CN110468089B - 微生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种微生物。该微生物过表达idi、JI‑018‑A、dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG以及ispH基因。利用根据本发明实施例的微生物发酵生产法尼烯，相对于现有技术，法尼烯的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。

Description

微生物及其用途
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，本发明涉及微生物及其用途，更具体地，本发明涉及微生物、制备法尼烯的方法以及制备微生物的方法。
背景技术
法尼烯最早从苹果树中分离得到，在植物防御方面起重要作用。由于其是一种重要的化工原料，在新兴航空燃料、橡胶、天然维生素E等领域具有广阔的市场价值，近年来受到广泛关注。
法尼烯在植物中的含量非常低，无法以提取天然产物的方式应用于市场。化学合成法虽然具有原料易得价廉、反应条件温和、反应速率快、产物易与反应体系分离等优点，但由于合成过程中β-法尼烯双键的立体构型难以控制及不同程度的化学试剂残留，其产品的质量、安全性及使用范围都受到了限制。微生物发酵法主要是利用微生物的生物代谢，将葡萄糖等廉价原料转化为法尼烯，这种方法不受季节、地域、气候等因素的影响，原料易获取、生产周期短、工艺操作简单、成本低廉、产物质量可控、产物易纯化、安全性高，并且环境污染较少，因而以微生物生产法尼烯是一种可行的方式。目前合成法尼烯的途径主要有MEP途径和MVA途径，参考图1。在此基础上，可以通过表达法尼烯合酶以生成法尼烯，参考图2。
然而，如何提高微生物生产β-法尼烯的产量，还需进一步研究。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
微生物发酵的最大问题就是如何提升产量，目前的报道都是随机地对微生物进行改造以提升微生物发酵合成法尼烯的产量。然而如何定向改造，才能够快速有效地提高微生物发酵生产法尼烯的产量，目前并没有相关的详细研究。基于上述问题，本申请发明人通过优化法尼烯MEP合成途径中各步骤的酶的含量比，构建了相应的微生物。利用该微生物发酵生产法尼烯，相对于现有技术，法尼烯的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物过表达idi、JI-018-A、dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG以及ispH基因。利用根据本发明实施例的微生物，相对于现有技术，法尼烯的产量显著提高，生产周期短，生产效率高。
根据本发明的实施例，上述微生物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi以及J1-018-A基因的表达量的比为2：1：2：2：2：1：2：5：5。发明人发现，所述微生物的上述基因的表达量的比在该比例时，法尼烯的产量进一步提高。
根据本发明的实施例，所述微生物为大肠杆菌、酵母菌或链霉菌。大肠杆菌生产周期短，酵母菌发酵方法成熟，同时发明人克服了导入链霉菌时存在的遗传操作困难、获得阳性接合子效率低等技术难点，利用本发明实施例的微生物生产法尼烯的产量和效率进一步提高。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备法尼烯的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在合适微生物发酵的条件下，将上述微生物进行发酵处理，以便获得法尼烯。利用根据本发明实施例的方法，能够高产量、高效率地获得法尼烯，且法尼烯的纯度高。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，进一步包括向发酵体系中加入三磷酸甘油醛和丙酮酸。其中，三磷酸甘油醛和丙酮酸作为MEP发酵途径的底物，在发酵过程不必须首先加入或补充。向发酵体系中补充三磷酸甘油醛和丙酮酸，法尼烯的产量进一步提高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备上述微生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一质粒、第二质粒、第三质粒导入大肠杆菌中，以便获得所述微生物；其中，所述第一质粒携带dxs、ispD、ispE、ispF以及ispH基因，所述dxs、ispD、ispE、ispF以及ispH基因在所述第一质粒的拷贝数为1，所述第二质粒携带idi基因，所述idi基因在所述第二质粒的拷贝数为3，所述第三质粒携带J1-018-A基因，所述J1-018-A基因在所述第三质粒的拷贝数为3。发明人发现，第一质粒、第二质粒以及第三质粒在上述特定结构和拷贝数下，获得的微生物中dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi以及J1-018-A基因的表达量无限接近于最优比2：1：2：2：2：1：2：5：5。利用根据本发明实施例的方法制备的微生物，扩增速率高，基因表达量的比无限接近上述预定比例，能够高产量、高效率地获得法尼烯，且法尼烯的纯度高。