CN114729337A - 优化的大麻素合酶多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体、包含编码所述经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸、制备包含所述核酸的经修饰的宿主细胞的方法、表达所述经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞、产生大麻素或大麻素衍生物的方法以及筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法。

Description

优化的大麻素合酶多肽
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在此随附电子提交的文本文件的内容全文以引用方式并入本文中：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：DEMT-004_03WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2020年5月19日，文件大小：924千字节)。
背景技术
大麻属植物由于其药用特性已被人类使用了数千年。在现代，大麻的生物活性作用归因于一类称为“大麻素”的化合物，其中有数百种结构类似物，包括四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)。最近发现这些大麻物质的分子和制剂可用作慢性疼痛、多发性硬化、癌症相关的恶心和呕吐、体重减轻、食欲缺乏、痉挛、癫痫发作和其他病症的治疗剂。
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某些大麻素的生理效应被认为是由它们与在人和其他动物中发现的两种细胞受体的相互作用介导的。大麻素受体1型(CB1)在脑、生殖系统和眼中是常见的。大麻素受体2型(CB2)在免疫系统中是常见的，在动物模型中介导与炎症相关的治疗作用。大麻素受体的发现及其与植物来源大麻素的相互作用先于内源性配体的鉴定。
除了THC和CBD，在大麻中也已经鉴定了数百种其他大麻素。然而，这些化合物中的许多以低水平存在，并且与更丰富的大麻素一起存在，使得难以从植物获得纯样品以研究它们的治疗潜力。类似地，化学合成这些类型的产物的方法是麻烦和昂贵的，并且倾向于产率不足。因此，需要制备纯大麻素或大麻素衍生物的另外的方法。
一种可能的方法是通过发酵经工程改造的微生物如酵母来产生。通过在微生物中工程改造产生相关植物酶，可以实现将各种原料转化成一系列大麻素，与从植物可获得的相比，可能以低得多的成本和高得多的纯度。这种努力的关键挑战是在微生物中表达植物酶的困难，特别是分泌的酶，如大麻素合酶，其必须成功地穿过微生物的分泌途径以正确地折叠和发挥功能。需要大麻素合酶的经工程改造的变体、经修饰的宿主细胞和新方法来应对这些挑战。
发明内容
本公开提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体、包含编码所述经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸、制备包含所述核酸的经修饰的宿主细胞的方法、用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞、产生大麻素或大麻素衍生物的方法以及筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法。本公开的经工程改造的变体可用于产生大麻素或大麻素衍生物(例如，非天然存在的大麻素)。本公开的经修饰的宿主细胞可以用于产生大麻素或大麻素衍生物(例如，非天然存在的大麻素)和/或用于表达本公开的经工程改造的变体。本公开还提供了用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞。另外，本公开提供了本公开的经工程改造的变体的制备。
本公开的一个方面涉及包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含与SEQID NO:3具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体在信号多肽、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、M412、L415、S428、L439、I445、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、M61、S62、L71、I97、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：L49、K50、N56、N57、V125、L132、V149、W161、K165、S170、L171、A172、N196、A235、K260、L268、T310、F316、L326、G378、S428、Y499、N527、H543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、N57、M61、L71、S170、A172、Y175、N196、H208、A235、K260、G378、K389和R543。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：N57、S170、A172、N196、A235、K260和G378。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：M412、L415和I445。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸I445处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：M61、G378和K389。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸M61和G378处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸M61和K389处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸G378和K389处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸M61、G378和K389处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、M412Q、L415M、S428L、L439M、I445M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、M61H、M61S、M61W、S62Q、L71A、L71Q、I97V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：L49E、L49Q、K50T、N56E、N57D、V125E、L132M、V149I、W161R、K165A、S170T、L171I、A172V、N196Q、N196T、N196V、A235P、K260W、K260C、L268I、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、S428L、Y499M、Y499V、N527E、H543E和H544E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、N57D、M61W、L71H、S170T、A172V、Y175F、N196V、H208T、A235P、K260W、G378T、K389E和R543E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N57D、S170T、A172V、N196V、A235P、K260W和G378T。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M412Q、L415M和I445M。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代I445M。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M61W、G378T和K389E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W和G378T。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W和K389E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代G378T和K389E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W、G378T和K389E。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ IDNO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ IDNO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ IDNO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ IDNO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ IDNO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ IDNO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ IDNO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ IDNO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:304。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQID NO:202、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:232。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ IDNO:232和SEQ ID NO:234。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184、SEQID NO:198、SEQ ID NO:202和SEQ ID NO:230。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:184和SEQ ID NO:198。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:304。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:318和SEQ ID NO:320。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述结构域中包含至少一个不变氨基酸。在一些实施方案中，经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少11个氨基酸、至少12个氨基酸、至少13个氨基酸、至少14个氨基酸或至少15个不变氨基酸。在一些实施方案中，经工程改造的变体在BBE结构域中包含至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少4个氨基酸、至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少11个氨基酸、至少12个氨基酸、至少13个氨基酸、至少14个氨基酸或至少15个不变氨基酸。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：A28、F34、L35、C37、L64、N70、P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248、V251、V259、Q276、F312、S313、L323、C341、F352、S354、F380、K381、I382、K383、D385、Y386、I391、G419、M422、I425、I430、P431、P433、H434、R435、G437、Y440、W443、Y444、I464、Y465、M468、T469、Y471、V472、P476、R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：C37、N70、I93、C99、E117、S120、F127、D131、G156、E157、Y159、G174、C176、G182、G183、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、R195、D202、D206、G214、W228、G234、F238、L248、Q276、S313、L323、S354、K381、K383、D385、G419、M422、R435、Y440、W443、Y444、Y471、P476、N513、F514、N528和Q534。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：A28、F34、L35、C37、L64、N70、P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248、V251、V259、Q276、F312、S313、L323、C341、F352、S354、F380、K381、I382、K383、D385、Y386、I391、M412、L415、G419、M422、I425、I430、P431、P433、H434、R435、G437、Y440、W443、Y444、I445、I464、Y465、M468、T469、Y471、V472、P476、R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个不变氨基酸。
在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生的大麻二酚酸(CBDA)的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)的量比由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，经工程改造的变体以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)。在一些实施方案中，经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，经工程改造的变体以增加的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)。在一些实施方案中，经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端、C末端或在N末端和C末端两者包含截短。在一些实施方案中，截短的经工程改造的变体包含信号多肽或膜锚定物。在一些实施方案中，经工程改造的变体缺乏天然信号多肽。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的截短。
本公开的另一方面涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231和SEQ ID NO:233。在本公开的核酸的一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ IDNO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ IDNO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ IDNO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301和SEQ ID NO:303。在本公开的核酸的一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列选自由SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317和SEQ ID NO:319组成的组。在本公开的核酸的一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一个方面涉及制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括将一种或多种核酸引入宿主细胞中，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。
本公开的另一方面涉及包含一种或多种核酸的载体，所述一种或多种核酸编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。
本公开的一个方面涉及制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括将一种或多种载体引入宿主细胞中，所述一种或多种载体包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。
本公开的另一个方面涉及用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞，其中经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，NphB多肽包含与SEQ ID NO:294具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码四酮化合物合酶(TKS)多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种含有编码橄榄醇酸环化酶(OAC)多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，TKS多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含三种或更多种异源核酸，所述三种或更多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，OAC多肽包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含三种或三种以上含有编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述异源核酸包含编码酰基活化酶(AAE)多肽的核苷酸序列。在某些此类实施例中，AAE多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含两种或更多种含有编码AAE多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在本公开的一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞包含以下的一者或多者：a)一种或多种包含编码HMG-CoA合酶(HMGS)多肽的核苷酸序列的异源核酸；b)一种或多种包含编码截短的3-羟基-3-甲基-戊二酰基-CoA还原酶(tHMGR)多肽的核苷酸序列的异源核酸；c)一种或多种包含编码甲羟戊酸激酶(MK)多肽的核苷酸序列的异源核酸；d)一种或多种包含编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽的核苷酸序列的异源核酸；e)一种或多种包含编码焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD1)多肽的核苷酸序列的异源核酸；或f)一种或多种包含编码异戊烯二磷酸异构酶(IDI1)多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，IDI1多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，tHMGR多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，HMGS多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，MK多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PMK多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，MVD1多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码丙酮酸脱羧酶(PDC)多肽的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，PDC多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸合酶(GPPS)多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施例中，GPPS多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，KAR2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含两种或更多种含有编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，PDI1多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，IRE1多肽包含与SEQ ID NO:11或SEQID NO:296具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，ERO1多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码FAD1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，FAD1多肽包含与SEQ ID NO:298具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码PEP4多肽的一种或多种基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，PEP4多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽的一种或多种基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，ROT2多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞是真核细胞。在某些此类实施方案中，真核细胞是酵母细胞。在某些此类实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母。在某些此类实施方案中，酿酒酵母是酿酒酵母的蛋白酶缺陷菌株。
在本公开的一些实施方案中，所述一种或多种核酸中的至少一种整合到所述经修饰的宿主细胞的染色体中。在本公开的一些实施方案中，所述一种或多种核酸中的至少一种保持在染色体外(例如，在质粒或人工染色体上)。在本公开的一些实施方案中，所述一种或多种核酸中的至少一种与诱导型启动子可操作地连接。在本公开的一些实施方案中，所述一种或多种核酸中的至少一种与组成型启动子可操作地连接。
在本公开的一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，所述经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
在本公开的一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，所述经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
在本公开的一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，所述经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比更快的生长速率和/或更高的生物质产率，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
在本公开的一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，所述经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％的生长速率和/或较高生物质产率，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
在本公开的一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
在本公开的一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在本公开的一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
在本公开的一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开的另一方面涉及一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括：a)在培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞。在某些此类实施方案中，所述方法包括：b)回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，培养基包含羧酸。在某些此类实施方案中，羧酸是未取代的或经取代的C3-C18羧酸。在某些此类实施方案中，未取代的或经取代的C3-C18羧酸是未取代的或经取代的己酸。在一些实施方案中，培养基包含橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物。在一些实施方案中，大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、次大麻酸或次大麻二酚。在一些实施方案中，培养基包含可发酵糖。在一些实施方案中，培养基包含经预处理的纤维素原料。在一些实施方案中，培养基包含非发酵碳源。在某些此类实施方案中，非发酵碳源包含乙醇。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。
在本公开的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是本公开的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，并且其中本公开的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但是缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是本公开的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，并且其中本公开的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但是缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是本公开的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，在相似培养条件下生长相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是本公开的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，在相似培养条件下生长相同时间长度。
本公开的一个方面涉及一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括使用本公开的经工程改造的变体。在某些此类实施方案中，所述方法包括回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。在本公开的方法的一些实施方案中，大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、次大麻酸或次大麻二酚。
在本公开的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体，其中本公开的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体，其中本公开的经工程改造的变体和具有SEQID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体，其中本公开的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体，其中本公开的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
在本公开的方法的一些实施方案中，所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开的另一个方面涉及一种筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述方法包括：a)将宿主细胞群体分成对照群体和试验群体；b)在所述对照群体中共表达具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽和对比大麻素合酶多肽，其中具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽可以将大麻萜酚酸(CBGA)转化为第一大麻素，即大麻二酚酸(CBDA)，而对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为不同的第二大麻素；c)在所述试验群体中共表达所述经工程改造的变体和所述对比大麻素合酶多肽，其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽一样，所述经工程改造的变体可以将CBGA转化为相同的第一大麻素，即大麻二酚酸(CBDA)，并且其中所述对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为所述第二大麻素并且在所述试验群体和所述对照群体中以相似水平表达；d)测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素即大麻二酚酸(CBDA)与所述第二大麻素的比率；并且e)以mg/L或mM计，测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素的量。在某些此类实施方案中，所述试验群体经鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体，其中改善的体内性能通过在相似培养条件下相同时间长度内，与由所述对照群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率相比，由所述试验群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率增加而得以证明。在筛选CBDAS多肽的经工程改造的变体的方法的一些实施方案中，通过在相似培养条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，与由所述对照群体产生的量相比，由所述试验群体产生更大量的所述第一大麻素，将所述试验群体鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体。
在筛选CBDAS多肽的经工程改造的变体的方法的一些实施方案中，大麻素合酶多肽是四氢大麻酚酸合酶多肽。在某些此类实施方案中，四氢大麻酚酸合酶多肽包含与SEQID NO:44具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在筛选CBDAS多肽的经工程改造的变体的方法的一些实施方案中，第二大麻素是四氢大麻酚酸(THCA)。
在筛选CBDAS多肽的经工程改造的变体的方法的一些实施方案中，经工程改造的变体是本公开的经工程改造的变体。
附图说明
图1A、图1B和图1C描绘了用于产生S29菌株的表达构建体。图1A、图1B和图1C中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S61、S122、S171、S181、S206、S220、S241、S270、S478、S487、S510、S562、S579、S606-S791、S1100-S1120、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。在所有图中，除了表1中的指定编码序列之外，构建体图谱还描绘了表6中描述的调控、非编码和基因组盒序列。构建体图谱还描绘了用前面的“m”表示的基因(例如，mERG13)，其指定了来自表1的具有下游调控(终止子)序列的200-250个碱基对(bp)的开放阅读框。构建体图谱中的箭头指示某些DNA部分的方向性。某一部分名称前面的“！”是所用DNA设计软件的输出，对于箭头方向性是冗余的，可以忽略。
图2描绘了用于产生S181菌株的表达构建体。图2中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S220、S241、S270、S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图3描绘了用于产生S220菌株的表达构建体。图3中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S241、S270、S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图4描绘了用于产生S241菌株的表达构建体。图4中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S270、S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图5描绘了用于产生S61菌株的着陆垫构建体。图5中描绘的构建体也用于产生以下菌株：S122、S171、S181、S220、S241、S270、S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图6描绘了用于产生S122菌株的表达构建体。图6中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S171、S181、S220、S241、S270、S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图7描绘了用于产生S171菌株的表达构建体。图7中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S181、S220、S241、S270、S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图8描绘了用于产生S270菌株的表达构建体。图8中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S478、S487、S562、S579、S606-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图9描绘了用于产生S478菌株的表达构建体。图9中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S562和S606-S698。
图10描绘了用于产生S487菌株的表达构建体。图10中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S579、S699-S791、S935、S938、S940-S946和S1205-S1208。
图11描绘了用于产生S562、S579和S1100菌株的表达构建体。
图12描绘了用于产生S606-S791、S935、S938、S940-S946、S1101-S1120和S1205-S1208菌株的表达构建体。
图13A和图13B描绘了用于产生S206的表达构建体。图13A和图13B中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S510和S1100-S1120。
图14描绘了用于产生S510菌株的表达构建体。图14中描绘的表达构建体也用于产生以下菌株：S1100-S1120。
具体实施方式
合成生物学允许工程改造工业宿主生物-例如微生物-将简单的糖原料转化为药品。这种方法包括鉴定产生靶分子的基因并优化它们在工业宿主中的活性。微生物生产可以比农业和化学合成有显著成本优势的，较少可变，并且允许对靶分子进行定制。然而，在工业宿主生物体中重构或创建产生靶分子的途径可能需要对途径基因和宿主二者进行显著的工程改造。本公开提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体、包含编码所述经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸、制备包含所述核酸的经修饰的宿主细胞的方法、用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞、产生大麻素或大麻素衍生物的方法以及筛选CBDAS多肽的经工程改造的变体的方法。本公开的经工程改造的变体可用于产生大麻素或大麻素衍生物(例如，非天然存在的大麻素)。本公开的经修饰的宿主细胞可以用于产生大麻素或大麻素衍生物(例如，非天然存在的大麻素)和/或用于表达本公开的经工程改造的变体。本公开还提供了用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞。另外，本公开提供了本公开的经工程改造的变体的制备。
大麻素合酶多肽，诸如四氢大麻酚酸合酶、大麻环萜酸合酶或大麻二酚酸合酶多肽，在大麻素的生物合成中起重要作用。然而，在经修饰的宿主细胞中重构它们的活性已被证明是具有挑战性的，阻碍大麻素或大麻素衍生物的产生的进展。大麻素合酶必须成功地穿过分泌途径以正确地折叠和发挥功能。这些分泌的植物酶尚未进化到在酵母细胞中表达，因此活性差，其底物大麻萜酚酸(CBGA)有限转化为大麻二酚酸(CBDA)、大麻环萜酚酸(CBCA)或四氢大麻酚酸(THCA)。增加酶活性的简单方法是增加其拷贝数(表达)。然而，大麻素合酶基因，诸如CBDAS和四氢大麻酚酸合酶(THCAS)基因在酵母中的表达是有害的(可能是由于蛋白质的错误折叠)，阻挠了通过整合基因的多个拷贝来加强活性的直接尝试。产品特性存在另一个问题。虽然天然CBDAS酶的主要产物是CBDA，但该酶还产生大量不期望的副产物THCA和CBCA，这将需要昂贵的附加下游纯化步骤以在工业过程中分离。
出于这些原因，天然大麻素合酶诸如CBDAS或THCAS酶对于工业目的不是最佳的，需要改良的酶。目标参数包括催化活性、产物特性、酶稳定性以及最佳pH和温度。酶的改良通常通过将多样性(经工程改造的变体文库)的产生与对目标性质的筛选或选择相结合来实现。编码经工程改造的变体的DNA文库可以以多种方式产生。例如，可以使用野生型基因序列作为模板，使用易错PCR产生文库。所得文库可以相当大，由在随机位置具有可变数目的突变的基因组成。易错PCR花费不多且方便，但具有几个缺点。首先，获得分布，而不是每个构建体的精确突变数目。这呈现出不幸的折衷。以低突变数目为中心的分布将包括大量浪费筛选能力零突变野生型构建体。以较高突变数目为中心的分布可能产生具有累积的功能丧失性突变的构建体，累积的功能丧失性突变将会阻止对所需功能获得性突变的鉴定。其次，易错PCR引入突变偏差(所用低保真度聚合酶的固有性质)，这意味着文库不能充分代表某些类型的突变。对易错PCR的有效替代是饱和诱变，其牵涉合成在蛋白质中的每个位置含有每种可能的氨基酸的文库。DNA合成技术的最新进展已经显著改善了这些文库的质量。
一旦产生编码经工程改造的变体的文库，就必须选择或筛选具有目标性质的经工程改造的变体。这可以通过使用蛋白质产生宿主表达和纯化经工程改造的变体，然后进行体外测试来实现。此类方法允许仔细测量经工程改造的变体的动力学参数并在仔细控制的条件下评估性能。然而，对于在经工程改造的微生物菌株中的应用，体外数据可能很大程度是误导的，因为没有体外系统可以准确地代表细胞环境。在这种情况下，最佳选择是在它们最终必须执行的精确背景下-在经工程改造的生产菌株内部测试经工程改造的变体。在大麻素合酶的情况下，将此类生产菌株工程改造为产生过量的底物CBGA。这种体内系统的一个挑战是可变性较高。当测试大文库时，这种可变性可使得难以区分具有比野生型酶活性更细微的改善的克隆物。为了解决这个问题，竞争方法可能有价值。在竞争系统中，经工程改造的文库变体与相关酶一起表达(例如，文库CBDAS构建体与THCAS构建体一起表达)。通过计算文库酶产物滴度和不变的竞争酶滴度的比率，可以显著降低数据的可变性。这是因为生物学变量倾向于以相同的方式影响两种酶，从而允许效果的标准化。与动力学参数不同，竞争比报道了两种酶催化参数诸如Km和Kcat的两种变化以及经工程改造的功能变体的稳态水平(表达和稳定性)的变化。
