CN114657078B

CN114657078B - 一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用

Info

Publication number: CN114657078B
Application number: CN202210098008.0A
Authority: CN
Inventors: 张雁; 许薷方; 陈雨彤; 胡瑾瑜; 李连威; 罗小舟
Original assignee: Senris Biotechnology Shenzhen Co ltd
Current assignee: Senris Biotechnology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114657078A

Abstract

本发明公开一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用，属于合成生物学技术领域、基因工程领域。本发明以能够合成CBGA的酿酒酵母为出发菌株，选择性地敲除Pep4、Prb1、Mrs2、Der1，选择性地敲除Gal80并过表达Gal4，以及选择性地过表达Hac1、Fad1和Fmn1、Erv29，选择性地采用pGal1启动子表达CBDAS通过或不通过linker与不同标签蛋白(TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP、mCherry)的融合蛋白，优化了CBDAS编码基因的表达水平和CBDAS的酶活水平，以提高CBDA的产量。

Description

一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用，属于合成生物学技术领域、基因工程领域。

背景技术

许多大麻素以低含量存在，并且与其他相对更丰富的大麻素共存，使得难以从植物中获得纯净的样品。类似地，化学合成大麻素及其衍生物的方法麻烦、昂贵，且产率低。因此，需要制备纯大麻素、大麻素前体、大麻素衍生物或大麻素前体衍生物的另外的方法，例如生物合成法。

大麻素的生物合成方法利用了不同途径、不同物种的基因来生产大麻素类似物，此方法为生产天然和非天然大麻素提供了一个平台，使大麻素的获取不再拘泥于传统的植物提取和化学合成，也使科学家们对这些化合物进行更系统深入的研究，让大麻素更好得造福大众。

Luo et al.报道了酿酒酵母利用半乳糖完整合成了主要的大麻素：大麻萜酚酸(CBGA)， Δ⁹-四氢大麻酸(THCA)，大麻二酚酸(CBDA)，Δ⁹-四氢大麻二酸(THCVA)和大麻二酸 (CBDVA)。Luo et al.的研究设计了天然甲羟戊酸途径以提供高通量的香叶基焦磷酸GPP，并引入了异源的香叶基焦磷酸:橄榄油酸酯香叶基转移酶CsPT4基因，以GPP和橄榄酸OA 为底物合成得到了大麻素生物合成中的重要前体化合物：CBGA。在合成CBGA的途径中，通过半乳糖和OA的添加，可以实现CBGA的大量积累。

大麻二酚酸(CBDA)是由CBGA转化而来的。CBDA的从头生物合成途径如附图1所示，大麻二酚酸合成酶(CBDAS)将CBGA转化为CBDA，CBDA的脱羧得到大麻二酚(CBD)。 CBDA是一类重要的大麻素，与CBD一样，都可以激活5-HT1AA血清素受体，与调节情绪、焦虑、失眠和恶心感有关，可用于药物、保健品及化妆品。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是优化重组酿酒酵母的异源大麻二酚酸合成酶CBDAS的表达水平，提高大麻二酚酸的产量。

[技术方案]

本发明提供了一种重组酿酒酵母，以表达合成大麻萜酚酸(CBGA)途径的酶、能够合成CBGA的酵母为出发菌株，表达大麻二酚酸合成途径中的大麻二酚酸合成酶，部分内源性基因被过表达或敲除，所述部分内源性基因包括：Fad1、Fmn1、Hac1、Pep4、Prb1、Mrs2、Gal80、Gal4、Erv29、Der1。进一步地，部分内源性基因被过表达或敲除是(a)～(k)任一种：

(a)过表达Fad1、Fmn1，

(b)过表达Hac1，

(c)敲除Pep4，

(d)同时具有(a)、(b)、(c)，

(e)在(d)的基础上，敲除Prb1，

(f)在(a)、(c)的基础上，敲除Mrs2、敲除Gal80、过表达Gal4，

(g)在(a)、(c)的基础上，敲除Mrs2、敲除Gal80、过表达Gal4、过表达Erv29，

(h)在(a)、(c)的基础上，敲除Der1，

(i)在(c)的基础上，敲除Gal80、过表达Gal4，

(j)在(a)、(c)的基础上，敲除Gal80、过表达Gal4，

(k)在(a)、(b)、(c)的基础上，敲除Gal80、过表达Gal4。

所述CBDAS基因编码大麻二酚酸合成酶，核苷酸序列可以是SEQ ID NO:1。所述CBDAS 的表达是指将异源的CBDAS基因插入到酿酒酵母基因组上去表达，可以通过内源性pGal1 启动子启动表达。

所述过表达是指把基因上调表达，即该基因被过度的转录、翻译，终基因表达产物超过正常水平。

所述敲除是指令特定基因功能丧失。

所述大麻二酚酸合成酶(CBDAS)还可以通过或不通过linker与标签蛋白进行融合表达。所述linker的序列可以如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:8任一所示。所述标签蛋白可以是TrxA (SEQ ID NO:9)、MBP(SEQ ID NO:10)、DsRed.T3(SEQ ID NO:11)、GFP(SEQ ID NO:12) 或mCherry(SEQ ID NO:13)。

所述Pep4基因编码空泡蛋白酶，核苷酸序列可以是NC_001148.4(259714..260931, complement)。所述敲除Pep4是指将酿酒酵母基因组上的Pep4不表达，可以通过缺失Pep4 的编码区来实现。

所述Gal80基因编码参与GAL基因抑制的转录调控因子，核苷酸序列可以是 NC_001145.3(171594..172901)。

所述Gal4基因编码参与GAL基因激活的转录调控因子，核苷酸序列可以是NC_001148.4 (79711..82356,complement)。所述敲除Gal80、过表达Gal4，是指将酿酒酵母基因组上Gal80 基因不表达同时强化Gal4的表达，可以通过缺失Gal80的编码区并在该位点使用优化的 pGal4mut启动子表达Gal4实现。