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备上述微生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第四质粒、第五质粒、第六质粒、第七质粒导入酵母菌中，以便获得所述微生物，其中，所述第四质粒携带dxs、ispD以及ispE基因，所述dxs、ispD以及ispE基因在所述第四质粒的拷贝数为1，所述第五质粒携带dxr、ispG、ispF以及ispH基因，所述dxr、ispG、ispF以及ispH基因在所述第五质粒的拷贝数为1，所述第六质粒携带idi基因，所述idi基因在所述第六质粒的拷贝数为3，所述第七质粒携带J1-018-A基因，所述J1-018-A基因在所述第七质粒的拷贝数为3。发明人发现，第四质粒、第五质粒、第六质粒以及第七质粒在上述特定结构和拷贝数下，获得的微生物中dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi以及J1-018-A基因的表达量无限接近于最优比2：1：2：2：2：1：2：5：5。利用根据本发明实施例的方法制备的微生物，扩增速率高，基因表达量的比无限接近上述预定比例，能够高产量、高效率地获得法尼烯，且法尼烯的纯度高。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备上述微生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第八质粒导入菌株A中，以便获得菌株B，其中，所述第八质粒携带dxs、ispD、ispE、ispF以及ispH基因，所述dxs、ispD、ispE、ispF以及ispH基因在所述第八质粒的拷贝数为1，所述第九质粒携带idi以及J1-018-A基因，所述idi基因在所述第九质粒的拷贝数为2，所述J1-018-A基因在所述第九质粒的拷贝数为3。发明人发现，第八质粒以及第九质粒在上述特定结构和拷贝数下，获得的微生物中dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi以及J1-018-A基因的表达量无限接近于最优比2：1：2：2：2：1：2：5：5。利用根据本发明实施例的方法制备的微生物，扩增速率高，基因表达量的比无限接近上述预定比例，能够高产量、高效率地获得法尼烯，且法尼烯的纯度高。
附图说明
图1是根据本发明实施例的生产法尼烯途径前体的MEP途径和MVA途径示意图；
图2是根据本发明实施例的微生物中法尼烯合成途径示意图；
图3是根据本发明的实施例MEP途径关键蛋白研究示意图；以及
图4是根据本发明实施例的MEP途径优化后的反应速率对比示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1体外重建MEP途径
体外重建方法同2014年Zhu等人建立的方法(Zhu F,et al.,2014.In vitroreconstitution of mevalonate pathway and targeted engineering of farneseneoverproduction in Escherichia coli.Biotechnol Bioeng.111(7):1396-405.)。发明人通过对MEP途径各个蛋白的进一步深入研究发现，增加dxr和ispG的蛋白含量对法尼烯的增加有抑制作用，而增加idi蛋白的含量对法尼烯的增加有促进作用，参见图3。最终发现，体外重建实验获得MEP途径各蛋白的最佳比例为dxs:dxr:ispD:ispE:ispF:ispG:ispH:idi:J1-018-A＝2:1:2:2:2:1:2:5:5，与等摩尔的各蛋白量相比，反应速率有明显提高，参考图4。
实施例2大肠杆菌中MEP途径优化比例蛋白表达质粒的构建
通过上述的体外途径获得通过MEP途径生产法尼烯的各蛋白的最佳比例为dxs:dxr:ispD:ispE:ispF:ispG:ispH:idi:J1-018-A＝2:1:2:2:2:1:2:5:5，因此发明人按照此方法指导，构建相关表达质粒，构建方法如下：
质粒pJ1-018-1质粒含有来源于MEP途径的dxs、ispD、ispE、ispF、ispH，这些基因通过PCR获得，所述基因编码在genebank库中的编号为CP001509.3的大肠杆菌BL21中的蛋白序列依次为ACT42267.1、ACT44416.1、ACT43075.1、ACT44415.1、ACT41935.1，通过设计引物使这些基因片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，利用Gisbson方法(Gibson.D.G.,2011.Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.MethodsEnzymol.498.349-61.)将这些基因克隆在pBBRIMCS/p15A(Zhu F,et al.,2014.In vitroreconstitution of mevalonate pathway and targeted engineering of farneseneoverproduction in Escherichia coli.Biotechnol Bioeng.111(7):1396-405.)上，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-1。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒的复制子为p15A复制子。
