressão gênica ou inativando a função de uma ou mais das enzimas da via de DXP. Compostos C5

Compostos C₅ da invenção geralmente são derivados de IPP ou DMAPP. Estes compostos também são conhecidos como hemiterpenos porque eles são derivados de uma única unidade de isopreno (EPP ou

DMAPP).

Isopreno

Isopreno, cuja estrutura é

é encontrado em muitas plantas. Isopreno é feito a partir de IPP por isopreno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem mas não são limitados a: (AB 198190; Populus alba) e (AJ294819; Populus alba x Populus tremula).

Compostos Cjo

Compostos Cio da invenção geralmente derivados de geranil pirofosfato (GPP) que é feito pela condensação de IPP com DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, geranil pirofosfato sintase. Estes compostos Cio também são conhecidos como monoterpenos porque eles são derivados de duas unidades de isopreno.

Figura 2 mostra esquematicamente como IPP e DMAPP podem produzir GPP, o qual pode ser adicionalmente processado para um monoterpeno.

Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos para geranil pirofosfato sintase incluem mas não são limitados a: (AF5I3111; Abies grandis), (AFS 13112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AE016877, Locus AP11092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia brewers), (AY953508; Ips pins), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Para coccus zearanthinifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), e (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).

GPP é então subseqüentemente convertido para uma variedade de compostos Cio. Exemplos ilustrativos de compostos Cjo incluem, mas não são limitados:

Careno

Careno, cuja estrutura é

é encontrado na resina de muitas árvores, particularmente árvores de pinheiros. Careno é feito a partir de GPP a partir de careno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: (AF461460, REGIÃO 43..1926; Picea abies) e (AF527416, REGIÃO: 78.. 1871; Salvia stenophylla).

Geraniol

Geraniol (também conhecida como rodnol), cuja estrutura é

é o principal componente de óleo de rosas e óleo de palmarosa. Ele também ocorre em gerânio, limão, e citronela. Geraniol é feito a partir de GPP por geraniol sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: (A3457070; Cinnamomum tenuipilum), (AY362553; Ocimum basilicum), (DQ234300; Perilla frutescens linhagem 1864), (DQ234299; Perilla citriodora linhagem 1861), (DQ234298; Perilla citriodora linhagem 4935), e (DQ088667; Perilla citriodora) Linalol

Linalol, cuja estrutura é

É encontrado em muitas flores e plantas de tempero tal como sementes de coentro. Linalol é feito a partir de GPP por linalol sintase. Exemplos ilustrativos de uma seqüência de nucleotídeos adequada incluem, mas não são limitados a: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294,

Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana), (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF154124; Artemisia annua), (AF067603; Clarkia breweri), (AF067602; Clarkia concinna), (AF067601;

Clarkia brewers), (1158314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum), (DQ263741; Lavandula angustifolia), (AY083653; Mentha citrate), (AY693647; Ocimum basilicum), (XM_463918; Oryza saliva), - 10 (AP004078, Locus BAD07605; Oryza saliva), (XM_463918, Locus

3CP_463918; Oryza saliva), (AY917193; Perilla citriodora), (AF271259;

Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitchensis), e (AF444798; Perillafrutescens var. crisps cultivar No. 79).

Limoneno

é encontrado na casca de frutas cítricas e hortelã. Limoneno é feito a partir de GPP por limoneno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: (+)-limoneno sintases (AF514287, REGIÃO: 47..1867; Citrus limon) e (AY055214, 20 REGIÃO: 48..1889; Agastache rugosa) e (-)-limoneno sintases (DQ195275,

REGIÃO: 1.. 1905; Picea sitchensis), (AF006193, REGIÃO: 73..1986; Abies grandis), e (MHC4SLSP, REGIÃO: 29.. 1828; Mentha spicata).

Mirceno

Mirceno, cuja estrutura é

É encontrado no óleo essencial em muitas plantas incluindo folha de louro, verbena, e myrcia da qual recebe seu nome. Mirceno é feito a partir de GPP por mirceno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: (U87908; Abies 5 grandis), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (NM_I27982; Arabidopsis thaliana TPS10), (NM_I 13485 ; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (AF271259; Perak frutescens), (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abler), e (A1304839; Quercus ilex).

- 10 Qcimeno a- e β-Ocimeno, cujas estruturas são respectivamente, são encontrados em uma variedade de plantas e frutos incluindo Ocimum basilicum e é feito a partir de GPP por ocimeno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: 15 (AY195607; Antirrhinum majus), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana), (NM _113485; Arabidopsis thaliana ATIPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana A1T 1³S-ON), (NM_i 17775; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (Nlvl_001036574; Arabidopsis thaliana A 1TPS03), (NM_127982;

Arabidopsis thaliana TPS 10), (AB 110642; Citrus unshiu CitMTSIA), e (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus).

g-Pineno α-Pineno, cuja estrutura é é encontrado em árvores de pinheiro e eucalipto. g-Pineno é feito a partir de

GPP por g-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: (+) a-pineno sintase (AF543530, REGIÃO: 1..1887; Pinus taeda), (-)a-pineno sintase (AF543527, REGIÃO: 32..1921; Pinus taeda), e (+)/(-)a-pineno sintase (AGU87909, REGIÃO: 6111892; Abies grandis).

β-Pineno β-Pineno, cuja estrutura é

é encontrado em árvores de pinheiro, alecrim, salsa, endro, manjericão, e rosa. $-Pineno é feito a partir de GPP por β-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a: () α-pineno sintases (AF276072, REGIÃO: 1..1749; Artemisia annua) e (AF514288, REGIÃO: 26.. 1834; Citrus Union).

Sabineno

Sabineno, cuja estrutura é

é encontrado em pimenta preta, sementes de cenoura, sálvia, e árvores de chá. Sabineno é feito a partir de GPP por sabineno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui mas não é limitado a AF05190 I, REGIÃO: 26..1798 de Salvia qfficinalis.

γ-Terpineno γ-Terpineno, cuja estrutura é

é um constituinte do óleo essencial de árvores cítricas. Bioquimicamente, γ26 terpineno é feito a partir de GPP por γ-terpineno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem: (AF514286, REGIÃO: 30..1832 de Citrus limon) e (AB110640, REGIÃO 1..1803 de Citrus unshiti).

Terpinoleno

Terpinoleno, cuja estrutura é

é encontrado em groselha negra, cipreste, goiaba, lichia, mamão, pinheiro, e chá. Terpinoleno é feito a partir de GPP por terpinoleno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui, mas não é limitado a AY906866, REGIÃO: 10..1887 de Pseudotsuga menziesii.

Compostos C]₅

Compostos Cis da invenção geralmente são derivados de famesil pirofosfato (FPP) que é feito pela condensação de duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, famesil pirofosfato sintase. Estes compostos Cis também são conhecidos como sesquiterpenos porque eles são derivados de três unidades de isopreno.

Figura 2 mostra esquematicamente como IPP e DMAPP podem ser combinados para produzir FPP, o qual pode ser adicionalmente processado para um sesquiterpeno.

Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos para famesil pirofosfato sintase incluem, mas não são limitados a: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum

ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi),'(CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF'019892; Helianassim annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyce,s cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), • 10 (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS 10270), (NC_008023, Locus YP 600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS 10750), e (MZEFPS; Zea mays).

Altemativamente, FPP também pode ser feito adicionando IP?

a OPP. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos codificando para uma enzima capaz desta reação incluem, mas não são limitados a: (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (UI 2678, Locus AAC28894; Bradyrhizobiumjaponicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K), (NC 005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz LI-130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YF'_208768;

Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (105091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus

AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6), e (NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temecula 1).

FPP é então subseqüentemente convertida para uma variedade de compostos Ci5. Exemplos ilustrativos de compostos Cis incluem, mas não são limitados a:

Amorfadieno

Amorfadieno, cuja estrutura é

é um precursor para artemisinina que é feita por Artemisia arma. Amorfadieno é feito a partir de FPP por amorfadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada é SEQ ID NO. 37 de Patente NorteAmericana No. 7.192.751.

a-Fameseno	α-Fameseno, cuja estrutura é >
é encontrado	em várias fontes biológicas incluindo mas não limitado à

glândula de Dufour em formigas e no revestimento de cascas de maça e pêra. α-Fameseno é feito a partir de FPP por α-fameseno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a DQ309034 de Pyrus communis cultivar d'Anjou (pera; nome de gene AFSI) e AY18224 I de Ma/us domestica (maça; gene AFS1). Pechouus et al., Planta 219(1):84-94 (2004).

β-Fameseno β-Fameseno, cuja estrutura é

é encontrado em várias fontes biológicas incluindo mas não limitado a afídeos e óleos essenciais tal como de menta. Em algumas plantas tal como batata selvagem, β-fameseno é sintetizado como um repelente natural contra insetos. β-Fameseno é feito a partir de FPP por β-fameseno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não é limitado a número de acesso de GenBank AF024615 de Mentha x piperita (hortelã; gene Tspal 1), e AY835398 de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).

Famesol

Famesol, cuja estrutura é

é encontrado em várias fontes biológicas incluindo insetos e óleos essenciais tal como de citronela, néroli, ciclâmen, capim-limão, tuberose, e rosa. Famesol é feito a partir de FPP por uma hidroxilase tal como famesol sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem, mas não são limitados a número de acesso de GenBank AF529266 de Zea mays e YDR481C de Saccharomyces cerevisiae (gene Pho8). Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006).

Nerolidol

Nerolidol, cuja estrutura é

é também conhecido como peruviol, e é encontrado em várias fontes biológicas incluindo como óleos essenciais tal como de néroli, gengibre, jasmim, alfazema, árvore de chá, e capim-limão. Nerolidol é feito a partir de FPP por uma hidroxilase tal como nerolidol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui, mas não é limitado a AF529266 de Zea mays (milho; gene tpsl).

Patchoulol

Patchoulol, cuja estrutura é .OH

é também conhecido como álcool patchouli e é um constituinte do óleo essencial de Pogostemon patchouli. Patchouliol é feito a partir de FPP por patchouliol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui, mas não é limitado a AY508730 REGIÃO: 1..1659 de 5 Pogostemon cablin.

Valenceno

Valenceno, cuja estrutura é é um dos principais componentes químicos do cheiro e sabor de laranjas e é encontrado em cascas de laranja. Valenceno é feito a partir de FPP por 10 nootkatona sintase. Exemplos ilustrativos de uma seqüência de nucleotídeos adequada incluem, mas não são limitados a AF441124 REGIÃO: 1..1647 de Citrus sinensis e AY917195 REGIÃO: 1..1653 de Perilla frutescens.

Compostos Cn,

Compostos C₂o da invenção geralmente derivados de geranilgeraniol pirofosfato (GGPP) que é feito pela condensação de três moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP. Uma enzima conhecida por catalisar esta etapa é, por exemplo, geranilgeranil pirofosfato sintase. Estes compostos C₂o também são conhecidos como diterpenos porque eles são derivados de quatro unidades de isopreno.

Figura 2 mostra esquematicamente como IPP e DMAPP podem ser combinados para produzir GGPP, o qual pode ser adicionalmente processado para um diterpeno, ou pode ser adicionalmente processado para produzir um carotenóide.

Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos para geranilgeranil pirofosfato sintase incluem, mas não são limitados a:

(ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZAMMO10003 80, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanassim roseus), (NZAABF02000074, Locus ZP OO144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentil, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella jujikuroi), (AY 3'71321; Ginkgo btloba), (AB055496; Hevea brasitiensis), (ABM /9/1; Homo sapiens), (MC 1276129; Mucor circinelloides lusitanicus), (ABO 16044; Mus musculus), (AABX01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (ABO 16095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius), (NC_007759, Locus YP 461832; Syntrophus aciditrophicus SB), e (NC 006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ES114).

Altemativamente, GGPP também pode ser feito adicionando IPP a FPP. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos codificando uma enzima capaz desta reação incluem, mas não são limitados a: (N/4_l 12315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA /4124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides), e (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UAI 59).

GGPP é então subseqüentemente convertido para uma variedade de isoprenóides C20· Exemplos ilustrativos de compostos C20 incluem mas não são limitados a:

Geranilgeraniol

Geranilgeraniol, cuja estrutura é

é um constituinte de óleo de madeira de Cedrela toona e de óleo de linhaça. Geranilgeraniol pode ser feito por e.g., adicionando às construções de expressão um gene de fosfatase depois do gene para uma GGPP sintase. Abietadieno

Abietadieno abrange os seguintes isômeros:

abietadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui, mas não são limitados a: (U50768; Abies grandis) e (AY473621; Picea abies).

Compostos C20+

Compostos C20+ também estão dentro do escopo da presente invenção. Exemplos ilustrativos de tais compostos incluem sesterterpenos (composto C25 feito a partir de cinco unidades de isopreno), triterpenos (compostos C₃₀ feitos a partir de seis unidades de isopreno), e tetraterpenos (composto C40 feito a partir de oito unidades de isopreno). Estes compostos são feitos usando métodos similares descritos neste lugar e substituindo ou adicionando seqüências de nucleotídeos para a(s) sintase(s) apropriada(s).

Vias de Engenharia

A presente invenção utiliza uma via de MEV e/ou de DXP manipulada para efetuar a produção de lato nível de isoprenóides em uma célula hospedeira. A via é tipicamente manipulada através de tecnologia de DNA recombinante expressando seqüências heterólogas codificando enzimas em pelo menos uma destas vias.

Os ácidos nucleicos de objeto de estudo podem ser expressos por um único ou múltiplos vetores. Por exemplo, um único vetor de expressão pode compreender pelo menos duas, três, quatro, cinco, ou todas as seqüências heterólogas codificando as enzimas da via de MEV ou de DXP inteira. Enquanto que a escolha de único ou múltiplos vetores pode depender do tamanho das seqüências heterólogas e da capacidade dos vetores, ela será 5 amplamente dependente da produção geral de um dado isoprenóide que o vetor é capaz de fornecer quando expresso em uma célula hospedeira selecionada. Os vetores de objeto de estudo podem permanecer replicáveis epissomicamente ou como uma parte integral do genoma de célula hospedeira. Tipicamente, o ultimo é preferido para uma propagação 10 sustentada da célula hospedeira.

Em certas células hospedeiras, a uma ou mais seqüências heterólogas codificando as enzimas da via de MEV ou de DXP podem ser controladas por um ou mais operons. Em algumas instâncias, um sistema de dois ou três operon fornece uma maior produção de um isoprenóide do que 15 um sistema de único operon.

Onde desejado, as seqüências de ácidos nucleicos sujeito podem ser modificadas para refletir a preferência de códons de uma célula hospedeira selecionada para efetuar uma maior expressão de tais seqüências em uma célula hospedeira. Por exemplo, as seqüências de nucleotídeos sujeito 20 serão em algumas formas de realização modificadas para preferência de códons de levedura. Veja, e.g., Bennetzen and Hall (1982) J: Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Como outro exemplo não limitante, as seqüências de nucleotídeos serão em outras formas de realização modificadas para preferência de códons de E. coli. Veja, e.g., Gouy and Gautier (1982) Nucleic 25 Acids Res. 10(22) :7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13(6) :864-872. Veja também Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292. Tabelas para utilização de códons para muitos organismos estão disponíveis, que podem ser usadas como uma referência para construir seqüências da presente invenção. O uso de códons prevalentes de um dado microorganismo hospedeiro geralmente aumenta a propensão de tradução, e, portanto o nível de expressão das seqüências desejadas.

Preparação dos ácidos nucléicos sujeito pode ser realizada por uma variedade de técnicas recombinantes e procedimentos sintéticos de 5 rotina. Resumidamente, os ácidos nucléicos sujeito podem ser fragmentos de DNA genômico, cDNAs, e RNAs preparados, todos os quais podem ser extraídos diretamente de uma célula ou recombinantemente produzidos por vários processos de amplificação incluindo mas não limitado a PCR e rt-PCR.

Síntese química direta de ácidos nucléicos tipicamente envolve 10 adição seqüencial de monômeros de nucleotídeos 3’-bloqueados e 5’ bloqueados ao grupo hidroxila 5' terminal de uma cadeia de polímeros de nucleotídeos crescente, caracterizado pelo fato de que cada adição é efetuada por ataque nucleofílico do grupo hidroxila 5' terminal da cadeia crescente na posição 3' do monômero adicionado, que é tipicamente um derivado de 15 fósforo, tal como um fosfotriéster, fosforamidita, ou os semelhantes. Tal metodologia é conhecida to aqueles de habitual verso na arte e é descrita nos textos e literatura pertinentes (por exemplo, Matteuei et al. (1980) Tet. Lett. 521:719; Patente Norte-Americana No. 4.500.707 a Caruthers et al.; e Patente Norte-Americana Nos. 5.436.327 e 5.700.637 a Southem et al.).

O nível de transcrição de um ácido nucleico em um microorganismo hospedeiro pode ser aumentado de diversas maneiras. Por exemplo, isto pode ser atingido aumentando o número de cópias da seqüência de nucleotídeos codificando a enzima (e.g., usando um maior número de cópias de vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nucleotídeos 25 codificando a enzima, ou introduzindo cópias adicionais de uma seqüência de nucleotídeos codificando a enzima no genoma do microorganismo hospedeiro, por exemplo, por recombinação mediada por recA, uso de vetores suicidas, recombinação usando lambda fago recombinase, e/ou inserção através de um transposon ou elemento reversível). Em adição, isto pode ser realizado mudando a ordem das regiões de codificação no mRNA policistrônico de um operon ou fragmentando um operon em genes individuais, cada um com seus próprios elementos de controle, ou aumentando a força do promotor (seqüência de iniciação de transcrição ou 5 controle de transcrição) com as quais* a região de codificação de enzima é operacionalmente ligada (por exemplo, usando um promotor induzível por arabinose ou lactose consenso em um microorganismo hospedeiro de Escherichia coli no lugar de um promotor induzível por lactose modificado, tal como aquele encontrado em pBluescript e os plasmídeos pBBRI MCS), ou 10 usando um promotor induzível e induzindo o promotor induzível adicionando um produto químico a um meio de crescimento. O nível de tradução de uma seqüência de nucleotídeos em um microorganismo hospedeiro pode ser aumentado de diversas maneiras, incluindo, mas não limitado a, aumentando a estabilidade do mRNA, modificando a seqüência do sítio de ligação de 15 ribossomo, modificando a distância ou seqüência entre o sítio de ligação de ribossomo e o códon de início da seqüência de codificação da enzima, modificando a região intercistrônica inteira localizada antes de ou adjacente ao lado 5' do códon de início da região de codificação de enzima, estabilizando a extremidade 3' do transcrito de mRNA usando estruturas em 20 forma de grampo e seqüências especializadas, modificando o uso de códons de enzima, alterando expressão de tRNAs de códons raros usados na biossíntese da enzima, e/ou aumentando a estabilidade da enzima, como, por exemplo, através de mutação de sua seqüência de codificação. Determinação de códons preferidos e tRNAs de códons raros pode ser baseada em uma 25 análise de seqüência de genes derivados do microorganismo hospedeiro.

A atividade de um MEV, DXP, ou preniltransferase em um hospedeiro pode ser alterada de diversas maneiras, incluindo, mas não limitado a, expressando uma forma modificada da enzima que exibe solubilidade aumentada na célula hospedeira, expressando uma forma alterada da enzima que carece de um domínio através do qual a atividade da enzima é inibida, expressando uma forma modificada da enzima que tem um Kcat maior ou um Km menor para o substrato, ou expressando uma forma alterada da enzima que não é afetada por regulação por retroalimentação ou alimentação avante por outra molécula na via. Tais enzimas variantes também podem ser isoladas através de mutagênese aleatória de uma enzima de especificidade mais ampla, como descrito abaixo, e uma seqüência de nucleotídeos codificando tal enzima variante pode ser expressa a partir de um vetor de expressão ou a partir de um gene recombinante integrado no genoma de um microorganismo hospedeiro.

O vetor de objeto de estudo pode ser construído para produzir um nível desejado de números de cópias da enzima codificada. Em algumas formas de realização, os vetores de objeto de estudo produzem pelo menos 10, entre 10 a 20, entre 20-50, entre 50-100, ou mesmo mais do que 100 cópias da HMG-CoA redutase, mevalonato quinase, ou ambos. Plasmídeos com número de cópias baixo geralmente fornecem menos do que cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula; plasmídeos com número de cópias médio geralmente fornecem de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 50 cópias de plasmídeo por célula, ou de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula; e plasmídeos com número de cópias alto geralmente fornecem de cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 200 cópias de plasmídeo por célula, ou mais.

Vetores de expressão com poucas cópias adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a, pACYC184, pBeloBacl 1, pBR332, pBAD33, pBBRIMCS e seus derivados, pSCIOl, SuperCos (cosmídeo), e pWE 15 (cosmídeo). Vetores de expressão com número de cópias médio adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a pTrc99A, pBAD24, e vetores contendo uma origem de replicação ColEl e seus derivados. Vetores de expressão com número de cópias alto adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a, vetores pUC, pBluescript, pGEM, e pTZ. Vetores de expressão com número de cópias baixo (centroméricos) adequados para levedura incluem, mas não são limitados a, pRS415 e pRS416 (Sikorski & Hieter (1989) Genetics 122:1927). Vetores de expressão com número de cópias alto de 2 mícrons adequados em levedura incluem, mas não são limitados a, pRS425 e pRS426 (Christainson et al. (1992) Gene 110:119-122). Vetores de expressão de 2 mícrons alternativos incluem variantes não selecionáveis do vetor de 2 mícrons (Bruschi & Ludwig (1988) Curr. Genet. 15:83-90) ou plasmídeos de 2 mícrons intactos sustentando uma gaveta de expressão (como exemplificado em Pedido de Patente Norte-Americana 20050084972) ou plasmídeos de 2 mícrons sustentando um marcador de seleção defeituoso tal como LEU2d (Erharut et al. (1983) J. Bacteriol. 156 (2): 625-635) ou URA3d (Okkels (1996) Annals of the New York Academy of Sciences 782(1): 202- 207).