所述Fad1基因编码辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸，核苷酸序列可以是NC_001136.10(372688..373608,complement)。

所述Fmn1基因编码辅酶黄素单核苷酸，核苷酸序列可以是NC_001136.10(935236..935892,complement)。所述过表达Fad1、Fmn1是指使用强启动子增加Fad1和Fmn1的表达量，可以通过内源性pPGK1(启动子序列是PGK1基因上游的600bp)和pTDH3启动子实现(启动子序列是TDH3基因上游的600bp)。

所述Hac1基因编码转录激活因子，核苷酸序列可以是NC_001138.5(75179..76147)。所述过表达Hac1是指使用强启动子增加Hac1的表达量，可以通过内源性pTDH3启动子替换 Hac1自身的pHac1启动子实现。

所述Prb1基因编码蛋白水解酶B，核苷酸序列可以是NC_001137.3(40046..41953,complement)。所述敲除Prb1是指将酿酒酵母基因组上的Prb1不表达，可以通过缺失Prb1的编码区来实现。

所述Der1基因编码用于促进错误折叠多肽输出到细胞质的内质网膜蛋白，核苷酸序列可以是NC_001134.8(623576..624211)。所述敲除Der1是指将酿酒酵母基因组上的Der1不表达，可以通过缺失Der1的编码区来实现。

所述Mrs2基因编码线粒体镁离子转运蛋白，核苷酸序列可以是NC_001147.6(944596..946008)。所述敲除Mrs2是指将酿酒酵母基因组上的Mrs2不表达，可以通过缺失Mrs2的编码区来实现。

所述Erv29基因编码COPII包被的内质网衍生的转运囊泡的成分，核苷酸序列可以是 NC_001139.9(1060658..1061590,complement)。所述过表达Erv29是指使用强启动子增加Erv29的表达量，可以通过内源性pTEF1启动子替换Erv29自身的pErv29启动子实现。

本发明还提供了构建所述重组酿酒酵母的方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增得到需要过表达的基因的表达盒，整合到酿酒酵母基因组上；或者，PCR 扩增得到用于敲除基因的同源片段，用同源片段替换酿酒酵母基因组上的待敲除基因；

使用CRISPR-Cas9技术实现酿酒酵母基因组上的基因敲除和插入；

(2)筛选获得阳性克隆。

本发明提供了促进酿酒酵母产大麻二酚酸的产量的方法，是：

(1)对表达大麻二酚酸合成酶能够合成CBDA的重组酵母采用权利要求2中(a)～(k) 任一所述的改造，或者，

(2)将大麻二酚酸合成酶利用或不利用linker与标签蛋白进行融合表达，所述标签蛋白是TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP或mCherry，或者，

(3)组合使用(1)、(2)。

本发明还提供了所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚酸中的应用，包括以下步骤：

(1)活化培养重组酿酒酵母，并培养得到重组酿酒酵母种子液，

(2)将重组酿酒酵母种子液转接到合适产大麻二酚的培养基中，在适宜条件下培养重组酿酒酵母使之产大麻二酚酸。

本发明所述重组酿酒酵母还可以用于生产大麻二酚，具体地，在本发明重组酿酒酵母中表达脱羧酶，将大麻二酚酸脱羧得到大麻二酚，或者，将本发明重组酿酒酵母生产得到的大麻二酚酸进行分离提纯，然后在体外利用酶催化剂或者化学催化剂进行脱羧得到大麻二酚。

[有益效果]

本发明以能够合成CBGA的酿酒酵母为出发菌株，选择性地敲除Pep4、Prb1、Mrs2、Der1，选择性地敲除Gal80并过表达Gal4，以及选择性地过表达Hac1、Fad1和Fmn1、Erv29，选择性地采用pGal1启动子表达CBDAS通过或不通过linker与不同标签蛋白(TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP、mCherry)的融合蛋白，优化了CBDAS编码基因的表达水平和CBDAS的酶活水平，以提高CBDA的产量。

附图说明

图1为大麻二酚酸在酿酒酵母中的合成途径；

图2为在产CBDA菌株ySC012的基础上，敲除空泡蛋白酶Pep4、过表达辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸酶Fad1和黄素单核苷酸酶Fmn1、过表达转录激活因子Hac1、以及敲除蛋白酶Prb1对于CBDA产率的影响。从图中可以看出，这些改造可以促进CBDA的积累。其中，敲除空泡蛋白酶Pep4、过表达辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸酶Fad1和黄素单核苷酸酶Fmn1、过表达转录激活因子Hac1这三类酶改造的叠加可以有效提高CBDA的积累。

图3为在产CBDA菌株ySC242的基础上，过表达辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸酶Fad1和黄素单核苷酸酶Fmn1、敲除Gal80过表达Gal4、敲除Mrs2、敲除Der1、以及过表达Erv29对于CBDA产率的影响。从图中可以看出，过表达辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸酶Fad1和黄素单核苷酸酶Fmn1、敲除Gal80过表达Gal4，这些改造后CBDA的积累明显提高。同时，ySC220 与ySC242的CBDA产量对比显示，CBDAS与蛋白的融合表达可以明显提高CBDA的积累。

图4为不同蛋白(TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP、mCherry)与CBDAS融合表达菌株的大麻二酚酸CBDA产率比较。在调控4类酶(转录激活因子Hac1、空泡蛋白酶Pep4、辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸Fad1和黄素单核苷酸Fmn1、敲除Gal80过表达Gal4)的表达的基础上， TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP、mCherry与CBDAS的融合表达都能实现CBDA的积累。