质粒pJ1-018-2质粒含有3个拷贝的idi基因，所述基因编码在genebank库中的编号为CP001509.3的大肠杆菌BL21中的蛋白序列为ACT44538.1，利用Gibson方法将3个idi基因克隆在pBBR1MCS-2质粒上，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-2。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒的复制子为pBBR1MCS复制子。
质粒pJ1-018-3质粒含有3个拷贝的J1-018-A基因，所述J1-018-A基因序列如SEQID NO：1所示，利用Gibson方法将3个J1-018-A基因克隆在pET21a质粒上，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-3。该质粒控制基因表达的为强启动子T7，质粒的复制子为pBBR3高拷贝复制子。
ATGCCTCACAAGCACGTTCCTCTTAGACCAGTCAAGTTGACATTTGATCCTGTAGGATCAAACACCCTAGGTGTGCCAACCTTGGACTTTGAGTCTCTGTTCCGGGAAGACAGCGTCTCTGAGGATGCCCCTCTTGTTATCTACCCAGAGGATATGGGTGTCCCATGGAACACCTCTCTTCCTTGGACCAGACAATCCAAGTTCTGGGCTTACGCCGAGGCAGCTGGATATGAAATGGCCAACGGAATCAGCCTTGACAAGGCATCAGAGCGTGGCACACTACCCATGGAGTTGATGGATGAGCGTCGCAAGTGGAAGATTGATGAGCTAGTTGAGGATGCCATCTCTTGCTGTGCTTATCTTTACCCTACATCATCTCCTACCAGATTGGCGTTGTTGACCCAGTCTGTTCTGCTTCTATTCCTCCACGACGATGTTATTGAGCGAGGAGCTACTCAAAACGAAACCACAGTGGTAGACGAATTTCTTAGCATGGCTCCCAAGAACAGGCATCTTAAGAAATTCTGGTCAGACGTATTGGAATGTGATCCCGTCCTTGGACCTGATCTGCTTTATGCTATCCATGCTTTCGTCCGTGATGGTCGTGTAAAGTCACCCTTTAAGCAGGATCACTATGCCACATTGGCTGATTACATGCTTTACCGTCGCAATGATGTTGGCAAGACATTTATGATTGCAGCTATCCGCTTCGGCTCTGGCGTGCAACAAACACGCGAAGAACTTGCTCCCTTTGACGAGCTTGCTGATCTTTACGTCAGACACTCAATTCTTATCAACGATCTCTACTCGTATGATAAGGAGGTGCACGAGGTCAAGACTATCGACGCGTCCATCGTGAACGCAGTTGCTGTCACAGAGCAGCTCCTTTCCGTGTCGCCTGACCTGGCCAAGAACTTAACCAGAGCTATTACCTTTGACATGGAGAAGGAGTTTTACGGCATTTGTGAGAAGTTTATGCACAGCCCTGATATCAACGATCGCCAGCGCGTGTTCGTTACTGCGCTCTTTGATGCGTTGACAGGCAATATCTTCCATTCTGCTACTTTGAGCAGATACGTTCGTCACGGCGAGAGACCACTTCCTTGCAAGTGTTAG(SEQ ID NO：1)。
进而，将携带有dxs、ispD、ispE、ispF、ispH、idi、J1-018-A基因的质粒导入大肠杆菌中后，大肠杆菌中dxs、ispD、ispE、ispF、ispH、idi、J1-018-A基因的表达量与大肠杆菌自有dxr、ispG基因的表达量的比(表示为dxs：dxr：ispD：ispE：ispF：ispG：ispH：idi：J1-018-A)为2：1：2：2：2：1：2：5：5。
实施例3法尼烯产生菌的构建
直接将质粒pJ1-018-3转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得菌株命名为菌株J1-018-2。
将质粒pJ1-018-1、pJ1-018-2、pJ1-018-3转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得菌株命名为菌株J1-018-3。
按照文献中的发酵方法(Zhu F,et al.,2014.In vitro reconstitution ofmevalonate pathway and targeted engineering of farnesene overproduction inEscherichia coli.Biotechnol Bioeng.111(7):1396-405.)对菌株进行摇瓶发酵，结果显示，菌株J1-018-2中能检测到法尼烯的产生，但是产量仅为30mg/L，但J1-018-3的产量明显提高，诱导后48小时法尼烯的产量为1.6g/L，后续仍持续增加。
结论：
1、两株菌均可产生法尼烯，证明发明人构建的利用MEP途径生产法尼烯的重组菌株可行。
2、J1-018-3菌株产量是J1-018-2菌株产量的50倍以上，证明发明人构建的微生物菌株发酵生产法尼烯是相对高效的。
实施例4酿酒酵母中MEP途径优化比例蛋白表达质粒的构建