Elementos reguladores incluem, por exemplo, promotores e operadores também podem ser manipulados para aumentar o fluxo metabólico das vias de MEV ou de DXP aumentando a expressão de um ou mais genes que desempenham um papel importante na determinação da produção geral de um isoprenóide produzido. Um promotor é uma seqüência de nucleotídeos que inicia e controla a transcrição de uma seqüência de ácidos nucleicos por uma enzima RNA polimerase. Um operador é uma seqüência de nucleotídeos adjacente ao promotor que funciona para controlar transcrição da seqüência de ácidos nucleicos desejada. O operador contém um domínio de ligação de proteína onde uma proteína repressora específica pode se ligar. Na ausência de uma proteína repressora adequada, transcrição inicia através do promotor. Na presença de uma proteína repressora adequada, a proteína repressora se liga ao operador e com isso inibe transcrição do promotor. Promotores e operadores também são referidos como reguladores transcricionais.

Em algumas formas de realização da presente invenção, promotores usados em vetores de expressão são induzíveis. Em outras formas de realização, os promotores usados em vetores de expressão são constitutivos. Em algumas formas de realização, uma ou mais seqüências de ácidos nucleicos são operacionalmente ligadas a um promotor induzível, e uma ou mais outras seqüências de ácidos nucleicos são operacionalmente ligadas a um promotor constitutivo.

Exemplos não limitantes de promotores adequados para uso em células hospedeiras procarióticas incluem um promotor de RNA polimerase de bacteriófago T7; um promotor de tap; um promotor de operon lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor lac/tac híbrido, um promotor tac/trc híbrido, um promotor trp/lac, um promotor T7/lac; um promotor de trc; um promotor de tac, e os semelhantes; um promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tal como um promotor de ssaG ou um promotor relacionado (veja, por exemplo, Publicação de Patente NorteAmericana No. 20040131637), um promotor pagC (Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1):86-93; Alpuche-Aranda at al. (1992) Prot. Natl. Acad. Sei. USA. 89(21):10079-83), um promotor nirB (Harbome et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), e os semelhantes (veja, por exemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. 'minim. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); um promotor sigma70, por exemplo, um promotor sigma70 consenso (veja, por exemplo, Nos. de Acesso de GenBank AX798980, AX798961, e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotor spy, e os semelhantes; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (veja, por exemplo, W096117951); um promotor actA (veja, por exemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immure. 70:10871096); um promotor rpsM (veja, por exemplo, Valdivia and Falkow (1996) Mol. Microbial. 22:367 378); um promotor tet (veja, por exemplo, Hillen at al. (1989) In Saenger W. and Heinemann U. (ads) Topics in Molecular and

Structural Biology, Protein—Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); um promotor SP6 (veja, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056); e os semelhantes.

Em algumas formas de realização, a atividade total de uma enzima MEV ou DXP heteróloga que desempenha um grande papel na produção geral de um isoprenóide em relação a outras enzimas nas respectivas vias é aumentada expressando a enzima a partir de um promotor forte. Promotores fortes adequados para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a Trc, Tac, T5, T7, e PLambda, Em outra forma de realização da 10 presente invenção, a atividade total da uma ou mais enzimas de via de MEV em um hospedeiro é aumentada expressando a enzima a partir de um promotor forte em um plasmídeo com alto número de cópias. Exemplos adequados, para Escherichia coli incluem, mas não são limitados a usar promotores Trc, Tac, T5, T7, e PLambda com vetores pBAD24, pBAD18, 15 pGEM, pBluescript, pUC, e pTZ.

Exemplos não limitantes de promotores adequados para uso em células hospedeiras eucarióticas incluem, mas não são limitados a, um promotor CMV de resposta imediata, um promotor 'RSV timidina quinase, um promotor SV40 imediato ou tardio, LTRs de retrovírus, e um promotor de 20 metalotioneina-1 de camundongo.

Exemplos não limitantes de promotores constitutivos adequados para uso em células hospedeiras procarióticas incluem um promotor sigma70 (por exemplo, um promotor sigma70 consenso). Exemplos não limitantes de promotores induzíveis adequados para uso em células 25 hospedeiras bacterianas incluem o pL de bacteriófago k, Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrplac); um promotor induzível por isopropil-beta-D44 tiogalactopiranosídeo (IPTG), por exemplo, um promotor lacZ, um promotor induzível por tetraciclina; um promotor induzível por arabinose, por exemplo, PBAD (veja, por exemplo, Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177:412140

4130); um promotor induzível por xilose, por exemplo, Pxyl (veja, por exemplo, Kim et al. (1996) Gene 181:71-76); um promotor GAL1; um promotor de triptofano; um promotor lac; um promotor induzível por álcool, por exemplo, um promotor induzível por metanol, um promotor induzível por 5 etanol; um promotor induzível por ramose; um promotor induzível por calor, por exemplo, um promotor induzível por calor lambda PL; um promotor controlado por um repressor sensível a calor (por exemplo, vetores de expressão baseados em lamba reprimidos por CI857; veja, por exemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2):327-34); e os 10 semelhantes.

Exemplos não limitantes de promotores constitutivos adequados para uso em células hospedeiras de leveduras incluem um promotor ADH 1, um ADH2, um PGK, ou um LEU2. Exemplos não limitantes de promotores induzíveis adequados para uso em células 15 hospedeiras de leveduras incluem, mas não são limitados a, um promotor induzível por galactose divergente tal como um promotor GAL 1 ou um GAL 10 (West at al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4(11):2467-2478), ou um promotor CUP!. Onde desejado, o vetor de objeto de estudo compreende um promotor que é mais forte do que um promotor de lac de E. coli nativo.

Exemplos não limitantes de operadores para uso em células hospedeiras bacterianas incluem um operador de promotor de lactose (proteína repressora Lea muda conformação quando colocada em contato com lactose, com isso prevenindo que a proteína repressora Lad se ligue ao operador), um operador de promotor de triptofano (quando complexada com 25 triptofano, proteína repressora TrpR tem uma conformação que se liga ao operador; na ausência de triptofano, a proteína repressora TrpR tem uma conformação que não se liga ao operador), e m operador de promotor tac (veja, por exemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:2125.).

Os genes no vetor de expressão tipicamente irão codificar um sítio de ligação de ribossomo para dirigir tradução (isto é, síntese) de qualquer produto de gene de mRNA codificado. Para sítios de ligação de ribossomo adequados para uso em Escherichia coil, veja Shine et al. (1975) Nature 5 254:34, e Steitz, in Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, N.Y. Inserção do sítio de ligação de ribossomo codificando seqüência de nucleotídeos 5'AAAACA-3' antes de uma seqüência de codificação facilita tradução eficiente em um microorganismo hospedeiro de levedura (Looman et al. (1993) Nuc.

Ac. Res. 21:4268-4271; Yun et. al. (1996) Mol. Microbiol. 19:1225-1239).

Outros elementos reguladores que podem ser usados em um vetor de expressão incluem elementos acentuadores de transcrição e terminadores de transcrição. Veja, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544.

Um vetor de expressão pode ser adequado para uso em tipos particulares de microorganismos hospedeiros e não outros. Alguém de habitual verso na arte, entretanto, pode determinar prontamente através de experimentação de rotina se um vetor de expressão particular é adequado para um dado microorganismo hospedeiro. Por exemplo, o vetor de expressão pode 20 ser introduzido no organismo hospedeiro, que é então monitorado para viabilidade e expressão de quaisquer genes contidos no vetor.

O vetor de expressão também pode conter um ou mais genes marcadores selecionáveis que, mediante expressão, conferem uma ou mais características fenotípicas úteis para selecionar ou de outra maneira identificar 25 células hospedeiras que carregam o vetor de expressão. Exemplos não limitantes de marcadores selecionáveis adequados para células eucarióticas incluem resistência a dihidrofolato redutase e neomicina. Exemplos não limitantes de marcadores selecionáveis adequados para células procarióticas incluem resistência a tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, carbenicilina, e canamicina.

Para produção de isoprenóide em uma escala industrial, pode ser não prático ou muito custoso usar um marcador selecionável que requer a adição de um antibiótico ao meio de fermentação. Por conseguinte, algumas formas de realização da presente invenção empregam células hospedeiras que não requerem o uso de um marcador selecionável conferindo resistência a antibiótico para assegurar manutenção de plasmídeo (vetor de expressão). Nestas formas de realização da presente invenção, o vetor de expressão contém um sistema de manutenção de plasmídeo tal como o plasmídeo 60-kb IncP (RK2), opcionalmente junto com o sistema de replicação e/ou segregação de plasmídeo RK2, para efetuar retenção de plasmídeo na ausência de seleção de antibiótico (veja, por exemplo, Sia et al. (1995) J. Bactéria 177:2789-97; Pansegrau et al. (1994) J. Mol. Biol. 239:623-63). Um sistema de manutenção de plasmídeo adequado para este propósito é codificado pelo operon parDE de RK2, que codifica para uma toxina estável e uma antitoxina instável. A antitoxina pode inibir a ação letal da toxina por interação direta de proteína- proteína. Células que perdem o vetor de expressão que abriga o operon parDE são rapidamente desprovidos da antitoxina instável, resultando na toxina estável então causando morte celular. O sistema de replicação de plasmídeo RK2 é codificado pelo gene trfA, que codifica para uma proteína de replicação de DNA. O sistema de segregação de plasmídeo RK2 é codificado pelo operon parCBA, que codifica para proteínas que funcionam para separar multímeros de plasmídeos que podem surgir a partir de replicação de DNA.

Os vetores de objeto de estudo podem ser introduzidos em uma célula hospedeira estavelmente ou transientemente por variedade de técnicas estabelecidas. Por exemplo, um método envolve um tratamento com cloreto de cálcio caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é introduzido através de um precipitado de cálcio. Outros sais, por exemplo, fosfato de cálcio, também podem ser usados seguindo um procedimento similar. Em adição, eletroporação (isto é, a aplicação de corrente para aumentar a permeabilidade de células a ácidos nucleicos) pode ser usada. Outros métodos de transformação incluem microinjeção, transformação mediada por DEAE 5 dextrana, e choque térmico na presença de acetato de lítio. Complexos lipídicos, lipossomos, e dendrímeros também podem ser empregados para transfectar o microorganismo hospedeiro.

Mediante transformação, diversos métodos podem ser praticados para identificar as células hospedeiras nas quais os vetores de 10 objeto de estudo foram introduzidos. Um método de seleção exemplar envolve subcultivar células individuais para formar colônias individuais, seguido por teste para expressão do produto de gene desejado. Outro método exige selecionar células hospedeiras transformadas baseado em características fenotípicas conferidas através da expressão de genes marcadores 15 selecionáveis contidos dentro do vetor de expressão. Aqueles de habitual verso podem identificar células hospedeiras geneticamente modificadas usando estes ou outros métodos disponíveis na arte.

A introdução de várias seqüências da via da invenção em uma célula hospedeira pode ser confirmada por métodos tal como PCR, Southem 20 blot ou hibridização Northem blot. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser preparados a partir das células hospedeiras resultantes, e as seqüências específicas de interesse podem ser amplificadas por PCR usando iniciadores específicos para as seqüências de interesse. O produto amplificado é sujeito a eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de poliacrilamida ou 25 eletroforese capilar, seguido por marcação com brometo de etídio, solução SYBR Verde ou os semelhantes, ou detecção de DNA com uma detecção de UV. Altemativamente, sondas de ácidos nucleicos específicas para as seqüências de interesse podem ser empregadas em uma reação de hibridização. A expressão de uma seqüência gênica específica pode ser confirmada detectando o mRNA correspondente através de PCR acoplado a transcrição reversa, hibridização Northem blot, ou por imunoensaios usando anticorpos reativos com o produto de gene codificado. Imunoensaios exemplares incluem, mas não são limitados a ELISA, radioimunoensaios, e imunoensaios tipo sanduíche.

A atividade enzimática de uma dada enzima da via pode ser ensaiada por uma variedade de métodos conhecidos na arte. Em geral, a atividade enzimática pode ser confirmada pela formação do produto ou conversão de um substrato de uma reação enzimática que está sob investigação. Esta reação pode ocorrer in vitro ou in vivo. Por exemplo, a atividade relativa de HMG-CoA redutase e HMG-CoA sintase em uma célula pode ser medida pelo nível de estado estacionário de HMG-CoA em uma célula. HMG-CoA pode ser extraída por ácido tricloroacético (TCA), seguido pela análise do material extraído através de Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa. A atividade de mevalonato quinase pode ser demonstrada pela formação de mevalonato 5-fosfato. A atividade relativa de mevalonato quinase e HMG-CoA redutase pode ser medida pelo nível de estado estacionário de mevalonato, que pode ser determinado por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massa. Veja e.g., Patente Internacional 05033287, que é incorporada neste lugar por referência.

A produção de um isoprenóide através de ou mais vias metabólicas descritas neste lugar pode ser aumentada inibindo reações que desviam intermediários de etapas produtivas para formação do produto isoprenóide. Inibição das reações improdutivas pode ser atingida reduzindo a expressão e/ou atividade de enzimas envolvidas em uma ou mais reações improdutivas. Tais reações incluem reações laterais do ciclo de TCA que levam à biossíntese de ácidos graxos, biossíntese de alanina, a supervia de aspartato, gliconeogênese, biossíntese de heme, e/ou biossíntese de glutamato, em um nível que afeta a produção geral de uma produção de isoprenóide.

Adicionalmente, a conversão de acetil-CoA para acetato através da ação de fosfotransacetilase é outro exemplo de reação lateral improdutiva. Portanto, onde desejado, nocautear ou derrubar o gene pta que codifica fosfotransacetilase também pode ser realizado a fim de aumentar o rendimento de produção de isoprenóide. Dependendo do isoprenóide específico de interesse, alguém versado na arte pode escolher direcionar etapas improdutivas adicionais. Por exemplo, onde carotenóide é o isoprenóide de escolha, alguém pode optar por nocautear ou derrubar um ou mais genes selecionados a partir do grupo consistindo de genes gdhA, aceE, fdhF, yjiD, btu- ou yjfP, ackA, appY, aspC, cip, clpP, cipXP, crcB, csdA, cyaA, evgS, fdhA, fdhD, feoB, filmA, ginE, glxR, gntK, hycl, lipB, lysU, modA, moeA, nadA, nuoC, nuoK, pfiB, pitA, pst, pstC, pta, p-yjiD, sohA, stpA, yagR, yaiD, ybaS, ycfZ, ydeN, yebB, yedN, yfcC, ygiP, yibD, yjfP, yjliH, ou yliE, ou quaisquer outros genes sozinhos ou em combinação, a inibição dos quais iria resultar em uma maior produção de carotenóide como descrito em Pedido de Patente Norte-Americana 20060121558, que é incorporado neste lugar por referência.

Diversos métodos estão disponíveis para nocautear ou derrubar um gene de interesse. Por exemplo, uma expressão gênica reduzida pode ser realizada por deleção, mutação, e/ou rearranjo gênico. Ela também pode ser realizada com o uso de RNA antisentido, siRNA, miRNA, ribozimas, DNA de fita tripla, e inibidores de transcrição e/ou tradução. Em adição, transposons podem ser empregados para romper expressão gênica, por exemplo, inserindo ele entre o promotor e a região de codificação, ou entre dois genes adjacentes para inativar um ou ambos os genes.

Altas Produções de Compostos Isoprenóides

A presente invenção fornece composições e métodos para uma produção robusta de isoprenóides pelo uso de enzimas da via de isopentenil pirofosfato que estão sob o controle de pelo menos um regulador heterólogo ou condições de fermentação, ou sozinhos ou em combinação.

Em um aspecto, um método de produzir um isoprenóide envolve as etapas de (a) obter uma pluralidade de células hospedeiras que compreendem uma via enzimática para fazer isopentenil pirofosfato 5 caracterizado pelo fato de que todas as enzimas da via estão sob controle de pelo menos um regulador transcricional heterólogo; e (b) cultivar as células hospedeiras em um meio em condições que são sub-ótimas se comparadas com condições que proveríam uma taxa máxima de crescimento específico para as células hospedeiras. Em algumas formas de realização, a via é a via de 10 mevalonato. Em outras formas de realização, a via é a via de DXP. Em outras formas de realização, a pelo menos uma seqüência reguladora transcricional heteróloga é induzível. Em outras formas de realização, as enzimas da via estão sob controle de um único regulador transcricional. Em outras formas de realização, as enzimas da via estão sob controle de múltiplos reguladores transcricionals heterólogos.

Em algumas formas de realização, a via compreende uma seqüência de ácidos nucleicos codificando uma enzima da via de mevalonato de um procarioto tendo uma via endógena de mevalonato. Exemplos não limitantes de procariotos adequados incluem aqueles dos gêneros: 20 Actinoplanes; Archaeoglobus; Bdellovibrio; Borrelia; Chlorojlexus;

Enter ococcus;

Lactobacillus; Listeria; Oceanobacillus;

Paracoccus;

Pseudomonas; Staphylococcus; Streptococcus; Streptomyces; Thermoplasma; e Vibrio. Exemplos não limitantes de linhagens específicas incluem: Archaeoglobus fidgidus; Bdellovibrio bacteriovorus; Borrelia burgdorferi; 25 Chlorollexus aurantiacus; Enterococcus faecalis; Enterococcus faecium;

Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus plantarum; Lactococcus lactic; Listeria innocua; Listeria monocytogenes; Oceanobacillus iheyensis; Paracoccus zeaxanthinifaciens; Pseudomonas mevalonii; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus haemolyticus;

Streptococcus agalactiae; Streptomyces griseolosporeus; Streptococcus mutans; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Thermoplasma acidophilum; Thermoplasma vokanium; Vibrio choterae; Vibrio parahaemolyticu.s; e Vibrio vulnificus;

Em outra forma de realização, a seqüência de ácidos nucléicos codificando uma enzima da via de mevalonato é selecionada a partir de acetilCoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, e mevalonato quinase. Em outra forma de realização, a seqüência de ácidos nucléicos codificando uma enzima da via de mevalonato é selecionada a partir de acetilCoA tiolase, 10 HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, e mevalonato quinase e é de um procarioto pertencendo ao gênero Enterococcus ou o gênero Pseudomonas ou o gênero Staphylococcus. Em outra forma de realização, a seqüência de ácidos nucléicos codificando uma enzima da via de mevalonato é selecionada a partir de acetilCoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, e mevalonato 15 quinase e é de Enterococcus faecalis ou de Staphyloccoccus aureus.

Em outra forma de realização, seqüência de ácidos nucléicos codificando uma enzima da via de mevalonato é uma HMGCoA redutase de Classe II. HMG-CoA redutases geralmente são classificadas em duas classes, que são distinguíveis baseado em homologia de seqüências e/ou propriedades 20 enzimáticas (veja, por exemplo, Hedl, et al., J. Bacteriology, 1927-1932, 2004, e Bochar, et al., Malec. Genet. Metab., 66, 122-127, 1999).

HMG-CoA redutases de Classe II podem ser caracterizadas, em parte, por sua baixa sensibilidade a linhagens, incluindo, mas não limitado a Atorvastatina, Cerivastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Pravastatina, 25 Simvastatina, em algumas formas de realização, a HMG-CoA redutase de Classe II exibe uma constante de inibição de linhagem maior do que cerca de 1 micromolar, 10 micromolar, ou 100 micromolar. Em outras formas de realização, a HMG-CoA redutase de Classe II tem uma constante de inibição para Lovastatina maior do que aquela da HMG-CoA de Classe I por um fator de pelo menos cerca de 10, 100, 1000, ou 10.000. Em outras formas de realização, a HMG-CoA redutase de Classe II tem uma constante de inibição para Lovastatina maior do que aquela da HMG-CoA de Classe I isolada de um Homo sapien por um fator de pelo menos cerca de 10, 100, 1000, ou 5 10.000. Em outras formas de realização, a HMG-CoA redutase de Classe II é de um procarioto. Em outras formas de realização, a HMG-CoA redutase de Classe II é de arqueobactérias.

Uma HMG-CoA redutase de Classe II prototípica é derivada de Pseudomonas mevalonii. Também abrangidas na invenção são HMG-CoA 10 redutases de Classe II variantes exibindo pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade se comparadas com a seqüência de aminoácidos de HMG-CoA redutase de P. mevalonii. Adicionalmente abrangidas na invenção são variantes tendo menos do que cerca de 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, ou menos, de identidade com 15 uma HMG-CoA redutase de H. sapiens. As identidades de seqüências de aminoácidos podem ser determinadas pelos métodos descritos em Bochar, et al., Molec. Genet. Metab., 66, 122-127, 1999.

HMG-CoA redutases de Classe II exemplares não limitantes incluem aquelas derivadas de HMG-CoA redutases de: Archaeoglobus 20 fulgidus (NC_000917); Bdellovibrio bacteriovorus (BX842650); Borrelia burgdotfert (AE001169); Chloroflexus aurantiacus (M299212); Enterococcus faecalis (AA081155); Enterococcus faecium (AF290094); Lactobacillus johnsonii (AE017204); Lactobacillus plantarum; Lactococcus lochs (AE006387); Listeria innocua (CAC96053); Listeria monocytogenes 25 (AE017324); Oceanobacillus iheyensis (NQ000917); Paracoccus zeaxanthinifaciens (A 1431696); Pseudomonas mevalonii (M24015); Staphylococcus aureus (AF290086); Staphylococcus epidermidis (AF290090); Staphylococcus haemolyticus (AF290088); Streptococcus agalactiae (CAD47046); Streptomyces griseolosporeus (AB037907);

Streptococcus mutans (AAN58647); Streptococcus pneumoniae (AF290098); Streptococcus pyogenes (AF290096); Thermoplasma acidophilum (CAC 11548); Thermoplasma volcanium (AL935253); Vibrio cholerae (AAF96622); Vibrio parahaemolyticus (BAC6231 I); e Vibrio vulnificus 5 (AA007090).

