CN113151024A - 一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株，属于生物工程技术领域。本发明以酿酒酵母为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在酿酒酵母中引入来源于伸长盐单胞菌的ectABC基因簇，再进行ectA、ectB、ectC单基因RBS优化、启动子优化以及单基因RBS和启动子双优化等策略，实现了高效生物合成四氢嘧啶。本发明构建的酿酒酵母重组菌在摇瓶上培养96h四氢嘧啶积累量高达2.3g/L，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株，属于生物工程技术领域。
背景技术
四氢嘧啶(Ectoine)是一种极性、易溶、生理pH范围内不带电荷的小分子有机物。研究表明，四氢嘧啶是好氧中度嗜盐细菌中最常见的渗透压调控物；对蛋白质的构象和活性有积极的影响，可以提高它们的功能性；对细菌细胞处于极端环境(干旱、冷冻、高盐碱、高温、射线等)中的核酸、蛋白质、酶等起到保护作用；广泛应用于医药，化妆品，酶工业等领域。
四氢嘧啶的合成主要有两种方法：化学合成法和生物合成法。其中，生物合成法主要采用酶催化法和发酵法。化学合成法存在着很多问题，包括生产过程复杂，合成产率低，副产物多且与目标产物的化学性质相似，下游分离纯化难度很高等。酶催化法，需要诱导表达并提取酶，操作复杂，成本较高。传统发酵法常采用的是一种叫做“细菌挤奶”的方法，通过循环控制培养环境中盐浓度的增加与降低来分别实现Halomonas elongata中四氢嘧啶的合成与分泌。该方法存在高盐的发酵废液对生产设备腐蚀严重，对环境压力大等缺点。此外，现有技术也有公开产四氢嘧啶的重组大肠杆菌，但该基因工程菌的构建依赖于具有特定基因型的大肠杆菌，同时该类菌为氨基酸缺陷型菌，一定程度上会抑制菌体生长，给菌体造成一定的压力，进而影响四氢嘧啶的生产。
酵母作为单细胞真核微生物，菌体培养和基因操作相对容易。同时，酵母无内毒素，因此，酵母在分子改造方面获得了广泛的应用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在现代分子和细胞生物学中被用作真核模式生物，具有遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，是发酵合成四氢嘧啶的优势平台。
发明内容
本发明的第一个目的是提供四氢嘧啶合成基因簇(ectABC)的DNA分子，含有SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供携带所述DNA分子的重组表达载体。
在一种实施方式中，所述重组表达载体为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS。
在一种实施方式中，所述pEBS的构建方法公开于论文Yang S,Liu Q,Zhang Y,etal.Construction and Characterization of Broad-spectrum Promoters forSynthetic Biology.[J].Acs Synthetic Biology,2017,7(1):287-291.中。
本发明的第三个目的是提供一种产四氢嘧啶的酿酒酵母，所述酿酒酵母表达SEQID NO.1所示的ectABC基因簇。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母宿主为S.cerevisiae CEN.PK2-1C。
在一种实施方式中，所述ectABC基因簇进行了RBS优化，所述RBS优化是采用SEQID NO.2～4任一所示的核苷酸序列替换ectABC基因簇中ectA、ectB或ectC的RBS序列。
在一种实施方式中，所述ectABC基因簇进行了启动子优化，所述启动子优化是采用SEQ ID NO.5～7任一所示的核苷酸序列替换ectABC基因簇中ectA、ectB或ectC的启动子序列。
在一种实施方式中，ectA基因通过SEQ ID NO.5所示的启动子调控表达。
在一种实施方式中，ectB基因通过SEQ ID NO.5所示的启动子调控表达，且ectB基因上游还融合SEQ ID NO.4所示的RBS序列。
本发明的第四个目的是提供所述酿酒酵母在生产四氢嘧啶中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述酿酒酵母在培养基中，于28～35℃发酵至少24h。
在一种实施方式中，发酵培养基组分为(g/L)：酵母粉10；蛋白胨20；葡萄糖40；磷酸钾缓冲液100mmol/L，pH6.0，MnSO4 2，100×氨基酸混合液10ml/L；其中100×氨基酸混合液为：L-组氨酸，L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸各0.5g共同溶于100ml水中，过滤除菌。
有益效果：本发明以酿酒酵母为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，引入来源于伸长盐单胞菌的ectABC基因簇，再进行ectA，ectB，ectC单基因RBS优化、启动子优化以及单基因RBS和启动子双优化等策略，实现了高效生物合成四氢嘧啶。本发明能够使酿酒酵母重组菌在摇瓶上培养96h四氢嘧啶积累量高达2.3g/L，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。
附图说明
图1所示为伸长盐单胞菌来源的ectABC基因簇表达的构建示意图；
图2所示为ectA,ectB,ectC单基因RBS优化、启动子优化示意图；
图3所示为单基因RBS和启动子双优化示意图。
具体实施方式
实施例涉及的核苷酸序列信息：