图5为不同linker融合表达DsRed.T3和CBDAS菌株的大麻二酚酸CBDA产率比较。在调控4类酶(转录激活因子Hac1、空泡蛋白酶Pep4、辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸Fad1和黄素单核苷酸Fmn1、敲除Gal80过表达Gal4)的表达的基础上，使用不同linker融合表达DsRed.T3和CBDAS的系列菌株，都实现了CBDA的生产。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

术语：

CBDAS是指，异源大麻二酚酸合成酶。

Pep4编码空泡蛋白酶，即蛋白酶A，可以激活其它一些蛋白酶的活性。

Fad1编码黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶，能够用于合成黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。

Fmn1编码核黄素激酶，能够用于合成黄素核苷酸(FMN)。

Prb1编码蛋白水解酶B，具有H3N端内肽酶活性。细胞内蛋白水解酶B的缺失可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。

Der1编码用于促进错误折叠多肽输出到细胞质的内质网膜蛋白。内质网是蛋白质合成和折叠的重要场所，在内质网中的蛋白质稳态由一套精细的质量控制系统调控。当新合成的蛋白质发生错误折叠时，它最终会被从内质网中逆向转运到细胞质，随后被多泛素化并降解，这是一种称为内质网相关蛋白降解(ERAD)的途径。在此过程中，负责跨膜运输的蛋白质通道由Der1和Hrd1这两个“半通道”组成。这两个“半通道”的共同作用，可以降低两侧都亲水的多肽环跨膜所遇到的能阻。

Mrs2编码线粒体镁离子转运蛋白，MRS2缺失会导致酵母线粒体镁离子浓度下降、线粒体内域型内含子剪接缺陷和非发酵碳源培养基上的生长缺陷。

Erv29编码COPII包被的内质网衍生的转运囊泡的成分。用于将一部分分泌蛋白有效运输到高尔基体。

pGal1是启动子，是编码半乳糖激酶的Gal1基因上游的600bp部分，Gal1基因的核苷酸序列是NC_001134.8(279021..280607)。

Gal80是参与抑制Gal基因的转录调节因子，Gal4受Gal80抑制。

Gal4编码转录激活蛋白GAL4，GAL4能识别基因启动子的上游激活序列(UASg)的17bp 长的一段序列：5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'(R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示任意脱氧核苷酸)。GAL4与GAL80作用，GAL80可结合半乳糖代谢产物。【GAL4/UAS是存在于酵母中的基因表达调控系统。UAS是upstream activating sequence的缩写。GAL4是转录调控因子，其Binding domain(BD)与UAS序列结合后，其Activity domain(AD)和promoter 区域结合，从而诱导基因的表达。GAL4/UAS系统已广泛应用于各种基因调控研究中。】

TrxA：硫氧还蛋白A。

MBP：麦芽糖结合蛋白。

DsRed.T3是一种红色荧光蛋白，来源于Discosoma sp.。

GFP：绿色荧光蛋白。

mCherry：一种红色荧光染料。

实验方法：

过表达，是指把基因上调表达，即该基因被过度的转录、翻译，终基因表达产物超过正常水平。

敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，令受体细胞基因组中特定的基因功能丧失作用。

下述实施例所用的PCR扩增方法、不同片段的融合方法、基因敲除及过表达方法可以采用本领域常见的技术手段，例如融合PCR、同源重组、CRISPR-Cas9技术。所用的酶、试剂盒均是可以购买的已经商业化的产品。

转化，是采用醋酸锂/PEG3350。下述实施例采用的转化方法是：先将宿主菌株在1×YPD 培养基中活化，30℃，200rpm培养过夜。然后接种到新的2×YPD培养基中使起始OD值为 0.2，30℃继续培养4-4.5h后，取5OD菌液，常温3000rcf，离心5min，弃上清，并用灭菌超纯水洗涤两次，获得酵母细胞；配制DNA混合物，每个构建取5OD的菌液获得细胞，并与50μLDNA混合物混合，使细胞重悬，50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH₂O混合而成。在悬浮的细胞中加入醋酸锂转化混合物，经培养后获取细胞，涂布到筛选平板上，获取单菌落，即为重组酿酒酵母，测序验证转化成功后，将重组酿酒酵母进行保存。

菌落PCR及测序验证：待筛选平板上长出单克隆菌落后，进行菌落PCR及测序验证，具体步骤是：用枪头挑取少量细胞分别置于20μL 20mmol/L NaOH溶液，涡旋混匀，于金属浴95℃孵育20min，涡旋混匀，取1μL菌液作为模板进行菌落PCR反应，反应引物为引物7 和引物8，比对克隆条带与阴性克隆条带大小，挑选菌落PCR阳性克隆的菌液送致金唯智公司进行测序验证。测序正确的菌株进行划线保存和甘油冻存。

重组酿酒酵母菌株的培养：单菌落在3ml 1×YPD 24孔板30℃200rpm摇床中过夜培养 16h后，过夜菌液用1×YPD稀释10倍后用紫外分光光度计检测菌液OD，波长设置为600nm。然后使起始OD为0.2转接至3mL 1×YPG培养液中培养。培养方式为：转接后，每隔24h 添加10μL 0.1M OA，300μL 20％半乳糖。培养72h后收集200μL菌液为样品。