Os métodos de fermentação descritos neste lugar se relacionam a modular o crescimento específico das células hospedeiras. Freqüentemente representado pelo parâmetro u, a taxa de crescimento específico representa a taxa de crescimento de células por unidade de biomassa por unidade de 10 tempo. A taxa de crescimento específico tem a unidades de tempo recíprocas (lit). A taxa máxima de crescimento específico para células em um meio de cultura se refere ao efeito de concentração de substrato em taxa de crescimento. Geralmente, células irão crescer lentamente em um baixo nível do substrato, e na medida em que o nível do substrato no meio aumenta, 15 também o faz a taxa de crescimento celular. Entretanto, a taxa de crescimento celular não continua a crescer indefinidamente, e em altos níveis de substrato, um dado aumento na quantidade de substrato irá produzir um menor e um menor aumento na taxa de crescimento celular. Portanto, a taxa de crescimento no final das contas atinge um limite, que é freqüentemente 20 referido como a taxa máxima de crescimento específico. Um tratamento teórico da relação entre taxa de crescimento em cultura é bem conhecido por aqueles versados na arte, e é referido como a equação de Monad. Veja, por exemplo, Pirt, Principies of Microbe and Cell Cultivation, Wiley, NY, 1975, páginas 4-10. Neste tratamento teórico, a taxa específica máxima é um limite 25 assintótico que nunca é atingido até que um nível infinito de substrato seja atingido. Na prática, entretanto, a taxa máxima de crescimento específico pode ser considerada como sendo obtida quando as condições sob investigação (e.g., um nível de substrato ou temperatura) suportam taxa de crescimento inicial mais rápida. Por exemplo, em um reator batelada alimentado, a condição inicial onde os nutrientes são fornecidos em excesso é tratada como as condições para a taxa de crescimento máxima. Veja, por exemplo, Lee et al. (1996) Trends Biotechnol. 14: 98-105 e Korz et al_ (1995) JBiotechnology 39:59-65. As condições onde um substrato é adicionado para suportar a taxa máxima de crescimento específico também é algumas vezes referido como crescimento ilimitado. Em adição, embora a equação de Monad descreva as propriedades teóricas de taxa para um substrato que se aproxima assintoticamente da taxa específica máxima, para muitos substratos, ao invés de se aproximar do valor na medida em que mais substrato é adicionado, uma diminuição em taxa é vista em níveis superiores de substrato depois de uma taxa máxima ser atingida, i.e., a taxa máxima de crescimento específico é atingida seguido por uma diminuição em taxa de crescimento.

A taxa máxima de crescimento específico também pode ser aplicada com respeito à temperatura assim como a substratos. Geralmente, um organismo irá crescer lentamente em baixas temperaturas, e irá crescer em uma taxa mais rápida na medida em que a temperatura aumenta até um certo ponto, depois do que, a taxa de crescimento irá declinar. Haverá uma temperatura na qual a taxa de crescimento estará em um nível máximo, esta é a temperatura na qual a taxa máxima de crescimento é atingida. Os requerentes encontraram que a produção de isoprenóides pode ser aumentada diminuindo a temperatura para abaixo da temperatura que suporta a taxa máxima de crescimento específico.

A taxa máxima de crescimento específico também pode ser aplicada com respeito a outros aditivos para a fermentação do que substratos. Por exemplo, com respeito a nutrientes, vitaminas, e minerais, pode haver uma baixa taxa em pequenas quantidades destes componentes, a taxa ficará maior na medida em que a concentração do componente é aumentada, então, em alguns casos, em concentrações ainda maiores dos componentes, a taxa irá diminuir. A taxa máxima de crescimento específico é obtida onde a concentração do componente suporta a maior taxa.

A taxa máxima de crescimento específico para uma célula em um meio é freqüentemente determinada nos estágios iniciais da fermentação antes de inibição por produto final ou intermediários, agrupamento celular, ou 5 outros fatores contribuem para tomar mais lenta a taxa de crescimento. Por exemplo, a taxa máxima de crescimento é freqüentemente determinada durante a fase exponencial de crescimento ao invés do que na fase lag, fase de desaceleração, ou na fase estacionária. O conceito de taxa máxima de crescimento específico também pode ser aplicado em estágios finais da 10 fermentação levando em conta as variáveis apropriadas.

Por conseguinte, em algumas formas de realização, células hospedeiras são cultivadas em condições de forma que crescimento é menor do que cerca de 90% da taxa máxima de crescimento específico. Em outras formas de realização, as células hospedeiras são cultivadas em condições de 15 forma que crescimento é menor do que cerca de 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, ou 1%, ou menos, da taxa máxima de crescimento específico.

Em outras formas de realização, as células hospedeiras são cultivadas em uma temperatura de meio que é pelo menos cerca de 2°C, 4°C, 20 5°C, 6°C, 8°C, 10°C, 15°C, ou 20°C abaixo da temperatura que proveria a taxa máxima de crescimento específico. Diminuindo a temperatura crescimento é reduzido, o que por sua vez, reduz a formação de subprodutos tóxicos no meio e a geração de calor metabólico. Diminuir temperatura de cultura também reduz demanda de oxigênio celular o que possibilita maiores 25 densidades celulares sejam obtidas.

A temperatura na qual a taxa máxima de crescimento específico de uma célula hospedeira pode ser atingida irá depender do tipo de célula hospedeira selecionada. Isto pode ser confirmado cultivando as células hospedeiras em várias temperaturas por um período de tempo definido para derivar as curvas de crescimento relevantes. A temperatura que suporta a taxa máxima de crescimento específico pode ser determinada comparando as inclinações de crescimento nas respectivas curvas. No caso de E. coli, a temperatura para taxa máxima de crescimento específico é de cerca de 37°C.

Por conseguinte, se E. coli é a célula hospedeira a ser usada para produção fermentativa de isoprenóide, a temperatura de fermentação é abaixo de 37°C. Se S. cerevisiae é empregada, a temperatura para taxa máxima de crescimento específico é de cerca de 30°C. Por conseguinte, se S. cerevisiae é a célula hospedeira a ser usada para produção fermentativa de isoprenóide, a 10 temperatura de fermentação é abaixo de 30°C. Tipicamente uma temperatura desejada é cerca de 2 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 8 °C, 10 °C, 15 °C, e 20 °C abaixo da temperatura na qual a taxa máxima de crescimento específico da célula hospedeira pode ser atingida.

Em outras formas de realização, as células hospedeiras são cultivadas em um meio de fermentação que compreende uma fonte de carbono presente em uma quantidade que é menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico. Em certas formas de realização, as células hospedeiras são cultivada em um meio onde a fonte de carbono é mantida em um nível para prover menos do que cerca de 90%, 80%, 75%, 20 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%,1%, ou menos, da taxa máxima de crescimento específico. Quaisquer fontes contendo carbono que são digeríveis pelo microorganismo podem ser usadas. Exemplos não limitantes incluem carboidratos tal como monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos, ácidos orgânicos tal como ácido acético, ácido propiônico; e 25 álcoois tal como etanol e propanol, e polióis tal como glicerol.

Em algumas formas de realização, as fontes de carbono compreendem primariamente monossacarídeos ou oligossacarídeos. Em outras formas de realização, a fonte de carbono consiste essencialmente de monossacarídeos e dissacarídeos. Em ainda outras formas de realização, a fonte de carbono é essencialmente livre de celulose.

Monossacarídeos são os açúcares simples que servem como blocos de construção para carboidratos. Eles são classificados baseado em seu esqueleto de átomos de carbono (C): trioses têm três átomos de carbono, 5 tetroses quatro, pentoses cinco, hexoses seis; e heptoses sete. Os átomos de carbono são ligados por átomos de hidrogênio (—H), grupos hidroxila (— OH), e grupos carbonila (—CO),, cujas combinações, ordem, e configurações possibilitam que exista um grande número de estereoisômeros. Pentoses incluem xilose, encontrada em materiais lenhosos; arabinose, encontrada em 10 gomas de coníferas; ribose, um componente de RNA e diversas vitaminas, e desoxirribose, um componente de DNA. Hexoses exemplares incluem glicose, galactose, e frutose. Monossacarídeos se combinam um com o outro e outros grupos para formar uma variedade de dissacarídeos, e oligossacarídeos. Um oligossacarídeo é um polímero de sacarídeos contendo um pequeno número 15 (tipicamente três a dez) de açúcares simples. Eles geralmente são encontrados ou O- ou N-ligados a cadeias laterais de aminoácidos compatíveis em proteínas ou unidades de lipídio. Um oligossacarídeo preferido para uso na presente reação de fermentação é dissacarídeo, incluindo, por exemplo, sacarose, ou trissacarídeo tal como rafinose.

Onde é desejado ter celulose, glicano, amido, ou outros polissacarídeos como a principal fonte de carbono, estes polissacarídeos podem ser primeiro convertidos em monossacarídeos e oligossacarídeos por meios químicos ou por métodos enzimáticos. Por exemplo, celulose pode ser convertida em glicose pela enzima celulase. Por conseguinte, se 25 polissacarídeos tal como celulose encontrada na biomassa (incluindo e.g., canola, alfafa, arroz, centeio, sorgo, girassol, trigo, soja, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata doce, mandioca, café, coco, árvores cítricas, cacau, chá, frutas tal como, banana, figo, abacaxi, goiaba, manga, aveia, cevada, hortaliças, ornamentais, ou coníferas) é usada como a principal fonte de carbono, ela pode ser digerida por celulase para gerar açúcares mais simples para uso em conjunção com o procedimento de fermentação da presente invenção. Em certas formas de realização, depois da degradação do polissacarídeo, o monossacarídeo e/ou oligossacarídeo constitui pelo menos 5 cerca de 50% em peso da fonte de carbono se determinado no começo da fermentação. Em outras formas de realização, o monossacarídeo e/ou oligossacarídeo constitui pelo menos cerca de 80% ou mesmo 90% em peso da fonte de carbono se determinado no começo da fermentação, de forma que o meio de fermentação é essencialmente livre de celulose.

Em outras formas de realização, as células hospedeiras são cultivadas em um meio de fermentação que compreende uma fonte de nitrogênio em uma quantidade que é menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico. Embora não se atendo a qualquer teoria particular, sabe-se que mudar os níveis de componentes tal como 15 nitrogênio que estão disponíveis para uma célula pode mudar o fluxo relativo através das várias vias químicas dentro da célula. Os requerentes encontram que restringindo o nível de nitrogênio disponível para o microorganismo, a quantidade de isoprenóide tal como amorfadieno produzida pelo microorganismo é aumentada. Níveis exemplares de nitrogênio da presente 20 invenção incluem em uma quantidade que suportaria cerca de 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1%, ou menos, da taxa máxima de crescimento específico.

A restrição de nitrogênio pode ser implementada em estágios. Em algumas formas de realização, nitrogênio na forma de amônia é fornecido 25 no começo da fermentação para suportar crescimento inicial, mas adições subseqüentes à fermentação são livres de nitrogênio, ou são livres de nitrogênio salvo por aquele nível de amônia necessário para manter o pH da fermentação em 7 com uma solução de amônia. Para o crescimento da fermentação, o nível de nitrogênio é mantido em um nível que é menor do que a quantidade que suportaria a taxa máxima de crescimento específico. As quantidades podem ser por exemplo quantidades que suportariam pelo menos cerca de 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, ou 1%, ou menos, da taxa máxima de crescimento específico. Uma fermentação 5 da presente invenção pode ter um nível inicial de nitrogênio acima de 10 mM se medido no meio de fermentação, para suportar um crescimento inicial, e um nível subseqüente de nitrogênio abaixo de 50mM, 40mM, 30mM, 20mM, 1 OmM, ou 4 mM no meio de fermentação.

Fontes de nitrogênio assimilável que podem ser usadas em 10 uma mistura de reação de fermentação adequada incluem, mas não são limitadas a, fontes de nitrogênio simples, fontes de nitrogênio orgânico, e fontes de nitrogênio complexo. Tais fontes de nitrogênio incluem amônia anidra, sais de amônio de ácidos inorgânicos ou orgânicos tal como cloreto de amônio, sulfato de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, outros 15 compostos e substâncias contendo nitrogênio de origem animal, vegetal, e/ou microbiana. Aminoácidos também podem ser usados como a fonte de nitrogênio, incluindo leucina, isoleucina ou valina, ou uma mistura destes.

Qualquer método conhecido por fornecer um substrato para uma reação de fermentação pode ser usado para manter o nível de substrato 20 abaixo do nível que proveria a taxa máxima de crescimento específico. Exemplos ilustrativos incluem o método de batelada onde todo o substrato para a fermentação é adicionado no começo da reação de fermentação; o método de alimentação contínua; e o método de taxa de alimentação variável, onde, por exemplo, uma quantidade crescente de substrato é fornecida na 25 medida em que a fermentação segue a fim de suportar a concentração aumentada de células no meio. Combinações destes três métodos são freqüentemente empregadas. Por exemplo, é comum ter uma certa quantidade de substrato presente inicialmente na fermentação, para permitir que os microorganismos esgotem esta quantidade inicial de substrato, para então adicionar subseqüentemente substrato ou continuamente ou para adicioná-lo • _^r, variavelmente depois da quantidade inicial de substrato ser utilizada. E um aspecto desta invenção fornecer uma quantidade inicial de substrato às células no meio de fermentação, que podem estar presentes em um nível relativamente alto, para permitir que as células hospedeiras usem substancialmente todo o substrato inicial, para então fornecer subseqüentemente substrato às células hospedeiras em um nível que é subótimo se comparado com a quantidade que suportaria a taxa máxima de crescimento ou por uma taxa de alimentação contínua ou variável. Será percebido por aqueles de verso na arte que uma vez que as células podem estar crescendo em uma taxa exponencial, pode ser vantajoso variar a taxa de alimentação em uma taxa exponencial a fim de manter a quantidade de substrato em relação ao nível de células hospedeiras constante. Assim em certas formas de realização, substratos são adicionados de uma maneira exponencialmente crescente, mais ainda em um nível que é menor do que o nível que suportaria a taxa máxima de crescimento específico.

Em algumas formas de realização, a reação de fermentação recebe uma ração reduzida de fonte de carbono em relação à ração de carbono que proveria a taxa máxima de crescimento específico. Embora não se atendo a uma teoria particular, sabe-se que mudar os níveis de nutrientes disponíveis para uma célula irá mudar o fluxo relativo através das várias vias químicas dentro da célula. Por exemplo, algumas enzimas são induzíveis, e serão ativas apenas quando certos nutrientes estão presentes. Os requerentes observaram que diminuir a taxa de alimentação de fonte de carbono para um microorganismo pode melhorar a quantidade de isoprenóide produzido na fermentação. Na prática, a fonte de carbono pode ser fornecida inicialmente em uma quantidade suficiente para suportar um crescimento inicial das células hospedeiras até que tal fonte de carbono inicial seja substancialmente esgotada, depois do que a fonte de carbono é adicionada em uma taxa exponencial, mas em uma taxa que está abaixo daquela que suportaria o crescimento específico máximo das células hospedeiras. Por exemplo, em um método da presente invenção, a fonte de carbono é adicionada em uma quantidade que suportaria cerca de 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 5 25%, 20%, 15%, 10%, ou menos, da taxa máxima de crescimento específico.

Em outras formas de realização, a reação de fermentação recebe um bolo inicial de fonte de carbono suficiente para crescer em ou perto da taxa máxima de crescimento específico (crescimento ilimitado) seguido por uma taxa de alimentação reduzida em um nível abaixo daquele requerido 10 para suportar a taxa máxima de crescimento específico, pelo restante da fermentação. Em alguns casos, o ponto no qual a taxa reduzida de ração de fonte de carbono é implementada é o ponto no qual uma taxa de alimentação pré-determinada é atingida. Em certas formas de realização, o microorganismo é fornecido com fonte de carbono suficiente para crescer 15 exponencialmente a uma taxa de alimentação de cerca de 15 g/Iihr, depois do que a taxa de alimentação é reduzida para 5,7 gil../h e mantida constante naquela taxa pelo restante da fermentação.

Em certas formas de realização, uma ou mais das enzimas heterólogas da via de mevalonato ou de DXP é induzível e induzida depois da 20 taxa de ração de fonte de carbono ter sido reduzida para um nível abaixo daquele requerido para crescimento específico máximo. Por exemplo, onde o microorganismo manipulado tem um promotor induzível, a fermentação é primeiramente realizada adicionando fonte de carbono para atingir um crescimento exponencial, mas em um nível que está abaixo daquele para 25 suportar crescimento específico máximo, então a taxa de ração de fonte de carbono é reduzida para um nível ainda menor pelo restante da fermentação, e o indutor adicionado depois da taxa de ração de fonte de carbono ser reduzida. Em algumas formas de realização, os microorganismos são induzidos com isopropiltio-beta-D-galactosídeo (IPTG) depois da alimentação reduzida de fonte de carbono ser iniciada.

Em outras formas de realização, a reação de fermentação é realizada de uma maneira que evita o aumento de substâncias tóxicas que diminui taxas de crescimento celular. Por exemplo, sabe-se que quando muita glicose é adicionada ao meio, produtos tóxicos tal como acetato podem aumentar no organismo. Veja, por exemplo, Kortz et al. (1995).1. Biotechnol. 39: 59-65. Assim fornecendo um alto nível de fonte de carbono, ou ao se aproximar da quantidade que suportaria uma taxa máxima de crescimento (crescimento ilimitado), o crescimento inicial das células pode ser maior, mas o crescimento se toma interrompido devido à acumulação de substâncias tóxicas. O nível no qual a fonte de carbono é adicionada abaixo do nível onde os produtos tóxicos não se acumulam é referido como o nível crítico ou o limiar inibidor. Assim em certas formas de realização, a reação de fermentação é realizada de forma que a fonte de carbono é mantida abaixo do nível crítico para o aumento de substâncias tóxicas. Aqueles versados na arte irão perceber que a concentração crítica de substratos irá variar com a linhagem e o meio que é usado.

Uma mistura de reação de fermentação efetiva pode conter outros compostos tal como sais inorgânicos, vitaminas, metais traço, ou promotores de crescimento. Tais outros compostos também podem estar presentes em fontes de carbono, nitrogênio ou mineral na mistura de reação efetiva ou podem ser adicionados especificamente à mistura de reação. Uma forma de realização da invenção envolve fornecer estes compostos em níveis que são sub-ótimos se comparados com aqueles que suportariam a taxa máxima de crescimento das células hospedeiras a fim de aumentar produção de isoprenóide.

A mistura de reação de fermentação também pode conter uma fonte de fosfato adequada. Tais fontes de fosfato tanto fontes de fosfato inorgânicas como orgânicas. Exemplos não limitantes de fontes de fosfato incluem, mas não são limitados a, sais de fosfato tal como fosfatos de sódio e potássio mono ou dibásicos, fosfato de amônio, polifosfato, e misturas destes. Uma mistura de reação de fermentação adequada também pode incluir uma fonte de magnésio. Em algumas formas de realização, o magnésio está na forma de um sal fisiologicamente aceitável, tal como sulfato de magnésio heptahidratado, embora outras fontes de magnésio em concentrações que doam quantidades similares de magnésio possam ser usadas. Ademais, em algumas instâncias pode ser desejável permitir que a mistura de reação de fermentação se tome depauperada de uma fonte de magnésio durante fermentação. Em algumas formas de realização, a fonte de fósforo é fornecida em uma quantidade que é sub-ótima se comparada com aquela que suportaria uma taxa máxima de crescimento específico.

A mistura de reação de fermentação também pode incluir um agente quelante biologicamente aceitável, tal como o citrato trissódico dihidratado e ácido etilenodiaminotetracético. A mistura de reação de fermentação também pode incluir um ácido ou base biologicamente aceitável para manter o pH desejado da mistura de reação de fermentação. Ácidos biologicamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, ácido clorídrico, ácido sulfürico, ácido nítrico, ácido fosfórico e misturas destes. Bases biologicamente aceitáveis incluem, mas não são limitadas a, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e misturas destes.

A mistura de reação de fermentação também pode incluir uma fonte de cálcio biologicamente aceitável, incluindo, mas não limitado a, cloreto de cálcio. A mistura de reação de fermentação também pode incluem cloreto de sódio. A mistura de reação de fermentação também pode incluir Metais traço. Tais metais traço podem ser adicionados à mistura de reação de fermentação como uma solução estoque que, para conveniência, pode ser preparada separadamente do resto da mistura de reação de fermentação. Uma solução adequada de metais traço pode incluir, mas não é limitada a selenato de sódio; sulfato ferroso heptahidratado; sulfato cúprico pentahidratado; sulfato de zinco heptahidratado; molibidato de sódio dihidratado; cloreto cobaltoso; solução de selênio ou cromo hexahidratada; e sulfato manganoso monohidratado. Ácido clorídrico pode ser adicionado à solução estoque para manter os sais de metal traço em solução.

Se um intermediário da via ou um composto que pode ser convertido para um intermediário da via é adicionado ao meio de fermentação, o intermediário ou composto está tipicamente presente em uma quantidade em excesso.

Fermentação pode ser conduzida em condições anaeróbicas (deficientes em oxigênio) ou aeróbicas (oxigenadas). Em condições aeróbicas, microorganismos podem degradar açúcares para produtos finais tal como CO2 e H₂O. Em condições anaeróbicas, as células hospedeiras utilizam uma via alternativa para produzir CO₂ e etanol. Fermentação também pode ser usada para se referir ao crescimento de massa de microorganismos em um meio de crescimento onde nenhuma distinção é feita entre metabolismo aeróbico e anaeróbico. Em geral, fermentação aeróbica é realizada para produção de isoprenóides.

