CN116904412B

CN116904412B - 一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用

Info

Publication number: CN116904412B
Application number: CN202310917540.5A
Authority: CN
Inventors: 谢玉萍; 陈雨彤; 胡瑾瑜; 罗小舟
Original assignee: Senris Biotechnology Shenzhen Co ltd
Current assignee: Senris Biotechnology Shenzhen Co ltd
Filing date: 2023-07-25
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2043-07-25

Abstract

本发明公开了一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用，属于合成生物学技术领域、基因工程领域。本发明以能够合成CBDA的酿酒酵母为出发菌株，通过片段置换对野生型CBDAS进行基因改造，并将CBDAS突变体与内源性的亚细胞结构定位基因融合表达，筛选得到CBDA产量提高的酿酒酵母；随后通过多重突变位点的组合，进而优化异源大麻二酚酸合成酶CBDAS的表达水平达到高产大麻二酚酸的目的。

Description

一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用，属于合成生物学技术领域、基因工程领域。

背景技术

由于其药用特性，大麻在全球范围内已被种植长达数千年，迄今为止从大麻中分离出的植物源性大麻素超过100种。大麻素具有潜在的医疗用途(抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗焦虑、抗抑郁等)，可用于治疗多种人类疾病(癫痫症、糖尿病、帕金森综合征等)。其中，CBGA(大麻萜酚酸)是大麻植株所产生的基础化合物，它对大麻生长有着保护作用，CBGA存在大麻花的毛状体中，并触发靶向植物细胞坏死，使大麻叶子得到自然“修剪”，为花体提供更多的生长能量。CBGA可以转化为其他多种大麻素，例如，通过大麻自身的酶转化成另外三种大麻素：THCA、CBDA和CBCA，CBGA、THCA、CBDA脱羧后，又分别得到CBG、THC(四氢大麻酚)、CBD(大麻二酚)。

许多大麻素以低含量存在，并且与其他相对更丰富的大麻素共存，使得难以从植物中获得纯净的样品。类似地，化学合成大麻素及其衍生物的方法麻烦、昂贵，且产率低。因此，需要制备纯大麻素、大麻素前体、大麻素衍生物或大麻素前体衍生物的另外的方法，例如生物合成法。采用生物合成技术,以酿酒酵母为细胞工厂高效生产CBDA很有必要。CBDA的从头生物合成途径如附图1所示，

通过大麻二酚酸合成酶(CBDAS)将CBGA转化为CBDA，CBDA的脱羧得到大麻二酚(CBD)。CBDA是一类重要的大麻素，与CBD一样，都可以激活5-HT1AA血清素受体，与调节情绪、焦虑、失眠和恶心感有关，可用于药物、保健品及化妆品。

然而在酿酒酵母内异源表达的CBDA产量较低，推测其原因可能由异源表达大麻二酚酸合成酶在转录、翻译、或蛋白结构水平效率不佳导致，并对酿酒酵母的菌株生长有影响，因此为了增加CBDA的合成产量，本专利对比了此前使用的CBDAS(CN114657078A)与表达较好的CBCAS序列(CN202010121334.X)，确定其主要差异，通过使用基因组片段替换的方法，将大麻二酚酸合成酶的序列优化，极大地提高CBDAS在酵母中的综合催化活性，CBDA的转化率得到极大提升。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是通过基因片段替换的方式对重组酿酒酵母中异源表达的大麻二酚酸合成酶CBDAS进行转录-翻译-蛋白结构方面的综合优化，提高其对大麻二酚酸CBDA的转化效率。

[技术方案]

本发明提供了大麻二酚酸合成酶CBDAS突变体，所述CBDAS突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的基础上，进行如下(1)～(43)一种或多种改造：

