CN111575310B

CN111575310B - 表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用

Info

Publication number: CN111575310B
Application number: CN202010405260.2A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 张倩; 曾伟主; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2040-05-14
Also published as: CN111575310A

Abstract

本发明公开了表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明通过在酿酒酵母中异源表达小窝蛋白CAV1基因，获得能够内吞外源添加油脂的重组酿酒酵母。所述重组酿酒酵母能够通过转运油脂和脂肪酸来提高柚皮素的产量；此外，重组酿酒酵母菌中的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A含量也有所提高，通过添加棕榈酸分析神经酰胺产量，重组酿酒酵母菌有提高神经酰胺的作用。因而所述重组酿酒酵母在化妆品、医药、食品领域具有重要作用。

Description

表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

微生物转化法由于其生物量积累快、转化时间短等特点，而逐渐被应用于工业化生产中制备各类化合物质。由于微生物细胞膜具有通透性，因此大分子物质不能随意进入细胞，而是依赖于细胞膜上的转运蛋白才能转运进入细胞。脂肪酸的吸收就需要依赖于转运蛋白，因此脂肪酸的转运过程限制了底物的可利用性和破坏了细胞膜的完整性，因此降低了细胞的生存能力和生物转化活性。外源添加的油脂更是无法透过细胞膜进入细胞被细胞所利用。因而造成了柚皮素、神经酰胺等需要利用油脂进行转化生产的化合物的低产。

柚皮素(Naringenin)是一类存在于橘子皮等植物组织中的重要天然产物，是黄酮类物质的基本骨架，可经过不同的催化反应形成种类繁多并且具有高附加值的各种黄酮类化合物。柚皮素具有重要的生理功能，在食品、药品和化妆品领域等具有重要作用。目前柚皮素的生产方式是以从橘子皮中萃取为主，这导致其价格昂贵，且无法满足市场需求。基于生物合成学的发展，将柚皮素的合成途径在微生物中异源表达，实现了柚皮素的低成本的投入和高效合成的生产方式。但是，前体物质丙二酰辅酶A不足限制了柚皮素的合成。目前，针对微生物异源合成柚皮素的调控策略主要是莽草酸途径的代谢调控，竞争代谢途径的调控，细胞质中丙二酰辅酶A的合成途径的调控等，然而，这些调控策略对于柚皮素的合成仍然存在许多不足，并且丙二酰辅酶A是柚皮素合成的关键限速步骤，因此，强化丙二酰辅酶A的合成是强化柚皮素合成的关键步骤。乙酰辅酶A是脂肪酸β氧化过程的终产物，而乙酰辅酶A是丙二酰辅酶A的直接合成前体，因此脂肪酸的β氧化过程是提供丙二酰辅酶A的另一重要途径。但是，脂肪酸的吸收限制了脂肪酸的β氧化过程。

神经酰胺(Ceramide)不仅具有维护皮肤的屏障功能而且还包括具有角质层的锁水性。虽然神经酰胺在人体皮肤中的确切作用尚不完全清楚。但是，神经酰胺已经广泛应用于化妆品和医药行业。相比与其它微生物，酵母生长迅速且无毒性，酿酒酵母更适合于生产神经酰胺。在酿酒酵母中，神经酰胺的合成以丝氨酸和棕榈酸为前体，长链脂肪酸棕榈酸需经过转运蛋白才能转运进入细胞，因此，前体物质的不足限制了神经酰胺的合成。

小窝蛋白细胞生物学是生物医学研究中一个发展迅速的领域。小窝蛋白主要以其在内皮细胞间运输分子的能力而闻名，但现代细胞技术极大地扩展了我们对小窝蛋白的认识。它们在大多数细胞的表面形成一个独特的胞吞和胞吐的腔室，能够导入分子并将其传递到细胞内的特定位置，或者将分子输出到细胞外空间，并将各种信号活动分隔开。它们不仅是一个具有特殊膜形状的内吞装置，而且是构成一个具有多种细胞基本功能的完整的膜系统。但目前还未有小窝蛋白在转运油脂、脂肪酸中的报道。