As fermentações da presente invenção podem ser realizadas em um processo em batelada, um batelada alimentado, ou um contínuo. Um processo em batelada é tipicamente um processo fechado onde todas as matérias-primas são adicionadas no começo da fermentação. Um processo batelada alimentado é tipicamente um processo fechado onde a fonte de carbono e/ou outros substratos são adicionados em incrementos ao longo do processo. Um processo batelada alimentado permite maior controle do meio e do crescimento dos microorganismos. Um processo continuo pode ser considerado um sistema aberto onde meio é continuamente adicionado e produto é simultaneamente removido. Processos dentre estes tipos também podem ser usados. Por exemplo, em uma forma de realização, a fermentação é iniciada como um processo batelada alimentado, e uma camada orgânica, tal como dodecano é colocada em contato com o meio de fermentação enquanto que o processo de fermentação continua. Isoprenóides, que tipicamente têm uma maior solubilidade no meio orgânico do que no meio aquoso de fermentação são extraídos do meio de fermentação para a camada orgânica. Onde os isoprenóides são produzidos em excesso do ponto de saturação e formam uma camada separável do meio, então separação simples como forma de drenar ou absorvendo a camada de fase distinta pode ser realizada. Este processo tem características tanto de um processo batelada alimentado como de um processo contínuo, por causa da remoção de produto do meio e dos progressos de fermentação. Os processos batelada alimentados e contínuos permitem o controle da adição de componentes de fermentação durante o processo de fermentação. Um processo batelada alimentado, contínuo, ou combinação destes normalmente é preferido para realizar a invenção. Estes processos permitem maior controle da taxa de adição de ração e outros componentes de fermentação como uma função de tempo. A remoção de produto durante fermentação pode ser benéfica, especialmente onde o produto acumulado leva a inibição das vias de produção.

A quantidade de microorganismo por litro de fermentação, ou a densidade de microorganismo, pode ser medida medindo o peso de microorganismo isolado a partir de um dado volume do meio de fermentação. Uma medida comum é o peso seco de células por litro de meio de fermentação. Outro método que pode ser usado para monitorar a fermentação enquanto ela está progredindo é por uma medida da densidade ótica do meio. Um método comum é medir a densidade ótica em um comprimento de onda de 600 nm, referida como o OD6₀0, ou o OD. O OD pode ser correlacionado com a densidade de um tipo específico de organismo dentro de um meio específico, mas a relação específica entre OD e quantidade de microorganismo por volume geralmente não será aplicável em todos os tipos de organismos em todos os tipos de meios. Uma curva de calibração pode ser criada medindo o 0D e o peso seco celular em uma variedade de densidades celulares. Em alguns casos, estas correlações podem ser usadas em fermentações diferentes dos mesmos microorganismos ou similares no mesmo meio ou similar.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método compreendendo as etapas de (i) realizar uma reação de fermentação compreendendo um meio de fermentação e uma pluralidade de células hospedeiras geneticamente modificadas que produzem o isoprenóide em condições de forma que (a) o meio de fermentação é mantido em uma temperatura menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico de ditas células hospedeiras; (b) o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono presente em uma quantidade que é menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico das células hospedeiras; e/ou (e) o meio de fermentação compreende uma fonte de nitrogênio em uma quantidade que é menor do que aquela que proveria uma taxa máxima de crescimento específico das células hospedeiras; (ii) recuperar o isoprenóide produzido em uma ou mais condições apresentadas em (a) até (c). Em uma forma de realização, a reação de fermentação é corrida em condição (a). Em outra forma de realização, a reação de fermentação é corrida em condições (a) e (b). Em ainda outra forma de realização, a reação de fermentação é corrida em condições de (a), (b), e (c), ou em quaisquer outras combinações destas.

Usando os métodos descritos neste lugar, as células hospedeiras produzem mais do que cerca de 10 gramas de isoprenóide por litro de mistura de reação de fermentação (lOg/L). Em outras formas de realização, mais do que cerca de 15g/L, mais do que cerca de 20g/L, mais do que 25g/L é produzido, ou mais do que cerca de 30g/L de isoprenóide é produzido.

Em outra forma de realização, as células hospedeiras produzem mais do que cerca de 50 miligramas de isoprenóide por grama de células hospedeiras secas (50 miligramas por grama de peso seco celular) é

produzido.

Em

outras

formas de realização,

mais

do

que

cerca

de

100

5

miligramas

por

grama

de

peso

seco

celular,

mais

do

que

cerca

de

150

miligramas

por

grama

de

peso

seco

celular,

mais

do

que

cerca

de

200

miligramas

por

grama

de

peso

seco

celular,

mais

do

que

cerca

de

250

miligramas

por

grama

de

peso

seco

celular,

mais

do

que

cerca

de

500

miligramas

por

grama

de

peso

seco

celular,

mais

do

que

cerca

de

750

10

miligramas por grama de peso seco celular, ou mais

do

que

cerca

de

1000

miligramas por grama de peso seco celular de isoprenóide é produzido.

Em outras formas de realização, o nível de produção, quer ele esteja em gramas por litro ou miligramas por grama de peso seco celular é atingido em menos do que cerca de 150 horas, preferivelmente menos do que 15 cerca de 96 horas, ou mesmo menos do que cerca de 72 horas.

Exemplos não limitantes de isoprenóides adequados incluem: hemiterpenos (derivados de 1 unidade de isopreno) tal como isopreno; monoterpenos (derivados de 2 unidades de isopreno) tal como mirceno; sesquiterpenos (derivados de 3 unidades de isopreno) tal como amorfa-4,1120 dieno; diterpenos (derivados de quatro unidades de isopreno) tal como taxadieno; triterpenos (derivados de 6 unidades de isopreno) esqualeno; tetraterpenos (derivados de 8 isoprenóides) β-caroteno; e politerpenos (derivado de mais do que 8 unidades de isopreno) tal como poliisopreno. Em algumas formas de realização, o isoprenóide não é um carotenóide. Em outras 25 formas de realização, o isoprenóide é um isoprenóide C_s-C₂o·

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com formas de realização específicas desta, a descrição precedente é pretendida para ilustrar e não limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens, e modificações dentro do escopo da invenção serão perceptíveis para aqueles versados na arte à qual a invenção pertence.

EXEMPLOS

A prática da presente invenção pode empregar, a menos que de outra maneira indicado, técnicas convencionais da indústria biossintética e os semelhantes, que estão todas dentro do verso da arte. Na medida em que tais técnicas não são completamente descritas aqui, alguém pode encontrar ampla referência a elas na literatura científica.

Nos exemplos seguintes, esforços foram feitos para assegurar acurácia com respeito a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, e assim por diante), mas variação e desvio podem ser acomodados, e no evento um erro clérico nos números relatados neste lugar existe, alguém de habitual verso nas artes às quais esta invenção pertence pode deduzir a quantidade correta em vista da descrição restante neste lugar. A menos que de outra maneira indicado, temperatura é registrada em graus Celsius, e pressão está em ou perto de pressão atmosférica no nível do mar. Todos os reagentes, a menos que de outra maneira indicado, foram obtidos comercialmente. Os exemplos seguintes são pretendidos apenas para propósitos ilustrativos e não limitam de qualquer maneira o escopo da presente invenção.

Exemplo 1

Este exemplo descreve métodos para fazer plasmídeos de expressão que codificam para enzimas incluindo enzimas da via de MEV de Saccharomyces cerevisiae organizadas em operons.

Plasmídeo de expressão pMevT foi gerado inserindo o operon MevT (SEQ ID NO: 1) no vetor pBAD33. O operon MevT codifica o conjunto de enzimas da via de MEV que juntas transformam o precursor abundante acetil-CoA em (R)-mevalonato, em outras palavras acetoacetilCoA tiolase, HMG-CoA sintase, e HMG-CoA redutase. O operon MevT foi gerado por amplificação por PCR da seqüência de codificação de DNA genômico de Escherichia coli do gene atoB (número de acesso de GenBank NC 000913 REGIÃO: 2324131..2325315) (codifica uma acetoacetil-CoA tiolase), da seqüência de codificação de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae do gene ERG13 (número de acesso de GenBank X96617, REGIÃO: 220..1695) (codifica uma HMG-Cc:A sintase), e de um segmento de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae da região de codificação do gene HMG; (número de acesso de GenBank M22002, REGIÃO: 1660..3165) (codifica uma HMG-CoA redutase (tHMGR)). O iniciador de PCR anterior usado para a amplificação do fragmento de gene HMG] incluiu um códon de início artificial. Os fragmentos amplificados foram cortados juntos usando extensões sobrepostas (SOEing), durante qual processo sítios de ligação de ribossomo foram introduzidos depois das seqüências de codificação de atoB e do ERGI3. Depois da adição de saliências A 3', o operon MevT foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), e seqüenciado para assegurar acurácia. O operon MevT foi subseqüentemente ligado no sítio de enzima de restrição Xmal Psil de vetor pBAD33 (Guzman et al. (1995)J. Bactéria 177(14): 4121-4130). Para colocar o operon sob o controle do promotor Pu„ o fragmento araC-P BAD Nsil-Xmal de pBAD33 foi substituído pelo fragmento Nsil-Xmal de pBBRIMCS, produzindo plasmídeo de expressão pMevT (veja Patente Norte-Americana Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pAM36-MevT66 foi gerado inserindo o operon MevT66 no vetor pAM36. Vetor pAM36 foi gerado inserindo uma gaveta de oligonucleotídeo contendo sítios de enzimas de restrição Ascl-SfilAsiSI-Xhaf-Pacl-Fill-Pmel no vetor pACYC184 (número de acesso de GenBank X06403), e removendo o gene de resistência tet em pACYC184. O operon MevT66 foi sinteticamente gerado usando a seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 1 como um modelo, que compreende o gene atoB de Escherichia coli (número de acesso de GenBank NC...000913 REGIÃO: 2324131_2325315), o gene ERG13 de Saccharomyces cerevisiae (número de acesso de GenBank X96617, REGIÃO: 220..1695), e uma versão truncada do gene HMG1 de Saccharomyces cerevisiae (número de acesso de GenBank M22002, REGIÃO: 1777.3285), todas as três seqüências sendo códonotimizadas para expressão em Escherichia coli. O operon MevT66 sinteticamente gerado foi flanqueada por um sítio de enzima de restrição 5' EcoRI e um sítio de enzima de restrição 3' Hind III, e pode assim ser clonada em sítios compatíveis de enzima de restrição de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão. A partir desta construção, o operon MevT66 foi amplificado por PCR com sítios de enzimas de restrição Sfit e AsiSI flanqueantes, o fragmento de DNA amplificado foi digerido até o final usando enzimas de restrição Sfii e AsiSI, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído em gel usando um kit de purificação em gel de Qiagen (Valencia, CA), e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição Sfil AsiSI do vetor pAM36, produzindo plasmídeo de expressão pAM36-MevT66.

Plasmídeo de expressão pAM25 foi gerado inserindo o operon MevT66 no vetor pAM29. Vetor pAM29 foi criado agrupando a origem de replicação pl5A e gene de resistência Iran de p2S24- MCSI (Lutz and Bujard (1997) Nue! Acids Res. 25:1203-1210) com um promotor IacUV5 gerado por oligonucleotídeo. A construção de síntese de DNA compreendendo o operon MevT66 (veja acima) foi digerida até o final usando enzimas de restrição EcoRI e Hind III, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 4,2 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição EcoRI Ilindlll de pAM29, produzindo plasmídeo de expressão pAM25.

Plasmídeo de expressão pMevB-Cm foi gerado inserindo o operon MevB no vetor pBBRIMCS-1. O operon MevB codifica o conjunto de enzimas que juntas convertem (R)-mevalonato para IPP, em outras palavras mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, e mevalonato pirofosfato carboxilase. O operon MevB foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae das seqüências de codificação do gene ERG12 (número de acesso de GenBank X55875, REGIÃO: 580..1911) (codifica uma mevalonato quinase), do gene ERG8 (número de acesso de GenBank 249939, REGIÃO: 3363..4718) (codifica uma fosfomevalonato quinase), e do gene MVD1 (número de acesso de GenBank X97557, REGIÃO: 544..1734) (codifica uma mevalonato pirofosfato carboxilase), e cortando os fragmentos de PCR juntos usando extensões sobrepostas (SOEing). Escolhendo seqüências apropriadas de iniciadores, os códons de parada de ERGI2 e ERG8 foram trocados de TAA para TAG durante amplificação para introduzir sítios de ligação de ribossomo. Depois da adição de saliências A 3', o operon MevB foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O operon MevB foi excisado digerindo a construção de clonagem até o final usando enzima de restrição PstI, separando a mistura de reação por eletroforese em gel, extraindo em gel o fragmento de DNA de 4,2 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de enzima de restrição Pst! De vetor pBBRIMCS-l (Kovach et al., Gene 166(1): 175-176 (1995)), produzindo plasmídeo de expressão pMevB-Cm.

Plasmídeo de expressão pMBI foi gerado inserindo o operon MBI no vetor pBBRlMCS-3. O operon MBI codifica as mesmas enzimas que o operon MevB, assim como uma isopentenil pirofosfatase isomerase que catalisa a conversão de IPP para DMAPP. O operon MBI foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Escherichia coli da seqüência de codificação do gene idi (número de acesso de GenBank AF 119715) usando iniciadores que continham um sítio de enzima de restrição Xmal em suas extremidades 5', digerindo o fragmento de DNA amplificado até o final usando enzima de restrição Xrnal, separando a mistura de reação por eletroforese em gel, extraindo em gel o fragmento de 0,5 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de enzima de restrição Xmal de plasmídeo de expressão pMevB-Cm, com isso colocando idi na extremidade 3' do operon MevB. O operon MBI foi subclonado nos sítios de enzimas de restrição Sall e Sad de vetor pBBRlMCS-3 (Kovach et al., Gene 166(1): 175176 (1995)), produzindo plasmídeo de expressão pMBI (veja Patente NorteAmericana Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pMBIS foi gerado inserindo o gene ispA em pMBI. O gene ispA codifica uma famesil pirofosfato sintase que catalisa a condensação de duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP para fazer famesil pirofosfato (FPP). A seqüência de codificação do gene ispA (número de acesso de GenBank D00694, REGIÃO: 484..1383) foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico de Escherichia coli usando um iniciador direto com um sítio de enzima de restrição Sadl e um iniciador reverso com um sítio de enzima de restrição Saci. O produto de PCR amplificado foi digerido até o final com enzimas de restrição Sacll e Sad, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, e o fragmento de 0,9 kb foi extraído em gel. O fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição Sacil Sad de pMBI, com isso colocando o gene ispA 3' de (di e o operon MevB, e produzindo plasmídeo de expressão pMBIS (veja Patente Norte-Americana Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pMBIS-gpps foi derivado de plasmídeo de expressão pMBIS substituindo a seqüência de codificação de ispA por uma seqüência de nucleotídeos codificando uma geranil difosfato sintase (gpps). Um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando a geranil difosfato sintase foi gerado sinteticamente usando a seqüência de codificação do gene gpps de Arabidopsis thaliana (número de acesso de GenBank Y17376, REGIÃO: 52..1320), códon otimizada para expressão em Escherichia coli, como um modelo. A seqüência de nucleotídeos foi flanqueada por um sítio de enzima de restrição Sadl líder e um sítio de enzima de restrição Sac/ terminal, e pode ser clonada em sítios compatíveis de enzima de restrição de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão. A seqüência de geranil difosfato sintase sinteticamente gerada foi isolada digerindo a construção de síntese de DNA até o final usando enzimas de restrição Sac!! e Sad, separando a mistura de reação por eletroforese em gel, extraindo em gel o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de enzima de restrição Sad( Sad de plasmídeo de expressão pMBIS, produzindo plasmídeo de expressão pMBIS-gpps (veja Figura 3 para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeo de expressão pAM45 foi gerado inserindo o operon MBIS em pAM36-MevT66 e adicionando promotores lacUV5 na frente dos dois operons. O operon MBIS foi amplificado por PCR a partir de pMBIS usando iniciadores compreendendo um sítio de enzima de restrição 5' Xhol e um sítio de enzima de restrição 3' Pad/. O produto de PCR amplificado foi digerido até o final usando enzimas de restrição Xhol e Pad, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 5,4 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição Xhol Pact de pAM36-MevT66, produzindo plasmídeo pAM43. Um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando o promotor lacUVS foi sintetizado a partir de oligonucleotídeos e subclonado nos sítios de enzimas de restrição Ascl Sfil e AsiSIXhol de pAM43, produzindo plasmídeo de expressão pAM45.

Exemplo 2

Este exemplo descreve métodos para fazer vetores de expressão codificando enzimas incluindo enzimas da via de MEV de Staphylococcus aureus organizadas em operons.

Plasmídeo de expressão pAM4I foi derivado de plasmídeo de expressão pAM25 substituindo a seqüência de codificação do gene HMGI, que codifica a HMG-CoA redutase de Saccharornyces cerevisiae, pela seqüência de codificação do gene mvaA, que codifica a HMG-CoA redutase de Staphylococcus aureus (número de acesso de GenBank BA000017, REGIÃO: 2688925..2687648). A seqüência de codificação do gene mvaA foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Staphyloccoccus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores 4-49 mvaA Spa (SEQ ID NO: 2) e 4-49 mvaAR Xbar (SEQ ID NO: 3), o fragmento de DNA amplificado foi digerido até o final usando enzima de restrição Spel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb foi extraído em gel. A seqüência de codificação de HMG! foi removida de pAM2S digerindo o plasmídeo até o final usando enzima de restrição Hindil. As saliências terminais do fragmento de DNA linear resultante foram embotadas usando T4 DNA polimerase. O fragmento de DNA foi então parcialmente digerido usando enzima de restrição Spel, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de 4,8 kb foi extraído em gel_ O fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de PCR mvaA digerido por Spel, produzindo plasmídeo de expressão pAM41. A seqüência de nucleotídeos do operon atoB(opt.):ERG13(opt):mvaA contido em pAM41 é SEQ ID NO: 41.

Plasmídeo de expressão pAM52 foi derivado de plasmídeo de expressão pAM41 substituindo a seqüência de codificação do gene ERG! 3, que codifica a HMG-CoA sintase de Saccharornyces cerevisiae, pela seqüência de codificação do gene mvaS, que codifica a HMG-CoA sintase de Staphylococcus aureus (número de acesso de GenBank BA000017, REGIÃO:

2689180..2690346) . ERG13 é também conhecida como HMGS ou HMGCoA sintase. A seqüência de codificação do gene mvaS foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Staphyloccoccus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores HMGS 5' Sa mvaS-S (SEQ ID NO: 4) e HMGS 3' Sa mvaS-AS (SEQ ID NO: 5), e o fragmento de DNA amplificado foi usado como um iniciador de PCR para substituir a seqüência de codificação do gene HMG! em pAM41 de acordo com o método de Geiser et at. (BioTechniques 31:88-92 (2001)), produzindo plasmídeo de expressão pAM52. A seqüência de nucleotídeos do operon atoB(opt):mvaS:mvaA 5 contido em pAM52 é SEQ ID NO: 42.

Plasmídeo de expressão pAM97 foi derivado de plasmídeo de expressão pAM45 substituindo o operon MevT66 pelo operon (atoB(opt):mvaS:rnvaA) de plasmídeo de expressão pAM52. Plasmídeo de expressão pAM45 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Asa' e 10 Sfil, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de 8,3 kb carecendo do operon MevT66 foi extraído em gel. O operon (atoB(opt) :mvaS:mvaA) de pAM52 foi amplificado por PCR usando iniciadores 19-25 atoB Sfil-S (SEQ ID NO: 6) e 19-25 mvaA-AsiSI-AS (SEQ ID NO: 7), o produto de PCR foi digerido até o final usando enzimas de 15 restrição Sfi/ e AsiSl, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 3,7 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição AsiSI Sfil de plasmídeo de expressão pAM45, produzindo plasmídeo de expressão pAM97.

Plasmídeo de expressão pAM97-MBI foi derivado de 20 plasmídeo de expressão pAM97 e pAM45 substituindo o operon MBIS de pAM97 pelo operon MBI de pAM45. O operon MBI foi amplificado por PCR a partir de pAM45 usando iniciadores 9-70C (SEQ ID NO: 8) e 26-39B (SEQ ID NO: 9), a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 4,5 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA 25 isolado foi digerido até o final usando enzimas de restrição Sac! e Xhoi.

Plasmídeo de expressão pAM97 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Sad e Xhol, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de 7,6 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de PCR de operon MBI, produzindo plasmídeo de expressão pAM97-MBL

Plasmídeo de expressão pAM97-MevB foi derivado de plasmídeo de expressão pAM97 e pAM45 substituindo o operon MBIS de pAM97 pelo operon MevB de pAM45. O operon MevB foi amplificado por 5 PCR a partir de pAM45 usando iniciadores 9-70C (SEQ ID NO: 8) e 26-3.9A (SEQ ID NO: 10),^pEFIl^scig7' separado por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de 3,9 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi digerido até o final usando enzimas de restrição Sac! e A770/. Plasmídeo de expressão pAM97 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Sac! e 10 Xhal, sl mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de 7,6 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de PCR de operon MevB, produzindo plasmídeo de expressão pAM97-MevB.

Plasmídeo de expressão pAM128 foi gerado inserindo os 15 operons (atoB(opt),InvaS:mvaA) e MBIS de plasmídeo de expressão pAM97 em um vetor que compreende o sistema de replicação, segregação, e manutenção de plasmídeo RK2, o que remove a necessidade contínua de seleção de antibiótico de transformantes de células hospedeiras. O plasmídeo RK2 foi digerido até o final usando enzima de restrição Psil, a mistura de 20 reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 6,3 kb contendo o locus par inteiro foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi subclonado no sítio de enzima de restrição Pstl do mini RK2 replicon pRR.10 (Roberts et al. (1990) JBactéria 172(11): 6204-6216), produzindo vetor pAM132. Plasmídeo de expressão pAM97 foi 25 digerido até o final usando enzimas de restrição Asei e Saci, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 9,4 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição Med Saar de pAM132, produzindo plasmídeo de expressão pAM128.