通过使用上述方法，本公开提供了大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体。在本文中，筛选超过6500种经工程改造的变体以提高滴度。在覆盖52个位置(所有残基的近10％)的68种不同变体中CBDA滴度提高(在野生型的标准偏差之外)。在第二次努力中，进行75个活性位点残基(由位置483处活性位点酪氨酸附近～11埃定义)的更密集的筛选，以鉴定减少CBDA合酶多肽产生的THCA(在某些情况下产生CBCA)的突变。这些活性位点残基包括：来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽的69、70、72、113、114、115、116、117、118、119、155、173、174、175、176、177、179、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、232、234、236、289、291、353、380、381、382、383、384、385、386、412、413、414、415、416、418、432、434、441、442、443、444、445、446、461、465、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、505、508、509、510、532和534。本公开的经工程改造的变体可用于产生大麻素或大麻素衍生物(例如，非天然存在的大麻素)。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，本公开的经工程改造的变体可以从大麻萜酚酸(CBGA)产生的大麻二酚酸(CBDA)的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。另外，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，本公开的经工程改造的变体以增加的CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与CBCA的比率相比，本公开的经工程改造的变体以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。相似条件可以包括相同的温度、pH、缓冲液和/或发酵条件，以及在相同的培养基和/或反应溶剂中。
本公开的方法可以包括使用本公开的经工程改造的微生物(例如，经修饰的宿主细胞)或CBDAS多肽的经工程改造的变体来产生天然存在的和非天然存在的大麻素。天然存在的大麻素和非天然存在的大麻素(例如，大麻素衍生物)由于它们的复杂结构而使用化学合成来产生具有挑战性。本公开的方法使得能够在活细胞内部构建代谢途径以从简单前体诸如糖和羧酸产生定制的大麻素或大麻素衍生物。包含编码本文公开的一种或多种多肽或经工程改造的变体的核苷酸序列的本文公开的一种或多种核酸(例如，异源核酸)，可以引入宿主微生物中，允许廉价原料例如糖逐步转化为终产物：大麻素或大麻素衍生物。这些产物可以通过选择和构建包含一种或多种本文公开的核酸(例如，异源核酸)的表达构建体或载体来指定，从而允许有效生物产生所选大麻素，诸如CBD和CBDA，以及在大麻(Cannabis)中以低水平发现的较不常见的大麻素种类；或大麻素衍生物。生物产生也使得能够合成具有限定立体化学的大麻素或大麻素衍生物，这对于使用化学合成来进行是具有挑战性的。为了产生大麻素或大麻素衍生物并在经修饰的宿主细胞内创建生物合成途径，包含一种或多种包含编码本公开的CBDAS多肽的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞可以表达或过表达异源核酸的组合，所述异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了用一种或多种包含编码本公开的CBDAS多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸(例如，异源核酸)修饰的宿主细胞的分泌途径的修饰。在一些实施方案中，编码CBDAS多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。宿主细胞中分泌途径的修饰可以改善本公开的经工程改造的变体的表达和溶解，因为这些变体通过分泌途径进行加工。在经修饰的宿主细胞，诸如经修饰的酵母细胞中重构通过分泌途径加工的多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)的活性可能具有挑战性且不可靠。常常，所表达的经工程改造的变体可错误折叠或错误定位，导致低表达，所表达的经工程改造的变体缺乏活性，经工程改造的变体聚集，宿主细胞活力降低和/或细胞死亡。另外，错误折叠或错误定位的表达的经工程改造的变体的积累可在经修饰的宿主细胞内诱导代谢应激，损害经修饰的宿主细胞。所表达的经工程改造的变体可能缺乏用于折叠和活性的必要翻译后修饰，诸如二硫键、糖基化和修剪，以及辅因子，从而提供无活性的多肽或酶活性降低的多肽。
本公开的经修饰的宿主细胞可以是经修饰的酵母细胞。酵母细胞可以使用已知条件培养，快速生长，并且通常被认为是安全的。酵母细胞含有所有真核生物共同的分泌途径。如本文所公开的，在用一种或多种包含编码本公开的CBDAS多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸(例如，异源核酸)修饰的酵母宿主细胞中对该分泌途径的操纵可以改善经工程改造的变体的表达、折叠和酶活性以及经修饰的酵母宿主细胞(诸如经修饰的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的活力。此外，使用编码本公开的经工程改造的变体的密码子优化的核苷酸序列可以改善经工程改造的变体的表达和活性以及修饰的酵母宿主细胞(诸如经修饰的酿酒酵母)的活力。
除了允许产生所需大麻素或大麻素衍生物之外，本公开提供了比基于农业的产生更可靠和经济的方法。微生物发酵可以在数天内完成，而不是对于农作物所必需的数月内完成，不受气候变化或土壤污染(例如，重金属污染)的影响，并且可以产生高滴度的纯产物。
本公开还提供了用于经济地产生高价值大麻素(包括CBD)及其衍生物的平台。还提供了不存在可行的产生方法的不同大麻素或大麻素衍生物的产生。使用本文公开的经工程改造的变体、方法和经修饰的宿主细胞，大麻素和大麻素衍生物可以以超过100mg/升培养基、超过1g/升培养基、超过10g/升培养基或超过100g/升培养基的量产生。
另外，本公开提供了CBDAS多肽的经工程改造的变体、方法、经修饰的宿主细胞和核酸，以在体内或体外从简单前体产生大麻素或大麻素衍生物。本文公开的核酸(例如，异源核酸)可以引入微生物(例如，经修饰的宿主细胞)中，引起一种或多种多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)的表达或过表达，然后可以将所述多肽在体外或体内用于大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，体外方法是无细胞的。
大麻素生物合成
除了编码CBDAS多肽的经工程改造的变体的一种或多种核酸(例如，异源核酸)之外，编码具有大麻素或大麻素前体生物合成途径中存在的多肽的至少一种活性的一种或多种多肽的一种或多种核酸(例如，异源核酸)可用于合成大麻素或大麻素衍生物的方法和经修饰的宿主细胞中。大麻素前体可以包括，例如香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A。
在大麻中，大麻素是通过三种多肽的作用从共同的代谢物前体香叶基焦磷酸(GPP)和己酰辅酶A产生的。己酰辅酶A和丙二酰辅酶A通过四酮化合物合酶(TKS)多肽组合以提供12-碳四酮化合物中间体。然后通过橄榄醇酸环化酶(OAC)多肽环化该四酮化合物中间体，以生成橄榄醇酸。然后通过香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽(例如，CsPT4多肽)用普通的类异戊二烯前体GPP将橄榄醇酸异戊二烯化以生成CBGA，也称为“母体大麻素”的大麻素。然后本公开的CBDAS多肽的经工程改造的变体将CBGA转化为其他大麻素，例如CBDA等。在热或光的存在下，酸性大麻素可以进行脱羧，例如CBDA生成CBD。
GPP和己酰辅酶A可以通过几种途径产生。编码具有这些途径中存在的多肽的至少一种活性的一种或多种多肽的一种或多种核酸(例如，异源核酸)可用于合成大麻素或大麻素衍生物的方法和经修饰的宿主细胞中。
产生GPP的或作为产生GPP的生物合成途径的一部分的多肽可以是具有甲羟戊酸(MEV)途径中存在的多肽的至少一种活性的一种或多种多肽(例如，一种或多种MEV途径多肽)。如本文所用的术语“甲羟戊酸途径”或“MEV途径”可以指将乙酰辅酶A转化为异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的生物合成途径。甲羟戊酸途径包含催化以下步骤的多肽：(a)使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A(例如，通过乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的作用)；(b)使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)(例如，通过HMG-CoA合酶(HMGS)多肽的作用)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸(例如，通过HMG-CoA还原酶(HMGR)多肽的作用)；(d)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸(例如，通过甲羟戊酸激酶(MK)多肽的作用)；(e)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸(例如，通过磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽的作用)；(f)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸(例如，通过甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)多肽的作用)；和(g)将异戊烯焦磷酸(IPP)转化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)(例如，通过异戊烯焦磷酸异构酶(IDI1)多肽的作用)。然后，香叶基焦磷酸合酶(GPPS)多肽作用于IPP和/或DMAPP以产生GPP。
产生己酰辅酶A的多肽可包括产生酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物的多肽(例如，酰基活化酶多肽、脂肪酰基辅酶A合酶多肽或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽)。己酰辅酶A衍生物、酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物也可经由此类多肽形成。
Figure BDA0003470646560000261
GPP和己酰辅酶A也可通过下述途径产生，所述途径包含使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A的多肽和经由乙醛从丙酮酸产生乙酰辅酶A的丙酮酸脱羧酶多肽。己酰辅酶A衍生物、酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物也可经由此类途径形成。
一般信息
在某些方面，除非另有说明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有全面解释：“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第二版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编辑，1987，及定期更新)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction,”(Mullis等人编辑，1994)。Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，以及March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版，JohnWiley&Sons(New York,N.Y.1992)为本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般指导。
如本文所用的“大麻素”或“大麻素化合物”可以指迄今为止仅在大麻(Cannabissativa)中发现的一类独特的杂萜类的成员。大麻素可以包括但不限于大麻环萜酚(CBC)型(例如，大麻环萜酚酸)、大麻萜酚(CBG)型(例如，大麻萜酚酸)、大麻二酚(CBD)型(例如，大麻二酚酸)、Δ9-反式-四氢大麻酚(Δ9-THC)型(例如，Δ9-四氢大麻酚酸)、Δ8-反式-四氢大麻酚(Δ8-THC)型、大麻环酚(CBL)型、大麻艾尔松(CBE)型、大麻酚(CBN)型、脱氢大麻二酚(CBND)型、大麻三酚(CBT)型、大麻萜酚酸(CBGA)、大麻萜酚酸单甲醚(CBGAM)、大麻萜酚(CBG)、大麻萜酚单甲醚(CBGM)、次大麻萜酚酸(CBGVA)、次大麻萜酚(CBGV)、大麻环萜酚酸(CBCA)、大麻环萜酚(CBC)、次大麻色酚酸(CBCVA)、次大麻色酚(CBCV)、大麻二酚酸(CBDA)、大麻二酚(CBD)、大麻二酚单甲醚(CBDM)、大麻二酚-C4(CBD-C4)、次大麻二酚酸(CBDVA)、次大麻二酚(CBDV)、大麻二苔黑酚(cannabidiorcol，CBD-C1)、Δ9–四氢大麻酚酸A(THCA-A)、Δ9–四氢大麻酚酸B(THCA-B)、Δ9–四氢大麻酚(THC)、Δ9–四氢大麻酚酸-C4(THCA-C4)、Δ9–四氢大麻酚-C4(THC-C4)、Δ9–四氢次大麻酚酸(THCVA)、Δ9–四氢次大麻酚(THCV)、Δ9–四氢大麻苔黑酚酸(THCA-C1)、Δ9–四氢大麻苔黑酚(THC-C1)、Δ7-顺式-异-四氢次大麻酚、Δ8–四氢大麻酚酸(Δ8–THCA)、Δ8–四氢大麻酚(Δ8–THC)、大麻环酚酸(CBLA)、大麻环酚(CBL)、次大麻环酚(CBLV)、大麻艾尔松酸A(cannabielsoic acid A，CBEA-A)、大麻艾尔松酸B(CBEA-B)、大麻艾尔松(CBE)、大麻伊索因酸(cannabielsoinic acid)、大麻二吡喃环烷酸(cannabicitranic acid)、大麻酚酸(CBNA)、大麻酚(CBN)、大麻酚甲醚(CBNM)、大麻酚-C4、(CBN-C4)、次大麻酚(CBV)、大麻酚-C2(CNB-C2)、大麻苔黑酚(CBN-C1)、脱氢大麻二酚(cannabinodiol，CBND)、脱氢次大麻二酚(cannabinodivarin，CBVD)、大麻三酚(CBT)、10-乙氧基-9-羟基-δ-6a-四氢大麻酚、8,9-二羟基-δ-6a-四氢大麻酚、次大麻三酚(CBTVE)、脱氢大麻呋喃(DCBF)、大麻呋喃(CBF)、大麻色满酮(CBCN)、大麻二吡喃环烷(CBT)、10-氧代-δ-6a-四氢大麻酚(OTHC)、δ-9-顺式-四氢大麻酚(顺式-THC)、3,4,5,6-四氢-7-羟基-α-α-2-三甲基-9-正丙基-2,6-桥亚甲基-2H-1-苯并噁辛因-5-甲醇(OH-异-HHCV)、大麻利比索(cannabiripsol，CBR)和三羟基-δ-9-四氢大麻酚(triOHTHC)。
如本文所详述的酰基辅酶A化合物可以包括具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003470646560000281
其中R可以是未取代的脂肪酸侧链或被本文公开的一个或多个官能团和/或反应性基团取代或包含本文公开的一个或多个官能团和/或反应性基团的脂肪酸侧链(即，酰基辅酶A化合物衍生物)。
如本文所用，己酰辅酶A衍生物、酰基辅酶A化合物衍生物、大麻素衍生物或橄榄醇酸衍生物可以指被一个或多个官能团和/或反应性基团取代或包含一个或多个官能团和/或反应性基团的己酰辅酶A、酰基辅酶A化合物、大麻素或橄榄醇酸。官能团可以包括但不限于叠氮基、卤素(例如氯、溴、碘、氟)、甲基、烷基(包括支链和直链烷基)、炔基、烯基、甲氧基、烷氧基、乙酰基、氨基、羧基、羰基、氧代、酯、羟基、硫基(例如，硫醇)、氰基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环烷基烯基、环烷基炔基、环烯基烷基、环烯基烯基、环烯基炔基、杂环基烯基、杂环基炔基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、芳基烯基、芳基炔基、杂环基、螺环基、杂螺环基、硫代烷基(或烷硫基)、芳硫基、杂芳硫基、砜、磺酰基、亚砜、酰氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、N-氧化物、酰亚胺、烯胺、亚胺、肟、腙、腈、芳烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基烷基、杂芳基烷基、硝基、硫酮基等。合适的反应性基团可以包括但不一定限于叠氮化物、羧基、羰基、胺(例如，烷基胺(例如，低级烷基胺)、芳基胺)、卤化物、酯(例如，烷基酯(例如，低级烷基酯、苄基酯)、芳基酯、经取代的芳基酯)、氰基、硫酯、硫醚、磺酰卤、醇、硫醇、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、肼、炔基、烯基等。反应性基团可促进目标分子的共价附接。合适的目标分子可包括但不限于可检测标记；显像剂；毒素(包括细胞毒素)；接头；肽；药物(例如，小分子药物)；特异性结合对的成员；表位标签；供靶受体结合的配体；有助于纯化的标签；增加溶解度的分子；增强生物利用度的分子；增加体内半衰期的分子；靶向特定细胞类型的分子；靶向特定组织的分子；提供穿过血脑屏障的分子；促进选择性附接至表面的分子；等等。官能团和反应性基团可以是未取代的或被一个或多个官能团或反应性基团取代。
大麻素衍生物或橄榄醇酸衍生物也可以指缺乏天然存在的大麻素或橄榄醇酸中发现的一个或多个化学部分，但仍保留天然存在的大麻素或橄榄醇酸的核结构特征(例如，环状核)的化合物。此类化学部分可以包括但不限于甲基、烷基、烯基、甲氧基、烷氧基、乙酰基、羧基、羰基、氧代、酯、羟基等。在一些实施方案中，大麻素衍生物或橄榄醇酸衍生物也可包含本文所述的任何官能团和/或反应性基团中的一种或多种。官能团和反应性基团可以是未取代的或被一个或多个官能团或反应性基团取代。
本文所用的术语“一种核酸”和“多种核苷酸”可以指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、基因、合成的DNA或RNA、DNA-RNA杂种，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然存在的、经化学或生物化学修饰的、非天然存在的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且可以指任何长度的氨基酸的聚合形式，这些聚合形式可以包括编码和非编码的氨基酸以及经化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸。本文公开的多肽可以包括全长多肽、多肽片段、截短的多肽、融合多肽或具有经修饰的肽骨架的多肽。本文公开的多肽也可以是与具体叙述的“参考”多肽(例如，野生型多肽)不同之处在于氨基酸插入、缺失、突变和/或取代的变体。
“大麻二酚酸合酶多肽的经工程改造的变体”或“本公开的经工程改造的变体”可以指具有大麻二酚酸合酶活性的非野生型多肽。本领域技术人员可以使用已知方法测量经工程改造的变体的大麻二酚酸合酶活性。例如，通过GC-MS或LC-MS或如本文提供的实例中所述。与野生型大麻二酚酸合酶序列，诸如具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，经工程改造的变体可以具有氨基酸取代。除了取代以外，与野生型大麻二酚酸合酶序列，诸如具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，经工程改造的变体可包含截短、添加和/或缺失和/或其他突变。与非野生型大麻二酚酸合酶序列相比，经工程改造的变体可以具有取代。除了取代以外，与非野生型大麻二酚酸合酶序列相比，经工程改造的变体可包含截短、添加和/或缺失和/或其他突变。本文所述的经工程改造的变体与亲本大麻二酚酸合酶多肽相比含有至少一个氨基酸残基取代。在一些实施方案中，亲本大麻二酚酸合酶多肽是野生型序列。在一些实施方案中，亲本大麻二酚酸合酶多肽是非野生型序列。
如本文所用，术语“异源”可以指通常未在自然界中发现的物质。术语“异源核苷酸序列”或术语“异源核酸”可以指在自然界中给定细胞中通常未发现的核酸或核苷酸序列。异源核苷酸序列可以是：(a)对于其宿主细胞是外来的(即，对于所述细胞是“外源的”)；(b)在宿主细胞中天然发现的(即“内源的”)，但以非天然量存在于细胞中(即，比在宿主细胞中天然发现的量更大或更小)；(c)在宿主细胞中天然发现的，但位于其天然基因座外；或(d)在宿主细胞中天然发现的，但去除或添加了内含子。异源核酸可以是：(a)对于其宿主细胞是外来的(即，对于所述细胞是“外源的”)；(b)在宿主细胞中天然发现的(即“内源的”)，但以非天然量存在于细胞中(即，比在宿主细胞中天然发现的量更大或更小)；或(c)在宿主细胞中天然发现的，但位于其天然基因座外。在一些实施方案中，异源核酸可包含密码子优化的核苷酸序列。密码子优化的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列的实例。在一些实施方案中，本文公开的异源核酸可以包含编码本文公开的多肽，诸如本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，但不包含不编码本文公开的多肽的核苷酸序列(例如，载体序列、启动子、增强子、上游或下游元件)。在一些实施方案中，本文公开的异源核酸可以包含编码本文公开的多肽，诸如本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，以及不编码本文公开的多肽的核苷酸序列(例如，载体序列、启动子、增强子、上游或下游元件)。
术语“异源酶”或“异源多肽”可以指在自然界中给定细胞中通常未发现的酶或多肽。该术语涵盖的酶或多肽是：(a)对于给定细胞是外源的(即，由不天然存在于宿主细胞中或不天然存在于宿主细胞中的给定背景中的核酸编码的)；或(b)在宿主细胞中天然发现的(例如，所述酶或多肽是由细胞内源的核酸编码的)，但在宿主细胞中以非天然量(例如，大于或小于天然发现的量)产生。例如，异源多肽可以包括宿主细胞中天然存在的多肽的突变型式。
如本文所用，术语“一种或多种异源核酸”或“一种或多种异源核苷酸序列”可以指包含编码一种或多种多肽的一种或多种核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，所述一种或多种异源核酸可包含编码一种多肽的核苷酸序列。在其他实施方案中，所述一种或多种异源核酸可包含编码多于一种多肽的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，编码多于一种多肽的核苷酸序列可以存在于相同的异源核酸上或不同的异源核酸上，或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源核酸可包含编码同一多肽的多个拷贝的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，编码同一多肽的多个拷贝的核苷酸序列可以存在于相同的异源核酸上或不同的异源核酸上，或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源核酸可包含编码不同多肽的多个拷贝的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，编码不同多肽的多个拷贝的核苷酸序列可以存在于相同的异源核酸上或不同的异源核酸上，或其组合。
如本文所用，“增加的比率”可以指与由本文公开的另一种多肽、经工程改造的变体、方法和/或经修饰的宿主细胞(例如，本文公开的比较多肽、经工程改造的变体、方法和/或经修饰的宿主细胞)产生的两种产物之间的摩尔比、质量(或重量)比、摩尔浓度比或质量浓度比相比，由本文公开的多肽、经工程改造的变体、方法和/或经修饰的宿主细胞产生的相同两种产物之间的摩尔比增加、质量(或重量)比增加、摩尔浓度比增加或质量浓度(例如，mg/L或mg/mL)比增加。例如，与本文公开的不同的经工程改造的变体产生的CBDA与THCA的11:1比率相比，本文公开的经工程改造的变体产生的CBDA与THCA的100:1比率将是增加的CBDA与THCA的比率。
如本文所用，由本文公开的多肽、经工程改造的变体、方法和/或经修饰的宿主细胞产生的产物比率，诸如CBDA与THCA的比率，可以指摩尔比、质量(或重量)比、摩尔浓度比或质量浓度(例如，mg/L或mg/mL)比。例如，如果本文公开的经修饰的宿主细胞产生4mMCBDA和1mM THCA，则CBDA与THCA的比率将为4:1。
“可操作地连接”可以指元件的排列，其中如此描述的组件配置成以便执行它们的普通功能。因此，与编码序列可操作地连接的控制序列能够实现编码序列的表达。控制序列不必与编码序列邻接，只要它们起到指导其表达的功能。因此，例如，在启动子序列与编码序列之间可以存在未翻译但转录的间插序列，并且启动子序列仍然可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。
“分离的”可以指多肽或核酸基本上或基本不含在其天然状态下通常伴随它们的组分。分离的多肽或核酸可以不同于其在自然界中发现的形式或环境。因此，分离的多肽和核酸可以与天然细胞中存在的多肽和核酸区分开。分离的核酸或多肽可以进一步从与分离的核酸或多肽混合的一种或多种其他组分中纯化，如果存在此类组分的话。
“经修饰的宿主细胞”(也可以称为“重组宿主细胞”)可以指已经引入核酸(例如，异源核酸)，例如表达载体或构建体的宿主细胞。例如，经修饰的真核宿主细胞可通过将核酸(例如，异源核酸)引入合适的真核宿主细胞中来产生。
如本文所用，“无细胞系统”可以指细胞裂解物、细胞提取物或其他制剂，其中制剂中基本上所有的细胞已经被破坏或以其他方式进行加工，使得所有或选定的细胞组分，例如细胞器、蛋白质、核酸、细胞膜本身(或其片段或组分)等从细胞释放或重悬于适当的培养基中和/或从细胞环境中纯化。无细胞系统可包括由纯化和/或分离的多肽和合适的试剂和缓冲液制备的反应混合物。
在一些实施方案中，可以在多肽的氨基酸序列中进行保守性取代而不破坏多肽的三维结构或功能。技术人员可以通过将具有相似疏水性、极性和R链长度的氨基酸彼此取代来实现保守性取代。另外，通过比较来自不同物种的同源蛋白质的比对序列，可以通过定位物种之间突变的氨基酸残基来鉴定保守性取代，而不改变所编码的蛋白质的基本功能。术语“保守性氨基酸取代”可以指蛋白质中具有相似侧链的氨基酸残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一类氨基酸可以由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成；具有脂肪族羟基侧链的一类氨基酸可以由丝氨酸和苏氨酸组成；具有含酰胺的侧链的一类氨基酸可以由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；具有芳族侧链的一类氨基酸可以由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成；具有碱性侧链的一类氨基酸可以由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成；具有酸性侧链的一类氨基酸可以由谷氨酸和天冬氨酸组成；并且具有含硫侧链的一类氨基酸可以由半胱氨酸和甲硫氨酸组成。示例性的保守性氨基酸取代类别是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这意味着比对时，该百分比的碱基或氨基酸是相同的，并且当比较两个序列时，处于相同的相对位置。可以以多种不同的方式测定序列同一性。为了测定序列同一性，可以使用在万维网网站(包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST,ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/mafft.cbrc.jp/alignment/software/)上可用的各种方法和计算机程序(例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)比对序列。参见，例如，Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10。
在进一步描述本公开之前，应理解本公开不限于所描述的特定实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在为限制性。
在提供值的范围时，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则介于该范围上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一)以及该规定范围内的任何其它规定值或居间值均涵盖在本公开的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本公开内，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实践或试验中，但现在描述的是优选方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”可包括复数指示物。因此，例如，提及“大麻素化合物”或“大麻素”可以包括多种此类化合物，并且提及“经修饰的宿主细胞”可以包括提及一种或多种经修饰的宿主细胞及其本领域技术人员已知的等同物，等等。还应注意，可以起草权利要求以排除任何任选要素。同样，该声明旨在作为与权利要求要素的叙述一起使用此类排他性术语如“只”、“仅”等，或使用“否定性”限制的前置基础。
应当理解，为了清楚起见在单独的实施方案的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施方案中以组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独地提供或以任何合适的子组合提供。与本公开有关的实施方案的所有组合都明确地被本公开所包含，并且在本文中公开，就如同每个组合都被单独地且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其元件的所有子组合也明确地被本公开所包含，并且在本文中公开，就如同每个此类子组合在本文中单独地且明确地公开一样。
大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体
本文公开了大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列。本发明人已经鉴定了包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽中当被取代时，可产生经工程改造的变体的一种或多种改善性质的氨基酸位置。在本公开的一个方面，该取代处于与来自大麻的SEQID NO:3的CBDAS多肽中的位置相对应的位置。来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽包含以下结构域：
1.信号多肽：氨基酸1-28。
2.FAD结合结构域：氨基酸77-251。
3.BBE结构域：氨基酸479-537。
来自大麻的SEQ ID NO：3的CBDAS多肽也包含以下结构域表面暴露的氨基酸：：28-33、35、36、39-45、47-50、52、55-59、61、62、65、66、69、71-77、79、80、82、88、89、90、94、98、101、102、104、109、114、115、124、125、126、133、134、136-139、141-145、148、150、161、164-168、176、183、197、202、205、208、213、215-221、223、224、225、231、236、245、247、250、252、253、258、260、261-267、270、273、274、277、278、280、281、283、284、285、291、293、295-305、311、317、320、321、322、325、326、328、329、330、332、333、335、337-340、342、343、348、355、357-367、370-373、376、377、388、389、390、392、393、394、398、401、402、404、405、407、408、409、412、421、423-429、436、437、443、445、447、449、450-453、455、456、459、462、463、466、467、469、470、471、474-477、482、483、486、487、490、492-501、503、504、507、508、512、515、516、519、523、524、526、527、529、531和539-544。
本文讨论的经工程改造的变体中的残基位置相对于参考氨基酸序列，来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽(本文示于表1；UniProtKB/Swiss-Prot：A6P6V9.1)进行标识。因此，提及“K165”标识的氨基酸是在来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽中，自N末端起第165个氨基酸，其中甲硫氨酸是第一个氨基酸。在来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽中，第165个氨基酸是赖氨酸(K)。本领域技术人员理解K165氨基酸在来自不同物种或不同同种型的CBDAS多肽中可具有不同位置。这些经工程改造的变体旨在被本公开所涵盖。
存在特定氨基酸或氨基酸变化(“残基差异”)的多肽序列位置在本文中有时描述为“Xn”或“位置n”，其中n是指相对于参考序列的氨基酸位置。因此，提及“X165”标识的氨基酸是在来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽中，自N末端起第165个氨基酸。
特定取代突变，其为参考序列中的特定氨基酸被不同的指定残基置换，可以用常规符号“X(数字)Y”表示，其中X是参考序列中氨基的单字母标识符，“数字”是参考序列中的氨基酸位置，且Y是经工程改造的序列中氨基酸取代的单字母标识符。因此，提及“K165A”标识的取代是在来自大麻的SEQ ID NO:3的CBDAS多肽中，自N末端起第165个氨基酸，即赖氨酸，被丙氨酸置换。
大麻素合酶多肽，分泌性多肽具有可阻碍在经修饰的宿主细胞(诸如经修饰的酵母细胞)中表达的结构特征。大麻素合酶多肽包含二硫键、许多糖基化位点(包括N-糖基化位点)和共价附接的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子部分。因此，在经修饰的宿主细胞，诸如经修饰的酵母细胞中重构大麻素合酶多肽的活性或表达大麻素合酶多肽可能具有挑战性且不可靠。常常这些分泌性多肽错误折叠或错误定位，导致低表达、多肽缺乏活性、宿主细胞活力降低和/或细胞死亡。如本文所公开的，与包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽相比，经工程改造的变体可具有改善的表达、折叠和酶活性。另外，与表达包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽的经修饰的宿主细胞相比，本公开的经工程改造的变体的表达可加强本文公开的经修饰的宿主细胞的活力。
本公开提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％序列同一性的氨基酸序列。
本公开提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在信号多肽、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，信号多肽中存在至少一个氨基酸取代。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体在信号多肽中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14或至少15个氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体在信号多肽中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。在其中信号多肽中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X12、X17、X18和X20。在其中信号多肽中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18和S20。在其中信号多肽中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W和S20G。在一些实施方案中，在FAD结合结构域中存在至少一个氨基酸取代。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14或至少15个氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。在其中FAD结构域中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X97、X98、X100、X103、X109、X124、X125、X129、X132、X137、X143、X149、X161、X165、X167、X168、X170、X171、X172、X175、X180、X181、X196、X208、X235和X250。在其中FAD结构域中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235和A250。在其中FAD结构域中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P和A250T。在一些实施方案中，在BBE结构域中存在至少一个氨基酸取代。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体在BBE结构域中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14或至少15个氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体在BBE结构域中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。在其中BBE结构域中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X499和X527。在其中BBE结构域中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：Y499和N527。在其中BBE结构域中存在至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸取代：Y499M、Y499V和N527E。