(1)SEQ ID NO.1序列信息为来源于伸长盐单胞菌的ectABC基因簇密码子优化后核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.2序列信息为RBS1(R1)核苷酸序列；
(3)SEQ ID NO.3序列信息为RBS2(R2)核苷酸序列；
(4)SEQ ID NO.4序列信息为RBS3(R3)核苷酸序列；
(5)SEQ ID NO.5序列信息为组成型启动子cyc100-1(P1)核苷酸序列；
(6)SEQ ID NO.6序列信息为组成型启动子cyc100-2(P2)核苷酸序列；
(7)SEQ ID NO.7序列信息为组成型启动子cyc100-3(P3)核苷酸序列；
样品的处理及高效液相色谱(HPLC)法分析四氢嘧啶产量：取1mL发酵液离心(13000rpm，2min)，将获得的上清使用超纯水稀释适当倍数，再经0.22μm的水系微孔滤膜过滤后打入液相瓶中待测；沉淀用等体积去离子水悬浮后进行超声破碎，将裂解物离心(13000rpm，2min)，裂解后的上清经0.22μm的水系微孔滤膜过滤后打入液相瓶中待测，四氢嘧啶产量为胞内和胞外四氢嘧啶含量之和。
HPLC检测条件：使用Agilent 1260高效液相色谱仪测定样品中的四氢嘧啶。设置进样量为5μL，色谱柱为ODS-2C18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速0.6mL/min，紫外检测波长210nm。测量析出四氢嘧啶峰面积。以四氢嘧啶标准品标定各菌株产量。
发酵培养基(g/L)：酵母粉10；蛋白胨20；葡萄糖40；磷酸钾缓冲液100mmol/L，pH6.0，MnSO4 2，100×氨基酸混合液10ml/L。
其中100×氨基酸混合液为：L-组氨酸，L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸各0.5g共同溶于100ml水中，过滤除菌。
表1引物序列
实施例1构建单独优化ectA,ectB,ectC基因或其RBS序列的重组载体
表达系统的构建：以Halomonas elongata基因组为模板，使用引物s-ect-F/s-ect-R通过PCR扩增出ectABC基因簇的DNA片段(如SEQ ID NO.1所示)，将所得的DNA片段与用引物pEBS-F/pEBS-R扩增pEBS(所述pEBS的构建方法公开于论文Yang S,Liu Q,Zhang Y,et al.Construction and Characterization of Broad-spectrum Promoters forSynthetic Biology.[J].Acs Synthetic Biology,2017,7(1):287-291.中)的pEBS骨架组装以产生pEBS-ectABC。以pEBS-ectABC为模板，分别使用引物R1A-F/R1A-R，R2A-F/R2A-R，R3A-F/R3A-R，P1A-F/P1A-R，P2A-F/P2A-R，P3A-F/P3A-R，R1B-F/R1B-R，R2B-F/R2B-R，R3B-F/R3B-R，P1B-F/P1B-R，P2B-F/P2B-R，P3B-F/P3B-R，R1C-F/R1C-R，R2C-F/R2C-R，R3C-F/R3C-R，P1C-F/P1C-R，P2C-F/P2C-R，P3C-F/P3C-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到pEBS-R1-ectABC，pEBS-R2-ectABC，pEBS-R3-ectABC，pEBS-P1-ectABC，pEBS-P2-ectABC，pEBS-P3-ectABC，pEBS-ectA-R1BC，pEBS-ectA-R2BC，pEBS-ectA-R3BC，pEBS-ectA-P1BC，pEBS-ectA-P2BC，pEBS-ectA-P3BC，pEBS-ectAB-R1C，pEBS-ectAB-R2C，pEBS-ectAB-R3C，pEBS-ectAB-P1C，pEBS-ectAB-P2C，pEBS-ectAB-P3C。
实施例2组合优化ectA,ectB,ectC基因RBS，启动子序列的重组质粒
以实施例1构建的pEBS-P1-ectABC为模板，分别使用引物R1A-F/R1P1-R，R2A-F/R2P1-R，R3A-F/R3P1-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-P1R1-ectABC，pEBS-P1R2-ectABC，pEBS-P1R3-ectABC。
以实施例1构建的pEBS-P2-ectABC为模板，分别使用引物R1A-F/R1P2-R，R2A-F/R2P2-R，R3A-F/R3P2-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-P2R1-ectABC，pEBS-P2R2-ectABC，pEBS-P2R3-ectABC。
以实施例1构建的pEBS-P3-ectABC为模板，分别使用引物R1A-F/R1P3-R，R2A-F/R2P3-R，R3A-F/R3P3-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-P3R1-ectABC，pEBS-P3R2-ectABC，pEBS-P3R3-ectABC。
以实施例1构建的pEBS-ectA-P1BC为模板，分别使用引物R1B-F/R1P1-R，R2B-F/R2P1-R，R3B-F/R3P1-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-ectA-P1R1BC，pEBS-ectA-P1R2BC，pEBS-ectA-P1R3BC。
以实施例1构建的pEBS-ectA-P2BC为模板，分别使用引物R1B-F/R1P2-R，R2B-F/R2P2-R，R3B-F/R3P2-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-ectA-P2R1BC，pEBS-ectA-P2R2BC，pEBS-ectA-P2R3BC。