发明内容

为解决上述问题，本申请旨在利用小窝蛋白对大分子的转运，以期提供一种更加高效和不破坏细胞完整性的的转运机制，促使其对合成生物学的发展具有潜在的指导价值和指导意义。

本发明的第一个目的是提供一种重组质粒，所述质粒上含有小窝蛋白CAV1基因。

在本发明的一种实施方式中，所述小窝蛋白CAV1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述小窝蛋白CAV1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒为pRS系列载体。

本发明的第二个目的是提供一种重组酿酒酵母，所述酿酒酵母含有所述重组质粒；所述酿酒酵母以酿酒酵母CER01或酿酒酵母ZLHB04-4为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以酿酒酵母CER01为宿主时，将得到重组酿酒酵母命名为CER01/pRS423-CAV1。

在本发明的一种实施方式中，以酿酒酵母ZLHB04-4为宿主时，将得到重组酿酒酵母命名为ZLHB04-4/pRS423-CAV1。

本发明的第三个目的是提供一种促进油脂类物质或脂肪酸类物质向细胞内转移的方法，所述方法为表达小窝蛋白CAV1或含有小窝蛋白CAV1基因；所述跨膜运输是将油脂类物质或脂肪酸运输进细胞内。

在本发明的一种实施方式中，所述油脂包括但不限于棕榈油、菜籽油、橄榄油、花生油、椰子油、玉米油、大豆油。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸包括但不限于油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、亚油酸、亚麻酸。

本发明的第四个目的是提供一种促进油脂类物质或脂肪酸类物质向细胞内转移的方法在提高柚皮素或神经酰胺产量方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1在含有棕榈酸的体系中发酵，合成神经酰胺。

在本发明的一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1在含有油脂或脂肪酸的体系中发酵，合成柚皮素。

本发明的第五个目的是提供一种提高细胞内的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平的方法，所述方法是将重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1在含有油脂或脂肪酸的体系中进行培养。

本发明的第六个目的是提供所述重组质粒，或所述重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1和/或重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1，或促进油脂类物质或脂肪酸类物质向细胞内转移的方法，或所述应用在食品、化妆品、医药领域提高以油脂或脂肪酸类物质为前体的代谢产物产量方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述以油脂或脂肪酸类物质为前体的代谢产物包括但不限于柚皮素、神经酰胺。

本发明的第七个目的是提供所述提高细胞内的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平的方法在食品、医药领域制备柚皮素中的应用。

本发明的有益效果：

本发明在酿酒酵母中转入重组质粒pRS423-CAV1，得到了异源表达小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌，所述重组酿酒酵母菌具有内吞外源添加脂肪酸和油脂的作用，因此，基于重组酿酒酵母菌对外源添加油脂的内吞作用，为脂肪酸β氧化提供了所需的前体物质，从而强化了脂肪酸的β氧化过程，脂肪酸β氧化的终产物乙酰辅酶A进一步提高了胞内的丙二酰辅酶A的合成，从而打破了柚皮素合成的瓶颈限速步骤，进一步提高了柚皮素的产量，使得柚皮素的产量可达275mg/L。基于重组酵母菌对外源添加脂肪酸的内吞作用，为神经酰胺的合成提供更加充足的前体物质，因此促进了神经酰胺测合成，使得神经酰胺的产量可达30mg/L。

附图说明

图1为CAV1的穿梭质粒图谱。

图2为CAV1重组酿酒酵母的菌落PCR验证的凝胶电泳图。

图3为细胞内吞5.6-羧酸荧光素的激光共聚焦显微镜图，(A)：对照菌，(B)：CAV1的重组酿酒酵母菌。

图4为细胞内吞被尼罗红染色的小油滴的荧光显微镜图，(A)：对照菌，(B)：CAV1的重组酿酒酵母菌。

图5为细胞内和细胞外油脂的薄层层析分析，其中，M1：十九烷酸标品，M2：甘油三酯标品；通道1：YPD培养基下对照菌的细胞内油脂；通道2：YPD培养基下重组菌的细胞内油脂；通道3：YPDSO培养基下对照菌的细胞内油脂；通道4：YPDSO培养基下重组菌的细胞内油脂；通道7：YPDSO培养基的油脂分析；通道8：YPD培养基下对照菌的发酵液上清油脂；通道9：YPD培养基下重组菌的发酵液上清油脂；通道10：YPDSO培养基下对照菌的发酵液上清油脂；通道11：YPDSO培养基下重组菌的发酵液上清油脂。