(1)将第3位至第13位的氨基酸置换为QENFLKCFSE；

(2)将第19位至第31位的氨基酸置换为PANPKFIYTQHDQL；

(3)将第29位至第41位的氨基酸置换为HDQLYMSVLNSTIQ；

(4)将第62位至第69位的氨基酸置换为NVSHIQAS；

(5)将第89位至第102位的氨基酸置换为AEGMSYISQVPFVV；

(6)将第102位至第109位的氨基酸置换为VVDLRNMH；

(7)将第135位至第146位的氨基酸置换为INEKNENFSFPG；

(8)将第147位至第154位的氨基酸置换为GYCPTVGV；

(9)将第153位至第166位的氨基酸置换为GVGGHFSGGGYGAL

(10)将第181位至第192位的氨基酸置换为HLVNVDGKVLDR；

(11)将第203位至第216位的氨基酸置换为IRGGGGENFGIIA；

(12)将第220位至第226位的氨基酸置换为KLVAVPS；

(13)将第226位至第235位的氨基酸置换为SKSTIFSVKKN；

(14)将第235位至第245位的氨基酸置换为NMEIHGLVKLF；

(15)将第258位至第268位的氨基酸置换为DLVLMTHFITK；

(16)将第274位至第283位的氨基酸置换为HGKNKTTVHG；

(17)将第280位至第291位的氨基酸置换为TVHGYFSSIFHG；

(18)将第315位至第323位的氨基酸置换为KEFSWIDTT；

(19)将第323位至第335位的氨基酸置换为TIFYSGVVNFNTA；

(20)将第338位至第351位的氨基酸置换为KKEILLDRSAGKKT；

(21)将第367位至第376位的氨基酸置换为TAMVKILEKL；

(22)将第381位至第387位的氨基酸置换为VGVGMYV；

(23)将第412位至第423位的氨基酸置换为MYELWYTASWEK；

(24)将第431位至第441位的氨基酸置换为INWVRSVYNFT；

(25)将第460位至第469位的氨基酸置换为DLGKTNPESP；

(26)将第488位至第497位的氨基酸置换为NRLVKVKTKA；

(27)将第13位至第22位的氨基酸置换为EYIPNNPANP；

(28)将第109位至第113位的氨基酸置换为HSIKI；

(29)将第249位至第251为的核苷酸突变为AGG；

(30)将第251位至第260位的氨基酸置换为IAYKYDKDLV；

(31)将第267位至第276位的氨基酸置换为TKNITDNHGK；

(32)将第316位至第330位的氨基酸置换为DSLVDLMNKSFPELG；

(33)将第349位至第357位的氨基酸置换为KKTAFSIKL；

(34)将第357位至第366位的氨基酸置换为LDYVKKPIPE；

(35)将第404位至第412位的L突变为PFPHRAGIM；

(36)将第447位至第453位氨基酸的置换为QNPRLAY；

(37)将第471位至第476位的氨基酸置换为LHPGKD；

(38)将第507位至第516位的氨基酸置换为QSIPPLPRHH；

(39)将第68位至第78位的氨基酸置换为ASILCSKKVGL；

(40)将第441位至第450位的氨基酸置换为TTPYVSQNPR；

(41)将第126位至第135位的氨基酸置换为ATLGEVYYWI；

(42)将第519位至第521位的核苷酸突变为为GCG；

(43)将第396位至第405位的氨基酸置换为EEISESAIPF。

本发明提供了编码上述CBDAS突变体的基因。

本发明提供了携带上述基因的载体。

本发明提供了携带上述载体或上述基因的宿主细胞。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括酵母细胞。

本发明提供了一种重组酿酒酵母，以表达合成大麻二酚酸(CBDA)途径的酶、能够合成CBDA的酵母为出发菌株，表达上述CBDAS突变体。

在一种实施方式中，所述CBDAS突变体与内源性的亚细胞结构定位基因融合表达。

在一种实施方式中，所述表达是指将异源的CBDAS基因整合至酿酒酵母基因组上。

在一种实施方式中，所述CBDAS基因通过内源性pGal1启动子启动表达。

在一种实施方式中，所述内源性的亚细胞结构定位基因包括红色荧光蛋白mCherry。

在一种实施方式中，所述mCherry的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了构建所述重组酿酒酵母的方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增得到需要过表达的基因的表达盒，整合到酿酒酵母基因组上；或者，PCR扩增得到用于敲除基因的同源片段，用同源片段替换酿酒酵母基因组上的待敲除基因；

使用CRISPR-Cas9技术实现酿酒酵母基因组上的基因敲除和插入；

(2)筛选获得阳性克隆。

本发明还提供了所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚酸中的应用，包括以下步骤：

(1)活化培养重组酿酒酵母，并培养得到重组酿酒酵母种子液，

(2)将重组酿酒酵母种子液转接到培养基中进行发酵培养以制备大麻二酚酸。

本发明所述重组酿酒酵母还可以用于生产大麻二酚，具体地，在本发明重组酿酒酵母中表达脱羧酶，将大麻二酚酸脱羧得到大麻二酚，或者，将本发明重组酿酒酵母生产得到的大麻二酚酸进行分离提纯，然后在体外利用酶催化剂或者化学催化剂进行脱羧得到大麻二酚。