本公开提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代。在某些此类实施方案中，至少一个表面暴露的疏水性氨基酸被亲水性氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个表面暴露的亲水性氨基酸被疏水性氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14或至少15个表面暴露的氨基酸的取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个表面暴露的氨基酸的取代。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：X31、X43、X49、X50、X55、X56、X57、X61、X62、X71、X109、X124、X125、X137、X143、X161、X165、X167、X168、X208、X250、X260、X326、X389、X428、X466、X499、X527、X541、X542、X543和X544。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：X31、X43、X49、X50、X55、X56、X57、X61、X62、X71、X109、X124、X125、X137、X143、X161、X165、X167、X168、X208、X250、X260、X326、X389、X412、X428、X445、X466、X499、X527、X541、X542、X543和X544。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、Q55、N56、N57、M61、S62、L71、T109、Q124、V125、S137、H143、W161、K165、E167、N168、H208、A250、K260、L326、K389、S428、N466、Y499、N527、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、Q55、N56、N57、M61、S62、L71、T109、Q124、V125、S137、H143、W161、K165、E167、N168、H208、A250、K260、L326、K389、M412、S428、I445、N466、Y499、N527、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、L71A、L71H、L71Q、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、S137G、H143D、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、H208T、A250T、K260C、K260W、L326I、K389E、S428L、N466D、Y499M、Y499V、N527E、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、L71A、L71H、L71Q、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、S137G、H143D、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、H208T、A250T、K260C、K260W、L326I、K389E、M412Q、S428L、I445M、N466D、Y499M、Y499V、N527E、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。用亲水性氨基酸取代表面暴露的疏水性氨基酸可以增加溶剂暴露的氨基酸的亲水性，从而可以改善本公开的经工程改造的变体在水性(非毛状体)环境中的溶解度。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X12、X17、X18、X20、X31、X33、X43、X49、X50、X51、X55、X56、X57、X59、X61、X62、X63、X66、X71、X75、X97、X98、X100、X103、X109、X124、X125、X129、X132、X137、X143、X149、X161、X165、X167、X168、X170、X171、X172、X175、X180、X181、X196、X208、X235、X250、X256、X260、X268、X309、X310、X316、X326、X378、X389、X406、X428、X439、X466、X474、X499、X527、X538、X541、X542、X543和X544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X12、X17、X18、X20、X31、X33、X43、X49、X50、X51、X55、X56、X57、X59、X61、X62、X63、X66、X71、X75、X97、X98、X100、X103、X109、X124、X125、X129、X132、X137、X143、X149、X161、X165、X167、X168、X170、X171、X172、X175、X180、X181、X196、X208、X235、X250、X256、X260、X268、X309、X310、X316、X326、X378、X389、X406、X412、X415、X428、X439、X445、X466、X474、X499、X527、X538、X541、X542、X543和X544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X31、X43、X49、X50、X51、X55、X56、X57、X61、X62、X71、X97、X100、X103、X109、X124、X125、X129、X132、X137、X143、X149、X161、X165、X167、X168、X170、X171、X172、X175、X180、X181、X196、X208、X235、X250、X256、X260、X268、X309、X310、X316、X326、X378、X389、X428、X439、X466、X474、X499、X527、X538、X541、X542、X543和X544。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X49、X50、X56、X57、X125、X132、X149、X161、X165、X170、X171、X172、X196、X235、X260、X268、X310、X316、X326、X378、X428、X499、X527、X543和X544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X31、X43、X49、X50、X56、X57、X71、X100、X103、X109、X124、X125、X129、X132、X137、X143、X161、X165、X167、X168、X170、X171、X172、X175、X180、X181、X196、X208、X235、X250、X256、X260、X268、X309、X310、X316、X326、X378、X389、X406、X428、X439、X466、X474、X499、X527、X541、X542、X543和X544。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X31、X57、X61、X71、X170、X172、X175、X196、X208、X235、X260、X378、X389和X543。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X57、X170、X172、X196、X235、X260和X378。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X412、X415和X445。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸X445处的氨基酸取代。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量，和/或在相似条件下相同时间长度内与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与CBCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、M412、L415、S428、L439、I445、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、M61、S62、L71、I97、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：L49、K50、N56、N57、V125、L132、V149、W161、K165、S170、L171、A172、N196、A235、K260、L268、T310、F316、L326、G378、S428、Y499、N527、H543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、N56、N57、L71、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、R541、H542、R543和H544。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、N57、M61、L71、S170、A172、Y175、N196、H208、A235、K260、G378、K389和R543。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：N57、S170、A172、N196、A235、K260和G378。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：M412、L415和I445。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸I445处的氨基酸取代。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量，和/或在相似条件下相同时间长度内与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与CBCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、M412Q、L415M、S428L、L439M、I445M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、M61H、M61S、M61W、S62Q、L71A、L71Q、I97V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：L49E、L49Q、K50T、N56E、N57D、V125E、L132M、V149I、W161R、K165A、S170T、L171I、A172V、N196Q、N196T、N196V、A235P、K260W、K260C、L268I、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、S428L、Y499M、Y499V、N527E、H543E和H544E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49Q、L49K、K50T、N56E、N57D、L71Q、L71H、L71A、S100A、V103F、V103A、T109V、Q124D、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、W161R、W161K、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260W、K260C、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499V、Y499M、N527E、R541V、H542V、R543E、R543A、H544D和H544E。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、N57D、M61W、L71H、S170T、A172V、Y175F、N196V、H208T、A235P、K260W、G378T、K389E和R543E。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N57D、S170T、A172V、N196V、A235P、K260W和G378T。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M412Q、L415M和I445M。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代I445M。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量，和/或在相似条件下相同时间长度内与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与CBCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ IDNO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ IDNO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ IDNO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ IDNO:232、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:304。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ IDNO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ IDNO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ IDNO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:142、SEQ IDNO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ IDNO:186、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:230和SEQ IDNO:232。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ IDNO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ IDNO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ IDNO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ IDNO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:104、SEQID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:202和SEQ ID NO:230。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:198。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:300、SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:304。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:300的氨基酸序列。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量，和/或在相似条件下相同时间长度内与具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与CBCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29或至少30个氨基酸取代。本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸取代。可以产生本文所述的氨基酸取代的组合，并针对改善的大麻二酚酸合酶(CBDAS)性质筛选所得经工程改造的变体。包含本文所述的所有取代的组合的经工程改造的变体旨在被本公开所涵盖。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29或至少30个本文所述的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个本文所述的氨基酸取代(例如，1-30个本文所述的氨基酸取代)。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个本文所述的氨基酸取代(例如，1-15个本文所述的氨基酸取代)。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个本文所述的氨基酸取代(例如，1-10个本文所述的氨基酸取代)。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个、2个、3个、4个或5个本文所述的氨基酸取代(例如，1-5个本文所述的氨基酸取代)。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个、2个、3个或4个本文所述的氨基酸取代(例如，1-4个本文所述的氨基酸取代)。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个、2个或3个本文所述的氨基酸取代(例如，1-3个本文所述的氨基酸取代)。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个或2个本文所述的氨基酸取代(例如，1-2个本文所述的氨基酸取代)。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含1个本文所述的氨基酸取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含2个本文所述的氨基酸取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含3个本文所述的氨基酸取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含4个本文所述的氨基酸取代。
在一些实施方案中，经工程改造的变体包含5个本文所述的氨基酸取代。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X61、X378和X389。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸X61和X378处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸X61和X389处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸X378和X389处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸X61、X378和X389处的氨基酸取代。本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：M61、G378和K389。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸M61和G378处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸M61和K389处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸G378和K389处的氨基酸取代。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在氨基酸M61、G378和K389处的氨基酸取代。本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M61W、G378T和K389E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W和G378T。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W和K389E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代G378T和K389E。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W、G378T和K389E。本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:318和SEQ ID NO:320。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:316的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含SEQ ID NO:320的氨基酸序列。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量，和/或在相似条件下相同时间长度内与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBCA与CBDA的比率相比，此类经工程改造的变体可以增加的CBCA与CBDA的比率从CBGA产生CBDA。
本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个不变氨基酸。本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个不变氨基酸。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含至少一个不变氨基酸。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14或至少15个不变氨基酸。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含至少一个不变氨基酸，所述至少一个不变氨基酸选自由以下组成的组：X87、X93、X99、X108、X110、X112、X117、X118、X120、X126、X127、X131、X141、X148、X152、X153、X155、X156、X157、X159、X160、X163、X173、X174、X176、X177、X178、X179、X182、X183、X184、X185、X187、X188、X189、X190、X191、X192、X193、X195、X201、X202、X205、X206、X210、X214、X223、X225、X226、X227、X228、X231、X234、X237、X238、X239、X245、X246、X248和X251。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体在FAD结合结构域中包含至少一个不变氨基酸，所述至少一个不变氨基酸选自由以下组成的组：P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248和V251。
在相似条件下相同时间长度内，与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽所产生的THCA与CBDA的比率相比，在FAD结合结构域中存在的氨基酸D115处包含取代，诸如D115N(SEQ ID NO:306)的经工程改造的变体，可以以增加的THCA与CBDA的比率从CBGA产生THCA。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在BBE结构域中包含至少一个不变氨基酸。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体在BBE结构域中包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14或至少15个不变氨基酸。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体在BBE结构域中包含至少一个不变氨基酸，所述至少一个不变氨基酸选自由以下组成的组：X484、X498、X502、X513、X514、X521、X528、X529、X533、X534和X535。在一些实施方案中，其中所述经工程改造的变体在BBE结构域中包含至少一个不变氨基酸，所述至少一个不变氨基酸选自由以下组成的组：R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：X28、X34、X35、X37、X64、X70、X87、X93、X99、X108、X110、X112、X117、X118、X120、X126、X127、X131、X141、X148、X152、X153、X155、X156、X157、X159、X160、X163、X173、X174、X176、X177、X178、X179、X182、X183、X184、X185、X187、X188、X189、X190、X191、X192、X193、X195、X201、X202、X205、X206、X210、X214、X223、X225、X226、X227、X228、X231、X234、X237、X238、X239、X245、X246、X248、X251、X259、X276、X312、X313、X323、X341、X352、X354、X380、X381、X382、X383、X385、X386、X391、X419、X422、X425、X430、X431、X433、X434、X435、X437、X440、X443、X444、X464、X465、X468、X469、X471、X472、X476、X484、X498、X502、X513、X514、X521、X528、X529、X533、X534和X535。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：X37、X70、X93、X99、X117、X120、X127、X131、X156、X157、X159、X174、X176、X182、X183、X185、X187、X188、X189、X190、X191、X192、X195、X202、X206、X214、X228、X234、X238、X248、X276、X313、X323、X354、X381、X383、X385、X419、X422、X435、X440、X443、X444、X471、X476、X513、X514、X528和X534。本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：A28、F34、L35、C37、L64、N70、P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248、V251、V259、Q276、F312、S313、L323、C341、F352、S354、F380、K381、I382、K383、D385、Y386、I391、G419、M422、I425、I430、P431、P433、H434、R435、G437、Y440、W443、Y444、I464、Y465、M468、T469、Y471、V472、P476、R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：C37、N70、I93、C99、E117、S120、F127、D131、G156、E157、Y159、G174、C176、G182、G183、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、R195、D202、D206、G214、W228、G234、F238、L248、Q276、S313、L323、S354、K381、K383、D385、G419、M422、R435、Y440、W443、Y444、Y471、P476、N513、F514、N528和Q534。本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：A28、F34、L35、C37、L64、N70、P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248、V251、V259、Q276、F312、S313、L323、C341、F352、S354、F380、K381、I382、K383、D385、Y386、I391、M412、L415、G419、M422、I425、I430、P431、P433、H434、R435、G437、Y440、W443、Y444、I445、I464、Y465、M468、T469、Y471、V472、P476、R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。
本公开提供经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24或至少25个不变氨基酸，条件是所述经工程改造的变体与SEQ ID NO:3相比具有至少一个氨基酸取代。可以产生具有本文所述的不变氨基酸和取代的组合的经工程改造的变体，并针对改善的大麻二酚酸合酶(CBDAS)性质筛选所得经工程改造的变体。包含本文所述的所有取代和不变氨基酸的组合的经工程改造的变体旨在被本公开所涵盖。
在相似条件下相同时间长度内，与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽所产生的THCA与CBDA的比率相比，在氨基酸D115处包含取代，诸如D115N(SEQ IDNO:306)，或在氨基酸A414处包含取代，诸如A414T(SEQ ID NO:308)、A414V(SEQ ID NO:310)和A414M(SEQ ID NO:312)的经工程改造的变体，可以以增加的THCA与CBDA的比率从CBGA产生THCA。
本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在C末端包含至少一个氨基酸取代。在某些此类实施方案中，亲水性氨基酸被疏水性氨基酸置换。在其中经工程改造的变体在C末端包含至少一个氨基酸取代的一些实施方案中，疏水性氨基酸被亲水性氨基酸置换。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：X541、X542、X543和X544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R541、H542、R543和H544。在一些实施方案中，经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:222、SEQID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，此类经工程改造的变体可以从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在N末端、C末端或在N末端和C末端两者包含截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端和C末端两者包含截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体缺乏天然信号多肽(即，SEQ ID NO:3的氨基酸1-28)。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端、C末端或在N末端和C末端两者包含截短，并且包含与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端、C末端或在N末端和C末端两者包含截短，并且包含与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的截短(例如，在N末端的1-10个氨基酸)。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的截短(例如，在N末端的11-20个氨基酸)。在一些实施方案中，经工程改造的变体在N末端包含21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的截短(例如，在N末端的21-30个氨基酸)。
在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个氨基酸的截短。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的截短(例如，在C末端的1-10个氨基酸)。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的截短(例如，在C末端的11-20个氨基酸)。在一些实施方案中，经工程改造的变体在C末端包含21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的截短(例如，在C末端的21-30个氨基酸)。
在一些实施方案中，本公开的截短的经工程改造的变体可包含信号多肽。在某些此类实施方案中，截短的经工程改造的变体区分天然信号多肽。在一些实施方案中，信号多肽是分泌信号多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是天然分泌信号多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是合成的分泌信号多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是内质网滞留信号多肽。在某些此类实施方案中，内质网滞留信号多肽是HDEL多肽或KDEL多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是线粒体靶向信号多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是高尔基体靶向信号多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是液泡定位信号多肽。在某些此类实施方案中，液泡定位信号多肽是PEP4t多肽或PRC1t多肽。在某些此类实施方案中，液泡定位信号多肽是PEP4t多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是质膜定位信号多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是过氧化物酶体靶向信号多肽。在一些实施方案中，过氧化物酶体靶向信号多肽是PEX8多肽。在一些实施方案中，分泌信号多肽是交配因子分泌信号多肽(例如，MF多肽或进化的MF多肽(MFev))。在一些实施方案中，信号多肽与经工程改造的变体的N末端连接。
在一些实施方案中，本公开的截短的经工程改造的变体可包含膜锚定物。膜锚定物可以是插入细胞的膜中并将附接的多肽锚定在那里的序列。膜锚定物可存在于细胞外部的膜中(例如，GPI多肽)或细胞内部的膜中(例如，尾锚定物、ER锚定)。膜锚定物的实例包括但不限于糖基磷脂酰肌醇膜锚定物(GPI多肽，例如AGA1)、CAAX盒多肽(异戊二烯化，例如RAS1)或具有疏水性C末端的尾锚定多肽(例如，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸5-磷酸酶(INP54)在ER膜中具有疏水性尾锚定物或突触泡蛋白2(VAMP2)在囊泡膜中具有疏水性聚I尾锚定物)。
本公开提供了经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含一个或多个氨基酸的添加和/或缺失。
可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，从CBGA产生的CBDA的量大于由具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。另外，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与THCA的比率相比，以增加的CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与CBCA的比率相比，本公开的经工程改造的变体以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。相似条件可以指在相同的温度、pH、缓冲液和/或发酵条件，以及在相同的培养基和/或反应溶剂中的反应条件。
在本公开的一些实施方案中，在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)的量比由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
在本公开的一些实施方案中，经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在本公开的一些实施方案中，经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
这些改善的性质可通过在体外用本公开的分离的和/或纯化的经工程改造的变体或在体内表达经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的情况下，CBGA向CBDA的转化，或可替代地另一种原材料向所需大麻素或大麻素衍生物的转化来评估。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞表达牵涉MEV途径的多肽和/或牵涉大麻素生物合成的多肽和/或包含对分泌途径的修饰。预期在一种或多种试验条件下具有不同程度的稳定性、溶解度、活性和/或表达水平的本公开的经工程改造的变体将在本公开中用于在多种宿主细胞中产生大麻素或大麻素衍生物。
另外，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，由包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量。
另外，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比更快/更高的生长速率和/或较高生物质产率。另外，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA的比率相比，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA的比率从CBGA产生CBDA。而且，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。相似的培养条件可以指宿主细胞在相同的培养基中在相同的温度、pH和/或发酵条件下生长。
而且，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞相比，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长或活力没有显著降低。另外，可以制备CBDAS多肽的经工程改造的变体并针对改善的性质对其进行筛选，诸如，与未经修饰的宿主细胞相比，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长或活力没有显著降低。
包含编码大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸以及表达载体和构建体
本公开提供了包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸以及包含所述核酸的表达载体和构建体。
本公开提供了包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232、SEQID NO:234、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:304。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ IDNO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ IDNO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ IDNO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQID NO:142、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182、SEQID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQID NO:230或SEQ ID NO:232。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ IDNO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:222、SEQID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:198、SEQ IDNO:202或SEQ ID NO:230。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:198。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:300、SEQID NO:302或SEQ ID NO:304。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQID NO:300。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:314、SEQID NO:316、SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:320。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:314。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQID NO:316。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:318。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:320。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:303。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:303，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:167、SEQID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQID NO:205、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:229或SEQ ID NO:231。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:167、SEQID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQID NO:205、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:229或SEQ ID NO:231，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ IDNO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ IDNO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ IDNO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ IDNO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:91、SEQID NO:103、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:229。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:91、SEQID NO:103、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:229，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:197。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:197，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:303。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:303，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:299中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:299中所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317或SEQ ID NO:319。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317或SEQ ID NO:319，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:313中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:313中所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:315中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:315中所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:317中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:317中所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:319中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:319中所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