以实施例1构建的pEBS-ectA-P3BC为模板，分别使用引物R1B-F/R1P3-R，R2B-F/R2P3-R，R3B-F/R3P3-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-ectA-P3R1BC，pEBS-ectA-P3R2BC，pEBS-ectA-P3R3BC。
以实施例1构建的pEBS-ectAB-P1C为模板，分别使用引物R1C-F/R1P1-R，R2C-F/R2P1-R，R3C-F/R3P1-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-ectAB-P1R1C，pEBS-ectAB-P1R2C，pEBS-ectAB-P1R3C。
以实施例1构建的pEBS-ectAB-P2C为模板，分别使用引物R1C-F/R1P21-R，R2C-F/R2P2-R，R3C-F/R3P2-R进行环化PCR扩增，再使用DpnⅠ消化后可得到启动子优化后的重组载体pEBS-ectAB-P2R1C，pEBS-ectAB-P2R2C，pEBS-ectAB-P2R3C。
以实施例1构建的pEBS-ectAB-P3C为模板，分别使用引物R1C-F/R1P3-R，R2C-F/R2P3-R，R3C-F/R3P3-R进行环化PCR扩增，消化后可得到pEBS-ectAB-P3R1C，pEBS-ectAB-P3R2C，pEBS-ectAB-P3R3C。
实施例3单独优化ectA,ectB,ectC基因RBS或启动子序列的重组菌的构建
重组菌的构建：向酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C单倍体感受态细胞中分别转入实施例1构建的线性化的重组质粒pEBS-R1-ectABC，pEBS-R2-ectABC，pEBS-R3-ectABC，pEBS-P1-ectABC，pEBS-P2-ectABC，pEBS-P3-ectABC，pEBS-ectA-R1BC，pEBS-ectA-R2BC，pEBS-ectA-R3BC，pEBS-ectA-P1BC，pEBS-ectA-P2BC，pEBS-ectA-P3BC，pEBS-ectAB-R1C，pEBS-ectAB-R2C，pEBS-ectAB-R3C，pEBS-ectAB-P1C，pEBS-ectAB-P2C，pEBS-ectAB-P3C。
分别挑取上述构建的18株单独优化ectA,ectB,ectC基因RBS以及启动子序列的酿酒酵母重组菌、阳性对照菌(基因组整合线性化pEBS-ectABC)和阴性对照菌(基因组整合线性化pEBS空质粒)单克隆接种于5mL YPD培养基，根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，置于220rpm 30℃培养24h，然后按1％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20mL。根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，然后置于220rpm30℃培养。培养96h后进行样品的处理及HPLC分析四氢嘧啶产量。重组菌都能实现异源合成四氢嘧啶，且与阳性对照菌相比，优化后的重组菌大部分产量提高，其中重组菌pEBS-ectA-P1BC的四氢嘧啶产量最高，达1.1g/L。
实施例4组合优化ectA,ectB,ectC基因RBS和启动子序列的酿酒酵母重组菌构建
向酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C单倍体感受态细胞中分别转入实施例2构建的线性化的重组质粒pEBS-P1R1-ectABC，pEBS-P2R1-ectABC，pEBS-P3R1-ectABC，pEBS-P1R2-ectABC，pEBS-P2R2-ectABC，pEBS-P3R2-ectABC，pEBS-P1R3-ectABC，pEBS-P2R3-ectABC，pEBS-P3R3-ectABC，pEBS-ectA-P1R1BC，pEBS-ectA-P2R1BC，pEBS-ectA-P3R1BC，pEBS-ectA-P1R2BC，pEBS-ectA-P2R2BC，pEBS-ectA-P3R2BC，pEBS-ectA-P1R3BC，pEBS-ectA-P2R3BC，pEBS-ectA-P3R3BC，pEBS-ectAB-P1R1C，pEBS-ectAB-P2R1C，pEBS-ectAB-P3R1C，pEBS-ectAB-P1R2C，pEBS-ectAB-P2R2C，pEBS-ectAB-P3R2C，pEBS-ectAB-P1R3C，pEBS-ectAB-P2R3C和pEBS-ectAB-P3R3C，筛选阳性克隆，得到的酿酒酵母重组菌分别命名为S.c-R1ABC,S.c-R2ABC,S.c-R3ABC,S.c-P1ABC,S.c-P2ABC,S.c-P3ABC,S.c-AR1BC,S.c-AR2BC,S.c-AR3BC,S.c-AP1BC,S.c-AP2BC,S.c-AP3BC,S.c-ABR1C,S.c-ABR2C,S.c-ABR3C,S.c-ABP1C,S.c-ABP2C,S.c-ABP3C,S.c-P1R1ABC,S.c-P2R1ABC,S.c-P3R1ABC,S.c-P1R2ABC,S.c-P2R2ABC,S.c-P3R2ABC,S.c-P1R3ABC,S.c-P2R3ABC,S.c-P3R3ABC,S.c-AP1R1BC,S.c-AP2R1BC,S.c-AP3R1BC,S.c-AP1R2BC,S.c-AP2R2BC,S.c-AP3R2BC,S.c-AP1R3BC,S.c-AP2R3BC,S.c-AP3R3BC,S.c-ABP1R1C,S.c-ABP2R1C,S.c-ABP3R1C,S.c-ABP1R2C,S.c-ABP2R2C,S.c-ABP3R2C,S.c-ABP1R3C,S.c-ABP2R3C,S.c-ABP3R3C。