[有益效果]

(1)本发明以能够合成CBDA的酿酒酵母为出发菌株，通过片段置换对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CBDAS进行改造，并将CBDAS突变体与内源性的亚细胞结构定位基因融合表达，筛选得到CBDA产量提高的酿酒酵母。

(2)将筛选到的使得CBDA产量提高的CBDAS突变片段进行多重突变，并整合至酿酒酵母基因组中，从中筛选CBDA产量提高的菌株，优化了CBDAS编码基因的表达水平和CBDAS的酶水平，大幅提高CBDA的产量。

附图说明

图1为大麻二酚酸在酿酒酵母中的合成途径；

图2为高产大麻二酚酸合成酶重组酵母系列菌株。

图3为二重突变菌株的CBDA产量。

图4为三重突变菌株的CBDA产量。

图5为四重突变菌株的CBDA产量。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

术语：

CBDAS是指，异源大麻二酚酸合成酶。

pGal1是指，酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因的强诱导型启动子，它是酵母重组蛋白表达系统中最常用的启动子。在葡萄糖存在的情况下，GAL1启动子的的转录受到抑制；半乳糖则会激活该启动子。

mCherry是指，红色荧光蛋白，一般用于提升特定蛋白可溶性，或将特定蛋白定位于液泡。

实验方法：

过表达，是指把基因上调表达，即该基因被过度的转录、翻译，终基因表达产物超过正常水平。

敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，令受体细胞基因组中特定的基因功能丧失作用。

下述实施例所用的PCR扩增方法、不同片段的融合方法、基因敲除及过表达方法可以采用本领域常见的技术手段，例如融合PCR、同源重组、CRISPR-Cas9技术。所用的酶、试剂盒均是可以购买的已经商业化的产品。

转化，是采用醋酸锂/PEG3350。下述实施例采用的转化方法是：先将宿主菌株在1×YPD培养基中活化，30℃，200rpm培养过夜。然后接种到新的2×YPD培养基中使起始OD值为0.2，30℃继续培养4-4.5h后，取5OD菌液，常温3000rcf，离心5min，弃上清，并用灭菌超纯水洗涤两次，获得酵母细胞；配制DNA混合物，每个构建取5OD的菌液获得细胞，并与50μLDNA混合物混合，使细胞重悬，50μLDNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH₂O混合而成。在悬浮的细胞中加入醋酸锂转化混合物，经培养后获取细胞，涂布到筛选平板上，获取单菌落，即为重组酿酒酵母，测序验证转化成功后，将重组酿酒酵母进行保存。

菌落PCR及测序验证：待筛选平板上长出单克隆菌落后，进行菌落PCR及测序验证，具体步骤是：用枪头挑取少量细胞分别置于20μL20mmol/LNaOH溶液，涡旋混匀，于金属浴95℃孵育20min，涡旋混匀，取1μL菌液作为模板进行菌落PCR反应，反应引物为引物9和引物10(表3)，比对克隆条带与阴性克隆条带大小，挑选菌落PCR阳性克隆的菌液送致金唯智公司进行测序验证。测序正确的菌株进行划线保存和甘油冻存。

重组酿酒酵母菌株的培养：单菌落在3ml1×YPD24孔板30℃200rpm摇床中过夜培养16h后，过夜菌液用1×YPD稀释10倍后用紫外分光光度计检测菌液OD，波长设置为600nm。然后使起始OD为0.2转接至3mL1×YPG培养液中培养。培养方式为：转接后，每隔24h添加10μL0.1M橄榄酸(olivetolicacid，OA)，300μL20％半乳糖。培养72h后收集200μL菌液为样品。

重组酿酒酵母CBDA产量的检测方法：样品收集后，根据样品OD₆₀₀，先用破壁酶2U/OD于30℃，200rpm摇床温育处理60min，然后加入0.2mL体积0.5mm玻璃珠和0.4ml的乙酸乙酯：甲酸(0.05％)，在高速组织研磨仪中，以65Hz处理180s，间隔30s，重复三次，每次处理后将研磨托盘置于冰上冷却1min，震荡15-30s，瞬时离心后，取上层有机层0.28mL至1.5mL离心管中，重复两次，并将收集的上层有机相合并。三次提取的有机层，Evaporation,modeV-AL,45℃1h挥干至无溶剂残留，用重悬液AHF(乙腈：H₂O：甲酸＝80:20:0.05％,含内标PHB(对羟基苯甲酸丙酯溶液标准物质，15μM)140μL重悬，0.22μmPVDF滤膜过滤至液相检测瓶内插管中，作为检测样品。每种样品三个平行。样品准备好之后，用HPLC进行检测，检测条件见表1。