还包括与本文公开的核酸杂交的核酸。杂交条件可以是严格的，因为在与编码本文公开的多肽的核酸中存在的核苷酸序列具有至少90％、至少95％或至少97％的序列同一性时，才会发生杂交。严格条件可以包括用于已知的Southern杂交的那些条件，例如，在具有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×邓哈特溶液(Denhardt’s solution)、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中在42℃下温育过夜，随后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤杂交支持物。其他已知的杂交条件是公知的，并且在Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)中有描述。
本文公开的核酸的长度可以取决于预期用途。例如，如果预期用途是作为引物或探针，例如用于PCR扩增或用于筛选文库，则核酸的长度将小于全长序列，例如15-50个核苷酸。在某些此类实施方案中，引物或探针可以与核苷酸序列的高度保守区基本上相同，或者可以与核苷酸序列的5'或3'末端基本上相同。在一些情况下，这些引物或探针可以在一些位置使用通用碱基，以便“基本上相同”，但仍然在序列识别上面提供灵活性。值得注意的是，合适的引物和探针杂交条件是本领域公知的。
本公开的一些实施方案涉及包含本文公开的一种或多种核酸的载体。本公开的一些实施方案涉及包含本文公开的一种或多种核酸的表达构建体。本公开的一些实施方案涉及包含编码本公开的经工程改造的变体的密码子优化的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本文公开的核酸是异源的。
筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法
本公开提供了一种筛选包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法。在某些此类实施方案中，所述方法牵涉竞争测定，其中本公开的经工程改造的变体与相关酶一起在经修饰的宿主细胞中表达。
本公开的一些实施方案涉及一种筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述方法包括：
a)将宿主细胞群体分成对照群体和试验群体；
b)在所述对照群体中共表达具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽和对比大麻素合酶多肽，其中具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽可以将CBGA转化为第一大麻素，即CBDA，而对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为不同的第二大麻素；
c)在所述试验群体中共表达所述经工程改造的变体和所述对比大麻素合酶多肽，其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽一样，所述经工程改造的变体可以将CBGA转化为相同的第一大麻素，即CBDA，并且其中所述对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为所述第二大麻素并且在所述试验群体和所述对照群体中以相似水平表达；
d)测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素即CBDA与所述第二大麻素的比率；并且
e)以mg/L或mM计，测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素的量。在某些此类实施方案中，经工程改造的变体是本公开的经工程改造的变体。
在一些实施方案中，通过在相似培养条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，与由对照群体产生的量相比，由试验群体产生更大量的第一大麻素，将试验群体鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体。在一些实施方案中，所述试验群体经鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体，其中改善的体内性能通过在相似培养条件下相同时间长度内，与由所述对照群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率相比，由所述试验群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率增加而得以证明。
在一些实施方案中，大麻素合酶多肽是四氢大麻酚酸合酶(THCAS)多肽。在某些此类实施方案中，THCAS多肽包含与SEQ ID NO:44具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码THCAS多肽的核苷酸序列是SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码THCAS多肽的核苷酸序列是SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，编码THCAS多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:45具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，第二大麻素是THCA。
用于表达大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体和用于产生大麻素和大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞
本公开提供了经修饰的宿主细胞，所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在某些此类实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞用于表达经工程改造的变体和/或用于产生大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，编码经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了核酸(例如，异源核酸)，所述核酸可以引入微生物(例如，经修饰的宿主细胞)中，引起本公开的经工程改造的变体的表达或过表达，然后可以将经工程改造的变体在体外(例如，无细胞)或体内用于大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，这些核酸包含编码经工程改造的变体的密码子优化的核苷酸序列。
大麻素合酶多肽，分泌性多肽，诸如本公开的经工程改造的变体，具有可阻碍在经修饰的宿主细胞(诸如修饰的酵母细胞)中表达的结构特征。大麻素合酶多肽(包括公开的经工程改造的变体)包含二硫键、许多糖基化位点(包括N-糖基化位点)和共价附接的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子部分。常常这些分泌性多肽错误折叠或错误定位，导致低表达、多肽缺乏活性、宿主细胞活力降低和/或细胞死亡。如本文所公开的，在用一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸修饰的宿主细胞中对分泌途径的操纵可以改善本公开的经工程改造的变体的表达、折叠和酶活性以及经修饰的宿主细胞的活力。在某些此类实施方案中，编码经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。
为了产生大麻素或大麻素衍生物并在经修饰的宿主细胞内创建生物合成途径，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞可以表达或过表达异源核酸的组合，所述异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的多肽的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，所述宿主细胞包含一种或多种修饰以调节一种或多种分泌途径多肽的表达。调节一种或多种分泌途径多肽的表达的所述一种或多种修饰可包括向宿主细胞中引入一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸和/或宿主细胞中编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞，包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，引起一种或多种分泌途径多肽的表达或过表达。在一些实施方案中，编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞，包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调，减少或消除了一种或多种分泌途径多肽的表达。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的下调。
在一些实施方案中，在培养基中培养用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞提供了大麻素或大麻素衍生物的合成。
为了表达本公开的经工程改造的变体，经修饰的宿主细胞可以表达或过表达一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，编码经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞，包含一种或多种修饰以调节一种或多种分泌途径多肽的表达。调节一种或多种分泌途径多肽的表达的所述一种或多种修饰可包括向宿主细胞中引入一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸和/或宿主细胞中编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞，包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，引起一种或多种分泌途径多肽的表达或过表达。在一些实施方案中，编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的，包含一种或多种包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞，包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调，减少或消除了一种或多种分泌途径多肽的表达。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的下调。在用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
分泌途径修饰
在本公开的经修饰的宿主细胞中具有受调节的表达的分泌途径多肽可以包括但不限于：KAR2多肽、ROT2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽、PEP4多肽和IRE1多肽。可通过向宿主细胞中引入一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸和/或通过宿主细胞中编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调来调节分泌途径多肽的表达。在一些实施方案中，编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含以下一个或多个基因的缺失或下调：ROT2基因或PEP4基因。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含以下一个或多个基因的缺失：ROT2基因或PEP4基因。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含以下一个或多个基因的下调：ROT2基因或PEP4基因。
分泌途径多肽和编码分泌途径多肽的核苷酸序列可以源自任何合适的来源，例如细菌、酵母、真菌、藻类、人、植物或小鼠。在一些实施方案中，分泌途径多肽和编码分泌途径多肽的核苷酸序列可源自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(现称为法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii))、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉毕赤氏酵母(Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、古尔克毕赤酵母(Pichiaguercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母菌属(Saccharomyces)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)(现称为安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维氏酵母(Kluyveromyces marxianus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、木糖发酵酵母(Scheffersomyces stipites)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)(前称解腺嘌呤阿氏酵母(Arxulaadeninivorans))、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、镰孢菌属(Fusarium)、禾谷镰孢菌(Fusarium gramineum)、枯萎镰孢菌(Fusarium venenatum)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等。在一些实施方案中，本公开还涵盖编码本文公开的分泌途径多肽的直向同源基因。本文公开的示例性分泌途径多肽还可包括全长分泌途径多肽、分泌途径多肽的片段、分泌途径多肽的变体、截短的分泌途径多肽或具有分泌途径多肽的至少一种活性的融合多肽。本公开还提供了编码分泌途径多肽的核苷酸序列，所述分泌途径多肽诸如全长分泌途径多肽、分泌途径多肽的片段、分泌途径多肽的变体、截短的分泌途径多肽或具有分泌途径多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，编码分泌途径多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性KAR2多肽可包括全长KAR2多肽、KAR2多肽的片段、KAR2多肽的变体、截短的KAR2多肽或具有KAR2多肽的至少一种活性的融合多肽。
本文公开的示例性ROT2多肽可包括全长ROT2多肽、ROT2多肽的片段、ROT2多肽的变体、截短的ROT2多肽或具有ROT2多肽的至少一种活性的融合多肽。
本文公开的示例性PDI1多肽可包括全长PDI1多肽、PDI1多肽的片段、PDI1多肽的变体、截短的PDI1多肽或具有PDI1多肽的至少一种活性的融合多肽。
本文公开的示例性ERO1多肽可包括全长ERO1多肽、ERO1多肽的片段、ERO1多肽的变体、截短的ERO1多肽或具有ERO1多肽的至少一种活性的融合多肽。
本文公开的示例性FAD1多肽还可包括全长FAD1多肽、FAD1多肽的片段、FAD1多肽的变体、截短的FAD1多肽或具有FAD1多肽的至少一种活性的融合多肽。
本文公开的示例性PEP4多肽可包括全长PEP4多肽、PEP4多肽的片段、PEP4多肽的变体、截短的PEP1多肽或具有PEP4多肽的至少一种活性的融合多肽。
本文公开的示例性IRE1多肽可包括全长IRE1多肽、IRE1多肽的片段(例如，丢失前7个氨基酸)、IRE1多肽的变体、截短的IRE1多肽或具有IRE1多肽的至少一种活性的融合多肽。
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一个或多个修饰以调节KAR2多肽、ROT2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽、PEP4多肽或IRE1多肽中的一种或多种的表达。调节KAR2多肽、ROT2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽、PEP4多肽或IRE1多肽中的一种或多种的表达的所述一个或多个修饰可包括向宿主细胞中引入一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，和/或宿主细胞中编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，从而引起KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的表达或过表达。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，从而降低或消除了ROT2多肽或PEP4多肽的表达。
在一些实施方案中，调节一种或多种分泌途径多肽的表达的所述一个或多个修饰可以改善经修饰的宿主细胞的活力。改善经修饰的宿主细胞的活力可以改善工业发酵过程。ERO1多肽可作为PDI1多肽(一种蛋白质二硫键异构酶多肽)的配偶体。调节IRE1多肽的表达可防止所表达的本公开的经工程改造的变体的降解。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，所述分泌途径多肽包含SEQ ID NO:5(KAR2多肽)、SEQ ID NO:9(PDI1多肽)、SEQ ID NO:7(ERO1多肽)、SEQ ID NO:298(FAD1多肽)、SEQID NO:11(IRE1多肽)或SEQ ID NO:296(IRE1多肽片段)所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，所述分泌途径多肽包含SEQ ID NO:5(KAR2多肽)、SEQ ID NO:9(PDI1多肽)、SEQ ID NO:7(ERO1多肽)、SEQ ID NO:298(FAD1多肽)、SEQID NO:11(IRE1多肽)或SEQ ID NO:296(IRE1多肽片段)所示的氨基酸序列，或前述任一项的保守性取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，所述分泌途径多肽包含与SEQ ID NO:5(KAR2多肽)、SEQ ID NO:9(PDI1多肽)、SEQ ID NO:7(ERO1多肽)、SEQ ID NO:298(FAD1多肽)、SEQID NO:11(IRE1多肽)或SEQ ID NO:296(IRE1多肽片段)具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调，所述分泌途径多肽包含SEQ ID NO:13(ROT2多肽)或SEQ ID NO:15(PEP4多肽)所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的两种或更多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的三种或更多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的两种或更多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的三种或更多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码FAD1多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽和PEP4多肽的基因的缺失或下调。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码分泌途径多肽的核苷酸序列的核酸，所述分泌途径多肽诸如全长分泌途径多肽、分泌途径多肽的片段、分泌途径多肽的变体、截短的分泌途径多肽或具有分泌途径多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的核酸，所述KAR2多肽诸如全长KAR2多肽、KAR2多肽的片段、KAR2多肽的变体、截短的KAR2多肽或具有KAR2多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码ROT2多肽的核苷酸序列的核酸，所述ROT2多肽诸如全长ROT2多肽、ROT2多肽的片段、ROT2多肽的变体、截短的ROT2多肽或具有ROT2多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的核酸，所述PDI1多肽诸如全长PDI1多肽、PDI1多肽的片段、PDI1多肽的变体、截短的PDI1多肽或具有PDI1多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的核酸，所述ERO1多肽诸如全长ERO1多肽、ERO1多肽的片段、ERO1多肽的变体、截短的ERO1多肽或具有ERO1多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码FAD1多肽的核苷酸序列的核酸，所述FAD1多肽诸如全长FAD1多肽、FAD1多肽的片段、FAD1多肽的变体、截短的FAD1多肽或具有FAD1多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码PEP4多肽的核苷酸序列的核酸，所述PEP4多肽诸如全长PEP4多肽、PEP4多肽的片段、PEP4多肽的变体、截短的PEP1多肽或具有PEP4多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的核酸，所述IRE1多肽诸如全长IRE1多肽、IRE1多肽的片段(例如，丢失前7个氨基酸)、IRE1多肽的变体、截短的IRE1多肽或具有IRE1多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，一种或多种分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可通过增加一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码所述一种或多种分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的异源核酸，所述异源核酸包含编码分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的异源核酸，所述异源核酸包含编码分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的异源核酸，所述异源核酸包含编码分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的异源核酸，所述异源核酸包含编码分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的异源核酸，所述异源核酸包含编码分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个或更多个拷贝的异源核酸，所述异源核酸包含编码分泌途径多肽，诸如KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽的核苷酸序列。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需多肽活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO:4(编码KAR2多肽)、SEQ ID NO:8(编码PDI1多肽)、SEQ ID NO:6(编码ERO1多肽)、SEQ ID NO:297(编码FAD1多肽)、SEQ ID NO:10(编码IRE1多肽)或SEQ ID NO:295(编码IRE1多肽片段)所示的核苷酸序列组成的组。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO:4(编码KAR2多肽)、SEQ ID NO:8(编码PDI1多肽)、SEQ ID NO:6(编码ERO1多肽)、SEQ ID NO:297(编码FAD1多肽)、SEQ ID NO:10(编码IRE1多肽)或SEQ ID NO:295(编码IRE1多肽片段)所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列组成的组。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列的异源核酸，所述核苷酸序列选自与SEQ ID NO:4(编码KAR2多肽)、SEQ ID NO:8(编码PDI1多肽)、SEQ ID NO:6(编码ERO1多肽)、SEQ ID NO:297(编码FAD1多肽)、SEQ ID NO:10(编码IRE1多肽)或SEQ ID NO:295(IRE1多肽片段)具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的核苷酸序列组成的组。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调，所述分泌途径多肽由选自由SEQ ID NO:12(编码ROT2多肽)和SEQ ID NO:14(编码PEP4多肽)所示的核苷酸序列组成的组的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含ROT2基因的缺失或下调。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含ROT2基因的缺失。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含ROT2基因的下调。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含PEP4基因的缺失或下调。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含PEP4基因的缺失。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含PEP4基因的下调。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的宿主细胞包含PEP4基因和ROT2基因的缺失或下调。在一些实施方案中，本发明的经修饰的宿主细胞包含PEP4基因和ROT2基因的缺失。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含PEP4基因和ROT2基因的下调。
大麻素和大麻素前体生物合成途径的修饰
包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞还可包含一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。除了本公开的经工程改造的变体之外，此类多肽可以包括但不限于：香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽、四酮化合物合酶(TKS)多肽、橄榄醇酸环化酶(OAC)多肽、一种或多种具有甲羟戊酸(MEV)途径中存在的多肽的至少一种活性的多肽(例如，一种或多种MEV途径多肽)、酰基活化酶(AAE)多肽、产生GPP的多肽(例如，香叶基焦磷酸合酶(GPPS)多肽)、使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A的多肽(例如，乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽)和丙酮酸脱羧酶多肽。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽和编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的核苷酸序列可以源自任何合适的来源，例如细菌、酵母、真菌、藻类、人、植物(例如，大麻)或小鼠。在一些实施方案中，本公开还涵盖编码本文公开的牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的直向同源基因。本文公开的牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的示例性多肽还可包括牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的全长多肽、牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的片段、牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的变体、牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的截短多肽或具有牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的至少一种活性的融合多肽。本公开还提供了编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的核苷酸序列，所述多肽诸如牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的全长多肽、牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的片段、牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的变体、牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的截短多肽或具有牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，大麻二酚酸合酶多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ IDNO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ IDNO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:304。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:168、SEQID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQID NO:206、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:230或SEQ ID NO:232。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含以下各项中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ IDNO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ IDNO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ IDNO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:234所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:156、SEQID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:202或SEQ ID NO:230所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中经工程改造的变体包含SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:184或SEQ ID NO:198所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:304所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:300所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:318或SEQ ID NO:320所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:314所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:316所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:318所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:320所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经工程改造的变体在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的一种或多种核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个或更多个拷贝的包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ IDNO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ IDNO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ IDNO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:231、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:303。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ IDNO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ IDNO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ IDNO:231、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:303，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ IDNO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ IDNO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ IDNO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ IDNO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ IDNO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ IDNO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ IDNO:229或SEQ ID NO:231。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:135、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ IDNO:229或SEQ ID NO:231，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ IDNO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ IDNO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ IDNO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ IDNO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ IDNO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:233，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:229。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:201或SEQ ID NO:229，或前述中任一者的密码子简并序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:197。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:197，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:299、SEQ IDNO:301或SEQ ID NO:303。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:299、SEQ IDNO:301或SEQ ID NO:303，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:299所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:299所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:313、SEQ IDNO:315、SEQ ID NO:317或SEQ ID NO:319。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是以下各项中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:313、SEQ IDNO:315、SEQ ID NO:317或SEQ ID NO:319，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:313所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:313所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:315所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:315所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:317所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:317所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:319所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本文公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:319所示的核苷酸序列，或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。