^T Exemplo 3

Este exemplo descreve métodos para fazer vetores de expressão que codificam enzimas incluindo enzimas da via de MEV de Enterococcus faecalis organizadas em operons.

Plasmídeo pAM16 foi gerado inserindo a seqüência de codificação do gene mvaE de Enterococcus faecalis (número de acesso de GenBank AF290092 REGIÃO: 1479..3890) (codifica uma acetil-CoA acetiltransferase/HMG-CoA redutase (HMGR)) no vetor pBlueScripII-KS(+). A seqüência de codificação do gene mvaE foi amplificada por PCR a partir de 10 DNA genômico de Enterococcus faecalis (ATCC 700802) usando iniciadores 5' fosforilados 4-40 mvaEF BamHI (SEQ ID NO: 11) e 4-40 mvaERHindl 11 (SEQ ID NO: 12). (Observe que iniciador 4-40 mvaEF BamHI muda o códon de início do gene mvaE de TTG para ATG no produto de PCR amplificado.) O produto de PCR resultante foi ligado no sítio de enzima de restrição Smal 15 de pBlueScripII-KS(+) (Stratagene, La Jolla, CA), produzindo plasmídeo de expressão pAM16.

Plasmídeo pAM18 foi gerado inserindo a seqüência de codificação do gene mvaS de Enterococcus faecalis (número de acesso de GenBank AF290092 REGIÃO: 142..1293) (codifica uma HMG-CoA sintase 20 (HMGS)) no vetor pBlueScripll-KS(+). A seqüência de codificação do gene mvaS foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico Enterococcus faecalis (ATCC 700802) usando iniciadores 5' fosforilados 4-40 mvaSF BOB (SEQ ID NO: 13) e 4-39 mvaSR BamHI (SEQ ID NO: 14), e o produto de PCR foi ligado no sítio de enzima de restrição Smal de pBlueScriplf-KSQ-) 25 (Stratagene, La Jolla, CA), produzindo plasmídeo de expressão pAMI8.

Plasmídeo de expressão pAM22 foi gerado inserindo a seqüência de codificação do gene mvaE de plasmídeo de expressão pAMló no vetor pZE21-PL.Ificot. Vetor pZE21 P é um derivado de vetor pZE21-MCS-l no qual o promotor tet foi substituído pelo promotor P_L.1„.O] (Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res, 2 5:1203-1210). Plasmídeo de expressão pAM16 foi digerido até o final usando enzimas de restrição BamHI e Hind!]!, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 2,4 kb contendo a seqüência de codificação mvaE foi 5 extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio de enzima de restrição BamHI HindlII de pZE21-PL-b_col, produzindo plasmídeo de expressão pAM22.

Plasmídeo de expressão pAM33 foi gerado inserindo a seqüência de codificação do gene rnvaS de plasmídeo de expressão pAM 18 10 em plasmídeo de expressão pAM22. Plasmídeo de expressão pAM18 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Bell e BamHI, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,2 kb contendo a seqüência de codificação do gene mvaS foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio 15 BamHI de plasmídeo de expressão pAM22, produzindo plasmídeo de expressão pAM33.

Plasmídeo de expressão pAM34 foi gerado inserindo o operon mvaS-mvaE de plasmídeo de expressão pAM33 em vetor pAM29. O operon mvaS-mvaE foi isolado digerindo parcialmente pAM33 usando enzima de 20 restrição EcoRI, digerindo o fragmento de DNA linear resultante usando enzima de restrição M/u/, separando a mistura de reação por eletroforese em gel, e extraindo em gel o fragmento de DNA de aproximadamente 3,6 kb. O esqueleto de vetor de pAM29 foi obtido digerindo até o final vetor de expressão pAM25 usando enzimas de restrição Mu/ e EcoRI, separando a 25 mistura de reação por eletroforese em gel, e extraindo em gel o fragmento de DNA de aproximadamente 2,1 kb. Os dois fragmentos de DNA isolados foram ligados, produzindo plasmídeo de expressão pAM34.

Exemplo 4

Este exemplo descreve métodos para fazer plasmídeos de * expressão que codificam enzimas, incluindo enzimas da via de DXP de Escherichia coli organizadas em operon.

Plasmídeo de expressão pAM408 foi gerado inserindo genes codificando enzimas da via de topo de DXP no vetor pAM29. Enzimas da 5 via de “topo” de DXP incluem l-deóxi-D-xilulose-5- fosfato sintase (codificada pelo gene dxs de Escherichia coil), l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (codificada pelo gene dxr de Escherichia coli), 4difosfocitidil-2C-metil-Deritritol sintase (codificada pelo gene ispD de Escherichia coli), e 4-difosfocitidil-2C-metil-Deritritol sintase (codificada 10 pelo gene ispE de Escherichia coli), que juntas transformam piruvato e Dgliceraldeído-3-fosfato para 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritrol-2-fosfato.

Fragmentos de DNA compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam enzimas da via de “topo” de DXP foram gerados amplificando por PCR as seqüências de codificação dos genes dxs (número de acesso de 15 GenBank U00096 REGIÃO: 437539..439401), dxr (número de acesso de GenBank U00096 REGIÃO: 193521..194717), ispD (número de acesso de GenBank U00096 REGIÃO: 2869803..2870512), e ispE (número de acesso de GenBank U00096 REGIÃO 1261249..1262100) de Escherichia coli linhagem DH1 (ATCC #33849) com seqüências Shine Dalgamo ótimas 20 adicionadas e sítios de enzimas de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR mostrados em SEQ ID NOS: 15-18_ Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel, extraídos em gel usando um kit de purificação em gel de Qiagen (Valencia, CA), digeridos até o final usando enzimas de restrição apropriadas (Xhal e Kpnl para o produto de PCR 25 compreendendo o gene dxs; Kprd e Apal para o produto de PCR compreendendo o gene dxr, Apal e Ndel para o produto de PCR compreendendo o gene ispD', ' Ndek e Mitti para o produto de PCR compreendendo o gene ispE), e purificados usando um kit de purificação em PCR de Qiagen (Valencia, CA). Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto de PCR foram então adicionadas a uma reação de ligação para reunir os genes individuais em um operon. A partir desta reação de ligação, 1 pi de mistura de reação foi usado para amplificar por PCR 2 gavetas gênicas separadas, em outras palavras as gavetas de genes dxs-dxr e theispD5 ispE. A gaveta de gene dxs-dxr foi amplificada por PCR usando iniciadores 67-1A-C (SEQ ID NO: 15) e 67-1D-C (SEQ ID NO: 18), e a gaveta de gene ispD-ispE foi amplificada por PCR usando iniciadores 67-1E-C (SEQ ID NO: 19) e 67-1H-C (SEQ ID NO: 22). Os dois produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel, e extraídos em gel, o produto de PCR compreendendo 10 a gaveta de gene dxs-dxr foi digerido até o final usando enzimas de restrição Xhol e Apal, e o produto de PCR compreendendo a gaveta de gene ispD-ispE foi digerido até o final usando enzimas de restrição Apal e Mimi, e os dois produtos de PCR foram purificados. Vetor pAM29 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Sall e Mu/, e os dois produtos de PCR digeridos 15 contendo o operon de topo de via de DXP foram ligados no sítio de enzima de restrição Sall Miul do vetor pAM29, produzindo plasmídeo de expressão pAM408 (veja Figura 4 para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeo de expressão pAM409 foi gerado inserindo genes codificando enzimas da via de “fundo” de DXP no vetor pAM369. Enzimas 20 da via de “fundo” de DXP incluem 2C-metil-D-eritrol 2,4-ciclodifosfato sintase (codificada pelo gene ispF de Escherichia coli), l-hidróxi-2-metil-2(E)- butenil-4-difosfato sintase (codificada pelo gene ispG de Escherichia coli), e isopentenil/dimetilalil difosfato sintase (codificada pelo gene ispH de Escherichia coli), que juntas transformam 4-difosfocitidil-2C-metil-D25 eritritol-2-fosfato para IPP e DMAPP. LPF também é convertida para DMAPP através da atividade de isopentil difosfato isomerase (codificada pelo gene idi de Escherichia coli). DMAPP pode ser adicionalmente convertida para FPP através da atividade de famesil difosfato sintase (codificada pelo gene ispA de Escherichia coli). Um operon codificando enzimas da via de “fundo” de DXP assim como uma isopentil difosfato isomerase e uma famesil difosfato sintase foi gerado amplificando por PCR os genes ispF (número de acesso de GenBank U00096 REGIÃO: 2869323..2869802), ispG (número de acesso de GenBank U00096 REGIÃO: 2638708..2639826), ispH (número de 5 acesso de GenBank U00096 REGIÃO: 26277..27227), idi (número de acesso de GenBank AF119715), e ispA (número de acesso de GenBank D00694 REGIÃO: 484..1383) de Escherichia coli linhagem DH1 (ATCC #33849) com seqüências Shine Dalgamo ótimas adicionadas e sítios de enzimas de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR apropriados. Os produtos de 10 PCR foram separados por eletroforese em gel, extraídos em gel, digeridos com as enzimas de restrição apropriadas (BamHI e Apal para o produto de PCR compreendendo o gene ispF·, Kpnl e Apal para o produto de PCR compreendendo o gene ispG\ Sail e Kpnl para o produto de PCR compreendendo o gene ispH', Sall e Hindll! para o produto de PCR compreendendo o gene idi', Hindlll e Ncol para o produto de PCR compreendendo o gene ispA), e purificados. Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto de PCR foram então adicionadas a uma reação de ligação para reunir os genes individuais em um operon. A partir desta reação de ligação, 1 Al de mistura de reação foi usado para amplificar por 20 PCR 2 gavetas gênicas separadas, em outras palavras as gavetas de genes ispF-ispG e ispH-idi-ispA. A gaveta de gene ispF-ispG foi amplificada por PCR usando iniciadores 67-2A-C (SEQ ID NO: 23) e 67-2D-C (SEQ ID NO: 26), e a gaveta de gene ispH-idi-ispA foi amplificada por PCR usando iniciadores 67-2E-C (SEQ ID NO: 27) e 67-2J-C (SEQ ID NO: 32). Os dois 25 produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel, e extraídos em gel.

O produto de PCR compreendendo a gaveta de gene ispF-LspG foi digerido até o final usando enzimas de restrição BamHI e Kpnl, e o produto de PCR compreendendo a gaveta de gene ispH-idi-ispA foi digerido até o final usando enzimas de restrição Kpnl e Neal, e os dois produtos de PCR foram purificados. Vetor pAM369 foi criado agrupando a origem de replicação pl5A de pAM29 e gene de beta-lactamase para resistência a ampicilina de pZE12-luc (Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210) com um promotor laclJV5 gerado por oligonucleotídeo. Vetor pAM369 foi digerido 5 até o final usando enzimas de restrição BamHI e Ncol, e os 2 produtos de PCR isolados contendo o operon de fundo de via de DXP foram ligados no sítio de enzima de restrição BamHI Ncol do vetor pAM369, produzindo plasmídeo de expressão pAN1409.

Plasmídeo de expressão pAM424, um derivado de plasmídeo 10 de expressão pAM409 contendo a origem de replicação de RK2 de ampla variedade de hospedeiros, foi gerado transferindo o promotor lacUV5 e o operon ispFGH-idi-ispA de pAM409 para o vetor pAM257. Vetor pAM257 foi gerado como segue: o locus RK2 par foi amplificado por PCR a partir de DNA de plasmídeo RK2 (Meyer et al. (1975) Science 190:1226-1228) usando 15 iniciadores 9156A (SEQ ID NO: 33) e 9-156B (SEQ ID NO: 34), o produto de PCR de 2,6 kb foi digerido até o final usando enzimas de restrição Aatll e Xhol, e o fragmento de DNA foi ligado em um plasmídeo contendo a origem de replicação pl5 e o gene de resistência a cloranfenicol de vetor pZA31-Iuc (Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210), produzindo 20 plasmídeo pAM37-par; pAM37-par foi digerido até o final usando enzimas de restrição Saci e Hindü!, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA compreendendo o locus par de RK2 e o gene de resistência a cloranfenicol foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de Sac! Hindü! do mini-RK2 replicon pRR.10 (Roberts et 25 al. (1990) J Bacterial. 172:6204 6216), produzindo vetor pAlvll33; pAM 133 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Bglif e Hindü!, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 6,4 kb carecendo do gene de resistência à ampicilina e origem conjugativa de oriT foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado com um fragmento de DNA sinteticamente gerado compreendendo um múltiplo sítio de clonagem contendo sítios de enzimas de restrição Pcil e Xhal, produzindo vetor pAM257. Plasmídeo de expressão pAM409 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Xhol e Pcil, a 5 mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de aproximadamente 4,4 kb foi extraído em gel. Vetor pAM257 foi digerido até o final usando enzimas de restrição Xhol e Pcil, e o fragmento de DNA isolado contendo o promotor lacUV5 e o operon ispFGH-idi-ispA foi ligado no sítio de enzima de restrição Xhol Pcil do vetor pAM257, produzindo 10 plasmídeo de expressão pAM424 (veja Figura 5 para um mapa de plasmídeo).

Exemplo 5

Este exemplo descreve métodos para fazer plasmídeos de expressão que codificam enzimas que convertem FP? ou GPP.

Plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS foi gerado inserindo 15 uma seqüência de nucleotídeos codificando uma amorfa-4,11-dieno sintase (ADS) em vetor pTrc99A. A seqüência de amorfa-4,11-dieno sintase foi gerada sinteticamente, de forma que mediante tradução a seqüência de aminoácidos deve ser idêntica àquela descrita por Merke et al. (2000) Ach. Biochem. Biophys. 381:173-180, de forma que a seqüência de nucleotídeos 20 codificando a amorfa-4,11-dieno sintase foi otimizada para expressão em Escherichia coil, e de forma que a seqüência de nucleotídeos foi flanqueada por um sítio de enzima de restrição 5' Ncoi e um de 3' Xmal (veja Patente Norte-Americana Número 7.192.751). A seqüência de nucleotídeos foi digerida até o final usando enzimas de restrição Neal e Xmal, a mistura de 25 reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,6 kb foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi inserido no sítio de enzima de restrição Ncol Xmal do vetor pTrc99A (Amman et al. (1985) Gene 40:183-190), produzindo plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS (veja Figura 6 para um mapa de plasmídeo).

’ Plasmídeo de expressão pAM 113 é um derivado resistente a cloranfenicol de pTrc99A-ADS. Ele foi gerado amplificando por PCR o gene de resistência a cloranfenicol de vetor p2A31-luc (Lutz and Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210) usando iniciadores 5' fosforilados 19-137 cml5 pAM37-AS (SEQ ID NO: 35) e 19-137 cml-pAM37-S (SEQ ID NO: 36), e inserindo o produto de PCR de 920 bp no sítio de enzima de restrição Fspl de plasmídeo de expressão pTrc99A-ADS, produzindo plasmídeo de expressão pAM113.

Plasmídeo de expressão pC9 foi gerado inserindo um fragmento de DNA genômico de Bacillus subtilis 6051 compreendendo a seqüência de codificação do gene nudF e seqüências genômicas anteriores (número de acesso de GenBank Z99116 REGIÃO: 49364.48548) em vetor pTrc99A (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315). Plasmídeo de expressão pNudF-H foi gerado inserindo a seqüência de codificação do gene nudF de

Bacillus subtilis 6051 (número de acesso de GenBank Z99116 REGIÃO:

49105..48548) em vetor pTrc99A. Plasmídeo de expressão pyhfR foi gerado inserindo a seqüência de codificação do gene yhfR de Bacillus subtilis 6051 (número de acesso de GenBank Z99109 REGIÃO: 97583..97002) em vetor pTrc99A.

Plasmídeo de expressão pAM373 foi gerado inserindo uma seqüência de nucleotídeos codificando a β-fameseno sintase (FSB) de Artemisia annua (número de acesso de GenBank AY835398), códonotimizada para expressão em Escherichia coli, no vetor pTrc99A. A seqüência de nucleotídeos codificando a β-fameseno sintase foi gerada sinteticamente, e foi amplificada por PCR a partir de sua construção de síntese de DNA usando os iniciadores apropriados. Para criar um sítio de enzima de restrição Neal líder no produto de PCR compreendendo a seqüência de codificação de β-fameseno sintase, o códon codificando o segundo aminoácido na seqüência original de polipeptídeo (TCG codificando para serina) foi substituído por um códon codificando ácido aspártico (GAC) no iniciador de PCR 5' (SEQ ID NO: 37). O produto de PCR resultante foi parcialmente digerido usando enzima de restrição Neal, e digerido até o fmal usando enzima de restrição Saci, a mistura de reação foi separada por 5 eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb compreendendo a seqüência de codificação de β-fameseno sintase foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição Ncol Sac! do vetor pTrc99A, produzindo plasmídeo de expressão pAM373 (veja Figura 6 para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeos de expressão pTrc99A-FSA, pTrc99A-GTS, pTrc99A-PS, pTrc99A-TS foram gerados inserindo um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma a-fameseno sintase (FSA), uma γ- terpizeno sintase (GTS), uma α-pineno sintase (APS), ou uma terpinoleno sintase (TS) no vetor pTrc99A. O inserto de fragmento de DNA foi gerado sinteticamente, usando como um modelo, por exemplo, a seqüência de codificação do gene de β-fameseno sintase de Picea abies (número de acesso de GenBank AY473627, REGIÃO: 24..1766), a seqüência de codificação do gene de β-fameseno sintase de Artemisia annua (número de acesso de GenBank AY835398), a seqüência de codificação do 20 gene y-terpineno sintase de Citrus limon (número de acesso de GenBank

AF514286 REGIÃO: 30..1832), a seqüência de codificação do gene de apineno sintase de Abies grandis (número de acesso de GenBank U87909, REGIÃO: 6..1892) ou de Pinus taeda (número de acesso de GenBank AF543530 REGIÃO: 1..1887), ou a seqüência de codificação do gene de 25 terpinoleno sintase de Ocimum basilicum (número de acesso de GenBank

AY693650) ou de Pseudotsuga menziesii (número de acesso de GenBank AY906866 REGIÃO: 10.. 1887) ou de A hies grandis (número de acesso de GenBank AF 139206), todas as seqüências de nucleotídeos sendo códon otimizadas para expressão em Escherichia coli. Os fragmentos de DNA para

PSA foi amplificado por PCR a partir de sua construção de síntese de DNA usando as seqüências de iniciadores SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40. O produto de PCR resultante foi digerido até o final usando enzimas de restrição Nail e Sad, a mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o 5 fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb compreendendo a seqüência de codificação de α-fameseno sintase foi extraído em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição Ncol Sac! do vetor pTrc99A, produzindo plasmídeo de expressão pTrc99A-FSA (veja figura 6 para um mapa de plasmídeo). Os fragmentos de DNA para GTS, APS, e TS 10 foram construídos para serem flanqueados por um sítio de enzima de restrição Xmal líder e um sítio de enzima de restrição Xbai terminal, e foram clonados em sítios compatíveis de enzimas de restrição de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pUC ou pACYC padrão, dos quais eles podem ser liberados de novo digerindo até o final a construção de síntese de DNA 15 usando enzimas de restrição Xbal e Xmaf, separando a mistura de reação por eletroforese em gel, e extraindo em gel o fragmento de DNA codificando terpeno sintase 1,7 a 1,9. Os fragmentos de DNA isolados foram ligados no sítio de enzima de restrição Xmal Xbal de vetor pTrc99A (Amman et at, Gene 40:183-190 (1985)), produzindo plasmídeos pTrc99A-GTS, pTrc99A-APS, 20 ou pTrc99A-TS (veja Figura 6 para mapas de plasmídeos).

Plasmídeos de expressão pRS425-FSA e pRS425-FSB foram gerados inserindo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma afameseno sintase (FSA) ou uma β-fameseno sintase (FSB), respectivamente, no vetor pRS425-Gall (Mumberg et. al. (1994) NucL Acids.

Res. 22(25): 5767-5768). Os insertos de seqüência de nucleotídeos foram gerados sinteticamente, usando como um modelo, por exemplo, a seqüência de codificação do gene de α-fameseno sintase de Picea abies (número de acesso de GenBank AY473627, REGIÃO: 24..1766) ou do gene de βfameseno sintase de Artemisia annua (número de acesso de GenBank

ΑΥ835398), códon-otimizada para expressão em Saccharomyces cerevisiae. A seqüência de nucleotídeos sinteticamente gerada foi flanqueada por um sítio de 5' BamIII e um sítio de 3' 'Cho/, e assim pode ser clonada em sítios compatíveis de enzima de restrição de um vetor de clonagem tal como um 5 vetor de origem pUC ou pACYC padrão. A seqüência de nucleotídeos sinteticamente gerada foi isolada digerindo até o final a construção de síntese de DNA usando enzimas de restrição BamHI e Xhol. A mistura de reação foi separada por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,7 kb compreendendo a seqüência de codificação de α-fameseno sintase ou 10 β-fameseno sintase foi extraída em gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de enzima de restrição BamHI Xhol do vetor pRS425-Gall, produzindo plasmídeo de expressão pRS425-FSA ou pRS425-FSB, respectivamente.