表1HPLC检测条件

2×YPD培养基配方：酵母浸膏20.0g/L，蛋白胨40.0g/L，葡萄糖40.0g/L。

醋酸锂转化混合物：50％W/V PEG3350260μL，1mol/L LiOAc 36μL，变性鲑鱼精DNA10μL(变性鲑鱼精DNA使用前先置于95℃金属浴变性5min)，ddH₂O 4μL。

缺少尿嘧啶的筛选平板配方：酵母氮源母液1.7g/L，硫酸铵5g/L，各种氨基酸如表1所示，琼脂20g/L，葡萄糖20g/L，注：葡萄糖分开灭菌。

表2筛选平板中各种氨基酸的含量

氨基酸	(mg/L)	氨基酸	(mg/L)
				Adeninehemisulfate	18	L-Phenylalanine	76
L-Alanine	76	L-Proline	76
				L-Argnine	76	L-Serine	76
L-Asparticacid	76	L-Threonine	76
				L-Asparagine	76	L-Tryptophane	76
L-Cysteine	76	L-Tyrosine	76
				L-Glutamicacid	76	L-Valine	76
L-Glycine	76	L-Methionine	76
				L-Isoleucine	76	L-Lysine	76
L-Glutamine	76	L-Leucine	360
				L-Histidine	76

实施例1构建表达高产大麻二酚酸合成酶重组酵母系列菌株ySC908-950

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母CEN.PK2-1C的基因组为模板，使用表3中的引物1和引物2扩增获得整合位点上游同源臂1021b-Up片段，使用引物3和引物4扩增获得整合位点下游同源臂1021b-Down片段，以ySC908为例，以菌株ySC242(公开于公开号为CN114657078A的中国专利申请文件)基因组为模板，使用表3中的引物5和引物6扩增获得pGal1-mCherry片段，使用引物7和引物8扩增获得CBDAS-tADH1片段。然后将上述片段组合转化到宿主酿酒酵母ySC594a中，通过同源重组将片段组合整合至酿酒酵母ySC594a的基因组1021b位点，获得菌株ySC908。表达盒通过使用引物PCR扩增得到供体DNA片段，以构建一个整合的表达盒(通常包含两个侧翼同源区，启动子，亚细胞结构定位基因，CBDAS基因序列，终止子，该表达盒片段包含靶向所选基因组位点的侧翼同源区域，然后与靶向该基因的Cas9-gRNA质粒pCUT 1021b ura共转化进入酵母细胞。此外，引物在片段之间会提供同源臂，因此，在酵母体1-4个单独的片段可以进行同源重组自组装。靶向基因组基因座1021b位点的pCUT 1021b ura质粒是从线性骨架pCUT和包含gRNA序列的线性片段体内组装而成的。sgRNA由在线sgRNA设计工具所产生。

利用表3中的引物9和引物10对菌株进行菌落PCR，将阳性克隆进行于基因测序。一重突变菌株ySC909-950的构建方法如ySC908，仅是替换扩增获得CBDAS-tADH1片段的引物(表11)。

培养重组酿酒酵母菌株，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC908～950菌株中有10个菌株CBDA产量明显高于ySC594a，产量达到400μM以上，可见特定亚细胞结构定位对于CBDA产量具有一定的影响。

表3引物序列

实施例2构建二重表达大麻二酚酸合成酶重组酵母菌株

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。使用实施例1中筛选出的CBDA产量较高的菌株(ySC912/913/914/917/919/929/931/932/936/937/941/942)为模板，将不同菌株来源的CBDAS-tADH1进行两两组合突变，构建二重突变菌株。