图6为细胞在YPD和YPDOA培养下转运脂肪酸合成的柚皮素量。

图7为细胞在YPD和YPDSO培养下转运油脂合成的柚皮素产量图。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂条，以配制LB固体培养基。

YNB培养基：Yeast Nutrition Base67.4 g/L，葡萄糖20g/L，氨基酸(5g/L尿嘧啶，10g/L色氨酸，10g/L亮氨酸，10g/L组氨酸，根据需要适当缺失相应氨基酸)。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。

YPDOA培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，油酸800mg/L，Tween802g/L，磷酸氢二钾5g/L。

YPDPA培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，棕榈酸800mg/L，Tween802g/L，磷酸氢二钾5g/L。

YPDSO培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，大豆油10mL/L，Tween802g/L，磷酸氢二钾5g/L。

(二)溶液

TBS缓冲液：Tris(三羟甲基胺基甲烷)6.05g/L，NaCl 8.75g/L，pH7.4。

(三)脂质提取和薄层层析分析(TLC)：上清中总油脂的提取，4mL的上清中加入500μL的冰醋酸，500μL的12％(w/v)的氯化钠溶液和内标，以及2mL的乙酸乙酯，室温震荡20min，离心收集上层有机相，然后氮吹，用氯仿重悬，取50μL的氯仿层用于薄层层析分析。离心收集500μL菌体(或者用冻干的菌粉)，加入1mL的1:1的甲醇:氯仿和内标，并加入玻璃珠破碎。加入500μL的超纯水，涡旋震荡5min，14000rpm离心5min，去除上层的水和甲醇相，收集下层氯仿层。氯仿层中再加入500μL的1:1的甲醇：氯仿，涡旋震荡10min，加入250μL的超纯水，涡旋震荡5min，14000rpm离心5min，去除上层的水和甲醇相，收集下层氯仿层。取50μL的氯仿层用于薄层层析分析。薄层层析分析的展开剂：正己烷：乙醚：乙酸(70:30:1)，薄层层析分析的显色剂：溶于80％丙酮的樱草灵。

(四)乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的LC-MS测定：采用安捷伦三重四级杆液质联用仪进行测定。LC条件：色谱柱，ThermoHypersil ODS-2column；流动相A，含有15mM的甲酸铵的超纯水；流动相B，含有10mM的乙酸铵的甲醇；流动相比例条件，0-5min：10-25％B，5-10min：25-100％B，10-11min，100-10％B，11-13min，10-10％B。；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL；以提取离子流EIC峰面积积分对乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A进行定量。

(五)柚皮素HPLC测定：采用Shimadzu高效液相色谱进行测定。LC条件：色谱柱，ThermoHypersil ODS-2column；流动相A，含有1‰甲酸的超纯水；流动相B，含有1‰甲酸的乙腈；流动相比例条件，0-10min，10-40％B，10-30min，40-80％B，30-35min，80-80％B，35-37min，80-10％B，37-40min，10-10％B；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器A350。

(六)神经酰胺HPLC测定：将细胞提取物与10mL氯仿:甲醇(2:1)混合。细胞提取物通过0.22μm有机滤膜过滤。采用Acme 9000HPLC系统进行测定。数据采集采用Autochro3000，检测系统采用ELSD Sedex 75。ELSD的漂移温度设置为40℃，雾化器气体(氮气)流量为3.5bar。本研究使用的正相柱为Waters Spherisorb 5μm二氧化硅，柱尺寸为4.6×250mm。流动相采用氯仿:甲醇(96:4)，流速为1mL/min。

(七)醋酸锂转化法：将酿酒酵母细胞在YPD平板划线，30℃培养3天，挑取单菌落接种于5mL的YPD液体培养基中，30℃220rpm振荡培养16h，以OD₆₀₀值为0.3转接于50mL的YPD液体培养基中，30℃220rpm振荡培养5h左右至OD₆₀₀值为1.2-1.6之间；