通过上述的体外途径获得通过MEP途径生产法尼烯的各蛋白的最佳比例为dxs:dxr:ispD:ispE:ispF:ispG:ispH:idi:J1-018-A＝2:1:2:2:2:1:2:5:5，因此发明人按照此方法指导，构建相关表达质粒，这些基因都是经过了酿酒酵母密码子优化的。构建方法如下：
质粒pJ1-018-4质粒含有来源于MEP途径的dxs、ispD、ispE，这些基因通过PCR获得，所述基因编码在genebank库中的编号为CP001509.3的大肠杆菌BL21中的蛋白序列依次为ACT42267.1、ACT44416.1、ACT43075.1，控制基因表达的分别为pGAL1，pGAL7，pGAL10启动子。通过设计引物使这些片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，在目的片段两侧带有1.5kb的与整合位点同源的序列，利用DNA assembly方法将这些片段克隆在pRS423载体上，片段与载体间包含NotI酶切位点，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-4。
质粒pJ1-018-5含有来源于MEP途径的ispF、dxr、ispG、ispH，这些基因通过PCR获得，所述基因编码在genebank库中的编号为CP001509.3的大肠杆菌BL21中的蛋白序列依次为ACT44415.1、ACT42072.1、ACT44227.1、ACT41935.1，控制基因表达的分别为pGAL1，pGAL2，pGAL7，pGAL10启动子。通过设计引物使这些片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，在目的片段两侧带有1.5kb的与整合位点同源的序列，利用DNAassembly方法将这些片段克隆在pRS424载体上，片段与载体间包含NotI酶切位点，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-5。
质粒pJ1-018-6质粒含有3个拷贝的idi基因，所述基因编码在genebank库中的编号为CP001509.3的大肠杆菌BL21中的蛋白序列为ACT44538.1，控制基因表达的分别为pGAL1，pGAL7，pGAL10启动子。通过设计引物使这些片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，在目的片段两侧带有1.5kb的与整合位点同源的序列，利用DNAassembly方法将这些片段克隆在pRS425载体上，片段与载体间包含NotI酶切位点，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-6。
质粒pJ1-018-7质粒含有3个拷贝的J1-018-A基因，所述J1-018-A基因序列如SEQID NO：1所示，控制基因表达的分别为pGAL1，pGAL7，pGAL10启动子。通过设计引物使这些片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，在目的片段两侧带有1.5kb的与整合位点同源的序列，利用DNA assembly方法将这些片段克隆在pRS426载体上，片段与载体间包含NotI酶切位点，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-7。
实施例5法尼烯产生菌的构建
直接将质粒pJ1-018-7通过NotI线性化后转入酿酒酵母中，获得菌株命名为菌株J1-018-4。
将质粒pJ1-018-4、pJ1-018-5、pJ1-018-6、pJ1-018-7通过NotI线性化后转入酿酒酵母中，获得菌株命名为菌株J1-018-5。
这些菌株通过摇瓶发酵培养，具体方法如下：将保种管中吸取适量甘油菌到含有5mL种子培养基的PA瓶中，种子培养基配方为：蛋白胨(20g/L)，酵母粉(10g/L)，葡萄糖(20g/L)。于30℃摇床摇起一级种子液，过夜培养(一般14-18h)后，再按初始OD为0.1转接到含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，发酵培养基配方为：蛋白胨(20g/L)，酵母粉(10g/L)，葡萄糖(10g/L)，半乳糖(10g/L)转接后覆盖20％的有机相(正十二烷或肉豆蔻酸异丙酯)置于30℃摇床开始摇瓶发酵。结果显示，菌株J1-018-4中能检测到法尼烯的产生，但是产量仅为50mg/L，但J1-018-5的产量明显提高，转接后72小时法尼烯的产量为1.7g/L，后续仍持续增加。
结论：
1、两株菌均可产生法尼烯，证明发明人构建的利用MEP途径生产法尼烯的重组菌株可行。
2、J1-018-5菌株产量是J1-018-4菌株产量的30倍以上，证明发明人构建的微生物菌株发酵生产法尼烯是相对高效的。
实施例6链霉菌中MEP途径优化比例蛋白表达质粒的构建
通过上述的体外途径获得通过MEP途径生产法尼烯的各蛋白的最佳比例为dxs:dxr:ispD:ispE:ispF:ispG:ispH:idi:J1-018-A＝2:1:2:2:2:1:2:5:5，因此发明人按照此方法指导，构建相关表达质粒，构建方法如下：