重组酿酒酵母产CBDA的量的检测方法：样品收集后，根据样品OD₆₀₀，先用破壁酶2U/OD于30℃，200rpm摇床温育处理60min，然后加入0.2mL体积0.5mm玻璃珠和0.4ml 的乙酸乙酯：甲酸(0.05％)，在高速组织研磨仪中，以65Hz处理180s，间隔30s，重复三次，每次处理后将研磨托盘置于冰上冷却1min，震荡15-30s，瞬时离心后，取上层有机层 0.28mL至1.5mL离心管中，重复两次，并将收集的上层有机相合并。三次提取的有机层，Evaporation,mode V-AL,45℃1h挥干至无溶剂残留，用重悬液AHF(乙腈：H₂O：甲酸＝80:20:0.05％,含内标PHB(对羟基苯甲酸丙酯溶液标准物质，15μM)140μL重悬，0.22μm PVDF滤膜过滤至液相检测瓶内插管中，作为检测样品。每种样品三个平行。样品准备好之后，用HPLC进行检测，检测条件见表1。

表1：HPLC检测条件

2×YPD培养基配方：酵母浸膏20.0g/L，蛋白胨40.0g/L，葡萄糖40.0g/L。

醋酸锂转化混合物：50％W/V PEG3350 260μL，1mol/L LiOAc 36μL，变性鲑鱼精DNA 10μL(变性鲑鱼精DNA使用前先置于95℃金属浴变性5min)，ddH₂O 4μL。

缺少尿嘧啶的筛选平板配方：酵母氮源母液1.7g/L，硫酸铵5g/L，各种氨基酸如表1所示，琼脂20g/L，葡萄糖20g/L，注：葡萄糖分开灭菌。

表2筛选平板中各种氨基酸的含量

下述实施例所用的菌株yCAN31的基因信息如下表3所示。

表3 yCAN31的基因信息

实施例1构建表达大麻二酚酸合成途径的酿酒酵母ySC012

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母CEN.PK2-1C的基因组为模板，使用表3中的引物1和引物2扩增获得整合位点上游同源臂416d-Up片段，使用引物3和引物4扩增获得整合位点下游同源臂416d-Down片段；以酿酒酵母CEN.PK2-1C的基因组为模板，通过PCR扩增得到启动子pGal1、终止子tADH1 的片段，以合成的CBDAS基因(SEQ ID NO:1)为模板，通过PCR扩增得到416d-Up -pGal1-CBDAS-tADH1-416d-Down表达盒片段。然后将416d-Up -pGal1-CBDAS-tADH1-416d-Down表达盒片段转化到宿主酿酒酵母yCAN31(Luo et al.报道的产CBGA菌株)中，获得菌株ySC012。表4中的引物5和引物6用于对菌株ySC012进行PCR 反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC012，并检测CBDA的含量，如图2所示，出发菌株yCAN31不产CBDA，而表达了CBDAS的重组菌株ySC012的CBDA的含量为9.72μM。

表4构造CBDAS表达菌株引物序列

引物序号	碱基序列
			1	GTCGTGGCAAGAATACCAA	SEQ ID NO:14
2	GGCCAGGTTACTGCCAAT	SEQ ID NO:15
			3	GCGAATTTCTTATGATTTATG	SEQ ID NO:16
4	ATTTTTCAATTGAGGAAACTTGAAAGGTGT	SEQ ID NO:17
			5	TGGCTTTTTGATTGATTGTACAGGA	SEQ ID NO:18
6	TCGCAATAATCTATATGCTCACCAA	SEQ ID NO:19

实施例2在产大麻二酚酸菌株ySC012基因组中过表达辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸Fad1 基因和黄素单核苷酸Fmn1基因，构建Fad1和Fmn1过表达菌株ySC044

以酿酒酵母ySC012的基因组为模板，通过2×Phanta Max Master Mix(PhantaDNA聚合酶)，使用表5的引物1和引物2扩增获得整合的整合位点上游同源臂与Fad1基因表达盒 Up-Fad1片段，使用表5的引物3和引物4扩增获得整合的整合位点下游同源臂与Fmn1基因表达盒Fmn1-Down片段。进行PCR扩增来整合片段。然后将整合的片段转化到宿主酿酒酵母ySC012中，获得菌株ySC044。表5的引物5和引物6用于对菌株ySC044进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC044，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC044的CBDA的含量为28.15μM。

表5过表达FAD1和FMN1引物序列

引物序号	碱基序列
			1	TTTGCACATAAAGGGTGCCTTCA	SEQ ID NO:20
2	AAAGTGCCCTCGGCAAAAG	SEQ ID NO:21
			3	GTACGGTTTAACGGAGG	SEQ ID NO:22
4	AAACCAATAACTTATAACAACATAGCGGC	SEQ ID NO:23
			5	CGACGGCTATAAAAGGAAGTTTTCC	SEQ ID NO:24
6	GAAGCCAAAGCAGCAATAGCAG	SEQ ID NO:25

实施例3在产大麻二酚酸菌株ySC012基因组中敲除空泡蛋白酶Pep4基因，得到重组酿酒酵母ySC207

通过2xPhanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母ySC012基因组为模板，使用表6中的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Pep4-Up片段，使用表6中的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Pep4-Down片段。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC012中，获得菌株ySC207。表6中的引物1和引物4用于对菌株 ySC207进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC207，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC207中的CBDA的含量为14.42μM。

表6敲除Pep4引物序列

引物序号	碱基序列
			1	CCTTGAAGTTTTGAGGTGGAGTA	SEQ ID NO:26
2	TCCGAAACTAGGCAGCGTAAACACGAGTTGTCCGATGA	SEQ ID NO:27
			3	CGCTGCCTAGTTTCGGATCAAGCTGAACATGTTAGTTTTGG	SEQ ID NO:28
4	CTGCTATTTATTCATTCCACCTTCT	SEQ ID NO:29