在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的所述一种或多种核酸中的至少一种与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的所述一种或多种核酸中的至少一种与组成型启动子可操作地连接。
香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性GOT多肽可包括全长GOT多肽、GOT多肽的片段、GOT多肽的变体、截短的GOT多肽或具有GOT多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，GOT多肽具有芳族异戊烯基转移酶(PT)活性。在一些实施方案中，GOT多肽使大麻素前体或大麻素前体衍生物改性。在某些此类实施方案中，GOT多肽使橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物改性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述GOT多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述GOT多肽包含SEQID NO:17所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码GOT多肽的核苷酸序列的核酸，所述GOT多肽诸如全长GOT多肽、GOT多肽的片段、GOT多肽的变体、截短的GOT多肽或具有GOT多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，GOT多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码GOT多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码GOT多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个或更多个拷贝的包含编码GOT多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少85％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GOT多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:16具有至少95％的序列同一性。
NphB多肽
在一些实施方案中，使用NphB多肽代替GOT多肽从GPP和橄榄醇酸产生大麻萜酚酸。本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性NphB多肽可包括全NphB多肽、NphB多肽的片段、NphB多肽的变体、截短的NphB多肽或具有NphB多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，NphB多肽具有芳族异戊烯基转移酶(PT)活性。在一些实施方案中，NphB多肽使大麻素前体或大麻素前体衍生物改性。在某些此类实施方案中，NphB多肽使橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物改性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述NphB多肽包含SEQ ID NO:294所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述NphB多肽包含SEQ ID NO:294所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述NphB多肽包含与SEQ ID NO:294具有至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述NphB多肽包含与SEQ ID NO:294具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述NphB多肽包含与SEQ ID NO:294具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码NphB多肽的核苷酸序列的核酸，所述NphB多肽诸如全长NphB多肽、NphB多肽的片段、NphB多肽的变体、截短的NphB多肽或具有NphB多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，NphB多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码NphB多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码NphB多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个或更多个拷贝的包含编码NphB多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:293所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:293所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:293具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:293具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:293具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:293具有至少85％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:293具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:293具有至少95％的序列同一性。
产生酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物的多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码产生酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物的多肽的核苷酸序列。此类多肽可包括但不限于酰基活化酶(AAE)多肽、脂肪酰基辅酶A合酶(FAA)多肽或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列。
AAE多肽、FAA多肽和脂肪酰基辅酶A连接酶多肽可以将羧酸转化成它们的辅酶A形式并产生酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物。混杂的酰基活化酶多肽(诸如CsAAE1和CsAAE3多肽)、FAA多肽或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽，可以容许产生大麻素衍生物(例如，大麻萜酚酸衍生物)以及大麻素(例如，大麻萜酚酸)。在一些实施方案中，将未取代的或经取代的己酸或除未取代的或经取代的己酸以外的羧酸加料至表达AAE多肽、FAA多肽或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的经修饰的宿主细胞(例如，存在于细胞在其中生长的培养基中)以产生己酰辅酶A、酰基辅酶A化合物、己酰辅酶A的衍生物或酰基辅酶A化合物的衍生物。然后己酰辅酶A、酰基辅酶A化合物、己酰辅酶A的衍生物或酰基辅酶A化合物的衍生物被经修饰的宿主细胞进一步利用以产生大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，包含经修饰的宿主细胞的细胞培养基包含未取代的或经取代的己酸。在一些实施方案中，包含经修饰的宿主细胞的细胞培养基包含除未取代或经取代的己酸以外的羧酸。
本文公开的示例性AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽可包括全长AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽；AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的片段；AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的变体；截短的AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽；或具有AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的至少一种活性的融合多肽。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述AAE多肽包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述AAE多肽包含SEQID NO:23所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述AAE多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述AAE多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述AAE多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽诸如全长AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽；AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的片段；AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的变体；截短的AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽；或具有AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，一种或多种AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的所述一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个或更多个拷贝的包含编码AAE、FAA或脂肪酰基辅酶A连接酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:22具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
使酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物与丙二酰辅酶A缩合以产生橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物的多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码一种或多种多肽的核苷酸序列，所述一种或多种多肽使酰基辅酶A化合物(诸如己酰辅酶A)或酰基辅酶A化合物衍生物(诸如己酰辅酶A衍生物)与丙二酰辅酶A缩合以产生橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物。使酰基辅酶A化合物或酰基辅酶A化合物衍生物与丙二酰辅酶A反应以产生橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物的多肽可包括TKS和OAC多肽。已经发现TKS和OAC多肽具有广泛的底物特异性，使得能够产生大麻素衍生物或大麻素。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性TKS或OAC多肽可包括全长TKS或OAC多肽、TKS或OAC多肽的片段、TKS或OAC多肽的变体、截短的TKS或OAC多肽或具有TKS或OAC多肽的至少一种活性的融合多肽。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述TKS多肽包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述TKS多肽包含SEQID NO:19所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述TKS多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述TKS多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述TKS多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的变体OAC(Y27F变体)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列的变体OAC(Y27F变体)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是包含与SEQ ID NO:48具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体OAC(Y27F变体)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是包含与SEQ ID NO:48具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体OAC(Y27F变体)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是包含与SEQ ID NO:48具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体OAC(Y27F变体)多肽。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码TKS或OAC多肽的核苷酸序列的核酸，所述TKS或OAC多肽诸如全长TKS或OAC多肽、TKS或OAC多肽的片段、TKS或OAC多肽的变体、截短的TKS或OAC多肽或具有TKS或OAC多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，TKS多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码TKS多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码TKS多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有九个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十一个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十二个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十二个或更多个拷贝的包含编码TKS多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，OAC多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码OAC多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码OAC多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有九个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十一个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十二个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十二个或更多个拷贝的包含编码OAC多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:18具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列或前述中任一者的密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:47具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:47具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是变体OAC(Y27F变体)多肽，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是变体OAC(Y27F变体)多肽，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是变体OAC(Y27F变体)多肽，其中所述核苷酸序列与与SEQ ID NO:47具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列，其中所述OAC多肽是变体OAC(Y27F变体)多肽，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:47具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
产生香叶基焦磷酸的多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码产生GPP的多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，产生GPP的多肽是香叶基焦磷酸合酶(GPPS)多肽。在一些实施方案中，GPPS多肽还具有法呢基二磷酸合酶(FPPS)多肽活性。在一些实施方案中，修饰GPPS多肽，使其具有比经修饰的GPPS多肽所来源的相应野生型或亲本GPPS多肽降低的FPPS多肽活性(例如，低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或大于至少90％的FPPS多肽活性)。在一些实施方案中，修饰GPPS多肽，使其基本上不具有FPPS多肽活性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性GPPS多肽可包括全长GPPS多肽、GPPS多肽的片段、GPPS多肽的变体、截短的GPPS多肽或具有GPPS多肽的至少一种活性的融合多肽。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是包含SEQ IDNO:41所示的氨基酸序列的变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列的变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是包含与SEQ ID NO:41具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是包含与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是包含与SEQ ID NO:41具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽。该氨基酸序列中的突变改变了GPP与法尼基二磷酸(FPP)的比率，增加了产生CBDA所需的GPP产量。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的核酸，所述GPPS多肽诸如全长GPPS多肽、GPPS多肽的片段、GPPS多肽的变体、截短的GPPS多肽或具有GPPS多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，GPPS多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码GPPS多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个或更多个拷贝的包含编码GPPS多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽，其中所述核苷酸序列与与SEQ ID NO:40具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码GPPS多肽的核苷酸序列，其中所述GPPS多肽是变体GPPS(ERG20mut，F96W、N127W)多肽，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:40具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
从丙酮酸产生乙酰辅酶A的多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码从丙酮酸产生乙酰辅酶A的多肽的核苷酸序列。从丙酮酸产生乙酰辅酶A的多肽可以包括丙酮酸脱羧酶(PDC)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性PDC多肽可包括全长PDC多肽、PDC多肽的片段、PDC多肽的变体、截短的PDC多肽或具有PDC多肽的至少一种活性的融合多肽。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述PDC多肽包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述PDC多肽包含SEQID NO:35所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述PDC多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述PDC多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述PDC多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的示例性异源核酸可以包括包含编码PDC多肽的核苷酸序列的核酸，所述PDC多肽诸如全长PDC多肽、PDC多肽的片段、PDC多肽的变体、截短的PDC多肽或具有PDC多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，PDC多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码PDC多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码PDC多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码PDC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码PDC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码PDC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码PDC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码PDC多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个或更多个拷贝的包含编码PDC多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDC多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:34具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A的多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A的多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A的多肽是乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽可包括全长乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽、乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的片段、乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的变体、截短的乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽或具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的至少一种活性的融合多肽。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的核酸，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽诸如全长乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽、乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的片段、乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的变体、截短的乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽或具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个或更多个拷贝的包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:30具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
甲羟戊酸途径多肽
本公开的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码具有甲羟戊酸(MEV)途径中存在的多肽的至少一种活性的一种或多种多肽的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，具有甲羟戊酸(MEV)途径中存在的多肽的至少一种活性的所述一种或多种多肽包括一种或多种MEV途径多肽。
在一些实施方案中，作为产生GPP的生物合成途径的一部分的所述一种或多种多肽可以是具有甲羟戊酸途径中存在的多肽的至少一种活性的一种或多种多肽。甲羟戊酸途径可包含催化以下步骤的多肽：(a)使两个乙酰辅酶A分子缩合以产生乙酰乙酰辅酶A(例如，通过乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的作用)；(b)使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)(例如，通过HMGS多肽的作用)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸(例如，通过HMGR多肽的作用)；(d)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸(例如，通过MK多肽的作用)；(e)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸(例如，通过PMK多肽的作用)；(f)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸(例如，通过甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD或MVD1)多肽的作用)；和(g)将异戊烯焦磷酸转化为二甲基烯丙基焦磷酸(例如，通过异戊烯焦磷酸异构酶(IDI1)多肽的作用)。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码一种或多种MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码两种或更多种MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码三种或更多种MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码四种或更多种MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码五种或更多种MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码六种或更多种MEV途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码所有MEV途径多肽的核苷酸序列。
本文公开的示例性MEV途径多肽还可包括全长MEV途径多肽、MEV途径多肽的片段、MEV途径多肽的变体、截短的MEV途径多肽或具有MEV途径多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，所述一种或多种MEV途径多肽选自由以下组成的组：乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽、HMGS多肽、HMGR多肽、MK多肽、PMK多肽、MVD1多肽和IDI1多肽。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述HMGS多肽包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述HMGS多肽包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述HMGS多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述HMGS多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述HMGS多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HMGR多肽是截短的HMGR(tHMGR)多肽。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述tHMGR多肽包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述tHMGR多肽包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述tHMGR多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述tHMGR多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述tHMGR多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述MK多肽包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述MK多肽包含SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述MK多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述MK多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述MK多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述PMK多肽包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述PMK多肽包含SEQID NO:37所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述PMK多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述PMK多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述PMK多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述MVD1多肽包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述MVD1多肽包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述MVD1多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述MVD1多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述MVD1多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述IDI1多肽包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述IDI1多肽包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其保守性取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述IDI1多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述IDI1多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述IDI1多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的示例性异源核酸可包括包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的核酸，所述MEV途径多肽诸如全长MEV途径多肽、MEV途径多肽的片段、MEV途径多肽的变体、截短的MEV途径多肽或具有作为MEV途径的一部分的多肽的至少一种活性的融合多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，一种或多种MEV途径多肽在经修饰的宿主细胞中过表达。过表达可以通过增加包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的一种或多种异源核酸的拷贝数来实现，例如通过使用高拷贝数表达载体(例如以每个细胞10-40个拷贝或约100个拷贝存在的质粒)和/或通过将编码MEV途径多肽的核苷酸序列与强启动子可操作地连接。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个或更多个拷贝的包含编码MEV途径多肽的核苷酸序列的异源核酸。异源核酸的拷贝数增加和/或核苷酸序列的密码子优化可以引起经修饰的宿主细胞中所需酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:28具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码HMGS多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:28具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ IDNO:26所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:26具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含两种异源核酸，所述两种异源核酸包含编码tHMGR多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQID NO:38所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:38具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:38具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:36具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PMK多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:36具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:32具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码MVD1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:32具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:24具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IDI1多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:24具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％的序列同一性。
产生大麻素或大麻素衍生物和/或表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿 主细胞
本公开提供了经修饰的宿主细胞，所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞可用于产生大麻素或大麻素衍生物和/或用于表达本公开的经工程改造的变体。在一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种，和/或牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞。为了产生大麻素或大麻素衍生物，可以修饰本文公开的经修饰的宿主细胞以表达或过表达本文公开的一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体，KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种，和/或牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞可包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞可包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞可包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的下调。在一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种，和/或牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了经修饰以表达或过表达包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的一种或多种核酸的经修饰的宿主细胞。在用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种核酸和一种或多种异源核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列，并且所述一种或多种异源核酸包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列。在用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞可包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞可包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的下调。在用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列是密码子优化的。在用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