质粒pJ1-018-21质粒含有来源于MEP途径的dxs、ispD、ispE、ispF、ispH，这些基因通过PCR获得，所述基因编码在genebank库中的编号为CP001509.3的大肠杆菌BL21中的蛋白序列依次为ACT42267.1、ACT44416.1、ACT43075.1、ACT44415.1、ACT41935.1，通过设计引物使这些基因片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，利用Gisbson方法(Gibson.D.G.,2011.Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.MethodsEnzymol.498.349-61.)将这些基因克隆在pIB139上，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-21。该质粒控制基因表达的为低强度的ermE启动子，含有attP位点和Int整合酶，为阿伯拉霉素抗性。
利用PCR-targetting(Gust.B.,2003.PCR-targeted Streptomyces genereplacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of thesesquiterpene soil odor geosmin.Proc Natl Acad Sci U S A.100(4):1541–1546.)将质粒pLH1(Qian Liu.,2016.Development of Streptomyces sp.FR-008as an emergingchassis.Synth Syst Biotechnol.1(3):207–214.)的抗性基因替换成硫链丝菌素的抗性基因tsr，将该质粒命名pJ1-018-22。将2个拷贝的idi基因克隆，SPL39启动子(Qian Liu.,2016.Development of Streptomyces sp.FR-008as an emerging chassis.Synth SystBiotechnol.1(3):207–214.)和3个拷贝的J1-018-A基因克隆于pJ1-018-22上，具体方法为通过设计引物使这些基因片段依次链接，并在相邻两个基因间形成50bp的重叠序列，利用Gisbson方法将这些基因克隆在pJ1-018-22上，该阳性克隆测序命名为pJ1-018-23。该质粒控制idi基因表达的为强启动子SPL44，控制J1-018-A基因表达的为强启动子SPL39，含有attP位点和Int整合酶，为硫链丝菌素抗性。
进而，将携带有dxs、ispD、ispE、ispF、ispH、idi、J1-018-A基因的质粒导入链霉菌中后，链霉菌中dxs、ispD、ispE、ispF、ispH、idi、J1-018-A基因的表达量与链霉菌自有dxr、ispG基因的表达量的比(表示为dxs：dxr：ispD：ispE：ispF：ispG：ispH：idi：J1-018-A)为2：1：2：2：2：1：2：5：5。
实施例7法尼烯产生菌的构建
将质粒pJ1-018-21通过文献报道的接合转移的方法(Qian Liu.,2016.Development of Streptomyces sp.FR-008as an emerging chassis.Synth SystBiotechnol.1(3):207–214.)转入白色链霉菌J1074中，挑选阳性接合子进行验证，验证成功的接合子命名为J1-018-10，再将质粒pJ1-018-23通过接合转移的方法转入J1-018-10中，得到的阳性接合子命名为J1-018-11。
将J1-018-11菌株进行划菌苔培养，在TSB培养基中进行种子摇瓶培养，培养温度为30度，培养转速为220rpm培养两天后，按照10％的接种量转接新的含有20％IPM覆盖的TSB培养基，继续培养3天后进行检测。结果显示，菌株J1-018-11中能检测到法尼烯的产生，产量为2.0g/L，后续仍持续增加。该产量为目前首次在链霉菌中合成法尼烯的报道产量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉臻智生物科技有限公司
<120> 微生物及其用途
<130> PIDC3181697
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1116
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> J1-018-A基因序列
<400> 1
atgcctcaca agcacgttcc tcttagacca gtcaagttga catttgatcc tgtaggatca 60
aacaccctag gtgtgccaac cttggacttt gagtctctgt tccgggaaga cagcgtctct 120
gaggatgccc ctcttgttat ctacccagag gatatgggtg tcccatggaa cacctctctt 180
ccttggacca gacaatccaa gttctgggct tacgccgagg cagctggata tgaaatggcc 240
aacggaatca gccttgacaa ggcatcagag cgtggcacac tacccatgga gttgatggat 300
gagcgtcgca agtggaagat tgatgagcta gttgaggatg ccatctcttg ctgtgcttat 360
ctttacccta catcatctcc taccagattg gcgttgttga cccagtctgt tctgcttcta 420