收集菌液于冰上预冷5min，以5000×g离心5min收集菌体，加入25mL预冷的无菌水重悬菌体，以5000×g离心5min收集菌体，加入1mL的0.1mM的醋酸锂重悬菌体，以5000×g离心1min收集菌体，加入400μL的0.1mM的醋酸锂溶液重悬菌体，取50uL的重悬液依次加入240μL PEG3350，36μL的1mM的醋酸锂溶液，25μL的2mg/mL的ssDNA，震荡30s混匀体系，30℃培养30min，42℃水浴热激25min，以5000×g离心1min收集菌体，加入1mL的无菌水重悬菌体，取100μL涂板于不含组氨酸的YNB平板上，30℃培养3天。

(八)含有柚皮素合成途径底盘细胞ZLHB04-4的构建：基于酿酒酵母CEN.PK2-1D细胞构建合成柚皮素的底盘细胞；具体步骤可参照DNA assembler,an in vivo geneticmethod for rapid construction of biochemical pathways,Zengyi Shao et al,Nucleic Acids Research,2009。

①利用酵母同源重组的原理敲除GAL80(GeneBank登录号为854954)；②利用同源重组方式将来源于Flavobacterium johnsoniae的酪氨酸解氨酶TAL(NCBI登录号为WP_012023194.1)整合至酵母基因组；③将ARO4的抗反馈基因ARO4^fbr(GeneBank登录号为852551)和ARO7的抗反馈基因ARO7^fbr(GeneBank登录号为856173)整合至酵母基因组；④利用酵母同源重组的原理将矮牵牛的查尔酮合成酶CHS(NCBI登录号为AAF60297.1)，紫苜蓿的查尔酮异构酶CHI(NCBI登录号为P28012.1)，香芹菜的4-香桂酸:辅酶A连接酶4CL(NCBI登录号为P14912.1)整合至酵母基因组；得到柚皮素生产菌株ZLHB04-4。

(九)含有神经酰胺合成途径的底盘细胞CER01的构建：基于酿酒酵母CEN.PK2-1D引入来源于人的delta-4-去饱和酶DEGS1(NCBI登录号为8560)和DEGS2(NCBI登录号为123099)，将两种酶同时构建于pY26TEF-GPD的载体骨架中，构建得pY26-DEGS1-DEGS2重组质粒。将重组质粒用醋酸锂转化法转化至酿酒酵母CEN.PK2-1D中，在不含尿嘧啶的YNB平板上进行筛选，得到正确的克隆子命名为CER01。

实施例1：CAV1基因合成及表达小窝蛋白CAV1穿梭质粒的构建

根据NCBI数据库的人类的小窝蛋白CAV1基因进行密码子优化，由上海生工公司进行基因合成，最终核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

设计用于扩增CAV1序列的引物对：

F1：TGA CTC GAG TTA AAT TTC CTT TTG CAA ATT AAT TCT AAC GTT AGA GAAAAT TTT ACC AA，SEQIDNO.3(下划线部分为同源臂序列，下同)，

R1：TCC CTC AAA AAT GTC TGG TGG TAA ATA CGT TGA TTC TGA AG，SEQIDNO.4。

以合成序列SEQ ID NO.1为模板，以F1和R1引物对进行PCR扩增，选择Primer StarMasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，55℃，5s，72℃，30s进行；延伸72℃，5min；将PCR产物进行产物纯化(纯化试剂盒购自上海生工公司)，得到CAV1片段。

设计载体pRS423线性扩增引物对：

F2：AGC TGG CAA ACA GCT TTT GTT CCC TTT AGT GAG GGT TAA TTG，SEQIDNO.5，

R2：GGA AAT TTA ACT CGA GTC ATG TAA TTA GTT ATG TCA CGC，SEQIDNO.6。

以质粒pRS423为模板，以F2和R2引物对进行PCR扩增，选择Primer StarMasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，55℃，5s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min；将PCR产物进行产物纯化，得到线性化的pRS423片段。