为了产生大麻素或大麻素衍生物，包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的一种或多种核酸在经修饰的宿主细胞中的表达或过表达可以与经修饰的宿主细胞对本文公开的一种或多种异源核酸(例如，包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的一种或多种异源核酸)的表达或过表达和/或与编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调组合进行。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的核苷酸序列。
为了表达或过表达本公开的经工程改造的变体，包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的一种或多种核酸在经修饰的宿主细胞中的表达或过表达可以与经修饰的宿主细胞对本文公开的一种或多种异源核酸(例如，包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的一种或多种异源核酸)的表达或过表达和/或与编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调组合进行。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率相似或更低。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率相比相似或更低的生长速率和/或生物质产率并且具有增加的CBDA滴度。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞具有更快的生长速率和/或更高的生物质产率。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率比包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率相似或更低。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率相比相似或更低的生长速率和/或生物质产率并且具有增加的CBDA滴度。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞具有更快的生长速率和/或更高的生物质产率。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率比包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率相似或更低。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或生物质产率相比相似或更低的生长速率和/或生物质产率并且具有增加的CBDA滴度。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞具有更快的生长速率和/或更高的生物质产率。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率比包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比更快的生长速率和/或更高的生物质产率。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率比包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比更快的生长速率和/或更高的生物质产率。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率比包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率相比更快的生长速率和/或更高的生物质产率。在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率比包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高生物质产率快/高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA比率相比，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA比率相比，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与THCA比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在相似培养条件下生长相同时间长度，与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与CBCA的比率相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与未经修饰的宿主细胞的生长和/或活力相比，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞的生长和/或活力未显著降低。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的细胞密度比在相同培养基中并且在相同培养条件下生长相同时间的未经修饰的对照宿主细胞的培养物的细胞密度大至少25％或更大、至少30％或更大、至少35％或更大、至少40％或更大、至少45％或更大、至少50％或更大、至少55％或更大、至少60％或更大、至少65％或更大、至少70％或更大、至少75％或更大、至少80％或更大、至少85％或更大、至少90％或更大、至少95％或更大、至少100％或更大、至少110％或更大、至少120％或更大、至少130％或更大、至少140％或更大或至少150％或更大。
在一些实施方案中，与未经修饰的宿主细胞的生长和/或活力相比，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞的生长和/或活力未显著降低。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的细胞密度比在相同培养基中并且在相同培养条件下生长相同时间的未经修饰的对照宿主细胞的培养物的细胞密度大至少25％或更大、至少30％或更大、至少35％或更大、至少40％或更大、至少45％或更大、至少50％或更大、至少55％或更大、至少60％或更大、至少65％或更大、至少70％或更大、至少75％或更大、至少80％或更大、至少85％或更大、至少90％或更大、至少95％或更大、至少100％或更大、至少110％或更大、至少120％或更大、至少130％或更大、至少140％或更大或至少150％或更大。
在一些实施方案中，与未经修饰的宿主细胞的生长和/或活力相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的生长和/或活力未显著降低。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的细胞密度比在相同培养基中并且在相同培养条件下生长相同时间的未经修饰的对照宿主细胞的培养物的细胞密度大至少25％或更大、至少30％或更大、至少35％或更大、至少40％或更大、至少45％或更大、至少50％或更大、至少55％或更大、至少60％或更大、至少65％或更大、至少70％或更大、至少75％或更大、至少80％或更大、至少85％或更大、至少90％或更大、至少95％或更大、至少100％或更大、至少110％或更大、至少120％或更大、至少130％或更大、至少140％或更大或至少150％或更大。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与未经修饰的宿主细胞的生长和/或活力相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的生长和/或活力未显著降低。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的细胞密度比在相同培养基中并且在相同培养条件下生长相同时间的未经修饰的对照宿主细胞的培养物的细胞密度大至少25％或更大、至少30％或更大、至少35％或更大、至少40％或更大、至少45％或更大、至少50％或更大、至少55％或更大、至少60％或更大、至少65％或更大、至少70％或更大、至少75％或更大、至少80％或更大、至少85％或更大、至少90％或更大、至少95％或更大、至少100％或更大、至少110％或更大、至少120％或更大、至少130％或更大、至少140％或更大或至少150％或更大。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与未经修饰的宿主细胞的生长和/或活力相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的生长和/或活力未显著降低。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的细胞密度比在相同培养基中并且在相同培养条件下生长相同时间的未经修饰的对照宿主细胞的培养物的细胞密度大至少25％或更大、至少30％或更大、至少35％或更大、至少40％或更大、至少45％或更大、至少50％或更大、至少55％或更大、至少60％或更大、至少65％或更大、至少70％或更大、至少75％或更大、至少80％或更大、至少85％或更大、至少90％或更大、至少95％或更大、至少100％或更大、至少110％或更大、至少120％或更大、至少130％或更大、至少140％或更大或至少150％或更大。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与未经修饰的宿主细胞的生长和/或活力相比，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的生长和/或活力未显著降低。在一些实施方案中，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的细胞密度比在相同培养基中并且在相同培养条件下生长相同时间的未经修饰的对照宿主细胞的培养物的细胞密度大至少25％或更大、至少30％或更大、至少35％或更大、至少40％或更大、至少45％或更大、至少50％或更大、至少55％或更大、至少60％或更大、至少65％或更大、至少70％或更大、至少75％或更大、至少80％或更大、至少85％或更大、至少90％或更大、至少95％或更大、至少100％或更大、至少110％或更大、至少120％或更大、至少130％或更大、至少140％或更大或至少150％或更大。在包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调的本公开的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。
合适的宿主细胞
适合用于产生本公开的经修饰的宿主细胞的亲本宿主细胞可包括真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞。
宿主细胞(包括亲本宿主细胞和经修饰的宿主细胞)在一些实施方案中是单细胞生物，或在培养物中作为单细胞生长。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞。合适的真核宿主细胞可包括但不限于酵母细胞和真菌细胞。合适的真核宿主细胞可包括但不限于巴斯德毕赤酵母(现称为法夫驹形氏酵母)、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、科克拉毕赤氏酵母、膜醭毕赤酵母、仙人掌毕赤酵母、耐热毕赤酵母、柳毕赤酵母、古尔克毕赤酵母、皮杰普毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母属、酿酒酵母、酵母菌属、多形汉逊氏酵母(现称为安格斯毕赤酵母)、解脂耶氏酵母、克鲁维氏酵母属、乳酸克鲁维氏酵母、马克斯克鲁维氏酵母、粟酒裂殖酵母、木糖发酵酵母、布鲁塞尔德克酵母、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(前称解腺嘌呤阿氏酵母)、白色念珠菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、卢克诺文思金孢子菌、镰孢菌属、禾谷镰孢菌、枯萎镰孢菌、粗糙脉孢菌等。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞是体外培养的。
在一些实施方案中，本公开的宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母的蛋白酶缺陷菌株。蛋白酶缺陷酵母菌株可有效减少表达的异源蛋白的降解。此类菌株中缺失的蛋白酶的实例可以包括以下的一种或多种：PEP4、PRB1和KEX1。
在一些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母。在一些实施方案中，用于产生本公开的经修饰的宿主细胞的宿主细胞可以因为易于培养；快速生长长；用于修饰的工具(诸如启动子和载体)的可用性；以及宿主细胞的安全特性而被选择。在一些实施方案中，用于产生本公开的经修饰的宿主细胞的宿主细胞可以因为其能够或不能将某些翻译后修饰引入到表达的多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)上而被选择。例如，经修饰的法夫驹形氏酵母宿主细胞可以使本公开的经工程改造的变体超糖基化，并且超糖基化可以改变所得表达多肽的活性。
本公开的宿主细胞的基因修饰和示例性的经修饰的宿主细胞
本公开提供了经修饰的宿主细胞和制备经修饰的宿主细胞的方法，所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，制备本公开的经修饰的宿主细胞的方法包括向宿主细胞中引入一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，所述核酸包含密码子优化的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽、FAD1多肽或IRE1多肽中的一种或多种，和/或牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了经修饰的宿主细胞和制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入本文公开的一种或多种核酸(例如，异源核酸)。在一些实施方案中，所述核酸包含密码子优化的核苷酸序列。
本公开提供了一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括a)向宿主细胞中引入一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，所述方法包括b)向宿主细胞中引入一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括b)向宿主细胞中引入一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码FAD1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽和PEP4多肽的一个或多个基因的缺失或下调。本公开提供了一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一种或多种基因的缺失或下调。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸以及编码ROT2多肽和PEP4多肽的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
本公开提供了一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，b)一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，和c)编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。
本公开提供了一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，和b)一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸并且表达或过表达异源核酸的组合，所述异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法包括向宿主细胞中引入一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在本文公开的一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽或PEP4多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调以及一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸以及编码ROT2多肽和PEP4多肽的基因的缺失或下调。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码FAD1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
本公开提供了一种制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入本文公开的一种或多种核酸。本公开提供了一种制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，和b)一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。本公开提供了一种制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，和b)一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸并且包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸并且包含一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码FAD1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体，包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽和PEP4多肽的一个或多个基因的缺失或下调。本公开提供了一种制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸和b)编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一种或多种基因的缺失或下调。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸以及编码ROT2多肽和PEP4多肽的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
本公开提供了一种制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的一种或多种核酸，b)包含编码KAR2多肽，PDI1多肽，ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的一种或多种异源核酸，和c)编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一种或多种基因的缺失或下调。
本公开提供了一种制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入：a)一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，和b)一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞可包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸并且表达或过表达异源核酸的组合，所述异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，制备用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞的方法包括向宿主细胞中引入一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在本文公开的一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或IRE1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸，编码ROT2多肽或PEP4多肽中的一种或多种的一个或多个基因的缺失或下调以及一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码IRE1多肽的核苷酸序列的异源核酸以及编码ROT2多肽和PEP4多肽的基因的缺失或下调。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码本公开的经工程改造的变体的多核苷酸序列的核酸，一种或多种包含编码KAR2多肽、PDI1多肽、ERO1多肽或FAD1多肽中的一种或多种的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种包含编码牵涉大麻素或大麻素前体(例如，香叶基焦磷酸(GPP)、异戊二烯磷酸、橄榄醇酸或己酰辅酶A)生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列的异源核酸。在某些此类实施方案中，经修饰的宿主细胞包含一种或多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码PDI1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码ERO1多肽的核苷酸序列的异源核酸、一种或多种包含编码FAD1多肽的核苷酸序列的异源核酸。在一些实施方案中，用于表达本公开的经工程改造的变体的经修饰的宿主细胞包含两种或更多种包含编码KAR2多肽的核苷酸序列的异源核酸。
为了修饰亲本宿主细胞以产生本公开的经修饰的宿主细胞，可以使用已建立的技术将本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)稳定地或瞬时地引入宿主细胞中。此类技术可包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、醋酸锂方法等。参见Gietz,R.D.和R.A.Woods.(2002)TRANSFORMATION OF YEAST BY THE Liac/SS CARRIER DNA/PEG METHOD。为了稳定地转化，包含本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)的质粒、载体、表达构建体等通常还包括选择标记，例如几种公知的选择标记诸如新霉素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氯霉素抗性、卡那霉素抗性等中的任一种。在一些实施方案中，提供用于选择经转化的宿主细胞的表型性状的选择标记基因是二氢叶酸还原酶。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas9系统用本文公开的一种或多种核酸(例如，异源核酸)修饰亲本宿主细胞，亲本宿主细胞经修饰以产生本公开的经修饰的宿主细胞。
在一些实施方案中，可以通过改变基因拷贝数、启动子强度和/或启动子调节和/或通过密码子优化来改变经修饰的宿主细胞中的多肽表达水平(诸如经工程改造的变体的表达水平)和/或大麻素或大麻素衍生物的产生。
本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)，诸如包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列的一种或多种核酸，可存在于表达载体或构建体中。合适的表达载体可包括但不限于质粒、酵母质粒、酵母人工染色体和特定目标宿主(诸如酵母)有特异性的任何其他载体。因此，例如，包含编码甲羟戊酸途径基因产物的核苷酸序列的一种或多种核酸(例如异源核酸)包括在用于表达甲羟戊酸途径基因产物的多种表达载体中的任一种中。此类载体可以包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列。
本公开提供了一种制备本公开的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入本文公开的一种或多种载体。
本公开提供了一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入本文公开的一种或多种载体。在某些此类实施方案中，所述一种或多种载体包括一种或多种包含一种或多种核酸(例如异源核酸)的载体，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，所述一种或多种载体包括一种或多种包含一种或多种核酸(例如异源核酸)的载体，所述一种或多种核酸包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括向宿主细胞中引入编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，所述一种或多种载体包括一种或多种包含一种或多种核酸(例如异源核酸)的载体，所述一种或多种核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
本公开提供了一种制备用于表达大麻素合酶多肽的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入本文公开的一种或多种载体。在某些此类实施方案中，所述一种或多种载体包括一种或多种包含一种或多种核酸(例如异源核酸)的载体，所述一种或多种核酸包含编码本公开的经工程改造的变体的核苷酸序列。在某些此类实施方案中，所述一种或多种载体包括一种或多种包含一种或多种核酸(例如异源核酸)的载体，所述一种或多种核酸包含编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码一种或多种分泌途径多肽的核苷酸序列是密码子优化的。在一些实施方案中，所述方法包括向宿主细胞中引入编码一种或多种分泌途径多肽的一个或多个基因的缺失或下调。在一些实施方案中，所述一种或多种载体包括一种或多种包含一种或多种核酸(例如异源核酸)的载体，所述一种或多种核酸包含编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的一种或多种多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码牵涉大麻素或大麻素前体生物合成的所述一种或多种多肽的核苷酸序列是密码子优化的。
许多其他合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购的。以举例的方式提供以下载体；对于酵母而言，提供低拷贝CEN ARS和高拷贝2微米质粒。然而，可以使用任何其他质粒或其他载体，只要它与宿主细胞相容。
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的两种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的三种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的四种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的五种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的六种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的七种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达载体中。
在一些实施方案中，本文公开的两种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的三种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的四种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的五种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的六种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的七种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的八种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的九种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。在一些实施方案中，本文公开的十种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达载体中。
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的两种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的三种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的四种或多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的五种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的六种或更多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的七种或多种核酸(例如异源核酸)存在于单个表达构建体中。
在一些实施方案中，本文公开的两种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的三种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的四种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的五种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的六种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的七种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的八种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的九种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。在一些实施方案中，本文公开的十种或更多种核酸(例如异源核酸)处于单独的表达构建体中。
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)存在于高拷贝数质粒中，例如以每个细胞约10-50个拷贝或每个细胞多于50个拷贝存在的质粒。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)存在于低拷贝数质粒中。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)存在于中等拷贝数质粒中。可以选择质粒的拷贝数以减少本文公开的一种或多种多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)的表达。通过限制质粒的拷贝数来减少表达可防止分泌途径饱和，导致可能的蛋白质降解和/或经修饰的宿主细胞死亡或经修饰的宿主细胞活力丧失。
在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有一个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有两个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有三个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有四个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有五个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有六个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有七个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有八个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有九个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十一个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十二个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞具有十二个或更多个拷贝的包含编码本文公开的多肽的核苷酸序列的核酸(例如异源核酸)。
取决于所利用的宿主/载体或宿主/构建体系统，可以在表达载体或构建体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些实施方案中，本文公开的核酸(例如异源核酸)与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子在真核细胞中有功能。在一些实施方案中，启动子可以是强表达驱动子。在一些实施方案中，启动子可以是弱表达驱动子。在一些实施方案中，启动子可以是中等表达驱动子。可以选择启动子以降低本文公开的一种或多种多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)的表达。通过启动子选择来减少表达可防止分泌途径饱和，导致可能的蛋白质降解和/或经修饰的宿主细胞死亡或经修饰的宿主细胞活力丧失。强组成型启动子的实例包括但不限于：pTDH3和pFBA1。中等组成型启动子的实例包括但不限于：pACT1和pCYC1。弱组成型启动子的实例包括但不限于：pSLN1。强诱导型启动子的实例包括但不限于：pGAL1和pGAL10。中等诱导型启动子的实例包括但不限于：pGAL7。弱诱导型启动子的实例包括但不限于：pGAL3。
合适的真核启动子的非限制性实例可包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。选择适当的载体、构建体和启动子完全在本领域普通技术人员的水平内。表达载体或构建体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体或构建体还可以包括用于扩增表达的适当序列。
诱导型启动子是本领域公知的。合适的诱导型启动子可包括但不限于四环素诱导型启动子；雌二醇诱导型启动子、糖诱导型启动子(例如pGal1或pSUC2)、氨基酸诱导型启动子(例如pMet25)；金属诱导型启动子(例如pCup1)、甲醇诱导型启动子(例如pAOX1)等。
在酵母中，可以使用许多含有组成型启动子或诱导型启动子的载体或构建体。综述参见urrent Protocols in Molecular Biology,第2卷,1988,Ed.Ausubel等人，GreenePublish.Assoc.&Wiley Interscience,第13章；Grant等人，1987,Expression andSecretion Vectors for Yeast,in Methods in Enzymology,Wu&Grossman编辑,31987,Acad.Press,N.Y.,第153卷,第516-544页；Glover,1986,DNA Cloning,第II卷,IRL Press,Wash.,D.C.,第3章；和Bitter,1987,Heterologous Gene Expression in Yeast,Methodsin Enzymology,Berger和Kimmel编辑,Acad.Press,N.Y.,第152卷,第673-684页；以及TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces,1982,Strathern等人编辑,ColdSpring Harbor Press,第I和II卷。可以使用组成型酵母启动子诸如pADH、pTDH3、pFBA1、pACT1、pCYC1和pSLN1或诱导型启动子诸如pGAL1、pGAL10、pGAL7和pGAL3(Cloning inYeast,Ch.3,R.Rothstein In:DNA Cloning第11卷,A Practical Approach,DM Glover编辑,1986,IRL Press,Wash.,D.C.)。可替代地，可以使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。通常，重组表达载体将包括复制起点和容许转化宿主细胞的选择标记，例如酿酒酵母TRP1基因或编码抗生素抗性的基因盒等；以及源自高表达基因的启动子，以指导编码序列的转录。此类启动子可以源自编码糖酵解酶诸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的基因序列。
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)整合到本文公开的经修饰的宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如异源核酸)整合到本文公开的经修饰的宿主细胞的染色体中。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种核酸(例如，异源核酸)保持游离(即，未整合到经修饰的宿主细胞的基因组或染色体中)。在一些实施方案中，本文公开的所述一种或多种核酸(例如，异源核酸)中的至少一种保持在染色体外(例如，在质粒或人工染色体上)。可以选择编码本文公开的一种或多种多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)的一个或多个基因的基因拷贝数以减少本文公开的所述一种或多种多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)的表达。通过限制基因拷贝数来减少表达可防止分泌途径饱和，导致可能的蛋白质降解和/或经修饰的宿主细胞死亡或经修饰的宿主细胞活力丧失。
如本领域技术人员所理解的，核苷酸序列的略微变化不一定改变所编码的多肽的氨基酸序列。本领域技术人员将理解，改变所编码的多肽的氨基酸序列的特定基因序列中的核苷酸同一性的变化可导致基因的有效性降低或增强，并且在一些应用(例如反义、共抑制或RNAi)中，部分序列常常与全长形式一样有效地起作用。改变或缩短核苷酸序列的方式是本领域技术人员公知的，测试所改变的基因的有效性的方法也是如此。在某些实施方案中，可以通过例如常规气相色谱法容易地测试有效性。因此，所有此类基因变异都包括在本公开中。
编码蛋白质的开放阅读框的基因组缺失可以消除基因的所有表达。基因的下调可以以几种方式在DNA、RNA或蛋白质水平实现，结果是细胞中活性蛋白的量降低。截短开放阅读框或引入使蛋白质去稳定或降低催化活性的突变实现了与融合使蛋白质去稳定的“降解决定子”多肽类似的目标。基因调控区的工程改造也可用于改变基因表达。改变启动子序列或用不同的启动子置换是一种方法。还已知终止子的截短(称为降低mRNA干扰丰度(DAmP))会降低基因表达。降低mRNA稳定性的其他方法包括使用顺式或反式作用核酶(诸如自裂解核酶)，或募集外切核酸酶的RNA元件，或反义DNA。RNAi可用于通过导入来自其他物种的所需蛋白因子(例如Drosha或Dice)而使出芽酵母菌株中的基因沉默(Drinnenberg等人2009)。在酿酒酵母中也可以经由天然或异源沉默因子或阻遏物的募集使基因表达沉默，这可以使用D-Cas9 CRISPR系统在任意位点实现(Qi等2013)。也可以通过工程改造靶蛋白的氨基酸序列来降低蛋白质水平。多种降解决定子序列可用于靶向蛋白质以快速降解，包括但不限于泛素融合物和氨基末端的N端规则残基。这些方法可以以制定的或有条件的方式执行。
诱导系统