分别挑取上述构建的27株组合优化ectA,ectB,ectC基因RBS和启动子序列的酿酒酵母重组菌，阳性对照菌(基因组整合线性化pEBS-ectABC)和阴性对照菌(基因组整合线性化pEBS空质粒)单克隆接种于5mL YPD培养基，根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，置于220rpm 30℃培养24h，然后按1％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20mL。根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，然后置于220rpm30℃培养。培养96h后进行样品的处理及HPLC分析四氢嘧啶产量。重组菌都能实现异源合成四氢嘧啶，且与阳性对照菌相比，优化后的重组菌部分产量明显提高，其中重组菌pEBS-ectA-P1R3BC的四氢嘧啶产量较高，达2.3g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏瑞霆生物科技有限公司
<120> 一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株
<130> BAA200616A
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2452
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctacagcga accacgacaa tgaacgcaac cacagagccc tttacaccct ccgccgacct 60
ggccaagccc agcgtggccg atgccgtggt cggccatgag gcctcaccgc tcttcatccg 120
caagccaagc cccgatgacg gctggggcat ctacgagctg gtcaagtcct gtccgcctct 180
cgacgtcaat tccgcctacg cctatctgtt gctggccacc cagttccgcg atagctgcgc 240
cgtggcgacc aacgaagagg gcgagatcgt cggcttcgtt tccggctacg tgaagagcaa 300
cgcccccgat acctatttcc tctggcaggt tgccgtgggc gagaaggcac gtggcaccgg 360
cctggcccgt cgtctggtgg aagccgtgat gacacgcccg gaaatggccg aggtccacca 420
tctcgagacc actatcacgc ccgacaacca ggcgtcctgg ggcttgttcc gccgtctcgc 480
cgatcgctgg caggcgccgt tgaacagccg cgaatacttc tccaccgatc aactcggcgg 540
tgagcatgac ccggaaaacc tcgttcgcat cggcccgttc cagaccgacc agatctgagc 600
cgggacgccg cctggccggc ccggtacggg ccggcaaccc gtcttttcgt tttatcactt 660
tccccccaca ggaggtcgca atgcagaccc agattctcga acgcatggag tccgacgttc 720
ggacctactc ccgctccttc ccggtcgtct tcaccaaggc gcgcaatgcc cgcctgaccg 780
acgaggaagg gcgcgagtac atcgacttcc tggccggtgc cggcaccctg aactacggcc 840
acaacaaccc gcacctcaag caggcgctgc tcgactatat cgacagcgac ggcatcgtcc 900
acggcctgga cttctggact gcggccaagc gcgactatct ggaaaccctg gaagaggtga 960
tcctcaagcc gcgcggtctc gactacaagg tgcatctgcc cggaccgact ggcaccaacg 1020
ccgtcgaggc ggccattcgc ctggcccggg tcgccaaggg gcgccacaat atcgtctcct 1080
tcaccaacgg ctttcatggc gtcaccatgg gcgcgctggc gaccaccggt aaccgcaagt 1140
tccgcgaggc caccggtggc gtgccgaccc aggctgcttc cttcatgccg ttcgatggct 1200
acctcggcag cagcaccgac accctcgact acttcgagaa gctgctcggc gacaagtccg 1260
gcggcctgga cgtgcccgcg gcggtgatcg tcgagacagt gcagggcgag ggcggtatca 1320
atgtcgccgg cctggagtgg ctcaagcgcc tcgagagcat ctgccgcgcc aatgacatcc 1380
tgctgatcat cgacgacatc caggcgggct gcggccggac cggcaagttc ttcagcttcg 1440
agcatgccgg catcacgccg gatatcgtga ccaactccaa gtcgctgtcc ggttacggcc 1500