分别以产量较高的菌株为模板，利用表4中的引物1和引物2扩出片段pGal1-mCherry-CBDAS、引物3和引物4扩出CBDAS-tADH1。然后将上述片段以及实施例1扩增得到的上游同源臂1021b-Up片段、下游同源臂1021b-Down片段组合转化到宿主酿酒酵母ySC594a中，获得菌株ySC999。采用相同的方法，仅替换模板和引物1～4以获得相应的二重组合菌株ySC1000-1006、ySC1017-1053(表11)。利用表4中的引物5和引物6对菌株ySC999-1006、ySC1017-1053进行菌落PCR，将阳性克隆进行基因测序。

培养ySC999-1006、ySC1017-1053，并检测CBDA的含量，如图3所示，通过高产菌株两两组合明显能提高CBDA产量，可以达到500μM以上。

表4引物序列

实施例3构建三重表达大麻二酚酸合成酶重组酵母菌株

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。分别以实施例1中的产量高的菌株和实施例2中构建的菌株为模板，将不同菌株来源的CBDAS-tADH1进行三重组合突变，构建三重突变菌株。

用表5中的引物1和引物2扩出片段pGal1-mCherry-CBDAS、引物3和引物4扩出CBDAS-tADH1。然后将上述片段以及实施例1扩增得到的上游同源臂1021b-Up片段、下游同源臂1021b-Down片段转化到宿主菌ySC594a中，获得相应的三重组合菌株ySC1061，采用相同的方法，仅替换模板和引物1～4以获得相应的三重菌株ySC1062～1068、ySC1076～1091、ySC1105～1113、ySC1158～1169。使用表5中的引物5和引物6用于对菌株ySC1061～1068、ySC1076～1091、ySC1105～1113、ySC1158～1169进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养菌株ySC1061～1068、ySC1076～1091、ySC1105～1113、ySC1158～1169菌株，并检测CBDA的含量，如图4所示，三重菌株在二重菌株基础上产量均有所提高，可以达到600～1000μM。

表5引物序列

实施例4构建四重表达大麻二酚酸合成酶重组酵母菌株

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以实施例2中构建的的菌株进行两两组合，将不同菌株来源的CBDAS-tADH1进行四重组合突变，构建四重突变菌株。

使用表6中的引物1和引物2扩出片段pGal1-mCherry-CBDAS、引物3和引物4扩出片段CBDAS-tADH1。然后将上述片段以及实施例1扩增得到的上游同源臂1021b-Up片段、下游同源臂1021b-Down片段转化至宿主菌ySC594a，获得菌株ySC1215，仅替换模板和引物1～4以获得相应的四重菌株ySC1216～1262。表6中的引物5和引物6用于对菌株ySC1215～1262进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养菌株ySC1215～1262，并检测CBDA的含量，如图5所示，通过构建四重菌株产量进一步提高，最后得到产量最高的菌株ySC1226(919+912+913+914)1454μM，ySC1250(913+914+936+937)1450μM。

表6引物序列

表7菌株构建信息

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表8序列表

表9序列表

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表10菌株信息

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表11菌株引物序列

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综上所述，结合图2-5可以看出，本发明通过片段替换与大麻二酚酸合成酶CBDAS融合表达，筛选高产量菌株，以及高产量菌株间的不同组合可明显提高CBDA产量。产量越高的菌株通过多重组合，效果好于单一定位的CBDAS表达。本发明通过片段替换将大麻二酚酸合成酶CBDAS序列优化，进而提高大麻二酚酸合成酶CBDAS的表达水平，提高大麻二酚酸的产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.大麻二酚酸合成酶CBDAS突变体，其特征在于，所述CBDAS突变体在氨基酸序列如SEQID NO.1所示的基础上，将第4位至第13位的氨基酸置换为QENFLKCFSE。

2.编码权利要求1所述CBDAS突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.携带权利要求3所述载体或权利要求2所述基因的宿主细胞。

5.一种重组酿酒酵母，其特征在于，以表达合成大麻二酚酸途径的酶、能够合成大麻二酚酸的酵母为出发菌株，表达权利要求1所述CBDAS突变体。

6.根据权利要求5所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述CBDAS突变体与内源性的亚细胞结构定位基因融合表达。

7.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述内源性的亚细胞结构定位基因包括红色荧光蛋白mCherry。

8.根据权利要求6所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述CBDAS通过内源性pGal1启动子启动表达。

9.权利要求5～8任一所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚酸中的应用，包括以下步骤：

10.权利要求1所述突变体、或权利要求2所述基因、或权利要求3所述载体、或权利要求4所述宿主细胞在生产大麻二酚酸中的应用。