为了适应不断变化的环境，微生物诸如酵母已经进化出广泛的天然诱导型启动子系统。受小分子或环境变化(温度、pH、氧水平、摩尔渗透压浓度、氧化损伤)调控的任何启动子原则上都可以转化为诱导型系统用于表达异源基因。酿酒酵母中的最佳已知系统是半乳糖调节子，该半乳糖调节子受葡萄糖强烈阻遏并受半乳糖活化。在半乳糖诱导型启动子控制下的异源遗传途径以相同方式调控，因此经工程改造的菌株可以在葡萄糖培养基中生长以构建生物质，然后转换为半乳糖以诱导途径表达。可以实现从非常强的pGAL1到相对弱的pGAL3的表达水平范围。然而，半乳糖可能昂贵并且是酿酒酵母的不良碳源。因此，对于工业应用，可能有利的是重新工程改造调节子，使得可以在非半乳糖培养基中诱导细胞。半乳糖调节子可以为此目的以多种方式进行修饰，包括：
●从诱导型启动子例如pSUC2-GAL3过表达GAL80的负调控因子GAL3，使得从葡萄糖转换为蔗糖减轻GAL80表达并活化该途径。
●删除阻遏物GAL80并用在蔗糖诱导型启动子(例如pSUC2-GAL4)控制下的型式置换天然GAL4盒，从而通过从葡萄糖转换为蔗糖来诱导表达。
●用可诱导型式例如pSUC2-GAL80置换天然GAL80基因，使得通过从蔗糖转换为葡萄糖来诱导表达。
这些策略常常需要微调活化剂和阻遏物水平以实现适当的动力学(在关闭状态表达非常低或没有活化剂，而在开启状态是所需的表达水平)。存在多种微调蛋白质表达的方式，包括使用蛋白质稳定或降解标签(例如降解决定子)或使用活化剂或调控因子的温度敏感突变体。在上述实例中，pSUC2启动子用于诱导蔗糖培养基中的半乳糖调节子。然而，任何诱导型启动子均可用于此目的，或用于控制半乳糖调节子背景之外的单个基因。以下列表提供了一些实例：
●磷酸调控启动子，例如pPHO5
●碳源调控启动子，例如pADH2
●氨基酸调控启动子，例如pMET25
●金属离子诱导型启动子，例如pCUP1
●温度调控启动子，例如pHSP12、pHSP26
●pH调控启动子，例如pHSP12、pHSP26
●氧水平调控启动子，例如pDAN1
●氧化应激调控启动子，例如AHP1、TRR1、TRX2、TSA1、GPX2、GSH1、GSH2、GLR1、SOD1或SOD2基因。
●ER应激调控启动子，例如未折叠蛋白应答元件启动子。
除了这些天然的实例之外，还有多种合成的诱导型启动子系统。这些通常基于将天然或外源转录元件重排到基础启动子支架和/或激活结构域与DNA结合结构域融合以产生新型转录因子。下面提供了两个实例：
●牵涉雌二醇受体与DNA结合和转录激活结构域的融合，与具有结合位点的合成或天然启动子配对的雌二醇诱导系统。
●与含tetO的启动子配对的tet反式活化剂(tTA)或反向tet反式活化剂(rtTA)系统。
在一些实施方案中，上述诱导型启动子系统之一用于本公开的经修饰的宿主细胞中。在一些实施方案中，诱导型启动子系统是天然诱导型启动子系统。在一些实施方案中，诱导型启动子系统是合成的诱导型启动子系统。在一些实施方案中，用于培养本公开的经修饰的宿主细胞的合适培养基包含本文公开的一种或多种诱导因子。可能的诱导因子包括：
●磷酸调控启动子，例如pPHO5
οKH2PO4
●碳源调控启动子，例如pADH2
ο半乳糖(如，pGAL1)
ο葡萄糖(例如，pADH2)
ο蔗糖(如，pSUC2、pGPH1、pMAL12)
ο麦芽糖(如，pMAL12、pMAL32)
●氨基酸调控启动子，例如pMET25
ο甲硫氨酸(如，pMET25)
ο赖氨酸(例如，pLYS9)
ο其他氨基酸
●金属离子诱导型启动子，例如pCUP1
οCuSO4
●温度调控启动子，例如pHSP12、pHSP26
ο温度变化，例如30℃变为37℃
●pH调控启动子，例如pHSP12、pHSP26
οpH变化，例如pH 6变为pH 4
●氧水平调控启动子，例如pDAN1
ο氧水平的变化，例如，溶解氧水平从20％变为1％
●氧化应激调控启动子，例如pSOD1
ο添加产生过氧化氢或过氧化物的药物甲萘醌
●ER应激调控启动子，例如未折叠蛋白应答元件启动子。
ο衣霉素，或易于错误折叠的蛋白质(例如，大麻素合酶)的表达
●牵涉雌二醇受体与DNA结合和转录激活结构域的融合，与具有结合位点的合成或天然启动子配对的雌二醇诱导系统。
ο雌二醇
●与含tetO的启动子配对的tet反式活化剂(tTA)或反向tet反式活化剂(rtTA)系统。
ο强力霉素
密码子使用
如本领域技术人员所公知的，通过将编码特定氨基酸的核苷酸序列(即，密码子)用在宿主生物中更好表达的另一密码子置换(即，密码子优化)，可以改善异源核酸在宿主生物中的表达。产生这种效应的一个原因是由于不同的生物对不同密码子显示出偏好的事实。在一些实施方案中，修饰或优化本文公开的核酸，使得核苷酸序列反映特定宿主细胞的密码子偏好。例如，在一些实施方案中，将出于酵母密码子偏好而修饰或优化核苷酸序列。在一些实施方案中，本文公开的核苷酸序列是密码子优化的。参见例如Bennetzen和Hall(1982)J.Biol.Chem.257(6):3026-3031。
已经产生了统计方法来分析各种生物中的密码子使用偏倚，并且已经开发了许多计算机算法在密码子优化的基因序列的设计中实施这些统计分析(Lithwick G,MargalitH(2003)Hierarchy of sequence-dependent features associated with prokaryotictranslation.Genome Research 13:2665-73)。也已经描述了不依赖于密码子偏倚的增加蛋白质表达的密码子使用的其他修饰(Welch等人，(2009)。在一些实施方案中，核苷酸序列的密码子优化可引起经修饰的宿主细胞中所需多肽或酶催化活性的增加。
在一些实施方案中，修饰或优化核苷酸序列的密码子使用，使得所编码的mRNA的翻译水平降低。在一些实施方案中，可以优化经密码子优化的核苷酸序列，使得编码的mRNA的翻译水平降低。通过修饰密码子使用降低mRNA翻译水平可以通过修饰核苷酸序列以包括宿主细胞稀有或不常用的密码子来实现。许多生物的密码子使用表可用，汇总了特定生物使用特定密码子编码氨基酸的时间百分比。某些密码子比其他“稀有”密码子使用得更频繁。在核苷酸序列中使用“稀有”密码子通常降低其翻译速率。因此，例如，通过引入一个或多个影响翻译速率的稀有密码子而不是翻译的多肽的氨基酸序列来修饰核苷酸序列。例如，有六个编码精氨酸的密码子：CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG。在大肠杆菌(E.coli)中，密码子CGT和CGC使用得比密码子AGG(编码大肠杆菌中大约2％的精氨酸)更频繁(编码大肠杆菌中大约40％的精氨酸)。将基因序列内的CGT密码子修饰为AGG密码子不会改变多肽的序列，但可能会降低基因的翻译速率。
在一些实施方案中，可以优化经密码子优化的核苷酸序列以在酵母细胞中表达。在某些此类实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母。
此外，应当理解，本公开包括密码子使用的简并性，这是本领域普通技术人员所理解的并在下表中说明。
密码子简并性
Figure BDA0003470646560001501
Figure BDA0003470646560001511
产生大麻素或大麻素衍生物或表达和/或制备大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法
本公开提供了用于表达本公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法。在某些此类实施方案中，所述方法包括在培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞。本公开还提供了用于制备本公开的大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法。本公开还提供了产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括使用本公开的经工程改造的变体。
本公开还提供了产生大麻素或大麻素衍生物的方法。本公开的方法可牵涉使用本文公开的经工程改造的变体产生大麻素或大麻素衍生物。所述方法可牵涉在培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞并回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。所述方法还可以牵涉使用本文公开的一种或多种多肽(诸如本公开的经工程改造的变体)进行大麻素或大麻素衍生物的无细胞产生，所述多肽由本公开的经修饰的宿主细胞表达或过表达。所述方法还可以牵涉使用本文公开的经工程改造的变体进行大麻素或大麻素衍生物的无细胞产生。
可用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物可包括但不限于大麻环萜酚(CBC)型(例如，大麻环萜酚酸)、大麻二酚(CBD)型(例如，大麻二酚酸)、Δ9-反式-四氢大麻酚(Δ9-THC)型(例如，Δ9-四氢大麻酚酸)、Δ8-反式-四氢大麻酚(Δ8-THC)型、大麻环酚(CBL)型、大麻艾尔松(CBE)型、大麻酚(CBN)型、脱氢大麻二酚(CBND)型、大麻三酚(CBT)型、前述任一种的衍生物、以及Elsohly M.A.和Slade D.,Life Sci.2005 Dec 22；78(5):539-48.Epub 2005 Sep 30中列出的其它物质。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
可用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物可包括但不限于大麻环萜酚酸(CBCA)、大麻环萜酚(CBC)、次大麻色酚酸(CBCVA)、次大麻色酚(CBCV)、CBDA、大麻二酚(CBD)、大麻二酚单甲醚(CBDM)、大麻二酚-C4(CBD-C4)、次大麻二酚酸(CBDVA)、次大麻二酚(CBDV)、大麻二苔黑酚(CBD-C1)、Δ9–四氢大麻酚酸A(THCA-A)、Δ9–四氢大麻酚酸B(THCA-B)、Δ9–四氢大麻酚(THC)、Δ9–四氢大麻酚酸-C4(THCA-C4)、Δ9–四氢大麻酚-C4(THC-C4)、Δ9–四氢次大麻酚酸(THCVA)、Δ9–四氢次大麻酚(THCV)、Δ9–四氢大麻苔黑酚酸(THCA-C1)、Δ9–四氢大麻苔黑酚(THC-C1)、Δ7-顺式-异-四氢次大麻酚、Δ8–四氢大麻酚酸(Δ8–THCA)、Δ8–四氢大麻酚(Δ8–THC)、大麻环酚酸(CBLA)、大麻环酚(CBL)、次大麻环酚(CBLV)、大麻艾尔松酸A(CBEA-A)、大麻艾尔松酸B(CBEA-B)、大麻艾尔松(CBE)、大麻伊索因酸、大麻二吡喃环烷酸、大麻酚酸(CBNA)、大麻酚(CBN)、大麻酚甲醚(CBNM)、大麻酚-C4、(CBN-C4)、次大麻酚(CBV)、大麻酚-C2(CNB-C2)、大麻苔黑酚(CBN-C1)、脱氢大麻二酚(CBND)、脱氢次大麻二酚(CBVD)、大麻三酚(CBT)、10-乙氧基-9-羟基-δ-6a-四氢大麻酚、8,9-二羟基-δ-6a-四氢大麻酚、次大麻三酚(CBTVE)、脱氢大麻呋喃(DCBF)、大麻呋喃(CBF)、大麻色满酮(CBCN)、大麻二吡喃环烷(CBT)、10-氧代-δ-6a-四氢大麻酚(OTHC)、δ-9-顺式-四氢大麻酚(顺式-THC)、3,4,5,6-四氢-7-羟基-α-α-2-三甲基-9-正丙基-2,6-桥亚甲基-2H-1-苯并噁辛因-5-甲醇(OH-异-HHCV)、大麻利比索(CBR)、三羟基-δ-9-四氢大麻酚(triOHTHC)、CBGA-氢化肉桂酸(3-[(2E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基]-2,4-二羟基-6-(2-苯基乙基)苯甲酸)、CBG-氢化肉桂酸(2-[(2E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基]-5-(2-苯基乙基)苯-1,3-二醇)、CBDA-氢化肉桂酸(2,4-二羟基-3-[3-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)环己-2-烯-1-基]-6-(2-苯基乙基)苯甲酸)、CBD-氢化肉桂酸(2-[3-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)环己-2-烯-1-基]-5-(2-苯基乙基)苯-1,3-二醇)、THCA-氢化肉桂酸(1-羟基-6,6,9-三甲基-3-(2-苯基乙基)-6H,6aH,7H,8H,10aH-苯并[c]异色烯-2-羧酸)、THC-氢化肉桂酸(6,6,9-三甲基-3-(2-苯基乙基)-6H,6aH,7H,8H,10aH-苯并[c]异色烯-1-醇、perrottetinene)以及任何前述的衍生物。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在一些实施方案中，用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的大麻素是Δ9-四氢大麻酚酸、Δ9-四氢大麻酚、Δ8-四氢大麻酚酸、Δ8-四氢大麻酚、大麻二酚酸、大麻二酚、大麻环萜酚酸、大麻环萜酚、大麻酸、大麻酚、次大麻酚酸、次大麻酚、四氢次大麻酚酸、四氢次大麻酚、次大麻色酚酸、次大麻色酚、次大麻萜酚酸、次大麻萜酚、大麻环酚酸、大麻环酚、大麻伊索因酸、大麻艾尔松、大麻二吡喃环烷酸或大麻二吡喃环烷。在一些实施方案中，所述大麻素以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素以大于50mg/L培养基的量产生。
在一些实施方案中，用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、大麻环萜酚酸或大麻环萜酚。在一些实施方案中，所述大麻素以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素以大于50mg/L培养基的量产生。
可用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的另外的大麻素或大麻素衍生物可包括但不限于CBDA、CBD、CBGA、THC、THCA、THCVA、CBDVA、CBCA、CBC、(6aR,10aR)-1-羟基-6,6,9-三甲基-3-丁基-6a,7,8,10a-四氢-6H-二苯并[b,d]吡喃-2-羧酸、(6aR,10aR)-1-羟基-6,6,9-三甲基-3-(3-甲基戊基)-6a,7,8,10a-四氢-6H-二苯并[b,d]吡喃-2-羧酸、(6aR,10aR)-1-羟基-6,6,9-三甲基-3-(4-戊烯基)-6a,7,8,10a-四氢-6H-二苯并[b,d]吡喃-2-羧酸、(6aR,10aR)-1-羟基-6,6,9-三甲基-3-己基-6a,7,8,10a-四氢-6H-二苯并[b,d]吡喃-2-羧酸、(6aR,10aR)-1-羟基-6,6,9-三甲基-3-(5-己炔基)-6a,7,8,10a-四氢-6H-二苯并[b,d]吡喃-2-羧酸，以及Bow,E.W.和Rimoldi,J.M.,“The Structure–Function Relationships of Classical Cannabinoids:CB1/CB2 Modulation,”Perspectives in Medicinal Chemistry 2016:8 17–39doi:10.4137/PMC.S32171中列出的其它物质，该文献以引用方式并入。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
可用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的另外的大麻素或大麻素衍生物可包括但不限于(1'R,2'R)-4-(己-2-基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-己基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(3-甲基戊基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-(4-氯丁基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(4-甲基戊基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(4-(甲硫基)丁基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-((E)-戊-1-烯-1-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-((E)-戊-3-烯-1-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-((E)-戊-2-烯-1-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-(丁-3-炔-1-基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-((E)-丁-1-烯-1-基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(戊-4-炔-1-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-4-十一烷基-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-(己-5-炔-1-基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-((E)-庚-1-烯-1-基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-辛基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-((E)-辛-1-烯-1-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-壬基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(3-苯基丙基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(4-苯基丁基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(5-苯基戊基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(6-苯基己基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(2-甲基戊基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-异丙基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-癸基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-4-三癸基-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(E)-3-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)丙烯酸、(Z)-3-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)丙烯酸、7-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)庚酸、8-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)辛酸、9-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)壬酸、11-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)十一酸、(1”R,2”R)-3',5'-二羟基-5”-甲基-2”-(丙-1-烯-2-基)-1”,2”,3”,4”-四氢-[1,1':4',1”-三联苯]-2-羧酸、(1”R,2”R)-3',5'-二羟基-5”-甲基-2”-(丙-1-烯-2-基)-1”,2”,3”,4”-四氢-[1,1':4',1”-三联苯]-3-羧酸、(1”R,2”R)-3',5'-二羟基-5”-甲基-2”-(丙-1-烯-2-基)-1”,2”,3”,4”-四氢-[1,1':4',1”-三联苯]-4-羧酸、(1”R,2”R)-3',5'-二羟基-5”-甲基-2”-(丙-1-烯-2-基)-1”,2”,3”,4”-四氢-[1,1':4',1”-三联苯]-3,5-di羧酸、(1'R,2'R)-4-(4-羟基丁基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-(4-氨基丁基)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、5-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)戊腈、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(3-甲基己-2-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-4-丙基-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-丁基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-戊基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-4-庚基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、(1'R,2'R)-5'-甲基-4-(戊-4-烯-1-基)-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、3-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)丙酸、(1'R,2'R)-4,5'-二甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-2,6-二醇、2-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)乙酸、4-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)丁酸、(1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-羧酸、5-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)戊酸和6-((1'R,2'R)-2,6-二羟基-5'-甲基-2'-(丙-1-烯-2-基)-1',2',3',4'-四氢-[1,1'-联苯]-4-基)己酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
大麻素衍生物也可以指缺乏在天然存在的大麻素中发现的一个或多个化学部分，但仍保留天然存在的大麻素的核结构特征(例如，环状核)的化合物。此类化学部分可以包括但不限于甲基、烷基、烯基、甲氧基、烷氧基、乙酰基、羧基、羰基、氧代、酯、羟基等。在一些实施方案中，大麻素衍生物也可包含本文所述的任何官能团和/或反应性基团中的一种或多种。官能团和反应性基团可以是未取代的或被一个或多个官能团或反应性基团取代。
大麻素衍生物可以是被一个或多个官能团和/或反应性基团取代或包含一个或多个官能团和/或反应性基团的大麻素。官能团可以包括但不限于叠氮基、卤素(例如氯、溴、碘、氟)、甲基、烷基、炔基、烯基、甲氧基、烷氧基、乙酰基、氨基、羧基、羰基、氧代、酯、羟基、硫基(例如，硫醇)、氰基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环烷基烯基、环烷基炔基、环烯基烷基、环烯基烯基、环烯基炔基、杂环基烯基、杂环基炔基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、芳基烯基、芳基炔基、螺环基、杂螺环基、杂环基、硫代烷基(或烷硫基)、芳硫基、杂芳硫基、砜、磺酰基、亚砜、酰氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、N-氧化物、酰亚胺、烯胺、亚胺、肟、腙、腈、芳烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基烷基、杂芳基烷基、硝基、硫酮基等。合适的反应性基团可以包括但不一定限于叠氮化物、羧基、羰基、胺(例如，烷基胺(例如，低级烷基胺)、芳基胺)、卤化物、酯(例如，烷基酯(例如，低级烷基酯、苄基酯)、芳基酯、经取代的芳基酯)、氰基、硫酯、硫醚、磺酰卤、醇、硫醇、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、肼、炔基、烯基、乙酰基等。在一些实施方案中，反应性基团选自羧基、羰基、胺、酯、硫酯、硫醚、磺酰卤、醇、硫醇、炔、烯烃、叠氮化物、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺和肼。官能团和反应性基团可以是未取代的或被一个或多个官能团或反应性基团取代。
“烷基”可以指直链或支链饱和烃。例如，C1-C6烷基含有1至6个碳原子。C1-C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基和叔丁基、异戊基和新戊基。
“烯基”可包括含有2-12个碳原子的无支链(即，直链)或支链烃链。“烯基”含有至少一个双键。烯基的双键可以是未共轭的或是与另一个不饱和基团共轭的。烯基的实例可包括但不限于乙烯基(ethylenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基等。
本文公开的化合物，诸如大麻素和大麻素衍生物，可以被一个或多个取代基取代，诸如本文一般性说明的那些，或如通过本公开的特定类别、子类和种类例示的那些。一般而言，术语“经取代的”是指给定结构中的氢原子被指定的取代基置换。本公开所设想的取代基的组合通常是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些。
如本文所用，术语“未取代的”可以意指指定基团不带有除列举的部分以外的取代基(例如，其中化合价由氢满足)。
反应性基团可促进目标分子的共价附接。合适的目标分子可包括但不限于可检测标记；显像剂；毒素(包括细胞毒素)；接头；肽；药物(例如，小分子药物)；特异性结合对的成员；表位标签；供靶受体结合的配体；有助于纯化的标签；增加溶解度的分子；等等。接头可以是肽接头或非肽接头。
在一些实施方案中，经叠氮化物取代的大麻素衍生物可与包含炔烃基团的化合物经由“点击化学”反应以产生包含杂环的产物，也称为叠氮化物-炔烃环加成。在一些实施方案中，经炔烃取代的大麻素衍生物可以与包含叠氮化物基团的化合物经由点击化学反应以产生包含杂环的产物。
可能期望附接至大麻素衍生物的其他目标分子可包括但不一定限于可检测标记(例如，自旋标记、荧光共振能量转移(FRET)型染料，例如用于研究体内生物分子的结构)；小分子药物；细胞毒性分子(例如，药物)；显像剂；供靶受体结合的配体；有助于通过例如亲和色谱法纯化的标签(例如，FLAG表位的附接)；增加溶解度的分子(例如，聚(乙二醇))；提高生物利用度的分子；增加体内半衰期的分子；靶向特定细胞类型的分子(例如，对靶细胞上的表位具有特异性的抗体)；靶向特定组织的分子；提供穿过血脑屏障的分子；以及促进选择性附接至表面的分子等。
在一些实施方案中，目标分子包含显像剂。合适的显像剂可以包括阳性造影剂和阴性造影剂。合适的阳性造影剂可包括但不限于钆-四氮杂环十二烷四乙酸(Gd-DOTA)；钆-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)；钆-1,4,7-三(羰甲基)-10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Gd-HP-DO3A)；锰(II)-二磷酸二吡哆醛(Mn-DPDP)；Gd-二乙烯三胺五乙酸-双(甲基酰胺)(Gd-DTPA-BMA)；等等。合适的阴性造影剂可包括但不限于超顺磁性氧化铁(SPIO)显像剂；和全氟化碳，其中合适的全氟化碳可包括但不限于氟代庚烷、氟代环庚烷、氟代甲基环庚烷、氟代己烷、氟代环己烷、氟代戊烷、氟代环戊烷、氟代甲基环戊烷、氟代二甲基环戊烷、氟代甲基环丁烷、氟代二甲基环丁烷、氟代三甲基环丁烷、氟代丁烷、氟代环丁烷、氟代丙烷、氟代醚、氟代聚醚、氟代三乙胺、全氟己烷、全氟戊烷、全氟丁烷、全氟丙烷、六氟化硫等。
可用本公开的经工程改造的变体、方法或经修饰的宿主细胞产生的其他大麻素衍生物可包括已经由有机合成或酶促途径修饰以改变药物代谢和药代动力学(例如溶解度、生物利用度、吸收、分布、血浆半衰期和代谢清除率)的衍生物。修饰实例可以包括但不限于卤化、乙酰化和甲基化。
本文所述的大麻素或大麻素衍生物还包括所有药学上可接受的同位素标记的大麻素或大麻素衍生物。“同位素”或“放射性标记的”化合物是其中一个或多个原子被原子质量或质量数与自然界中通常发现(即，天然存在)的原子质量或质量数不同的原子置换或取代的化合物。例如，在一些实施方案中，在本文所述的大麻素或大麻素衍生物中，氢原子被一个或多个氘或氚置换或取代。本公开的某些同位素标记的大麻素或大麻素衍生物，例如掺入放射性同位素的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究中。放射性同位素氚(即3H)和碳14(即14C)，由于它们易于掺入和现成的检测手段，对于该目的特别有用。用较重的同位素如氘(即2H)取代可以提供由更大的代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期和减少的剂量需求，并且因此可以在一些情况下优选。可掺入本文所述的大麻素或大麻素衍生物中的合适同位素包括但不限于2H(对于氘也写作D)、3H(对于氚也写作T)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。用正电子发射同位素(诸如11C、18F、15O和13N)取代，可用于正电子发射断层扫描(PET)研究中。
本文公开的生物生产方法、经修饰的宿主细胞和经工程改造的变体使得能够合成具有确定立体化学的大麻素或大麻素衍生物，这对于使用化学合成是具有挑战性的。本文公开的大麻素或大麻素衍生物可以是对映异构体或非对映异构体。术语“对映异构体”可指彼此为不重叠镜像的一对立体异构体。在一些实施方案中，大麻素或大麻素衍生物可以是(S)-对映异构体。在一些实施方案中，大麻素或大麻素衍生物可以是(R)-对映异构体。在一些实施方案中，大麻素或大麻素衍生物可以是(+)或(-)对映异构体。术语“非对映异构体”可以指不能通过围绕单键旋转使其重叠的一组立体异构体。例如，顺式-双键和反式-双键，双环系统上的内取代和外取代，以及具有不同相对构型的含多个立体中心的化合物可以被认为是非对映异构体。术语“非对映异构体”可以指该组化合物的任何成员。本文公开的大麻素或大麻素衍生物可以包括双键或稠环。在某些此类实施方案中，除非明确定义了构型，否则双键或稠环可以是顺式或反式的。除非明确定义了构型，否则如果大麻素或大麻素衍生物含有双键，则取代基可以是E或Z构型。
在一些实施方案中，当从细胞裂解物；从培养基；从经修饰的宿主细胞；从细胞裂解物和培养基两者；从经修饰的宿主细胞和培养基两者；从细胞裂解物、经修饰的宿主细胞和培养基；或从包含本文公开的一种或多种多肽和/或经工程改造的变体的无细胞反应混合物中回收大麻素或大麻素衍生物时，回收的大麻素或大麻素衍生物是盐形式。在某些此类实施方案中，所述盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化回收的大麻素或大麻素衍生物的盐。
本公开包括本文所述的大麻素或大麻素衍生物的药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”可以指保留游离碱的生物有效性和性质，不是生物学上或其他方面不期望的那些盐。代表性的药学上可接受的盐包括但不限于，例如水溶性和水不溶性盐，诸如乙酸盐、氨芪磺酸盐(water-insoluble salt)(4,4-二氨基二苯乙烯-2,2-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、钙盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐(camsylate)、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐(clavulariate)、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐(edisylate)、丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、反丁烯二酸盐(fiunarate)、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐(sethionate)、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、镁盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1,1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐，恩波酸盐(einbonate))、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、苏拉明酸盐(suramate)、丹宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐、三乙碘化物和戊酸盐。
“药学上可接受的盐”还包括酸加成盐和碱加成盐两者。“药学上可接受的酸加成盐”可以指保留游离碱的生物有效性和性质，不是生物学上或其他方面不期望的，并且与无机酸和有机酸形成的那些盐，所述无机酸诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸诸如但不限于醋酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-l,5-二磺酸、萘-2-磺酸、l-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
“药学上可接受的碱加成盐”可以指保留游离酸的生物有效性和性质，不是生物学上或其他方面不期望的那些盐。这些盐通过向游离酸中添加无机碱或有机碱来制备。源自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。例如，无机盐包括但不限于铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。源自有机碱的盐包括但不限于以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺、经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂(诸如氨)、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、地阿诺(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组胺、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、海巴明(hydrabamine)、胆碱(choline)、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱(theobromine)、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。
本公开提供了一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括使用本公开的经工程改造的变体。在某些此类实施方案中，以mg/L或mM计，产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于在包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体的方法中产生的大麻素或大麻素衍生物的量。在某些此类实施方案中，本公开的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。在本公开的产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的大麻素或大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括使用具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体。在某些此类实施方案中，本公开的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
在本公开的产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法与在包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体的方法中产生的CBDA与THCA比率相比，以增加的CBDA与THCA比率产生CBDA。在某些此类实施方案中，本公开的经工程改造的变体和具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。在本公开的产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在本公开的产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法与在包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是本公开的经工程改造的变体的方法中产生的CBDA与CBCA的比率相比，以增加的CBDA与THCA比率产生CBDA。在某些此类实施方案中，本公开的经工程改造的变体和具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。在本公开的产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
使用宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法
本公开提供了产生大麻素或大麻素衍生物(诸如本文所述的那些)的方法，所述方法包括：在培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞。在某些此类实施方案中，所述方法包括回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化产生的大麻素或大麻素衍生物。
在一些实施方案中，与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞相比，在培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞，以增加的量提供大麻素或大麻素衍生物(诸如本文所述的那些)的合成。
本公开提供了产生大麻素或大麻素衍生物(诸如本文所述的那些)的方法，所述方法包括：在包含羧酸的培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞。在某些此类实施方案中，所述方法包括回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化产生的大麻素或大麻素衍生物。
在一些实施方案中，从细胞裂解物；从培养基；从经修饰的宿主细胞；从细胞裂解物和培养基两者；从经修饰的宿主细胞和培养基两者；或从细胞裂解物、经修饰的宿主细胞和培养基中回收大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化回收的大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，当从细胞裂解物；从培养基；从经修饰的宿主细胞；从细胞裂解物和培养基两者；从经修饰的宿主细胞和培养基两者；或从细胞裂解物、经修饰的宿主细胞和培养基中回收大麻素或大麻素衍生物时，回收的大麻素或大麻素衍生物是盐形式。在某些此类实施方案中，所述盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化回收的大麻素或大麻素衍生物的盐。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养。在一些实施方案中，羧酸可以被一个或多个官能团和/或反应性基团取代或包含一个或多个官能团和/或反应性基团。官能团可以包括但不限于叠氮基、卤素(例如氯、溴、碘、氟)、甲基、烷基、炔基、烯基、甲氧基、烷氧基、乙酰基、氨基、羧基、羰基、氧代、酯、羟基、硫基(例如，硫醇)、氰基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环烷基烯基、环烷基炔基、环烯基烷基、环烯基烯基、环烯基炔基、杂环基烯基、杂环基炔基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、芳基烯基、芳基炔基、螺环基、杂螺环基、杂环基、硫代烷基(或烷硫基)、芳硫基、杂芳硫基、砜、磺酰基、亚砜、酰氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、N-氧化物、酰亚胺、烯胺、亚胺、肟、腙、腈、芳烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基烷基、杂芳基烷基、硝基、硫酮基等。合适的反应性基团可以包括但不一定限于叠氮化物、卤素、羧基、羰基、胺(例如，烷基胺(例如，低级烷基胺)、芳基胺)、酯(例如，烷基酯(例如，低级烷基酯、苄基酯)、芳基酯、经取代的芳基酯)、氰基、硫酯、硫醚、磺酰卤、醇、硫醇、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、肼、炔基、烯基等。在一些实施方案中，反应性基团选自羧基、羰基、胺、酯、硫酯、硫醚、磺酰卤、醇、硫醇、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、叠氮化物、炔烃、烯烃和肼。官能团和反应性基团可以是未取代的或被一个或多个官能团或反应性基团取代。