设计用于扩增启动子GAL7(GeneBank登录号为852306序列上游1～725bp)的引物对：

F3:CAC CAG ACA TTT TTG AGG GAA TAT TCA ACT GTT TTT TTT TAT CAT GTTGAT G，SEQIDNO.7，

R3:ACA AAA GCT GTT TGC CAG CTT ACT ATC CTT CTT GAA AAT ATG C，SEQIDNO.8。

以酿酒酵母基因组为模板，以F3和R3引物对进行PCR扩增，选择Primer StarMasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，55℃，5s，72℃，45s进行；延伸72℃，5min；将PCR产物进行产物纯化(纯化试剂盒购自上海生工公司)，得到GAL7片段。

用Infusion-Cloning的方法将CAV1片段，GAL7片段和线性化的pRS423片段重组为载体pRS423-CAV1(见图1)，并转化大肠杆菌JM109。将菌液提取质粒并送上海生工测序，测序正确的质粒即为pRS423-CAV1。

实施例2：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌株的构建

将测序正确的重组载体pRS423-CAV1用醋酸锂化学转化法转化至底盘细胞ZLHB04-4中，在不含组氨酸的YNB平板上，30℃培养3天，至长出单菌落；挑取单菌落于YNB培养基中，220rpm培养24h；将培养得到的菌液进行PCR验证，挑取正确的克隆，构建得重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(见图2)。

菌落PCR所用引物：

F4：TTG AAT TTC AAT CAA GAA AGA CTT AAT ACA TGG AAC AAC，SEQIDNO.9，

R4：GGG TAA TTT TTC CCC TTT ATT TTG TTC，SEQIDNO.10。

实施例3：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母转运外源物质的功能验证

将构建完成的重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(以转化有pRS423空载的菌株ZLHB04-4/pRS423作为对照)于不含组氨酸的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接入于5mL的对应的YNB培养基中，培养24h使OD₆₀₀为3，按体积比为1％的接种量转接于5mL不含组氨酸的YNB培养基中，培养16h后加入10mM的5.6-羧酸荧光素(3.7632g5.6-羧酸荧光素溶解于1L无水乙醇中)，培养6h后收集5mL的菌液离心弃上清，用冰浴TBS缓冲液洗涤细胞，最后重悬于1mL的TBS缓冲液，用激光共聚焦显微镜观察细胞。

通过对比分析可知，重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1，细胞内的荧光强度明显比对照强，说明重组酿酒酵母细胞对外源添加的荧光素的摄入能力更强，说明表达小窝蛋白CAV1的重组菌株可以强化对外源物质的摄入能力(见图3)。

实施例4：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母转运油脂的功能验证

将构建完成的重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(以转化有空载体的菌株ZLHB04-4/pRS423作为对照)于不含组氨酸的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接入于5mL的对应的YNB培养基中，24h后按1％接种量转接于30mL的YPDSO培养基中，并加入尼罗红染料进行共培养，培养48h后收集5mL的菌液离心弃上清，用冰浴TBS缓冲液洗涤细胞，最后重悬于1mL的TBS缓冲液，用荧光显微镜观察细胞内的红色荧光。尼罗红的添加先把培养基中的小油滴染成红色后，通过细胞对已染色小油滴的摄入情况观察细胞对外源添加油脂的摄入作用，重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1的细胞内有微小红色荧光，而对照没有，说明小窝蛋白CAV1的表达能促进外源油滴的摄入。因此，说明通过表达小窝蛋白CAV1可以强化细胞对外源添加油脂的摄入能力(见图4)。

实施例5：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母转运油脂的胞内胞外的薄层层析分析

将构建完成的重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(以转化有空载体的菌株ZLHB04-4/pRS423作为对照)于不含组氨酸的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接于5mL的对应的YNB培养基中，24h后按1％接种量转接于30mL的YPD培养基和YPDSO培养基中，培养48h后分别收集上清和菌体，上清和菌体分别进行总油脂的提取和TLC分析。在添加大豆油YPDSO培养基的培养条件下，表达小窝蛋白CAV1的重组菌株细胞外的TAG含量低于对照未表达小窝蛋白CAV1的菌株，并且表达小窝蛋白CAV1的重组菌株细胞内的TAG含量高于对照未表达小窝蛋白CAV1的菌株。因此说明小窝蛋白CAV1的表达能促进油脂的吸收和利用(见图5)。