实施例4在产大麻二酚酸菌株ySC012基因组中采用pTDH3启动子过表达转录激活因子HAC1以构建ySC220

替换Hac1启动子，构建菌株ySC220。通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母ySC012基因组为模板，使用表7的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Hac1s-Up片段，使用表7的引物3/4及5/6融合扩增获得下游同源臂Hac1s-Down片段。使用表7的引物7和引物8扩增出片段pTDH3。然后将片段的组合 pTDH3-Hac1s-tHac1转化到宿主酿酒酵母ySC012中，获得菌株ySC220。表7的引物1和引物6用于对重组酿酒酵母进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。验证正确后，菌株ySC220构建成功，作为替换Hac1启动子的宿主菌。

培养ySC220，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC220中的CBDA的含量为15.96μM。

表7替换Hac1启动子引物序列

实施例5在重组酿酒酵母ySC220基因组中敲除Pep4以构建ySC221

将实施例3中的Pep4-Up、Pep4-Down作为插入片段转化至酿酒酵母ySC220中，获得敲除Pep4基因的重组酿酒酵母ySC221。

培养ySC221，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC221中的CBDA的含量为34.26μM。

实施例6在重组酿酒酵母ySC221基因组中过表达Fad1和Fmn1以构建ySC222

将实施例2中的Up-Fad1、Fmn1-Down作为插入片段转化至酿酒酵母ySC221中，获得调控Fad1和Fmn1表达水平的重组酿酒酵母ySC222。

培养ySC222，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC222中的CBDA的含量为53.26μM。

实施例7在重组酿酒酵母ySC222基因组中敲除Prb1以构建ySC223

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以初始酿酒酵母ySC222基因组为模板，使用表8的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Prb1-Up 片段，使用表8的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Prb1-Down片段。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC222中，获得菌株ySC223。表8的引物1和引物4用于对菌株ySC223进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC223，并检测CBDA的含量，如图2所示，ySC223中的CBDA的含量为43.57μM。

表8敲除Prb1引物序列

实施例8重组菌株ySC242的构建

将实施例4中的Hac1s-Up、Hac1s-Down和pTDH3片段，以及实施例1中的416d-Up片段、416d-Down片段和pGal1-mCherry-CBDAS-tADH1表达盒片段(以ySC012的基因组和合成的mCherry基因为模板扩增)作为插入片段转化至yCAN31中，获得ySC242。

培养ySC242，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC242中的CBDA的含量为67.77μM，是ySC220(15.96μM)产量的4.2倍。

实施例9在产大麻二酚酸菌株ySC242基因组中敲除Gal80并过表达Gal4

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以初始酿酒酵母ySC012的基因组为模板，使用表9的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Gal80-Up 片段，使用表9的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Gal80-Down片段；以经过序列优化的Gal4质粒为模板，使用表9的引物5和引物6通过PCR扩增得到Gal4表达盒片段。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC242中，获得菌株ySC257。表9的引物7和引物8用于对菌株ySC257进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC257，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC257中的CBDA的含量为94.33μM。

表9改造Gal80引物序列

引物序号	碱基序列
			1	AAGACGGGTCGGATACCTG	SEQ ID NO:42
2	CAATAGAGCACCTGGCAGTCATCTCGACGGGAGTGGAAAGAACG	SEQ ID NO:43
			3	CTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCTAAGCATCTTGCCCTGTG	SEQ ID NO:44
4	GGCTAGATTATTCTCAGGA	SEQ ID NO:45
			5	GTTTCCCGTTCTTTCCACTCCCGTCGAGATGACTGCCAGGTGCT	SEQ ID NO:46
6	GGGCCAAGCACAGGGCAAGATGCTTAGAGCGACCTCATGCTATACC	SEQ ID NO:47
			7	TGTCTGCTACATTCATAATAACCA	SEQ ID NO:48
8	TTTGACAGTTATACGTAGCAT	SEQ ID NO:49

实施例10在产大麻二酚酸菌株ySC242基因组中过表达Fad1和Fmn1以构建重组菌株 ySC287

将实施例2中的Up-Fad1、Fmn1-Down作为插入片段转化至酿酒酵母ySC242中，获得调控Fad1和Fmn1表达水平的重组酿酒酵母ySC287。

培养ySC287，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC287中的CBDA的含量为77.99μM。

实施例11重组菌株ySC342的构建

将实施例9中的Gal80-Up、Gal80-Down和Gal4表达盒片段作为插入片段转化至酿酒酵母ySC287中，获得重组酿酒酵母ySC342。

培养ySC342，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC342中的CBDA的含量为38.43μM。

实施例12在产大麻二酚酸菌株ySC342基因组中敲除Der1构建重组菌株ySC349

通过2xPhanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以初始酿酒酵母ySC012基因组为模板，使用表10的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Der1-Up片段，使用表10的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Der1-Down片段。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC342中，获得菌株ySC349。表10的引物1和引物4用于对菌株 ySC302进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC349，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC349中的CBDA的含量为30.42μM。

表10敲除Der1引物序列

实施例13在产大麻二酚酸菌株ySC342基因组中敲除Mrs2构建重组菌株ySC357

通过2xPhanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以初始酿酒酵母ySC012基因组为模板，使用表11的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Mrs2-Up片段，使用表11的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Mrs2-Down片段。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC342中，获得菌株ySC357。表11的引物1和引物4用于对菌株 ySC357进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC284，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC357中的CBDA的含量为40.01μM。

表11敲除Mrs2引物序列

实施例14在敲除Mrs2的基础上过表达Erv29

通过2xPhanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以初始酿酒酵母ySC357的基因组为模板，使用表12的引物1和引物2扩增获得上游同源臂Mrs2-Up 片段，使用表12的引物3和引物4扩增获得下游同源臂Mrs2-Down片段；以ySC357的基因组为模板，使用表12的引物5和引物6通过PCR扩增得到Erv29表达盒片段。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC357中，获得菌株ySC359。表12的引物7和引物8用于对菌株ySC359进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