Plasmídeos de expressão pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, 15 pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-CS, e pTrc99A-SS são gerados inserindo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma linalol sintase (LLS), limoneno sintase (LMS), α-pineno sintase (BPS), β-felandreno (FHS), careno sintase (CS), ou sabineno sintase (SS) no vetor pTrc99A. Os insertos de seqüência de nucleotídeos são gerados sinteticamente, usando 20 como um modelo, por exemplo, a seqüência de codificação do gene de linalol sintase de Artemisia annua (número de acesso de GenBank AF154124, REGIÃO: 13..1764), a seqüência de codificação do gene de limoneno sintase de Abies grandis (número de acesso de GenBank AF006193 REGIÃO:

73..1986), a seqüência de codificação da β-pineno sintase de Artemisia annua 25 (número de acesso de GenBank AF276072 REGIÃO: 1..1749), a seqüência de codificação do gene de β-felandreno sintase de Abies grandis (número de acesso de GenBank AF 139205 REGIÃO: 34..1926), a seqüência de codificação do gene de careno sintase de Salvia stenophylla (número de acesso de GenBank AF527416 REGIÃO: 78..1871), ou a seqüência de codificação do gene de sabineno sintase de Salvia afficinalis (número de acesso de GenBank AF051901 REGIÃO: 26..1798). As seqüências de nucleotídeos codificando as β-pineno, sabineno, e β-felandreno sintases são flanqueadas por um sítio de enzima de restrição Xmal líder e um de enzima de 5 restrição Xbal terminal, as seqüências de nucleotídeos codificando as linalol e careno sintases são flanqueadas por um sítio de enzima de restrição Ncol líder e um sítio de enzima de restrição Xmal terminal, e a seqüência de nucleotídeos codificando a limoneno sintase é flanqueada por um sítio de enzima de restrição Ncol líder e um sítio de enzima de restrição Psti terminal. 10 As construções de síntese de DNA são digeridas para completar usando enzimas de restrição Xmal e ,w/ (para as construções de β-pineno, sabineno, e β-felandreno sintase), Neal e Xmal (para as construções de linalol e careno sintase), ou enzimas de restrição Xbal e Psti (para a construção de limoneno sintase). As misturas de reação são separadas por eletroforese em gel, os 15 fragmentos de DNA de aproximadamente 1,7 a 1,9 kb são extraídos em gel, e os fragmentos de DNA isolados são ligados no sítio de enzima de restrição Xmal Xbal (para os insertos de β-pineno, sabineno, e β-felandreno sintase), no sítio de enzima de restrição Neal' Xmal (para os insertos de linalol e careno sintase), ou no sítio de enzima de restrição Xbal Psti (para o inserto de 20 limoneno sintase) do vetor pTrc99A, produzindo plasmídeos de expressão pTrc99A-LLS, pTrc99A-LMS, pTrc99A-BPS, pTrc99A-PHS, pTrc99A-CS, e pTrc99A-SS (veja Figura 6 para mapas de plasmídeos).

Exemplo 6

Este exemplo descreve a geração de linhagens hospedeiras de 25 Escherichia coli úteis na invenção.

Como detalhado em Tabela 1, as linhagens hospedeiras foram criadas transformando células parentais de Escherichia coil quimicamente competentes com um ou mais plasmídeos de expressão de Exemplo 1 até 5.

Tabela 1. Linhagens hospedeiras de E. coli

Linhagem hospedeira	Linhagem parental de E.coli	Plasmídeos de Expressão	Seleção de antibiótico
B32	DHI	PMev TpMBIS pTrc99A-ADS	100 ug/mL de carbenicilina 5 ug/mL de tetraciclina 34 ug/mL de cloranfenicol
B292	B
B210	DP
B153	DHI	pAM97 pTrc99A-ADS	100 ug/mL de carbenicilina 34 ug/mL de cloranfenicol 100 ug/mL de carbenicilina 34 ug/mL de cloranfenicol
B282	DP
B255	DHI	pAM128
B256	DP	pAM113
B86	DHI	pAMS2 pMBIS pTrc99A-ADS	50 ug/mL de canamicina 100 ug/mL de carbenicilina 5 ug/mL de tetraciclina
B61	DHI	pAM25 pBBRlMCS-3 pTrc99A
B62	pAM34 pBBRlMCS-3 pTrc99A
B003	DH10B	pTrc99A-ADS	100 pg/ml de carbenicilina
B617	pAM408 pTrc99A-ADS	100 ug/mL de carbenicilina 50 ug/mL de canamicina
B618	pAM424 pTrc99A-AJDS	100 ug/mL de carbenicilina 35 geml de cloranfenicol
B619	pAM408 pAM424 pTrc99A-ADS	100 ug/ml de carbenicilina 50 g/ml de canamicina 35 ug/ml de cloranfenicol
B650	DH10B	pAM373	100 ug/lde carbenicilina
B651	pAM408 pAM373	100 ug/ml de carbenicilina 50 ug/ml de canamicina
B652	pAM424 pAM373	100 ug/ml de carbenicilina 35 ug/ml de cloranfenicol
B653	pAM408 pAM424 pAM373	100 ughnl de carbenicilina 50 ug/ml de canamicina 35 ug/ml de cloranfenicol
B286	DHI	pAM97 MevB pC9	100 ug/ml de carbenicilina 34 ug/ml de cloranfenicol
B287	pAM97 MevB pnudF-H
B288	pAM97-MevB pyhfR
B291	pAM97-MBl pyhfR	100 ug/ml de carbenicilina 34 ug/ml de cloranfenicol
B592	DHI	pMevT pMBIS pTrc99A-FSA
B552	PMevT	5 ug/ml de tetraciclina
		pMBIS pAM373

Exemplo 21 célula hospedeira (produção de		pMevT pMBIS-gpps pTrc99A-GTS ou - APS ou -TS
Exemplo 21 célula hospedeira (produção de LLS, LMS, BPS, PHS, CS,	pMevT pMBIS-gpps pTrc99A-LLS ou LMS ou —BPS ou PHS ou —CS ou -SS	100 ug/mL de carbenicilina 34 ug/mL de cloranfenicol 5 ug/mL de tetraciclina.

Transformantes de células hospedeiras foram selecionados em ágar Luria Bertoni (LB) contendo antibióticos como detalhado em Tabela 1. Colônias individuais foram transferidas de ágar LB para tubos de cultura contendo 5 mL de meio LB líquido e antibióticos. Transformantes de células ⁴ 5 hospedeiras 13003, 13617, 13618, 33619, B650, 13651, B652, e B653 foram incubados a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm por 30 horas. Todos os outros transformantes de células hospedeiras foram incubados a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm até crescimento ter atingido fase estacionária. As células foram adaptadas a meio mínimo passando elas por 4 a 5 ciclos 10 sucessivos de meio M9-MOPS contendo 0,8% de glicose e antibióticos (veja Tabela 2 para a composição do meio M9-MOPS). As células foram armazenadas a -80°C em criofrascos em alíquotas estoque de 1 mL constituídas de 400 uL de glicerol a 50% estéril e 600 uL de cultura líquida.

Tabela 2 — Composição de Meio de Cultura M9-MOPS

Componente	Quantidade (por L)
Na2HPO4 7H2O	12,8 g
kh2po4	3g
NaCI	0,5 g
NPUCl	1 g
MgSO4	2 mmol
CaCi2	0,1 mmol
Tiamina	0,1 ug
Tampão MOPS pH 7,4	100 mmol
(NH3)6Mo7024 4H20	3,7 ug
H3B04	25 ug
CoCl2	7,1 ug
CuSO4	2,4 ug
Mna2	16 ug

ZI1SO4	2,9 ug
FeSO4	0,28 mg

Exemplo 7

Este exemplo demonstra estabilidade de plasmídeo de expressão na ausência de antibióticos em uma linhagem hospedeira de Escherichia coli que abriga um plasmídeo de expressão compreendendo o 5 sistema de replicação, segregação, e manutenção de plasmídeo RK2.

Uma cultura inseminada de linhagem hospedeira 8255 foi estabelecida adicionando uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 125 mL contendo 40 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando a cultura 10 durante a noite.

A cultura inseminada foi usada para inocular em um °Do° inicial de aproximadamente 0,05, dois frascos de 250 mL cada contendo 40 mL de meio M9-MOPS, 2% de glicose, and 0,5% de extrato de levedura. Cultura #1 também conteve 100 ug/mL de carbenicilina e 34 ug/mL de 15 cloranfenicol. Cultura #2 não recebeu nenhum antibiótico. Ambas as culturas foram incubadas a 37°C em um agitador rotatório at 250 rpm até que elas atingissem um OD600 de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção de amorfa-4,11 -dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de 1M IPTG ao meio de cultura. No momento de indução, as culturas foram 20 cobertas com 8 mL de uma camada orgânica para capturar o amorfa-4,11dieno. Amostras foram tomadas periodicamente por um total de 72 horas. Produção de amorfa-4,11 -dieno pela linhagem hospedeira nas 2 culturas foi confirmada por GC/MS como descrito em Exemplo 10.

Para verificar estabilidade de plasmídeo nas duas culturas 25 celulares, uma amostra de cada cultura foi removida em 72 horas e corrida em uma placa de ágar LB (sem antibiótico). Depois de incubação durante a noite a 37°C, 50 colônias individuais derivadas de cada cultura foram replicaemplacadas em uma placa de ágar LB mais antibióticos (34 ug/mL de cloranfenicol, 100 ug/mL de carbenicilina) e uma placa de ágar LB menos antibióticos (sem antibiótico). Depois de outra incubação durante a noite a 37°C, a placa de ágar LB mais antibióticos e a placa de ágar LB menos antibióticos foram cada uma encontradas contendo aproximadamente 50 5 colônias, indicando que retenção de plasmídeo tanto na presença como na ausência de antibióticos no meio de cultura foi de aproximadamente 100%. Exemplo 8

Este exemplo demonstra atividade específica aumentada e estabilidade da Enterococcus faecalis HMGR comparada com a 10 Saccharomyces cerevisiae tHMGR em uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras B61 e B62 foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a frascos de 125 mL contendo 20 mL de meio M9-MOPS, 0,8% % de glicose, e 15 antibióticos como detalhado em Tabela 5, e cultivando as culturas até saturação. As culturas inseminadas foram diluídas 1; 100 em 140 mL de meio fresco em um frasco de 500 mL, e cultivadas de novo até um OD₅₅₀ de aproximadamente 0,1, em cujo ponto produção de amorfa-4,11-dieno foi induzida adicionando 140 uL de 1 M IPTG a cada cultura. Em 4, 12, 20, 28, 20 36, e 49 horas após indução, amostras foram removidas de cada cultura, e células foram peletizadas por centrifugação. Os péletes celulares foram imediatamente congelados em gelo seco, e então armazenados a -80°C.

Para conduzir ensaios enzimáticos, péletes celulares foram congelados em gelo, e então lisados usando Bugbuster (Novagen, Madison, 25 WI) contendo mistura de inibidor de protease #3 (Calbiochem, San Diego, CA), benzonase (20 oer5 mL bugbuster; Novagen, Madison, WI), e lisozima (30 ug/mL). Atividade enzimática da Saccharomyces cerevisiae tHMGR foi ensaiada em 50 mM de Tris MCI (pll7.5), 0,2 mM de NADPH (Sigma, St. Louis, MO), e 0,3 mM de sal de sódio de DL-3-hidróxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) (Sigma, St. Louis, MO). O ensaio foi iniciado adicionando lisado celular, e o desaparecimento de NADPH foi monitorado por absorbância em 340nM. Para explicar desaparecimento não específico de NADPH, resultados obtidos em um ensaio carecendo de HMG-CoA foram subtraídos de resultados obtidos em amostras de teste. Atividade enzimática da HMGR de Enterococcus faecalis foi medida similarmente exceto que o tampão de ensaio conteve 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH6,5), 0,4 mM de NADPH, 1,0 mM de EDTA, e 100 mM de KCI.

Ensaios protéicos foram feitos pelo método de Bradford ((1976) Anal Biochem. 72:248-254). Atividades específicas foram calculadas como Anmol NADPH/min/mg de proteína.

Como mostrado em Figura 8, a HMGR de Enterococcus faecalis exibiu maior atividade específica e estabilidade aumentada comparada com a tHMGR de Saccharomyces cerevisiae.

Exemplo 9

Este exemplo descreve a calibração de OD600 com peso seco celular (DCW).

Para obter a relação entre DCW e OD600, uma linhagem representativa, B32, foi cultivada em processos de alta densidade celular similares àqueles descritos em Exemplos 10-14. Amostras foram tomadas ao longo dos ciclos, e o °D_0C, e DCW foram medidos para cada amostra. Para determinar o DCW, as células foram peletizadas e o sobrenadante descartado. O pélete celular foi lavado uma vez com água, e foi então seco em um forno a 80°C por pelo menos 3 dias. Os tubos contendo péletes celulares foram pesados, o peso do tudo foi subtraído dos pesos medidos, e o peso remanescente foi dividido pelo volume inicial de cada amostra (0.0015 L) para obter o DCW.

Figura 9 mostra a relação entre DCW e °D6) medidos nestes experimentos.

Exemplo 10

Este exemplo demonstra produção aumentada de amorfa-4,11dieno em linhagens hospedeiras de Escherichia coil expressando as HMGR e HMGS de Staphylococcus aureus comparadas com linhagens hospedeiras expressando as tHMGR e HMGS de Saccharornyces cerevisiae.

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras B32, B153,l 1210,13282, B292,1386, B255, e B256 foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a frascos separados de 125 mL contendo 25 mL de meio M9-MOPS, 0,8% de glicose, e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando as culturas durante a noite.

As culturas inseminadas foram usadas para inocular em um OD₆₀o inicial de aproximadamente 0,05 frascos separados de 250 ml contendo 40 mL de meio M9-MOPS, 2% de glicose, e antibióticos. As culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que elas atingissem um OD600 de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção de amorfa4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de 1M 1PTG ao meio de cultura. As culturas foram cobertas com 8 mL de uma camada orgânica (e.g., dodecano, oleato de metila ou miristato de isopropila). Amostras da camada orgânica de revestimento e do caldo foram tomadas uma vez por dia por 72 horas. Amostras de caldo foram usadas para medir o OD600. Concentração de amorfa-4,11-dieno foi medida transferindo 5 uL da camada orgânica de revestimento para um frasco de vidro limpo contendo 500 uL de acetato de etila reforçado com beta- ou trans-cariofileno como um padrão interno.

As amostras de camada orgânica/acetato de etila foram analisadas em um equipamento Hewlett-Packard 6890 de cromatografia gasosa/espectrômetro de massa (GC/MS) mapeando apenas dois íons, o íon molecular (204 m/z) e o íon 189 m/z, como descrito em Martin et al. (2001) Biotechnol. Bioeng, 75:497-503. Para agilizar tempos de ciclos, o programa de temperatura e matriz de coluna foram modificados para atingir resolução ótima em pico e o menor tempo de ciclo total. Uma amostra de 1 uL foi separada na GC usando uma coluna DB-XLB (disponível a partir de Agilent Technologies, Inc., Paio Alto, CA) e gás carreador hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 100°C por 0,75 minutos, aumentando temperatura em 60°C/minuto para uma temperatura de 300°C, e uma parada em 300°C por 0,5 minutos. As amostras separadas foram analisadas por um detector seletivo de massa Hewlett-Packard modelo 5973 que monitorou íons 189 e 204 m/z. Espectros de massa prévios demonstraram que o produto de amorfa-4,11-dieno sintase foi amorfa-4,11-dieno, e que amorfa-4,11-dieno teve um tempo de retenção de 3,7 minutos usando este protocolo de GC. Beta- ou trans-cariofileno foi usado como um padrão interno para quantificação. Título de amorfa-4,11-dieno foi calculado usando a proporção de padrão interno para áreas de pico de amorfa-4,11-dieno baseado em uma curva de calibração quantitativa de amorfa-4,11-dieno purificado (0,63-10 mg/L de KJF17-109-3) em acetato de etila reforçado com cariofileno.

Como mostrado em Figuras 10A and 10B, linhagens B153 e B282, que expressaram as HMGR e HMGS de Staphylococcus aureus, produziram níveis elevados de amorfa-4,1 1-dieno comparadas com linhagens 832, B210, B255, B256, e B292, que expressaram as tHMGR e HMGS de Saccharomyces cerevisiae.

Exemplo 11

Este exemplo demonstra produção aumentada de amorfa-4,11dieno por uma linhagem hospedeira de Escherichia coli cultivada em temperatura sub-ótima.

Uma cultura inseminada de linhagem hospedeira B32 foi estabelecida adicionando 0,5 rriL de uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando a cultura durante a noite a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm.

A cultura inseminada foi usada para inocular em um OD600 inicial de aproximadamente 0,05 quatro frascos de 250 mL, cada um contendo 40 mL de meio de fermentação batelada (veja Tabela 6 para composição de meio), 100 mM de tampão MOPS pH 7,1, e antibióticos. As culturas foram incubadas em um agitador rotatório a 250 rpm ou a 30°C ou 37°C até que elas atingissem um OD_E® de 0,18 a 0,22, em cujo ponto a produção de amorfa4,11 -dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de I M PTO ao meio de cultura. No momento de indução, as culturas foram cobertas com 8 mL de uma camada orgânica para capturar o amorfa-4,11 -dieno. Amostras foram tomadas uma vez por dia, e analisadas como descrito em Exemplo 10.

Como mostrado em Figuras 11A e 11B, fermentação a 30°C não afetou crescimento celular, mas levou a um aumento de aproximadamente 50% na produção específica de amorfa-4,11-dieno pela linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Exemplo 12

Este exemplo demonstra produção aumentada de amorfa-4,11dieno por uma linhagem hospedeira de Escherichia coli cultivada em condições de fonte de carbono restrita.

Uma cultura inseminada de linhagem hospedeira B32 para ciclos de fermentação 050608-1 e 050629-1 foi estabelecida adicionando 0,25 uL de uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e incubando a cultura a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que ela tenha atingido um OD₆₀o de 1 a 2.

Uma cultura inseminada de linhagem hospedeira B32 para ciclo de fermentação 060403-3 foi estabelecida adicionando uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio M9MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e incubando a cultura durante a noite a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm. A cultura inseminada foi usada para inocular em um odóoo inicial de aproximadamente 1 a frasco de 250 mL contendo 40 mL de meio M9-MOPS e antibióticos, e a cultura foi de novo incubada a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que ela tenha atingido um OD₆₀o de 3 a 5.

Para todos os processos de fermentação, ο KH2PO4, K211PO4 3H20, EDTA, ácido cítrico, e (NH^SC^ foram esterilizados por calor no biorreator (2L Applikon Bioconsole AD! 1025s com controladores ADI 1010, Applikon Biotechnology, Foster City, CA). Os componentes remanescentes de meio foram filtro-esterilizados como soluções estoques e injetados através da placa principal. Tabela 3 mostra a composição final de meio para ciclos de fermentação 050608-1 e 050629-1. Tabela 4 mostra a composição final de meio para ciclo de fermentação 060403-3. O volume inicial para ciclo 050608-1 foi 0,8 L, o volume inicial para 050629-1 foi 1,2 L e o volume inicial para 060403-3 foi 1 L. Todos os ciclos foram inoculados injetando 50 mL da cultura inseminada através da placa principal.

Tabela 3 - Composição de Meio de Fermentação de Ciclos de Fermentação 050608-1 e 050629-1

Componente	Meio de Batelada (por L)	Solução de Alimentação (por L)
Glicose	5g	590-650 g
Kll2l404	4,2 g
Κ211Γ04 3H20	15,7 g	-
Ácido cítrico	1,7 g
(N114)2SO4	2g	-
MgSO4 7H20	L2 g	12g
EDTA	8,4 mg	13 g
CoC12 6H20	0,25 mg	0,4 mg
MnC12 4H20	1,5 mg	2,35 mg
CuC12 2H20	0,15 mg	0,25 mg
H3B04	0,3 mg	0,5 mg

Na2Mo04 2H20	0,25 mg	0,4 mg
Zn(CH3C00)2 2H20	1,3 mg	1,6 mg
Hidrato de citrato de Fe(III)	10,0 mg	4,0 mg
Tiamina HC1	4,5 mg	-
Carbenicilina	100 ug	100 ug
Tetraciclina	5 ug	5 ug
Cloranfenicol	34 ug	34 ug

Tabela 4 - Composição de Meio de Fermentação de Ciclo de Fermentação

060403-3

Componente	Meio de batelada (por L)	Solução de alimentação (por L)
Glicose	15 g	650 g
KH2PO4	4,2 g	-
'K2HPO4 3H20	15,7 g	-
Ácido cítrico	1,7 g	-
(NH4)2SO4	2g	-
MgSO4 7H20	1,2 g	12 g
EDTA	8,4 mg	13 mg
CoCl26H20	2,5 mg	4 mg
MnCl24H20	15 mg	23,5 mg
CuCl2 2H20	1,5 mg	2,5 mg
II3BO4	3 mg	3 mg
NFa2Mo04 2H20	2,5 mg	4 mg
Zn(CH3C00)2 2H20	13 mg	16 mg
Hidrato de citrato de Fe(l 11)	100 mg	40 mg
Tiamina HCI	4,5 mg	-
Carbenicilina	100 ug	100 ug
Tetraciclina	5 ug	5 ug
Cloranfenicol	34 ug	34 ug

Para ciclo de fermentação 050608-1 (carbono em excesso), a ração foi iniciada em indução, e taxas de alimentação foram ajustadas 5 manualmente para fornecer glicose nas concentrações mostradas em Figura 12C. Para ciclo de fermentação 050629-1 (restrito por carbono), a ração foi entregue ao fermentador de acordo com o protocolo mostrado em Tabela 5. Para ciclo de fermentação 060403-3 (pouco carbono), a alimentação foi iniciada automaticamente quando o bolo inicial de glicose (15 g) foi exaurido e o oxigênio dissolvido reforçado. Até um máximo de 27,6 _gfhr, a taxa da ração foi calculada de acordo com a seguinte equação:

// = 0.12

S(Q = 15g caracterizado pelo fato de que t₀ é o momento no qual a glicose inicial foi esgotada. Ao atingir a taxa máxima, a ração de glicose foi restrita a uma taxa 5 de 9,5 g/h, e mantida constante nesta taxa para o restante do ciclo.