将大豆油替换为棕榈油，菜籽油，橄榄油，花生油，椰子油，玉米油，按照上述步骤进行，结果显示，小窝蛋白CAV1的表达也能促进其他油脂的吸收和利用。

实施例6：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母转运脂肪酸并促进柚皮素的合成

将构建完成的重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(以转化有空载体的菌株ZLHB04-4/pRS423作为对照)于不含组氨酸的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接于5mL的对应的YNB培养基中，24h后按1％接种量转接于30mL的YPD培养基和YPDOA培养基中，培养72h后取500μL发酵液，加入500μL甲醇，将重悬液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。重组酿酒酵母菌和对照菌在YPDOA培养基中的柚皮素产量是235mg/L和212mg/L，分别高于YPD培养基中的柚皮素产量191mg/L和111mg/L，说明油酸的添加能促进柚皮素的合成，小窝蛋白CAV1的表达促进了脂肪酸的转运并且提高了柚皮素的合成(见图6)。

将油酸替换为月桂酸，肉豆蔻酸，硬脂酸，棕榈酸，油酸，棕榈油酸，亚油酸，亚麻酸，按照上述步骤进行，结果显示，小窝蛋白CAV1的表达也促进了其他脂肪酸的转运并且提高了柚皮素的合成。

实施例7：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母转运油脂并促进柚皮素的合成

将构建完成的重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(以转化有空载体的菌株ZLHB04-4/pRS423作为对照)于不含组氨酸的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接于5mL的对应的YNB培养基中，24h后按1％接种量转接于30mL的YPD培养基和YPDSO培养基中，培养72h后取500μL发酵液，加入500μL甲醇，将重悬液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。重组酿酒酵母菌和对照菌在YPDOA培养基中的柚皮素产量是275mg/L和238mg/L，分别高于YPD培养基中的柚皮素产量191mg/L和111mg/L，说明大豆油的添加能促进柚皮素的合成，表达小窝蛋白CAV1的促进了油脂的转运并且提高了柚皮素的合成(见图7)。

实施例8：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母转运油脂并提高细胞内的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A含量

将构建完成的重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1(以转化有空载体的菌株ZLHB04-4/pRS423作为对照)于不含组氨酸的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接于5mL的对应的YNB培养基中，24h后按1％接种量转接于30mL的YPD和YPDSO培养基中，第36h收集菌体，加入1mL的冰甲醇重悬，随后在4℃条件下细胞超声破碎5min，破碎后的细胞12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行LC-MS分析。

在YPD培养基中，含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌中的乙酰辅酶A含量是0.135nmol/mg DCW，对照菌株为0.126nmol/mg DCW；含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌中的丙二酰辅酶A含量是0.00257nmol/mg DCW，较对照菌的0.00191nmol/mg DCW，提高了34.6％。

含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌中的乙酰辅酶A含量是0.33nmol/mg DCW，高于对照菌株的0.324nmol/mg DCW；含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌中的丙二酰辅酶A含量是0.00509nmol/mg DCW，也略高于对照菌0.00483nmol/mg DCW。

实施例9：基于合成神经酰胺的底盘细胞中表达重组小窝蛋白CAV1的构建

将测序正确的重组载体pRS423-CAV1用醋酸锂化学转化法转化至酿酒酵母中。以酿酒酵母CEN.PK2-1D为出发菌株的经过基因工程改造成含有神经酰胺合成途径的CER01为底盘细胞。转化方法如下：将酿酒酵母底盘细胞在YPD平板划线，30℃培养3天，挑取单菌落接种于5mL的YPD液体培养基中，30℃220rpm振荡培养16h，以OD₆₀₀值为0.3转接于50mL的YPD液体培养基中，30℃220rpm振荡培养5h左右至OD₆₀₀值为1.2-1.6之间。收集菌液于冰上预冷5min，以5000×g离心5min收集菌体，加入25mL预冷的无菌水重悬菌体，以5000×g离心5min收集菌体，加入1mL的0.1mM的醋酸锂重悬菌体，以5000×g离心1min收集菌体，加入400μL的0.1mM的醋酸锂溶液重悬菌体，取50ul的重悬液依次加入240μL PEG3350，36μL的1mM的醋酸锂溶液，25μL的2mg/mL的ssDNA，震荡30s混匀体系，30℃培养30min，42℃水浴热激25min，以5000×g离心1min收集菌体，加入1mL的无菌水重悬菌体，取100μL涂板于不含组氨酸和尿嘧啶的YNB平板上，30℃培养3天，菌落PCR验证，挑取正确的克隆，构建得重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1。