tgccgttcgc tcacgtcctg atgcgccccg agctcgacaa gtggaagccc ggtcagtaca 1560
acggcacctt ccgcggcttc aacctggctt tcgccactgc tgctgccgcc atgcgcaagt 1620
actggagcga cgacaccttc gagcgtgacg tgcagcgcaa ggctcgcatc gtcgaggaac 1680
gcttcggcaa gatcgccgcc tggctgagcg agaacggcat cgaggcctcc gagcgcggcc 1740
gcgggctgat gcggggcatc gacgtgggtt ccggcgatat cgccgacaag atcacccacc 1800
aagccttcga gaacgggttg atcatcgaaa ccagcggtca ggacggcgaa gtggtcaagt 1860
gcctgtgccc gctgaccatt cccgacgaag acctggtcga gggactcgac atcctcgaga 1920
ccagcaccaa gcaggccttt agctgatcgc ctgaggtgcg ccatcgggcc tgtccatggc 1980
atcctgtatc ggtcggccgt gcgcggccgg ccagtcattg attcactgga gaatcgacat 2040
gatcgttcgc aatctcgaag aagcgcgcca gaccgaccgt ctggtcaccg ccgaaaacgg 2100
caactgggac agcacccgcc tgtcgctggc cgaagatggt ggcaactgct ccttccacat 2160
cacccgcatc ttcgagggta ccgagaccca catccactat aagcatcact tcgaggctgt 2220
ttattgcatc gaaggcgagg gcgaagtgga aaccctggcc gatggcaaga tctggcccat 2280
caagccgggt gacatctaca tcctcgacca gcacgacgag cacctgctgc gcgccagcaa 2340
gaccatgcac ctggcctgcg tgttcacgcc gggcctgacc ggcaacgaag tgcaccgcga 2400
agacggttcc tacgcacctg ccgacgaagc cgacgaccag aagccgctgt aa 2452
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggaaggaa atat 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagaaggaga atat 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaggagagaa gtgt 14
<210> 5
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcatgtgctc actatgtata taagactctt gtatcttctt ttgtctaaat attctttcct 60
tatacattag gacctttgca gcataaatta ctatacttc 99
<210> 6
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcatgtgctc tgtatcatta tattactctt gtttcaagtt ttctctaaat attctttcct 60
tatacattag gacctttgca gcataaatta ctatacttc 99
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcttgtgctc tgtttgtata taattctctt gttttcaact tttctctaaa tattctttcc 60
ttatacatta ccacctttgc aggatatatt actttacttc 100
Claims (10)
1.编码四氢嘧啶合成基因簇的DNA分子，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.携带权利要求1所述DNA分子的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS。
4.携带权利要求1所述DNA分子，或含有权利要求2或3所述表达载体的微生物细胞。
5.一种产四氢嘧啶的酿酒酵母，其特征在于，表达SEQ ID NO.1所示的ectABC基因簇。
6.根据权利要求5所述的酿酒酵母，其特征在于，宿主为S.cerevisiae CEN.PK2-1C。
7.根据权利要求6所述的酿酒酵母，其特征在于，所述ectABC基因簇进行了RBS优化，所述RBS优化是采用SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列替换ectABC基因簇中ectA、ectB或ectC的RBS序列。
8.根据权利要求6或7所述的酿酒酵母，其特征在于，所述ectABC基因簇进行了启动子优化，所述启动子优化是采用SEQ ID NO.5～7任一所示的核苷酸序列替换ectABC基因簇中ectA、ectB或ectC的启动子序列。
9.权利要求5～8任一所述的酿酒酵母在生产四氢嘧啶或含四氢嘧啶的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将权利要求5～8任一所述的酿酒酵母在发酵培养基中，于28～35℃发酵至少24h。
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