Tabela 5 -Protocolo de Alimentação para ciclo de fermentação 050629-1

Tempo de Ciclo (horas)	Taxa de Ração de Glicose (g/h)
0	0
7	0,37
10	0,74
12	1,11,
14	1,48
16	2,22
18	2,96
20	3,69
22	4,80
24	5,91
31	7,39
33	5,54
47	3,69

Ciclos 050608-1 e 050629-1 foram realizados a 37°C. Fluxo de ar no biorreator foi ajustado em 1-2 L/min; pH foi mantido em 7 usando hidróxido de amônio e/ou hidróxido de sódio; agitação inicial foi 500-600 10 rpm; espuma foi controlada com antiespuma B (Sigma-Aldich, St. Louis, MO); os níveis de oxigênio dissolvido foram mantidos acima de 30% usando uma cascata de agitação. Depois de 5-6 horas de cultivo, produção de amorfa4,11 -dieno pelas células hospedeiras foi induzida adicionando 0,8 mL de 1 M IPTG a ciclo 050608-1 e 1,2 mL IPTG a ciclo 050629-1. Mediante indução, a 15 temperatura de cultura foi reduzida para 30°C.

o

Ciclo 060403-3 foi realizado a 30 C. Fluxo de ar no biorreator foi ajustado em 1-2 L/min; pH foi mantido em 7 usando hidróxido de amônia. Oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30% por uma cascata de agitação e enriquecimento de oxigênio. Em um OD_d de aproximadamente 28 (19 horas depois de inoculação), produção de amorfa4,11-dieno pelas células hospedeiras foi induzida adicionando 1 mL 1 M IPTG.

Amorfa-4,11-dieno foi capturado e extraído de acordo com dois protocolos diferentes. Para ciclos 050608-1 e 050629-1, amorfa-4,11dieno volátil presente no gás de exaustão foi capturado expelindo o gás de exaustão através de um lavador de gases contendo 200 mL de heptanol. O heptanol foi então diluído em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4,11-dieno na amostra fosse entre 0,63 mg/L e 20 mg/L. Para ciclo 060403- 3, amorfa-4,11-dieno foi capturado no biorreator adicionando 200 mL de uma camada orgânica ao fermentador no momento de indução. Concentração de produto foi medida combinando 25 uL de caldo mais camada orgânica com 975 uL de acetonitrila, agitando a amostra em velocidade máxima em um misturador Fisher Vortex Genie 2TM (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) por pelo menos 3 minutos, removendo células da amostra por centrifugação, e diluindo a solução de acetonitrila em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4.11-dieno na amostra fosse entre 0,63 e 20 mg/L. As amostras de acetato de etila foram analisadas por GC/MS como descrito em Exemplo 10.

Como mostrado em Figuras 12A e 12B, ciclo de fermentação 050608-1 (carbono em excesso) resultou em baixas densidades celulares máximas e baixa produção de amorfa-4,11-dieno, respectivamente, se correlacionando, pelo menos em parte, ao aumento relativamente rápido em níveis de acetato (Figura 12D). Em comparação, ciclo de fermentação 050629-1 (restrito por carbono) resultou em produção aumentada de amorfa4,11-dieno (Figura 12B), e atrasou o início de produção de acetato. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que rações com glicose em excesso levam a uma rápida produção de acetato e morte celular precoce.

Restrição de glicose adicional como atingida por ciclo de fermentação 060403-3 (pouco carbono) resultou em baixa produção de acetato por mais de 100 horas (Figura 12D), e densidade celular máxima e produção de amorfa-4,11-dieno significantemente maior (Figuras 12A and 12B).

Exemplo 13

Este exemplo demonstra produção aumentada de amorfa-4,11dieno por uma linhagem hospedeira de Escherichia coli cultivada em condições de fonte de carbono restrita e em temperatura sub-ótima.

Uma cultura inseminada de linhagem hospedeira BI53 foi estabelecida adicionando uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando a cultura a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm para um OD₆₀o de 3,5 a 4,5.

Biorreatores de 2 L (Biocontroller ADI 1010 com Bioconsole ADI 1025, Applikon Biotechnology, Foster City, CA) foram configurados e executados da mesma maneira como descrito em Exemplo 12 para ciclo 060403-3, exceto que linhagem e tempo de indução foram variados.

Produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 1 mL, de 1 M IPTG ao meio de cultura. No ciclo de fermentação mostrado em Figura 13A, síntese de amorfa-4,11-dieno foi induzida em um OD₆₀o de aproximadamente 2, enquanto que o fermentador conteve ainda glicose em excesso. No ciclo de fermentação mostrado em Figura 13B, síntese de amorfa-4,11-dieno foi induzida em um ODD de aproximadamente 33, o que foi depois da ração restrita em glicose ter começado.

Amorfa-4,11-dieno foi capturado e extraído de acordo com dois protocolos diferentes. Para o ciclo de fermentação mostrado em Figura

13A, amorfa-4,11-dieno volátil presente no gás de exaustão foi capturado expelindo o gás de exaustão através de um lavador de gases contendo 200 mL de heptanol. O heptanol foi então diluído em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4,11-dieno na amostra fosse entre 0,63 e 20 mg/L. Para o ciclo de fermentação mostrado em Figura 13B, amorfa-4,11 -dieno foi capturado adicionando 200 de mL, de uma camada orgânica ao fermentador no momento de indução.

Amorfa-4,11-dieno foi extraído do meio de cultura combinando 25 uL de caldo com 975 uL de acetonitrila, agitando a amostra em velocidade máxima em um misturador Fisher Vortex Genie ru (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) por pelo menos 3 minutos, removendo células da amostra por centrifugação, e diluindo a solução de acetonitrila em acetato de etila até que a concentração de amorfa-4.11-dieno na amostra fosse entre 0,63 e 20 mg/L. As amostras de acetato de etila foram analisadas por GC/MS como descrito em Exemplo 10. Para o ciclo de fermentação mostrado em Figura 13A, a quantidade total de amorfa-4,11-dieno foi derivada combinando as quantidades presentes no gás de exaustão e no meio de cultura, e dividindo o total pelo volume de fermentador.

A fermentação mostrada em Figura 13A atingiu um OD₆₀o máximo de 93 e uma concentração máxima de amorfa-4,11-dieno de 3,2 g/L. Em contraste, a fermentação mostrada em Figura 13B atingiu um OD₆oo máximo de 245 e uma concentração máxima de amorfa-4,11 -dieno de 15 g/L. Uma explicação provável para as diferenças em crescimento de cultura e níveis de produção de amorfa-4,11-dieno observadas nas duas culturas é que no ciclo de fermentação mostrado em Figura 13 A produção de amorfa-4,11dieno foi induzida antes de a glicose em excesso ter sido consumida, e que a disponibilidade irrestrita de glicose causou morte celular possibilitando o aumento de níveis tóxicos de intermediários da via de mevalonato. No ciclo de fermentação mostrado em Figura 13B, indução ocorreu depois da liberação de glicose ter sido restrita, o que preveniu o aumento de intermediários da via, levando a uma densidade celular e níveis de produção amorfa-4,11-dieno maiores.

Exemplo 14

Este exemplo demonstra produção aumentada de amorfa-4,11dieno por uma linhagem hospedeira de Escherichia coli cultivada em condições restritas de fonte de carbono e nitrogênio e em temperatura subótima.

Uma cultura inseminada de linhagem hospedeira B86 foi estabelecida adicionando uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio M9-MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1. A cultura foi cultivada durante a noite a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm, subcultivada na manhã seguinte no mesmo meio em um OD_d de aproximadamente 1, e cultivada de novo a 37°C e 250 rpm para um OD_d de 3 a 5'.

Quatro biorreatores de 2 L (Biocontroller ADI 1010 com Bioconsole ADI 1025, Applikon Biotechnology, Foster City, CA) foram configurados e executados da mesma maneira como descrito em Exemplo 12 para ciclo 060403-3, exceto que os ciclos restritos por nitrogênio não continham sulfato de amônia na ração.

Uma ração de glicose exponencial com um tempo de duplicação de 6 horas foi iniciada automaticamente quando o bolo inicial de glicose (15 g) foi exaurido e o oxigênio dissolvido reforçado. Até um máximo de 30A g/h, a taxa da ração foi calculada de acordo com a seguinte equação:

μ = 0.12 min¹ caracterizado pelo fato de que tO é a taxa de crescimento específico, e to é o momento no qual o bolo inicial de glicose foi esgotado. Ao atingir a taxa máxima, a ração de glicose foi reduzida para uma taxa de 11,4 g/h, e mantida

100 constante nesta taxa para o restante do ciclo. Em ciclos de fermentação 060710-4, 060724-5, e 060619-5 (restritos por carbono e nitrogênio), a ração de glicose foi adicionalmente reduzida quando restrição de amônia levou a acúmulo de glicose no meio.

Fermentação foi realizada em uma temperatura reduzida de 30°C. Fluxo de ar no biorreator foi ajustado em 1 win; agitação inicial foi a 700 rpm; espuma foi controlada com antiespuma B (Sigma-Aldich, St. Louis, MO); e tensão de oxigênio dissolvido foi controlada em 40% usando uma cascata de agitação (700-1,200 rpm) e enriquecimento de oxigênio. Em ciclo de fermentação 060327-3 (restrito por carbono), o pH foi mantido em 7 usando 20% de NH4OH; em ciclos de fermentação 060710-4, 060724-5, e 060619-5 (restritos por carbono e nitrogênio), pH foi mantido em 7 inicialmente usando 20% NH4OH, e começando em 72 horas usando uma mistura 50/50 de 2.5 N NaOH e 10 N NH4OH, para restringir adicionalmente a quantidade de amônia indo no fermentador.

Produção de amorfa-4,11-dieno nas células hospedeiras foi induzida em um OD₆©_o de aproximadamente 30 adicionando 1 rriL de I M IPTG ao meio de cultura.

Amorfa-4,11-dieno foi capturado cobrindo o meio com 10% (v/v) de uma camada orgânica. Amorfa-4,11-dieno foi então extraído combinando 25 uL de caldo com 975 uL de metanol, agitando a amostra em velocidade máxima em um misturador Fisher Vortex Genie 2¹⁷⁴ (Scientific Industries, Inc., Bohemia, N.Y.) por pelo menos 15 minutos, removendo células da amostra por centrifúgação, e adicionando 10 uL da solução de metanol a 990 ul de acetato de etila contendo 10 uL/L de trans-cariofileno.

Amostras foram analisadas por GC/MS como descrito em Exemplo 10.

Figuras 14A-E mostram dados de ciclo de fermentação 060327-3 (restrito por carbono). A fermentação produziu uma concentração

101 máxima de amorfa-4,11-dieno de 16 g/L (Figura 14A). A produtividade volumétrica máxima da linhagem hospedeira foi de mais do que 200 mg/L/hora (Figura 14B). A produtividade específica máxima da linhagem hospedeira foi >2 mg/L/hora/OD600 (Figura 14C). A concentração de amônia no meio de cultura foi de cerca de 30 mM no início do ciclo de fermentação, subiu para cerca de 76 mM mediante adição da solução de alimentação durante a fase de crescimento exponencial, e permaneceu acima de 60 mM para o resto do ciclo (Figura 14D). O 0D₆₀₀ máximo atingido foi cerca de 290 (Figura 14D), correspondendo a 116 g de DCW/L. A concentração de glicose no meio de cultura caiu de 15 g/L para abaixo de 1 g/L em menos do que 20 horas, e permaneceu baixa (Figura 14E). Níveis de acetato foram baixos ao longo da fermentação (Figura 14E).

Figuras 15A-E mostram dados de ciclos de fermentação 0607104, 060724-5, e 060619-5 (restritos por carbono e nitrogênio). As fermentações produziram uma concentração máxima de amorfa-4,11-dieno de cerca de 20 g/L a 30 g/L (Figura 15A). A produtividade volumétrica máxima da linhagem hospedeira foi de mais do que 400 mg/L/hora em todos os três ciclos de fermentação (Figura 1 SB), que é signifícantemente maior do que a produtividade volumétrica máxima obtida na fermentação não restrita por nitrogênio (Figura 14B). A produtividade específica máxima da linhagem hospedeira foi >2 nag/L/hora/OD₆₀o para todos os ciclos, e permaneceu alta ao longo dos ciclos (Figura 15C). A concentração de amônia no meio de cultura foi de cerca de 35 mM a 50 mM no início do ciclos de fermentação, caiu mediante adição da solução de alimentação durante crescimento exponencial, e permaneceu abaixo de 10 mM para o restante do ciclo (Figura 15D). (Os níveis diminuídos de amônia comparados com ciclo de fermentação 060327-3 (Figura 14D) são devidos à ausência de amônia na solução de alimentação e amônia reduzida na base usada para manter o pH. Ciclos de fermentação 060710-4 e 060619-5 mostraram um aumento em concentração de amônia no

102 final dos ciclos, mas os aumentos ocorreram depois do crescimento da produção de amorfa-4,11-dieno.) O OD_6D0 máximo atingido foi de 170 a 220 (Figura

15D), correspondendo a 68 g a 88 g de DCW/L. A concentração de glicose no meio de cultura caiu de 15 g/L para abaixo de 1 g/L em menos do que 20 horas, e permaneceu baixa (Figura 15E). Níveis de acetato foram baixos ao longo dos ciclos de fermentação (Figura 15E). Exemplo 15

Este exemplo descreve a produção de amorfa-4,11-dieno através da via de DXP em uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras B003,13617, B618, e 8619 foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a frascos separados de 125 mL contendo 25 mL de M9-MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando as culturas durante a noite.

As culturas inseminadas foram usadas para inocular em um OD₆₀o inicial de aproximadamente 0,05, frascos separados de 250 mL contendo 40 mL de meio M9-MOPS, 45 ug/mL de tiamina, micronutrientes, l,00E-5 molIL de FeSO4, 0,1 M de MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 20 g/L de lD-glicose, e antibióticos. Culturas foram incubadas a 30°C em uma incubadora umidificada a 250 rpm até que elas atingissem um OD₆₀o de 0,2 a 0,3, em cujo ponto a produção de amorfa-4,11 -dieno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de l.M de 1PTG ao meio de cultura.

No momento de indução, as culturas foram cobertas com 8 mL de uma camada orgânica para capturar o amorfa-4,11-dieno. Amostras foram tomadas em vários momentos, e amorfa-4,11-dieno foi extraído e analisado por GC/MS como descrito em Exemplo 10. Experimentos foram realizados usando 2 clones independentes de cada linhagem hospedeira, e foram calculadas médias de resultados. Desvio entre amostras foi encontrado como

103 sendo de menos do que 10%.

Como mostrado em Figura 16, Escherichia coli linhagem hospedeira B619, que compreende seqüências de nucleotídeos codificando enzimas da via de DXP manipulada total, produziu aproximadamente 45 mg/g de DCW amorfa-4,11-dieno.

Exemplo 16

Este exemplo descreve a produção de 3-metil-but-3-en-l-ol e 3-metil-but-2-en- l-ol em linhagens hospedeiras de Escherichia coli.

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras B286, B287, B288, e B291 foram estabelecidas correndo uma alíquota estoque de cada linhagem em ágar LB contendo antibióticos como detalhado em Tabela I. Três colônias independentes foram escolhidas para cada linhagem, e cada colônia foi inoculada em 7 mL de meio LB contendo antibióticos. As culturas foram cultivadas durante a noite a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm até fase exponencial tardia. As culturas foram então inoculadas em um OD60O de aproximadamente 0,05, em um frasco de 250 noL contendo 40 ml de M9MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos. As culturas foram cultivadas durante a noite a 37°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que elas atingissem um ODD, de aproximadamente 0,2, ponto no qual elas foram induzidas adicionando 40 uL de I M IPTG. As culturas foram cultivadas por 72 horas a 30°C em um agitador rotatório at 250 rpm. Uma a duas vezes por dia, o OD_d de cada cultura foi medido, e uma amostra de 700 uL foi removida. Para extrair o 3-metil-but-3-en-l -ol e 3-metil-but-2-en-l-ol do caldo de cultura, 600 uL de acetato de etila foi adicionado a 300 uL de cada amostra removida. A amostra foi então turbilhonada por 15 minutos, e 400 uL da fase superior de acetato de etila foi transferido para um frasco de vidro limpo para análise.

As amostras foram analisadas em um equipamento de HewlettPackard 6890 de cromatografia gasosa/espectrômetro de massa (GC/MS).

104

Uma amostra de 1 uL foi separada na GC usando uma coluna DB-5 (Agilent Technologies, Inc., Paio Alto, CA) e gás carreador hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 60°C por 3 minutos, aumentando temperatura em 60°C/minuto para uma temperatura de 300°C, e uma parada em 300°C por 2 minutos. O tempo total de ciclo foi de 9 minutos. As amostras separadas foram analisadas por um detector seletivo de massa HewlettPackard modelo 5973. Espectros de massa prévios demonstraram que 3-metil3-buten-l -ol e 3-metil-2-buten-lol têm um tempo de restrição de 2,067 minutos usando este protocolo de GC. Para focar detecção em 3-metil-but-3enl -ol e 3-metil-but-2-en-l-oI, um método de monitoramento de íon seletivo foi empregado que monitora apenas íons 56 e 68 em 3-metil-but-3-en-l-ol e 3inetil-but-2-en-1 -o 1.

Exemplo. 17

Este exemplo descreve a produção de amorfa-4,1 [-dieno por uma linhagem hospedeira de Saccharomyces cerevisiae.

A geração de linhagem hospedeira EPY224 é descrita em Ro et a!. (Nature 440: 940-943; 2006) e em Publicação de Patente de PCT W02007/005604. Linhagem hospedeira EPY224 foi melhorada a partir de plasmídeo de expressão pRS425ADS por cultivo em meio YPD (Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 ed., ISBN 0-87969-728-8), emplacando colônias individuais em ágar YPD, e então embutindo colônias individuais em ágar CSM-Met His e ágar CSM-Met Lett. Clones que cresceram em ágar CSM-Met His, mas não em ágar CSMMet Leu foram melhorados (i.e., perderam o plasmídeo pRS425ADS). Um tal clone foi designado EPY300. EPY300 foi transformado com plasmídeo de expressão pRS425-ADS-LEU2d, um plasmídeo idêntico a pRS425-ADS exceto que ao invés de LEU2 ele contém um marcador de seleção LEU2d (Erhart and Hollenberg (1983)J Bacterial. 156: 625-635) produzindo linhagem hospedeira Y 185.

105

Transformardes de células hospedeiras Y185 foram selecionados em meios sintéticos definidos, contendo 2% de glicose e todos os aminoácidos exceto histidina, leucina, e metionina (CSM-glicose; MP Biomedicals, Solon, OH). A linhagem hospedeira EPY300 é auxotrófica para biossíntese de leucina (leu2), mas plastídio de expressão pRS425-ADSLEU2d em Y185 restaura prototrofia para leucina (LEU2). Colônias individuais foram embutidas em meio seletivo (CSM-glicose-histidina, leucina, metionina), e cultivadas por 2 dias. As células foram raspadas da placa e transferidas para 1 mL de 25% (v/v) glicerol em um criotubo. A suspensão foi misturada, e então armazenada a -80°C.

Frascos inseminados de linhagem hospedeira Y185 foram estabelecidos adicionando uma alíquota estoque da linhagem a um frasco de 125 mL contendo 25 mL de CSM-glicose carecendo de leucina e metionina, e cultivando as culturas durante a noite. As culturas foram usadas para inocular em um 0D_60a inicial de aproximadamente 0,05 um frasco septado de 250 mL contendo 40 mL de meio sintético definido carecendo de leucina, e contendo 0,2% de glicose, 1,8% de galactose, e 1 mM de metionina. A cultura foi incubada a 30°C em um agitador rotatório a 200 rpm. Pelo fato da presença de glicose no meio prevenir indução do promotor GALl por galactose, produção de amorfa-4,11- dieno não foi induzida até que as células tivessem usado a glicose no meio e tivessem mudado para usar galactose como sua principal fonte de carbono. No momento de inoculação, as culturas foram cobertas com 8 mL de uma camada orgânica para capturar o amorfa-4, 11-dieno. Amostras foram tomadas em 72 horas transferindo 5 uL da camada de solvente orgânico para um frasco de vidro limpo contendo 500 uL de acetato de etila contendo uma concentração conhecida de beta- ou trans-cariofileno como um padrão interno.

As amostras de camada orgânica/acetato de etila foram analisadas em um equipamento Hewlett-Packard 6890 de cromatografia

106 gasosa/espectrômetro de massa (GC/MS) como descrito em Exemplo 10.

Depois de 72 horas de crescimento, 3 culturas de levedura foram encontradas produzindo 60,68, 54,48, e 59,25 mg/L de amorfa4,lldieno.

Exemplo 18

Este exemplo descreve a produção de amorfa-4,11-dieno em uma linhagem hospedeira de Saccharomyces cerevisiae onde a linhagem hospedeira inclui uma via nativa de mevalonato assim como uma via heteróloga de mevalonato que está sob o controle de um controle regulador heterólogo.

Linhagens de levedura CEN.PIC2-1C (Y002) (MATA; ura352; trpl-289; leu2-3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) e CEN.PK2-ID (Y003) (MATalpha; ura3-52; trpl-289; leu2-3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) (J. P. van Dijken et al, Enzyme Microb Technol 26, 706 (Jun I, 2000) foram cultivadas ou em meio rico padrão (YPD) ou em meio sintético definido (. D. Rose, F. Winston, P. Heiter, Methods in yeast genetics: a laboratory course manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1990) carecendo de nutrientes apropriados permitindo seleção de transformantes integrativos, retenção de plasmídeo, e progênie meiótica.

Transformações mediadas por DNA em S. cerevisiae foram conduzidas usando o procedimento de acetato de lítio como descrito por R. H. Schiestl, R. D. Gietz, Carr Genet 16, 339 (Dec, 1989). Todas as rupturas e substituições de genes foram confirmadas por análise fenotípica, reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônia e seqüenciamento de DNA genômico amplificado. Plasmídeos pAM489-pAM498 foram construídos usando o pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad CA) e são esquematicamente descritos por Figura 7A-C e Tabela 6. As seqüências de marcadores HISMX são descritas em M. S. Longtime et at, Yeast 14, 953 (Jul, 1998). Propagação de DNA de plasmídeo foi realizada em Escherichia coli linhagem DH5cc.