实施例10：含小窝蛋白CAV1的重组酿酒酵母菌转运棕榈酸促进神经酰胺的合成

将构建完成的重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1(以转化有空载体的菌株CER01/pRS423作为对照)于不含组氨酸和尿嘧啶的YNB平板上划线，30℃培养3天，挑取单菌落转接于5mL的对应的YNB培养基中，24h后按1％接种量转接于30mL的YPD培养基和YPDPA培养基中，培养72h后收集菌体，提取细胞中的总油脂并分离纯化神经酰胺，进行HPLC分析。重组酿酒酵母菌和对照菌在YPDPA培养基中的神经酰胺的产量是30mg/L和18mg/L，分别高于在YPD培养基中的产量21mg/L和13mg/L，说明棕榈酸作为前体的添加能促进神经酰胺的合成，在添加棕榈酸的培养条件下，重组酿酒酵母菌的神经酰胺的产量高于对照菌的神经酰胺的产量，说明小窝蛋白CAV1的表达能促进棕榈酸的转运，为神经酰胺的合成提供更充分的前体物质，因此促进了神经酰胺的合成。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctggtg gtaaatacgt tgattctgaa ggtcatttgt acactgttcc aattagagaa 60

caaggtaaca tctacaagcc aaacaacaag gctatggctg atgaattgtc tgaaaagcaa 120

gtttacgatg ctcatactaa ggaaattgat ttggttaaca gagatccaaa gcacttgaac 180

gatgatgttg ttaagattga tttcgaagat gttattgctg aaccagaagg tactcattct 240

ttcgatggta tttggaaggc ttctttcact actttcactg ttactaagta ctggttctac 300

agattgttgt ctgctttatt cggtattcca atggctttga tttggggtat ctatttcgct 360

attttgtcct ttttgcatat ttgggctgtt gttccatgta ttaagtcttt cttgattgaa 420

attcaatgta tttctagagt ttactctatc tacgttcata ctgtttgtga tccattgttt 480

gaagctgttg gtaaaatttt ctctaacgtt agaattaatt tgcaaaagga aatttaa 537

<210> 2

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val

1 5 10 15

Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met

20 25 30

Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu

35 40 45

Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val

50 55 60

Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser

65 70 75 80

Phe Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys

85 90 95

Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala

100 105 110

Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp

115 120 125

Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Ile

130 135 140

Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe

145 150 155 160

Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys

165 170 175

Glu Ile

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgactcgagt taaatttcct tttgcaaatt aattctaacg ttagagaaaa ttttaccaa 59

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccctcaaaa atgtctggtg gtaaatacgt tgattctgaa g 41

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agctggcaaa cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tg 42

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaaatttaa ctcgagtcat gtaattagtt atgtcacgc 39

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caccagacat ttttgaggga atattcaact gttttttttt atcatgttga tg 52

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acaaaagctg tttgccagct tactatcctt cttgaaaata tgc 43

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgaatttca atcaagaaag acttaataca tggaacaac 39

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggtaatttt tcccctttat tttgttc 27

Claims

1.小窝蛋白CAV1基因在提高柚皮素或神经酰胺产量方面的应用，其特征在于，所述小窝蛋白CAV1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是将重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1在含有棕榈酸的体系中发酵，合成神经酰胺；以酿酒酵母ZLHB04-4为宿主，在酿酒酵母ZLHB04-4中表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的小窝蛋白CAV1基因得到所述重组酿酒酵母ZLHB04-4/pRS423-CAV1。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是将重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1在含有油脂或脂肪酸的体系中发酵，合成柚皮素；以酿酒酵母CER01为宿主，在酿酒酵母CER01中表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的小窝蛋白CAV1基因得到所述重组酿酒酵母CER01/pRS423-CAV1。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述油脂为大豆油、菜籽油、橄榄油、花生油、椰子油或玉米油；所述脂肪酸为油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸或亚麻酸。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为棕榈油酸或亚油酸。