培养ySC359，并检测CBDA的含量，如图3所示，ySC359中的CBDA的含量为34.46μM。

表12改造Erv29引物序列

引物序号	碱基序列
			1	GATACAGCATGTCCTCCGCTATT	SEQ ID NO:58
2	CTTAATATACATGGGACGAAAAGCGGATAATAGTACGCCGATTCATGAG	SEQ ID NO:59
			3	ATCGCACAGAATTCCCTTGTATTATAGGACAGTCAATAGCGGTTGGGAG	SEQ ID NO:60
4	AGTTTGCTGCTGATTTGGATGC	SEQ ID NO:61
			5	CATCTCATGAATCGGCGTACTATTATCCGCTTTTCGTCCCATGTAT	SEQ ID NO:62
6	CACTCCCAACCGCTATTGACTGTCCTATAATACAAGGGAATTCTGTG	SEQ ID NO:63
			7	GCATTGCCCGCCATCAG	SEQ ID NO:64
8	TTTCCAAATCATATCTCTGTTCTGC	SEQ ID NO:65

实施例15构造酿酒酵母ySC340

ySC340：过表达转录激活因子Hac1基因、敲除空泡蛋白酶Pep4基因、过表达辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸Fad1基因和黄素单核苷酸Fmn1基因、以及敲除Gal80基因并在该位点过表达Gal4基因。

将实施例2中的Up-Fad1、Fmn1-Down片段，实施例3中的Pep4-Up、Pep4-Down片段，实施例4中的Hac1s-Up、Hac1s-Down(pTDH3)和pTDH3片段，实施例9中的Gal80-Up、 Gal80-Down和Gal4表达盒片段转化至yCAN31中，获得优化酿酒酵母内源性基因表达的重组菌株ySC340。

培养ySC340(未表达CBDAS基因)，并检测CBDA的含量，结果表明，没有表达CBDAS基因，ySC340中的CBDA的含量为0μM。

实施例16在完成以上各类酶的改造的基础上构造不同蛋白 (TrxA/MBP/DsRed.T3/GFP/mCherry)与CBDAS融合表达菌株

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。以酿酒酵母ySC012的基因组为模板，使用表13的引物1和引物2扩增获得上游同源臂416d-Up片段，使用表13的引物3和引物4扩增获得下游同源臂416d-Down片段；以酿酒酵母ySC012的基因组和合成的TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP、mCherry基因为模板，通过PCR扩增得到不同蛋白(TrxA/MBP/DsRed.T3/GFP/mCherry)-CBDAS表达盒片段(TrxA-CBDAS、 MBP-CBDAS、DsRed.T3-CBDAS、GFP-CBDAS、mCherry-CBDAS)。然后将片段的组合转化到宿主酿酒酵母ySC340中，获得系列菌株ySC344、ySC345、ySC346、ySC347、ySC348。表13的引物5和引物6用于对系列菌株ySC344-348进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

经检测，如图4所示，ySC344、ySC345、ySC346、ySC347、ySC348中的CBDA的含量分别为39.83、19.66、77.40、52.98、51.77μM。

表13构造不同蛋白融合CBDAS引物序列

实施例17在完成以上各类酶的改造的基础上利用linker构造DsRed.T3-CBDAS菌株

通过2×Phanta Max Master Mix(Phanta DNA聚合酶)进行PCR扩增整合片段。

以酿酒酵母ySC012的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂416d-Up片段；

以酿酒酵母ySC012的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂416d-Down片段；

以酿酒酵母ySC346的基因组为模板，通过PCR扩增得到不同linker连接的DsRed.T3-CBDAS表达盒片段；

将416d-Up、不同linker连接的DsRed.T3-CBDAS表达盒片段、416d-Down作为插入片段转化至酿酒酵母ySC340中，获得调控CBDAS表达水平的系列重组酿酒酵母ySC366、ySC384、ySC385、ySC386、ySC387、ySC388、ySC389。

表14的引物5和引物6用于对系列菌株ySC366、ySC384-389进行PCR反应，获得菌落PCR阳性克隆的菌液，用于基因测序。

表14构造DsRed.T3-CBDAS引物序列

引物序号	碱基序列
			1	GTCGTGGCAAGAATACCAA	SEQ ID NO:72
2	GGCCAGGTTACTGCCAAT	SEQ ID NO:73
			3	GCGAATTTCTTATGATTTATG	SEQ ID NO:74
4	ATTTTTCAATTGAGGAAACTTGAAAGGTGT	SEQ ID NO:75
			5	TGGCTTTTTGATTGATTGTACAGGA	SEQ ID NO:76
6	TCGCAATAATCTATATGCTCACCAA	SEQ ID NO:77

如图5所示，ySC346、ySC366、ySC 384、ySC385、ySC386、ySC 387、ySC 388、ySC389、中的CBDA的含量分别为77.40、136.72、70.34、52.55、59.53、69.48、59.80、49.98μM。

表15为菌株构建信息

综上所述，结合图2-5可以看出，本发明通过调控酵母细胞内源转录激活因子Hac1、空泡蛋白酶Pep4、辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸Fad1和黄素单核苷酸Fmn1、Gal80与Gal4蛋白的表达，达到优化CBDAS表达的效果。改造后的工程菌株可以合理地在整个合成通路中利用中间产物CBGA生成目标产物CBDA，实现了大麻素前体大麻萜酚酸CBGA向大麻二酚酸 CBDA的转化。本发明通过在酵母中通过调控各类酶的表达，改善CBGA的积累以及其向CBDA的转化，对CBDA的生物合成具有十分重要的意义。

实施例18实施例1-17构建的重组酿酒酵母在生产大麻二酚中的应用

在实施例1-17构建的重组酿酒酵母中进一步表达脱羧酶，使大麻二酚酸脱羧得到大麻二酚。或者，将利用实施例1-17构建的重组酿酒酵母生产得到的大麻二酚酸经过热处理脱羧得到大麻二酚。