ttcctccacg acgatgttat tgagcgagga gctactcaaa acgaaaccac agtggtagac 480
gaatttctta gcatggctcc caagaacagg catcttaaga aattctggtc agacgtattg 540
gaatgtgatc ccgtccttgg acctgatctg ctttatgcta tccatgcttt cgtccgtgat 600
ggtcgtgtaa agtcaccctt taagcaggat cactatgcca cattggctga ttacatgctt 660
taccgtcgca atgatgttgg caagacattt atgattgcag ctatccgctt cggctctggc 720
gtgcaacaaa cacgcgaaga acttgctccc tttgacgagc ttgctgatct ttacgtcaga 780
cactcaattc ttatcaacga tctctactcg tatgataagg aggtgcacga ggtcaagact 840
atcgacgcgt ccatcgtgaa cgcagttgct gtcacagagc agctcctttc cgtgtcgcct 900
gacctggcca agaacttaac cagagctatt acctttgaca tggagaagga gttttacggc 960
atttgtgaga agtttatgca cagccctgat atcaacgatc gccagcgcgt gttcgttact 1020
gcgctctttg atgcgttgac aggcaatatc ttccattctg ctactttgag cagatacgtt 1080
cgtcacggcg agagaccact tccttgcaag tgttag 1116

Claims (7)

1.一种微生物，其特征在于，所述微生物过表达idi、J1-018-A、dxs、dxr、ispD、ispE、 ispF、ispG以及ispH基因，所述J1-018-A具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述idi具有如genebank库中编号为ACT44538.1所示的氨基酸序列，所述dxs具有如genebank库中编号为ACT42267.1所示的氨基酸序列，所述dxr具有如genebank库中编号为ACT42072.1所示的氨基酸序列，所述ispD具有如genebank库中编号为ACT44416.1所示的氨基酸序列，所述ispE具有如genebank库中编号为ACT43075.1所示的氨基酸序列，所述ispF具有如genebank库中编号为ACT44415.1所示的氨基酸序列，所述ispG具有如genebank库中编号为ACT44227.1所示的氨基酸序列，所述ispH具有如genebank库中编号为ACT41935.1所示的氨基酸序列；
所述dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi以及J1-018-A基因的表达量的比为2：1：2：2：2：1：2：5：5。
2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌、酵母菌或链霉菌。
3.一种制备法尼烯的方法，其特征在于，包括：在合适微生物发酵的条件下，将权利要求1~2任一项所述的微生物进行发酵处理，以便获得法尼烯。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包括向发酵体系中加入三磷酸甘油醛和丙酮酸。
5.一种制备权利要求1~2任一项所述的微生物的方法，其特征在于，包括：
将第一质粒、第二质粒以及第三质粒导入大肠杆菌中，以便获得所述微生物，
其中，所述第一质粒携带dxs、ispD、ispE、ispF以及ispH基因，所述dxs、ispD、ispE、 ispF以及ispH基因在所述第一质粒的拷贝数为1，
所述第二质粒携带idi基因，所述idi基因在所述第二质粒的拷贝数为3，
所述第三质粒携带J1-018-A基因，所述J1-018-A基因在所述第三质粒的拷贝数为3。
6.一种制备权利要求1~2任一项所述的微生物的方法，其特征在于，包括：
将第四质粒、第五质粒、第六质粒以及第七质粒导入酵母菌中，以便获得所述微生物，
其中，所述第四质粒携带dxs、ispD以及ispE基因，所述dxs、ispD以及ispE基因在所述第四质粒的拷贝数为1，
所述第五质粒携带dxr、ispG、ispF以及ispH基因，所述dxr、ispG、ispF以及ispH基因在所述第五质粒的拷贝数为1，
所述第六质粒携带idi基因，所述idi基因在所述第六质粒的拷贝数为3，
所述第七质粒携带J1-018-A基因，所述J1-018-A基因在所述第七质粒的拷贝数为3。
7.一种制备权利要求1~2任一项所述的微生物的方法，其特征在于，包括：
将第八质粒导入菌株A中，以便获得菌株B，其中，菌株A为链霉菌菌株；
将第九质粒导入菌株B中，以便获得所述微生物；
其中，所述第八质粒携带dxs、ispD、ispE、ispF以及ispH基因，所述dxs、ispD、ispE、 ispF以及ispH基因在所述第八质粒的拷贝数为1，
所述第九质粒携带idi以及J1-018-A基因，所述idi基因在所述第九质粒的拷贝数为2，所述J1-018-A基因在所述第九质粒的拷贝数为3。
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