107

Tabela 6

Cepa	5’HR	Gene #1	Promotor Crick	| Promotor | Waison.	Gene #2	Marcador genético	3’HR
pAM489	TRPl	«HMGR	GALl	GAL10	ERG20	TRPl	TRPl
pAM490	TRPl	«HMGR	CUP1	CUP1	ERG20	TRPl	TRPl
PÁN491	ÜRA3	«HMGR	GALl	GAL10	ERG13	URAS	URAS
PAM492	URAS	IDI1	CUP1	CLfPl	«HMGR	URA3	URAS
pAM493	ADE1	«HMGR	GALl	GAL10	IDll	ADE1	URAS
pAM494	ADÉ1	«HMGR	CUP1	CUP1	IDU	ADE1	ADE1
pAM495	H1S3	ERG12	GALl	í GAL10	ERG10	HISMX	H1S3
pAM496	HJSS	ERG12	CUP1	Í CUP1	ERG10	HISMX	HIS3
pAM497	LEU2	ERG19	GALl	1 GALl	ERGS	HISMX	LEU2
PAM498	LEU2	ERGI9	CUP1	( CUP1	ERGS	HISMX	LEU2

S. cerevisiae linhagens Y002 e Y003 foram preparadas para introdução de genes induzíveis da via de mevalonato pelo seguinte. O promotor ERG9 foi substituído pelo promotor MET3 de S. cerevisiae por amplificação por PCR da REGIÃO KamMX-PMET3 de pAM32S (SEQ ID NO: 43) usando iniciadores X)..6-pwl0.0-G (SEQ ID NO: 44) e 50-56pwlOl-G (SEQ ID NO: 45) contendo 45 pares de bases de homologia com o promotor ERGS nativo. lOng do produto de PCR resultante foi transformado em linhagens de crescimento exponencial Y002 e Y003 usando 40% w/w de polietilenoglicol 3350 (Sigma-Aldrich St Louis, MO), 100 mM de acetato de lítio (Sigma), lOng de DNA de Esperma de Salmão (Invitrogen) e incubação a 30°C por 30 minutos seguido por um choque térmico de 42°C por 30 minutos (como descrito por Schiestl.& Gietz, Curr. Genet. 16: 339 (1989)). Recombinantes positivos foram identificados por sua capacidade de crescer em meio rico contendo 0,5 pg/ml de Geneticina (Invitrogen Co, Carlsbad, CA) e confirmados por PCR diagnóstico. Os clones resultantes receberam a designação Y93 (ΜΑΤ A) e Y94 (MAT alfa). Em seguida, o quadro de leitura aberta de AnE/ foi substituído pelo gene LEU2 de Candida glabrata (CgLEU2). O locus genômico CgLEU2 de 3,5KB foi amplificado a partir de DNA genômico de C. glabrata (ATCC, Manassas, VA) usando iniciadores 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 46) e 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 47) contendo 50 pares de bases de homologia flanqueadora com o quadro de leitura aberta (ORF) de ADE1. lOpg do produto de PCR resultante foi transformado em Y93 e Y94 crescendo exponencialmente como descrito

108 acima. Linhagens de adel - foram selecionadas para crescimento na ausência de suplementação com leucina e confirmadas por PCR diagnóstico. Os clones resultantes receberam a designação Y176 (ΜΑΤ A) e Y177 (MAT alfa).

Para gerar S. cerevisiae linhagem Y188, 2 pg's de DNA de plasmídeo de pAM491 (SEQ ID NO: 48) e pAM495 (SEQ ID NO:49), respectivamente, foram digeridos durante a noite com Pmel (New England Biolabs, Beverly, MA) e introduzidos em Y176 crescendo exponencialmente como descrito acima. Recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio carecendo de uracil e histidina. Integração no locus genômico correto foi confirmada por PCR diagnóstico.

Para gerar S. cerevisiae linhagem YI89, 2 pg's de DNA de plasmídeo de pAM489 (SEQ ID NO: 50) e pAM497 (SEQ ID NO: 51), respectivamente, foram digeridos durante a noite com Pine' e introduzidos em Y177 crescendo exponencialmente como descrito acima. Recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio carecendo de triptofano e histidina. Integração no locus genômico correto foi confirmada por PCR diagnóstico.

Aproximadamente 1 X 10' células de Y188 e Y189 foram misturadas em um placa de meio YPD por 6 horas em temperatura ambiente para permitir acasalamento. A cultura de células misturadas foi então emplacada em meio carecendo de histidina, uracil e triptofano para selecionar por crescimento de células diplóides. 2ug de DNA de plasmídeo de pAM493 (SEQ ID NO: 52) foi digerido durante a noite com Pmel e introduzido em células diplóides crescendo exponencialmente como descrito acima. Recombinantes positivos foram selecionados por crescimento em meio carecendo de adenina. Integração no locus genômico correto foi confirmada por PCR diagnóstico. A linhagem resultante recebeu a designação Y238.

Para gerar linhagens haplóides contendo o complemento inteiro de genes introduzidos, Y238 foi esporulado em 2% de acetato de

109 potássio e 0,02% de meio líquido de rafinose. Aproximadamente 200 tétrades genéticas (tétrades são produtos meióticos de quatro esporos) foram isoladas usando um micromanipulador Singer Instruments MSM300 series (Singer Instrument Co, LTD. Somerset, UK). Isolados genéticos independentes contendo o complemento apropriado de material genético introduzido foram identificados por sua capacidade de crescer na ausência de adenina, histidina, uracil, e triptofano. Integração de todo DNA introduzido foi confirmada por PCR diagnóstico. As linhagens resultantes receberam a designação Y210 (ΜΑΤ A) e Y211 (MAT alfa).

2pg de DNA de plasmídeo de pAM426 (SEQ ID NO:53), contendo Amorfadieno Sintase (ADS) de S. cerevisiae códon otimizada expressa a partir do promotor GAL! De S. cerevisiae, foi introduzido em Y2I0 e Y211 crescendo exponencialmente como descrito acima. Linhagens de S. cerevisiae que continham o plasmídeo pAM426 foram selecionadas por sua capacidade de crescer na ausência de suplementação com leucina. As linhagens resultantes receberam a designação Y225 (ΜΑΤ A) e Y227 (MAT alfa).

2pg de DNA de plasmídeo de pAM322 (SEQ ID NO: 54), contendo Amorfadieno Sintase (ADS) de S. cerevisiae códon otimizada e citocromo P450 monooxigenase (AMO) expressa a partir do GALlde S. cerevisiae e a citocromo P450 oxidoredutase (CPR) expressa a partir do promotor GAL10 de S. cerevisiae, foi introduzido em Y210 e Y2 I 1 crescendo exponencialmente como descrito acima. Linhagens de 5. cerevisiae que continham o plasmídeo pAM322 foram selecionadas por sua capacidade de crescer na ausência de suplementação com leucina. As linhagens resultantes receberam a designação Y222 (ΜΑΤ A) e Y224 (MAT alfa). Exemplo 19

Este exemplo descreve a produção de α-fameseno ou βfameseno em linhagens hospedeiras de Escherichia coli.

110

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras B552 e B592 foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a um frasco de 125 mL contendo 25 mL de M9-MOPS, 0,8% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando as culturas durante a noite.

As culturas inseminadas foram usadas para inocular em um OD₀ inicial de aproximadamente 0,05, frascos de 250 mL contendo 40 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos. Culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que elas atingissem um OD_d de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção de α-fameseno ou β-fameseno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de 1 M IPTG. No momento de indução, as culturas foram cobertas com 8 mL de uma camada orgânica para capturar o a-fameseno. Amostras foram tomadas a cada 24 horas até 120 horas (total de 5 momentos de avaliação) transferindo 2 a 10 uL da camada orgânica de revestimento para um frasco de vidro limpo contendo 1 mL de acetato de etila reforçado com transcariofileno como um padrão interno. Em adição, alíquotas de 1 mL das culturas foram centrifugadas, péletes celulares foram ressuspensos em 250 uL de água estéril, e as suspensões celulares foram transferidas para um frasco de vidro contendo 1 mL de acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. Em adição, alíquotas de 0,5 mL do caldo de cultura inteiro foram adicionadas a frascos de vidro contendo 1 mL de acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. As amostras do caldo de cultura inteiro foram extraídas no acetato de etila turbilhonando os frascos de vidro por 10 minutos, depois do que 600 uL da extração de acetato de etila foram transferidos para um frasco de vidro limpo.

As amostras de camada orgânica /acetato de etila e as amostras de caldo de cultura inteiro extraídas com acetato de etila foram analisadas em um cromatógrafo gasoso Agilent 6890N equipado com um espectrômetro de

111 massa Agilent 5975 (GC/MS) em modo de varredura completa (50-500 m/z). Para agilizar tempos de ciclos, o programa de temperatura e matriz de coluna foram modificados para atingir resolução ótima em pico e o menor tempo de ciclo total. Uma amostra de 1 uL foi separada usando uma coluna HP-5MS (Agilent Technologies, Inc., Paio Alto, CA) e gás carreador hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 150°C mantido por 3 minutos, aumentando temperatura em 25°C/minuto para uma temperatura de 200°C, aumentando temperatura em 60°C/minuto para uma temperatura de 300 C, e uma parada em 300°C por 1 minuto. Espectros de massa prévios demonstraram que o produto de β-fameseno sintase foi β-fameseno, e que βfameseno teve um tempo de retenção de 4,33 minutos usando este protocolo de GC. Títulos de fameseno foram calculados comparando áreas de pico geradas contra uma curva de calibração quantitativa de β-fameseno purificado (Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO) em acetato de etila reforçado com trans-cariofileno.

Linhagem hospedeira B592 produziu aproximadamente 400 mg/L de a-fameseno em 120 horas (com média de 3 clones independentes), e teve uma produtividade máxima específica de aproximadamente 46 mg/L/OD₆₀o. Linhagem hospedeira B552 produziu aproximadamente 1,1 g/L de β-fameseno em 120 horas (com média de 3 clones independentes), e teve uma produtividade máxima específica de aproximadamente 96 mg/L/OD₆₀o(l clone representativo).

Exemplo 20

Este exemplo descreve a produção de β-fameseno através da via de DXP em uma linhagem hospedeira de Escherichia coli.

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras B650, B651, B652, e B653 foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a frascos separados de 125 mL contendo 25 mL de M9-MOPS e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando as culturas durante a

112 noite.

As culturas inseminadas foram usadas para inocular em um ODE® inicial de aproximadamente 0.,05 frascos separados de 250 mL contendo 40 mL de meio mínimo M9-MOPS, 45 ug/mL de tiamina, micronutrientes, 1.00E-5 mol/L FeSO4, 0.1 M MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 20 g/L de D-glicose, e antibióticos. As culturas foram incubadas a 30°C em uma incubadora umidificada a 250 rpm até que elas atingissem um OD_d de 0,2 a 0,3, em cujo ponto a produção de β-fameseno nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de 1 M IPTG ao meio de cultura. No momento de indução, as culturas foram cobertas com 8 mL de uma camada orgânica para capturar o β-fameseno. Amostras foram tomadas em vários momentos transferindo amostras de 100 uL da camada orgânica de revestimento superior para um tubo limpo. O tubo foi centrifugado para separar quaisquer células ou meios remanescentes, e 10 uL das amostras de camada orgânica foram transferidos para 500 uL de acetato de etila reforçado com beta- ou transcariofileno como um padrão interno em frascos GC de vidro limpo. As misturas foram turbilhonadas por 30 segundos, e então analisadas como descrito em Exemplo 18. Escherichia coli linhagem hospedeira B653 produziu aproximadamente 7 mg/g de DCW de β-fameseno. Exemplo 21

Este exemplo descreve a produção de α-fameseno ou βfameseno em uma linhagem hospedeira de Saccharomyces cerevisiae.

Linhagem EPY300 foi gerada removendo o plasmídeo de expressão de Saccharomyces cerevisiae linhagem EPY224 (Ro et al. (2006) Nature 440: 940-943; Publicação de Patente de PCT W02007/005604) cultivando em meio rico. Linhagem EPY300 foi então transformada com plasmídeos de expressão pRS425-FSA ou pR425-FSB, produzindo linhagens hospedeiras Y166 e Y164, respectivamente.

Transformantes de células hospedeiras foram selecionados em

113 meios sintéticos definidos, contendo 2% de glicose e todos os aminoácidos exceto leucina (SM-glu). A linhagem hospedeira EPY300 foi auxotrófica para biossíntese de leucina (leu2), mas plasmídeo de expressão pRS425-FSA ou pRS425-FSB restaura prototrofia para leucina (LEU2). Colônias individuais foram transferidas para frascos de cultura contendo 5 mL de SM-glu líquido carecendo de leucina. As culturas foram incubadas agitando a 30°C até que crescimento atingisse fase estacionária. As células foram armazenadas a 80°C em criofrascos em alíquotas congeladas de 1 mL constituídas de 400 AL de glicerol a 50% e 600AL de cultura líquida.

Culturas inseminadas foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque a um frasco de 125 mL contendo 25 mL de SM-glu carecendo de leucina, e cultivando as culturas durante a noite. As culturas inseminadas foram usadas para inocular em um OD₆₀o inicial de aproximadamente 0,05 frascos septados de 250 mL contendo 40 mL de meio sintético definido carecendo de leucina, 0.2% de glicose, e 1,8% de galactose. Culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 200 rpm. Pelo fato da presença de glicose no meio prevenir indução do promotor Gall por galactose, produção de fameseno não foi induzida até que as células tivessem usado a glicose no meio e mudado para usar galactose como sua principal fonte de carbono. As culturas são cobertas com 8 mL de oleato de metila ou miristato de isopropila. Amostras foram tomadas uma vez a cada 24 horas transferindo 2-10 uL da camada de solvente orgânico para um frasco de vidro limpo contendo 500 uL de acetato de etila contendo uma concentração conhecida de beta- ou transcariofileno como um padrão interno. Em adição, alíquotas de 0,5 mL do caldo de cultura inteiro foram adicionadas a frascos de vidro contendo 1 mL de acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. As amostras do caldo de cultura inteiro foram extraídas no acetato de etila turbilhonando os frascos de vidro por 10 minutos, depois do que 600 uL da extração de acetato de etila foram transferidos para um frasco

114 de vidro limpo.

Linhagem hospedeira Y166 produziu aproximadamente 9,8 mg/L de α-fameseno em 120 horas (com média de 3 clones independentes), e teve uma produtividade máxima específica de aproximadamente 3 nag/L/OD₆oo (1 clone representativo). Linhagem hospedeira Y164 produziu aproximadamente 56 mg/L de β-fameseno em 120 horas (com média de 3 clones independentes), e teve uma produtividade máxima específica de aproximadamente 20 mg/L/OD600(l clone representativo).

Exemplo 22

Este exemplo descreve a produção de γ-tetpineno, α-pineno, e terpinoleno em linhagens hospedeiras de Escherichia coli.

Culturas inseminadas de linhagens hospedeiras para produção de γ-terpineno (E. coli DHl-Tlr [pMevT, pMevB-Gpps, pAM445]), apineno (E. coli DHl-Tlr [pMevT, pMevB-Opps, pAM443 ou pAM442]) ou terpinoleno (E. coli DH1-T lr tpMevT, pMevB-Gpps, pAM444] foram estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a frascos separados de 125 mL contendo 25 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando as culturas durante a noite até fase exponencial tardia.

As culturas inseminadas foram usadas para inocular em um M₆0° inicial de aproximadamente 0,05, frascos de 250 mL contendo 40 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, e antibióticos. No momento de inoculação, as culturas também foram cobertas com 4 mL de hexadecano. Culturas foram incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 200 - 250 rpm até que elas atingissem um OD600 de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção do composto de interesse nas células hospedeiras nas células hospedeiras foi induzida adicionando 40 uL de 1 M IPTG. Amostras foram tomadas uma vez per dia por 96 horas transferindo 200 uL da camada de hexadecano para um tubo de microfuga de 0,6 mL. Para análise, a camada

115 de hexadecano foi diluída 1:1 ou 1:10 com acetato de etila reforçado com transcariofileno como um padrão interno em um frasco de GC de 1,8 mL. Em adição, alíquotas de 1 mL das culturas foram centrifugadas, péletes celulares foram ressuspensos em 250 uL de água estéril, e as suspensões celulares foram transferidas para um frasco de vidro contendo 1 mL acetato de etila reforçado com trans-cariofileno como um padrão interno. Os péletes celulares foram extraídos no acetato de etila turbilhonando os frascos de vidro por 15 minutos, depois do que 500 uL da extração de acetato de etila foram transferidos para um frasco de vidro limpo.

As amostras de hexadecano/acetato de etila e as amostras de acetato de etila-pélete celular extraído foram analisadas em um cromatógrafo gasoso Agilent 6890N equipado com um espectrômetro de massa Agilent 5975 (GC/MS) em modo de varredura completa (50-500 m/z). Para agilizar tempos de ciclos, o programa de temperatura e matriz de coluna foram modificados para atingir resolução ótima em pico e o menor tempo de ciclo total. Uma amostra de 1 mL foi dividida (uma proporção de divisão entre 1:2 e 1:50 foi selecionada baseado em concentração de amostra) e então separada usando uma coluna HP-5MS (Agilent Technologies, Inc., Paio Alto, CA) e gás carreador hélio. O programa de temperatura para a análise foi como segue: 75°C mantido por 3 minutos, aumentando temperatura em 20°C/minuto para uma temperatura de 115°C, aumentando temperatura em 60 C/minuto para uma temperatura de 300 C, e uma parada em 300°C por 0,5 minuto. Os vários produtos, γ-terpineno, α-pineno, e terpinoleno foram observados em 5,4, 4,1, 5,4, e 5,9 minutos, respectivamente. Títulos foram calculados comparando áreas de pico geradas contra uma curva de calibração quantitativa de padrões purificados em acetato de etila reforçado com transcariofileno.

Exemplo 23

Este exemplo descreve a produção de linalol, limoneno, β116 pineno, β-felandreno, careno, ou sabineno em linhagens hospedeiras de

Escherichia coli.

Culturas inseminadas são estabelecidas adicionando uma alíquota estoque de cada linhagem a frascos separados de 125 mL contendo

25 mL de M9-M0PS, 0,5% de extrato de levedura, 2% de glicose, e antibióticos como detalhado em Tabela 1, e cultivando as culturas durante a noite.

As culturas inseminadas são usadas para inocular em um OD_o inicial de aproximadamente 0,05, frascos septados de 250 mL contendo 40 10 mL de M9-MOPS, 0,5% de extrato de levedura, 2% de glicose, e antibióticos.

Culturas são incubadas a 30°C em um agitador rotatório a 250 rpm até que elas atinjam um OD₆₀o de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção do composto de interesse nas células hospedeiras é induzida adicionando 40 ul de

I M 1PTG ao meio de cultura. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração solvente-solvente, ou por colonização e decantação se o título do composto de interesse é grande o suficiente para saturar o meio e para formar uma segunda fase.

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para produzir um isoprenóide, caracterizado pelo fato de compreender:

   (a) obter uma pluralidade de células hospedeiras bacterianas ou fungicas que compreendem uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica uma ou mais enzimas da via de mevalonato para fazer isopentenil pirofosfato; e (b) cultivar as células hospedeiras em um meio compreendendo uma fonte de carbono, em que a fonte de carbono é mantida em um nível que é sub-ótimo e provê menos do que 90% da taxa máxima de crescimento específicose comparadas com condições que proveríam uma taxa máxima de crescimento específico para as células hospedeiras.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo está sob controle de um regulador transcricional que é induzível.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas da via estão sob controle de um único regulador transcricional.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas da via estão sob controle de um regulador transcricional múltiplo.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são E. coli.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são fungos.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são 5. cerevisiae.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a via compreende uma seqüência de ácidos nucleicos codificando

   Petição 870180129461, de 12/09/2018, pág. 14/20 uma enzima da via de mevalonato de um procarioto tendo uma via endógena de mevalonato.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o procarioto é do gênero selecionado a partir de Enterococcus, Pseudomonas, e Staphyloccoccus.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácidos nucleicos é selecionada a partir de acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, e mevalonato quinase.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácidos nucleicos codifica uma HMG redutase de Classe II.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura do meio é pelo menos 2-20°C abaixo daquela que proveria a taxa máxima de crescimento específico.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são cultivadas em uma temperatura pelo menos 5°C abaixo daquela que proveria a taxa máxima de crescimento específico.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura do meio é pelo menos 10°C abaixo daquela que proveria a taxa máxima de crescimento específico.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de fonte de carbono irá prover 75% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de fonte de carbono irá prover 50% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

    Petição 870180129461, de 12/09/2018, pág. 15/20 pelo fato de que a quantidade de fonte de carbono irá prover 25% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de fonte de carbono irá prover 75%-10% da taxa máxima de crescimento específico.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma fonte de nitrogênio em uma quantidade abaixo daquela que proveria 90% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a quantidade da fonte de nitrogênio irá prover 75% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a quantidade da fonte de nitrogênio irá prover 50% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a quantidade da fonte de nitrogênio irá prover 25% ou menos da taxa máxima de crescimento específico.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a quantidade da fonte de nitrogênio irá prover 75%-10% da taxa máxima de crescimento específico.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o isoprenóide é selecionado a partir do grupo consistindo de um hemiterpeno, monoterpeno, diterpeno, triterpeno, tetraterpeno, e politerpeno.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o isoprenóide é um isoprenóide C5-C20.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o isoprenóide é selecionado a partir do grupo consistindo de

    Petição 870180129461, de 12/09/2018, pág. 16/20 abietadieno, amorfadieno, careno, a-fameseno, β-fameseno, famesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalol, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, β-pineno, sabineno, γ-terpineno, terpinoleno e valenceno.