SEQUENCE LISTING

<110> 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司

<120> 一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用

<130> IBAA211538A

<160> 77

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaactgtt ccgcattctc tttttggttt gtctgtaaaa tcatcttttt cttcttgagc 60

tttaacattc aaatcagtat cgctaatcca agagaaaatt tcttgaagtg tttttctcag 120

tatatcccga ataatgcgac gaaccttaag ttagtataca ctcagaacaa ccctctatat 180

atgagcgttc taaattctac aatccacaac ctaagattta cgtccgacac gactccgaaa 240

cccctagtta tagtgacacc gtcacatgtt agccatatac agggcaccat actatgttcc 300

aaaaaagttg ggttacaaat acgtacccgt agcgggggac acgacagtga ggggatgagt 360

tatattagtc aggtgccttt cgtcatagtg gatttaagaa atatgaggtc aattaaaatc 420

gacgttcact cacaaactgc ctgggttgag gcgggggcca cattgggtga agtatattac 480

tgggtcaatg agaagaacga gaatctttca ctagcagccg gttattgtcc cacagtctgc 540

gccggcggtc actttggcgg cggcggatac ggtcccttaa tgagaaatta cgggcttgcc 600

gcagacaata tcatagatgc tcacttagtt aatgttcatg gaaaagtgtt agaccgtaaa 660

agcatggggg aggatctgtt ttgggcgctt agagggggag gggcagaatc atttggaata 720

atagtggcat ggaaaatcag gcttgtggct gttccaaaga gtaccatgtt ctcagtaaag 780

aaaataatgg agatccatga gctagttaaa cttgtgaata aatggcaaaa catagcctat 840

aaatatgata aggacttgct gcttatgact catttcataa ccagaaacat tacggataac 900

caagggaaga acaaaacagc catccatacc tactttagct ccgttttctt gggtggtgta 960

gacagcttag ttgacctgat gaacaagagt tttccggaac taggtatcaa gaagacagat 1020

tgtagacaac tttcctggat tgataccata atcttttaca gcggagtcgt caattatgac 1080

actgacaact tcaacaagga aattttatta gataggagtg cgggtcaaaa tggggccttc 1140

aagatcaaac tagactacgt taaaaaaccc attcctgaaa gtgtttttgt tcagattctg 1200

gagaagctgt atgaagaaga tattggcgcg gggatgtacg ctctttatcc gtacggcggc 1260

ataatggatg agattagtga aagcgccatc cctttccccc acagagctgg tatcctgtac 1320

gagttgtggt atatctgctc ctgggagaaa caggaggata acgaaaagca cttaaattgg 1380

attaggaata tctacaattt catgacgccc tacgtttcca agaaccccag gttggcctat 1440

ttgaactaca gggatcttga tattggaatc aacgacccca aaaacccaaa caactacacc 1500

caggcaagga tttggggaga gaagtacttc gggaagaact tcgacaggct agttaaggtg 1560

aaaacgctag ttgatccaaa taattttttc agaaacgaac agagtatccc tcccttaccg 1620

cgtcataggc actaa 1635

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctggtggag gcggtggagg ctctaga 27

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggtg gctcg 45

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggttctgctg gatctgctgc cggttctgga gaattt 36

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatccggtt ctggtggatc c 21

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcttctggag gtagcggtgg ttccggaggt tcggctggc 39

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagccgctg caaaagaagc tgccgcaaaa gaggcggcag ctaag 45

<210> 8

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcagaagccg cggcaaaaga ggcagctgct aaagaggctg cagccaaaga agctgccgcc 60

aaagcattgg aagcagaagc agctgcaaag gaagctgccg ctaaggaggc tgccgctaag 120

gaagctgcgg cgaaagct 138

<210> 9

<211> 109

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 9

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala

100 105

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 10

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr

355 360 365

<210> 11

<211> 225

<212> PRT

<213> Discosoma sp.

<400> 11

Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Arg Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Pro Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 12

<211> 238

<212> PRT

<213> 水母

<400> 12

Met Gly Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 13

<211> 235

<212> PRT

<213> 珊瑚

<400> 13

Met Arg Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met

1 5 10 15

Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu

20 25 30

Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala

35 40 45

Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile

50 55 60

Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro

65 70 75 80

Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys

85 90 95

Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr

100 105 110

Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu

115 120 125

Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr

130 135 140

Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala

145 150 155 160

Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His

165 170 175

Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln

180 185 190

Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His

195 200 205

Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg

210 215 220

His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcgtggcaa gaataccaa 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggccaggtta ctgccaat 18

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcgaatttct tatgatttat g 21

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atttttcaat tgaggaaact tgaaaggtgt 30

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tggctttttg attgattgta cagga 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcgcaataat ctatatgctc accaa 25

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tttgcacata aagggtgcct tca 23

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aaagtgccct cggcaaaag 19

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtacggttta acggagg 17

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aaaccaataa cttataacaa catagcggc 29

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cgacggctat aaaaggaagt tttcc 25

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaagccaaag cagcaatagc ag 22

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccttgaagtt ttgaggtgga gta 23

<210> 27

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tccgaaacta ggcagcgtaa acacgagttg tccgatga 38

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgctgcctag tttcggatca agctgaacat gttagttttg g 41

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctgctattta ttcattccac cttct 25

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gggaaaatgc ttgatgagtt agg 23

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

agtggcggtt gttgtcgt 18

<210> 32

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tcgaataaac acacataaac aaacaaaatg gaaatgactg attttgaact aact 54

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctggattacg ccaattgtca agat 24

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cttgacaatt ggcgtaatcc agaagcgcag tcaggtttga 40

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gtcttcaacc agtgcgatta t 21

<210> 36

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

acgacaacaa ccgccacttt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctg 47

<210> 37

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

agttagttca aaatcagtca tttccatttt gtttgtttat gtgtgtttat tcga 54

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aaacaacttc aaaagaaccc tc 22

<210> 39

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

actaaaccta attctaacaa gcaaagttct tcatttagaa aaatttcagc tg 52

<210> 40

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gctgaaattt ttctaaatga agaactttgc ttgttagaat taggtttagt ttg 53

<210> 41

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

taggctgtgc cgacat 16

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aagacgggtc ggatacctg 19

<210> 43

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

caatagagca cctggcagtc atctcgacgg gagtggaaag aacg 44

<210> 44

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ctcaggtata gcatgaggtc gctctaagca tcttgccctg tg 42

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ggctagatta ttctcagga 19

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gtttcccgtt ctttccactc ccgtcgagat gactgccagg tgct 44

<210> 47

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gggccaagca cagggcaaga tgcttagagc gacctcatgc tatacc 46

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tgtctgctac attcataata acca 24

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tttgacagtt atacgtagca t 21

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aactttatga tgatttgcga gagta 25

<210> 51

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ccccagtaac ctcaggaacg tgacaactac ttttctttag cttttcttct gttggtga 58

<210> 52

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cgttcctgag gttactgggg acaagggaac actgaaacac cctaaaggaa ag 52

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

accttcccct catttttgta cg 22

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gatacagcat gtcctccgct att 23

<210> 55

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tgtcctccaa ttatttgttt cacaaggata atagtacgcc gattcatgag atgct 55

<210> 56

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gtgaaacaaa taattggagg acagtcaata gcggttggga gtgctact 48

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

agtttgctgc tgatttggat gc 22

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gatacagcat gtcctccgct att 23

<210> 59

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

cttaatatac atgggacgaa aagcggataa tagtacgccg attcatgag 49

<210> 60

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

atcgcacaga attcccttgt attataggac agtcaatagc ggttgggag 49

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

agtttgctgc tgatttggat gc 22

<210> 62

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

catctcatga atcggcgtac tattatccgc ttttcgtccc atgtat 46

<210> 63

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

cactcccaac cgctattgac tgtcctataa tacaagggaa ttctgtg 47

<210> 64

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gcattgcccg ccatcag 17

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

tttccaaatc atatctctgt tctgc 25

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gtcgtggcaa gaataccaa 19

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

ggccaggtta ctgccaat 18

<210> 68

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gcgaatttct tatgatttat g 21

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

atttttcaat tgaggaaact tgaaaggtgt 30

<210> 70

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

tggctttttg attgattgta cagga 25

<210> 71

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

tcgcaataat ctatatgctc accaa 25

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

gtcgtggcaa gaataccaa 19

<210> 73

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ggccaggtta ctgccaat 18

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

gcgaatttct tatgatttat g 21

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

atttttcaat tgaggaaact tgaaaggtgt 30

<210> 76

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

tggctttttg attgattgta cagga 25

<210> 77

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

tcgcaataat ctatatgctc accaa 25

Claims

1.一种重组酿酒酵母，表达合成大麻萜酚酸途径的酶、能够合成大麻萜酚酸，其特征在于，表达大麻二酚酸合成途径中的大麻二酚酸合成酶，部分内源性基因被过表达或敲除，所述部分内源性基因包括：Fad1、Fmn1、Hac1、Pep4、Prb1、Mrs2、Gal80、Gal4、Erv29、Der1；

所述部分内源性基因被过表达或敲除是（a）~（f）任一种：

（a）同时过表达Fad1、Fmn1、Hac1，敲除Pep4，

（b）在（a）的基础上，敲除Prb1，

（c）过表达Fad1、Fmn1，敲除Pep4、Mrs2、敲除Gal80、过表达Gal4，

（d）过表达Fad1、Fmn1，敲除Pep4、Mrs2、敲除Gal80、过表达Gal4、过表达Erv29，

（e）过表达Fad1、Fmn1、Hac1、Gal4，敲除Pep4、Der1、Gal80，

（f）过表达Fad1、Fmn1、Hac1，敲除Pep4、Gal80、过表达Gal4。

2. 根据权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述编码大麻二酚酸合成酶的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1或2所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，表达大麻二酚酸合成酶是指将编码基因插入到酿酒酵母基因组上、通过内源性pGal1启动子启动表达。

4.根据权利要求1或2所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶通过或不通过linker与标签蛋白进行融合表达。

5.根据权利要求3所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶通过或不通过linker与标签蛋白进行融合表达。

6. 根据权利要求4所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述linker的序列如SEQID NO:2~ SEQ ID NO:8任一所示。

7. 根据权利要求5所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述linker的序列如SEQID NO:2~ SEQ ID NO:8任一所示。

8.根据权利要求4所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述标签蛋白是TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP或mCherry。

9.根据权利要求5所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述标签蛋白是TrxA、MBP、DsRed.T3、GFP或mCherry。

10.构建权利要求1~9任一所述重组酿酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）PCR扩增得到需要过表达的基因的表达盒，整合到酿酒酵母基因组上；或者，PCR扩增得到用于敲除基因的同源片段，用同源片段替换酿酒酵母基因组上的待敲除基因；

（2）筛选获得阳性克隆。

11.权利要求1~9任一所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚酸中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）活化培养重组酿酒酵母，并培养得到重组酿酒酵母种子液，

（2）将重组酿酒酵母种子液转接到合适产大麻二酚酸的培养基中，在适宜条件下培养重组酿酒酵母使之产大麻二酚酸。

13.权利要求1~9任一所述重组酿酒酵母在生产大麻二酚中的应用。