在一些实施方案中，羧酸是同位素标记的或放射性标记的。在一些实施方案中，羧酸可以是对映异构体或非对映异构体。在一些实施方案中，羧酸可以是(S)-对映异构体。在一些实施方案中，羧酸可以是(R)-对映异构体。在一些实施方案中，羧酸可以是(+)或(-)对映异构体。在一些实施方案中，羧酸可包括双键或稠环。在某些此类实施方案中，除非明确定义了构型，否则双键或稠环可以是顺式或反式的。除非明确定义了构型，否则如果羧酸含有双键，则取代基可以是E或Z构型。
在一些实施方案中，羧酸包含C＝C基团。在一些实施方案中，羧酸包含炔烃基团。在一些实施方案中，羧酸包含N3基团。在一些实施方案中，羧酸包含卤素。在一些实施方案中，羧酸包含CN基团。在一些实施方案中，羧酸包含碘。在一些实施方案中，羧酸包含溴。在一些实施方案中，羧酸包含氯。在一些实施方案中，羧酸包括氟。在一些实施方案中，羧酸包含羰基。在一些实施方案中，羧酸包含乙酰基。在一些实施方案中，羧酸包含烷基。在一些实施方案中，羧酸包含芳基。
羧酸可以包括但不限于未取代或取代的C3-C18脂肪酸、C3-C18羧酸、C1-C18羧酸、丁酸、异丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、C15-C18脂肪酸、C15-C18羧酸、富马酸、衣康酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、戊二酸、葡萄糖二酸、草酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸、戊烯二酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸、丙三羧酸和均苯三甲酸。C羧酸可以包括未取代或取代的未取代或取代的C1-C18羧酸。C羧酸可以包括未取代或取代的未取代或取代的C3-C18羧酸。C羧酸可以包括未取代或取代的未取代或取代的C3-C12羧酸。C羧酸可以包括未取代或取代的未取代或取代的C4-C10羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C4羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C5羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C6羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C7羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C8羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C9羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的C10羧酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的丁酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的戊酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的己酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的庚酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的辛酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的壬酸。在一些实施方案中，羧酸为未取代或取代的癸酸。
羧酸可以包括但不限于2-甲基己酸、3-甲基己酸、4-甲基己酸、5-甲基己酸、2-己烯酸、3-己烯酸、4-己烯酸、5-己烯酸、5-氯戊酸、5-氨基戊酸、5-氰基戊酸、5-(甲基硫烷基)戊酸、5-羟基戊酸、5-苯基戊酸、2,3-二甲基己酸、d3-己酸、4-戊炔酸、反式-2-戊烯酸、5-己炔酸、反式-2-己烯酸、6-庚炔酸、反式-2-辛烯酸、反式-2-壬烯酸、4-苯基丁酸、6-苯基己酸、7-苯基庚酸等等。在一些实施方案中，羧酸为2-甲基己酸。在一些实施方案中，羧酸为3-甲基己酸。在一些实施方案中，羧酸为4-甲基己酸。在一些实施方案中，羧酸为5-甲基己酸。在一些实施方案中，羧酸为2-己烯酸。在一些实施方案中，羧酸为3-己烯酸。在一些实施方案中，羧酸为4-己烯酸。在一些实施方案中，羧酸为5-己烯酸。在一些实施方案中，羧酸为5-氯戊酸。在一些实施方案中，羧酸为5-氨基戊酸。在一些实施方案中，羧酸为5-氰基戊酸。在一些实施方案中，羧酸为5-(甲基硫烷基)戊酸。在一些实施方案中，羧酸为5-羟基戊酸。在一些实施方案中，羧酸为5-苯基戊酸。在一些实施方案中，羧酸为2,3-二甲基己酸。在一些实施方案中，羧酸为d3-己酸。在一些实施方案中，羧酸为4-戊炔酸。在一些实施方案中，羧酸为反式-2-戊烯酸。在一些实施方案中，羧酸为5-己炔酸。在一些实施方案中，羧酸为反式-2-己烯酸。在一些实施方案中，羧酸为6-庚炔酸。在一些实施方案中，羧酸为反式-2-辛烯酸。在一些实施方案中，羧酸为反式-2-壬烯酸。在一些实施方案中，羧酸为4-苯基丁酸。在一些实施方案中，羧酸为6-苯基己酸。在一些实施方案中，羧酸为7-苯基庚酸。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是未取代的或经取代的C3-C18羧酸。在某些此类实施方案中，未取代的或经取代的C3-C18羧酸是未取代的或经取代的己酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是丁酸、戊酸、己酸、辛酸、2-甲基己酸、3-甲基己酸、4-甲基己酸、5-甲基己酸、2-己烯酸、3-己烯酸、4-己烯酸、5-己烯酸、庚酸、5-氯戊酸、5-(甲基硫烷基)戊酸、4-戊炔酸、反式-2-戊烯酸、5-己炔酸、反式-2-己烯酸、6-庚炔酸、反式-2-辛烯酸、壬酸、反式-2-壬烯酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、4-苯基丁酸、5-苯基戊酸、6-苯基己酸、7-苯基庚酸、异丁酸、富马酸、衣康酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、戊二酸、葡糖二酸、草酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸、戊烯二酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸、丙三羧酸、均苯三酸、5-氨基戊酸、5-氰基戊酸、5-羟基戊酸或2,3-二甲基己酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是丁酸、戊酸、己酸、辛酸、2-甲基己酸、3-甲基己酸、4-甲基己酸、5-甲基己酸、2-己烯酸、3-己烯酸、4-己烯酸、5-己烯酸、庚酸、5-氯戊酸、5-(甲基硫烷基)戊酸、4-戊炔酸、反式-2-戊烯酸、5-己炔酸、反式-2-己烯酸、6-庚炔酸、反式-2-辛烯酸、壬酸、反式-2-壬烯酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、4-苯基丁酸、5-苯基戊酸、6-苯基己酸、7-苯基庚酸、异丁酸、富马酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、戊二酸、草酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、均苯三酸、5-氨基戊酸、5-氰基戊酸、5-羟基戊酸或2,3-二甲基己酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是2-甲基己酸、3-甲基己酸、4-甲基己酸、5-甲基己酸、2-己烯酸、3-己烯酸、4-己烯酸、庚酸、5-氯戊酸、5-(甲基硫烷基)戊酸、4-戊炔酸、反式-2-戊烯酸、5-己炔酸、反式-2-己烯酸、6-庚炔酸、反式-2-辛烯酸、壬酸、反式-2-壬烯酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、4-苯基丁酸、5-苯基戊酸、6-苯基己酸、7-苯基庚酸、异丁酸、富马酸、衣康酸、苹果酸、马来酸、葡糖二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸、戊烯二酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸、丙三羧酸、均苯三酸、5-氨基戊酸、5-氰基戊酸、5-羟基戊酸或2,3-二甲基己酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是2-甲基己酸、3-甲基己酸、4-甲基己酸、5-甲基己酸、2-己烯酸、3-己烯酸、4-己烯酸、庚酸、5-氯戊酸、5-(甲基硫烷基)戊酸、4-戊炔酸、反式-2-戊烯酸、5-己炔酸、反式-2-己烯酸、6-庚炔酸、反式-2-辛烯酸、壬酸、反式-2-壬烯酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、4-苯基丁酸、5-苯基戊酸、6-苯基己酸、7-苯基庚酸、异丁酸、富马酸、马来酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十二烷二酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、均苯三酸、5-氨基戊酸、5-氰基戊酸、5-羟基戊酸或2,3-二甲基己酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是4-戊炔酸、反式-2-戊烯酸、5-己炔酸、反式-2-己烯酸、6-庚炔酸、反式-2-辛烯酸、壬酸、反式-2-壬烯酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、4-苯基丁酸、5-苯基戊酸、6-苯基己酸或7-苯基庚酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
在其中本公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸的培养基中培养的一些实施方案中，所述羧酸是2-甲基己酸、4-甲基己酸、5-甲基己酸、2-己烯酸、3-己烯酸、4-己烯酸、庚酸、5-氯戊酸或5-(甲基硫烷基)戊酸。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
本公开还提供了产生大麻素或大麻素衍生物(诸如本文所述的那些)的方法，所述方法包括：在包含橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物的培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞。在某些此类实施方案中，所述方法包括回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化产生的大麻素或大麻素衍生物。
本文所用的橄榄醇酸衍生物可被本文公开的一个或多个反应性基团和/或官能团取代或包含本文公开的一个或多个反应性基团和/或官能团。在一些实施方案中，橄榄醇酸衍生物可以缺少在橄榄醇酸中发现的一个或多个化学部分。在一些实施方案中，当培养基包含橄榄醇酸衍生物时，所述橄榄醇酸衍生物是苔色酸。在一些实施方案中，当培养基包含橄榄醇酸衍生物时，所述橄榄醇酸衍生物是二茶碱酸(divarinic acid)。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物以大于50mg/L培养基的量产生。
本公开提供了使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法。在使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的大麻素或大麻素衍生物的量，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞。在某些此类实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
在使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，以mg/L或mM计，产生的大麻素或大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞。在某些此类实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
在使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法以与在替代方法中产生的CBDA与THCA比率相比增加的CBDA与THCA比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，其在相似培养条件下生长相同时间长度。在使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
在使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法以与在替代方法中产生的CBDA与CBCA的比率相比增加的CBDA与THCA比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但缺乏包含编码经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，其在相似培养条件下生长相同时间长度。在使用本公开的经修饰的宿主细胞产生大麻素或大麻素衍生物的方法的一些实施方案中，所述大麻素是CBDA并且所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
示例性细胞培养条件
用于培养本公开的经修饰的宿主细胞的合适的培养基可以包括标准培养基(例如，Luria-Bertani肉汤，任选地补充有一种或多种另外的试剂，诸如诱导因子(例如，其中本文公开的核酸在诱导型启动子的控制下，等等)；标准酵母培养基；等等)。在一些实施方案中，培养基可以补充有可发酵糖(例如己糖或戊糖，例如葡萄糖、木糖、半乳糖等)。可由酵母发酵的糖可包括但不限于蔗糖、右旋糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖和麦芽糖。
在一些实施方案中，培养基可以补充有未取代的或经取代的己酸、除未取代的或经取代的己酸之外的羧酸、橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物。在一些实施方案中，培养基可以补充有经预处理的纤维素原料(例如，麦草、麦秆、大麦秆、高粱、稻草、甘蔗秆、甘蔗渣、柳枝稷、玉米秸、玉米纤维、谷物或它们的任何组合)。在一些实施方案中，培养基可以补充有油酸。在一些实施方案中，培养基包含非发酵碳源。在某些此类实施方案中，非发酵碳源包含乙醇。在一些实施方案中，合适的培养基包含诱导因子。在某些此类实施方案中，诱导因子包括半乳糖。在一些实施方案中，诱导因子包括KH2PO4、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、氨基酸(例如，甲硫氨酸、赖氨酸)、CuSO4、温度变化(例如，30℃变为37℃)、pH变化(例如，pH 6变为pH 4)、氧水平变化(例如，溶解氧水平从20％变为1％)、添加产生过氧化氢或超氧化物的药物甲萘醌、衣霉素、易于错误折叠的蛋白质的表达(例如，大麻素合酶)、雌二醇或强力霉素。本文详述了另外的诱导系统。
合适培养基中的碳源可以显著不同，从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的更复杂的水解产物诸如酵母提取物。盐的添加通常提供必需元素诸如镁、氮、磷和硫，以允许细胞合成多肽和核酸。合适的培养基还可以补充有选择性试剂，诸如抗生素，以选择维持某些质粒等。例如，如果微生物对某种抗生素(诸如氨苄青霉素或四环素)具有抗性，则可以将该抗生素添加到培养基中以便防止缺乏抗性的细胞生长。合适的培养基可以根据需要补充其他化合物以选择所需的生理或生化特征，诸如特定的氨基酸等。
在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在一种或多种基本培养基中生长。如本文所用，术语“一种基本培养基”或“多种基本培养基”可以指包含规定营养组成的培养基，通常以最小的成本选择，同时仍然允许稳健的生长和产生。如本文所用，术语“一种基本培养基”或“多种基本培养基”可以指含有以下的培养基：(1)一种或多种供细胞(例如，细菌或酵母)生长的碳源；(2)可在细胞(例如，细菌或酵母)物种和生长条件之间变化的各种盐；(3)维生素和微量元素；和(4)水。通常，但不总是，基本培养基缺乏一种或多种氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种氨基酸)。基本培养基还可以包含生长因子、诱导因子和阻遏物。在一些实施方案中，与一种或多种丰富培养基相比，一种或多种基本培养基在发酵罐中提供更高的生物质形成。在一些实施方案中，一种或多种基本培养基包含羧酸(例如，1mM橄榄醇酸、1mM橄榄醇酸衍生物、2mM未取代的或经取代的己酸，或2mM除未取代的或经取代的己酸以外的羧酸)。
在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在一种或多种丰富培养基中生长。在某些此类实施方案中，所述一种或多种丰富培养基包含酵母提取物右旋糖蛋白胨(YPD)培养基，该培养基包含水、酵母提取物、细菌蛋白胨和右旋糖(葡萄糖)。在某些此类实施方案中，所述一种或多种丰富培养基包含酵母提取物右旋糖蛋白胨(YPD)培养基，该培养基包含水、10g/L酵母提取物、20g/L细菌蛋白胨和20g/L右旋糖(葡萄糖)。在一些实施方案中，所述一种或多种丰富培养基包含YP+半乳糖和葡萄糖。在一些实施方案中，所述一种或多种丰富培养基包含YP+20g/L半乳糖或YP+40g/L半乳糖和1g/L葡萄糖。在一些实施方案中，所述一种或多种丰富培养基包含羧酸(例如，1mM橄榄醇酸、1mM橄榄醇酸衍生物、2mM未取代的或经取代的己酸，或2mM除未取代的或经取代的己酸以外的羧酸)。在一些实施方案中，与一种或多种基本培养基相比，一种或多种丰富培养基在发酵中提供更大的细胞密度。
本文例如在实施例部分中描述了适于本公开的重组细胞维持和生长的材料和方法。适于细胞(例如，细菌或酵母)培养物维持和生长的其他材料和方法是本领域公知的。示例性技术可见于国际公开号WO2009/076676、美国专利申请号12/335,071(美国公开号2009/0203102)、WO 2010/003007、美国公开号2010/0048964、WO 2009/132220、美国公开号2010/0003716、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt等人编辑),American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1994)或Brock inBiotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第二版(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA中。
标准细胞培养条件可用于培养本文公开的经修饰的宿主细胞(参见，例如WO2004/033646和其中引用的参考文献)。在一些实施方案中，细胞在适当的温度、气体混合物和pH(诸如在约20℃至约37℃，在约0.04％至约84％CO2，在约0％至约100％溶解氧和在约2至约9的pH)下生长和维持。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在约34℃下在合适的细胞培养基中生长。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在约20℃至约37℃下在合适的细胞培养基中生长。虽然最适于酿酒酵母生长的是约30℃，但是在较高温度例如34℃下培养细胞可通过降低冷却工业发酵罐的成本而有利。在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在合适的细胞培养基中在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃下生长。在一些实施方案中，发酵的pH范围在约pH 3.0至约pH9.0之间(诸如约pH 3.0、约pH3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 6.0至约pH 8.0或约pH 6.5至约pH7.0)。在一些实施方案中，发酵的pH范围在约pH 4.5至约pH 5.5之间。在一些实施方案中，发酵的pH范围在约pH 4.0至约pH 6.0之间。在一些实施方案中，发酵的pH范围在约pH 3.0至约pH 6.0之间。在一些实施方案中，发酵的pH范围在约pH 3.0至约pH 5.5之间。在一些实施方案中，发酵的pH范围在约pH 3.0至约pH 5.0之间。在一些实施方案中，溶解氧在约0％至约10％、约0％至约20％、约0％至约30％、约0％至约40％、约0％至约50％、约0％至约60％、约0％至约70％、约0％至约80％、约0％至约90％、约5％至约10％、约5％至约20％、约5％至约30％、约5％至约40％、约5％至约50％、约5％至约60％、约5％至约70％、约5％至约80％、约5％至约90％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％或约10％至约50％之间。在一些实施方案中，CO2水平在约0.04％至约0.1％CO2、约0.04％至约1％CO2、约0.04％至约5％CO2、约0.04％至约10％CO2、约0.04％至约20％CO2、约0.04％至约30％CO2、约0.04％至约40％CO2、约0.04％至约50％CO2、约0.04％至约60％CO2、约0.04％至约70％CO2、约0.1％至约5％CO2、约0.1％至约10％CO2、约0.1％至约20％CO2、约0.1％至约30％CO2、约0.1％至约40％CO2、约0.1％至约50％CO2、约1％至约5％CO2、约1％至约10％CO2、约1％至约20％CO2、约1％至约30％CO2、约1％至约40％CO2、约1％至约50％CO2、约5％至约10％CO2、约10％至约20％CO2、约10％至约30％CO2、约10％至约40％CO2、约10％至约50％CO2、约10％至约60％CO2、约10％至约70％CO2、约10％至约80％CO2、约50％至约60％CO2、约50％至约70％CO2或约50％至约80％CO2之间。本文公开的经修饰的宿主细胞可以基于细胞的需求在需氧、缺氧、微需氧或厌氧条件下生长。
可以使用的标准培养条件和发酵模式，诸如分批发酵、补料分批发酵或连续发酵在国际公开号WO 2009/076676、美国专利申请号12/335,071(美国公开号2009/0203102)、WO 2010/003007、美国公开号2010/0048964、WO 2009/132220、美国公开号2010/0003716中有描述，其各自的内容通过引用整体并入本文。分批发酵和补料分批发酵是本领域常见和公知的，并且可以在Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第二版(1989)Sinauer Associates,Inc.中找到实例。
大麻素或大麻素衍生物的产生和产生的大麻素或大麻素衍生物的回收
本公开提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法由本公开的经修饰的宿主细胞以约1mg/L培养基至约1g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1mg/L培养基至约500mg/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1mg/L培养基至约100mg/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。例如，在一些实施方案中，本公开的方法以约1mg/L培养基至约5mg/L培养基、约5mg/L培养基至约10mg/L培养基、约10mg/L培养基至约25mg/L培养基、约25mg/L培养基至约50mg/L培养基、约50mg/L培养基至约75mg/L培养基或约75mg/L培养基至约100mg/L培养基的量提供大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约100mg/L培养基至约150mg/L培养基、约150mg/L培养基至约200mg/L培养基、约200mg/L培养基至约250mg/L培养基、约250mg/L培养基至约500mg/L培养基、约500mg/L培养基至约750mg/L培养基或约750mg/L培养基至约1g/L培养基的量提供大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50mg/L培养基至约100mg/L培养基、约50mg/L培养基至约150mg/L培养基、约50mg/L培养基至约200mg/L培养基、约50mg/L培养基至约250mg/L培养基、约50mg/L培养基至约500mg/L培养基或约50mg/L培养基至约750mg/L培养基的量提供大麻素或大麻素衍生物的产生。
在一些实施方案中，本公开的方法以约50mg/L培养基至约100g/L培养基或大于100g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50mg/L培养基至约100mg/L培养基或大于100mg/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以大于50mg/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以大于100mg/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约100mg/L培养基至约500mg/L培养基或大于500mg/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约500mg/L培养基至约1g/L培养基或大于1g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约10g/L培养基或大于10g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约100g/L培养基或大于100g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约20g/L培养基或大于20g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约30g/L培养基或大于30g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约40g/L培养基或大于40g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约50g/L培养基或大于50g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约60g/L培养基或大于60g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约70g/L培养基或大于70g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约80g/L培养基或大于80g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约1g/L培养基至约90g/L培养基或大于90g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约20g/L培养基或大于20g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约30g/L培养基或大于30g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约40g/L培养基或大于40g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约50g/L培养基或大于50g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约60g/L培养基或大于60g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约70g/L培养基或大于70g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约80g/L培养基或大于80g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约10g/L培养基至约90g/L培养基或大于90g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50g/L培养基至约100g/L培养基或大于100g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50g/L培养基至约60g/L培养基或大于60g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50g/L培养基至约70g/L培养基或大于70g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50g/L培养基至约80g/L培养基或大于80g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约50g/L培养基至约90g/L培养基或大于90g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约100g/L培养基或大于100g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约30g/L培养基或大于30g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约40g/L培养基或大于40g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约50g/L培养基或大于50g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约60g/L培养基或大于60g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约70g/L培养基或大于70g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约80g/L培养基或大于80g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。在一些实施方案中，本公开的方法以约20g/L培养基至约90g/L培养基或大于90g/L培养基的量提供了大麻素或大麻素衍生物的产生。
在一些实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在包含羧酸、橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物的液体培养基中培养。
在一些实施方案中，产生大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的方法可牵涉在有利于大麻素或大麻素衍生物产生的条件下培养本公开的经修饰的酵母细胞；其中所述大麻素或大麻素衍生物由所述经修饰的酵母细胞产生并且存在于培养所述经修饰的酵母细胞的培养基(例如，液体培养基)中。在一些实施方案中，培养经修饰的酵母细胞的培养基包含1ng/L至1g/L(例如，1ng/L至50ng/L、50ng/L至100ng/L、100ng/L至500ng/L、500ng/L至1μg/L、1μg/L至50μg/L、50μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、500μg/L至1mg/L、1mg/L至50mg/L、50mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L或500mg/L至1g/L)的量的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，经修饰的酵母细胞是经修饰的酿酒酵母。在一些实施方案中，培养经修饰的酵母细胞的培养基包含50mg/L至100mg/L的量的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，经修饰的酵母细胞是经修饰的酿酒酵母。在一些实施方案中，培养经修饰的酵母细胞的培养基包含100mg/L至500mg/L的量的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，经修饰的酵母细胞是经修饰的酿酒酵母。在一些实施方案中，培养经修饰的酵母细胞的培养基包含500mg/L至1g/L的量的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，经修饰的酵母细胞是经修饰的酿酒酵母。在一些实施方案中，培养经修饰的酵母细胞的培养基包含大于1g/L的量的大麻素或大麻素衍生物。在某些此类实施方案中，经修饰的酵母细胞是经修饰的酿酒酵母。
在一些实施方案中，产生大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的方法可牵涉在有利于糖发酵的条件下和在有利于大麻素或大麻素衍生物产生的条件下培养本公开的经修饰的酵母细胞；其中所述大麻素或大麻素衍生物由所述经修饰的酵母细胞产生并且存在于由所述经修饰的酵母细胞产生的醇中。本公开提供了由经修饰的酵母细胞产生的酒精饮料，其中所述酒精饮料包含由经修饰的酵母细胞产生的大麻素或大麻素衍生物。酒精饮料可以包括啤酒、葡萄酒和蒸馏型酒精饮料。在一些实施方案中，本公开的酒精饮料包含1ng/L至1g/L(例如，1ng/L至50ng/L、50ng/L至100ng/L、100ng/L至500ng/L、500ng/L至1μg/L、1μg/L至50μg/L、50μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、500μg/L至1mg/L、1mg/L至50mg/L、50mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L或500mg/L至1g/L)的量的大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，本公开的酒精饮料包含大于1g/L的量的大麻素或大麻素衍生物。
本公开提供了由经修饰的酵母细胞产生的饮料，其中所述饮料包含由经修饰的酵母细胞产生的大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)。在一些实施方案中，本公开的饮料包含1ng/L至1g/L(例如，1ng/L至50ng/L、50ng/L至100ng/L、100ng/L至500ng/L、500ng/L至1μg/L、1μg/L至50μg/L、50μg/L至100μg/L、100μg/L至500μg/L、500μg/L至1mg/L、1mg/L至50mg/L、50mg/L至100mg/L、100mg/L至500mg/L或500mg/L至1g/L)的量的大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，本公开的饮料包含大于1g/L的量的大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，本公开的饮料是非酒精性的。
在一些实施方案中，本公开的方法提供增加的大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生。在某些此类实施方案中，与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞相比，在培养基中培养本文公开的经修饰的宿主细胞提供增加的量的大麻素或大麻素衍生物的合成。与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞相比，本文公开的经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物产生可增加约5％至约1,000,000倍。与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生相比，本文公开的经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生可增加约10％至约1,000,000倍(例如，约50％至约1,000,000倍，约1至约500,000倍，约1至约50,000倍，约1至约5,000倍，约1至约1,000倍，约1至约500倍，约1至约100倍，约1至约50倍，约5至约100,000倍，约5至约10,000倍，约5至约1,000倍，约5至约500倍，约5至约100倍，约10至约50,000倍，约50至约10,000倍，约100至约5,000倍，约200至约1,000倍，约50至约500倍，或约50至约200倍)。与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生相比，本文公开的经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生也可以增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍或1,000,000倍或更多中的任何情况。
在一些实施方案中，与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生相比，本公开的经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的产生也可以增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任何情况。在一些实施方案中，与在相似条件下培养的未经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生相比，本文公开的经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生还可以增加至少约1-20％、2-20％、5-20％、10-20％、15-20％、1-15％、1-10％、2-15％、2-10％、5-15％、10-15％、1-50％、10-50％、20-50％、30-50％、40-50％、50-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％或50-100％中的任何情况。
在一些实施方案中，通过LC-MS分析测定本公开的经修饰的宿主细胞的大麻素或大麻素衍生物的产生。在某些此类实施方案中，通过从真实标准确定的保留时间和多反应监测(MRM)转换来鉴定每种大麻素或大麻素衍生物。
在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞是酵母细胞。在某些此类实施方案中，本文公开的经修饰的宿主细胞在生物反应器中培养。在一些实施方案中，在补充有未取代的或经取代的己酸、除未取代的或经取代的己酸以外的羧酸、橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物的培养基中培养经修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，经修饰的酵母细胞是经修饰的酿酒酵母。
在一些实施方案中，从细胞裂解物中回收大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)，例如通过裂解本文公开的经修饰的宿主细胞并从裂解物中回收大麻素或大麻素衍生物。在其他情况下，从培养本文公开的经修饰的宿主细胞的培养基中回收大麻素或大麻素衍生物。在其他情况下，从细胞裂解物和培养基中回收大麻素或大麻素衍生物。在其他情况下，从经修饰的宿主细胞中回收大麻素或大麻素衍生物。在其他情况下，从经修饰的宿主细胞和培养基中回收大麻素或大麻素衍生物。在其他情况下，从细胞裂解物、经修饰的宿主细胞和培养基中回收大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，当从细胞裂解物；从培养基；从经修饰的宿主细胞；从细胞裂解物和培养基两者；从经修饰的宿主细胞和培养基两者；或从细胞裂解物、经修饰的宿主细胞和培养基中回收大麻素或大麻素衍生物时，回收的大麻素或大麻素衍生物是盐形式。在某些此类实施方案中，所述盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化回收的大麻素或大麻素衍生物的盐。
在一些实施方案中，然后纯化回收的大麻素或大麻素衍生物，诸如本文公开的那些。在一些实施方案中，可以用合适的有机溶剂萃取来自包含本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的全细胞肉汤以提供大麻素或大麻素衍生物。合适的有机溶剂包括但不限于己烷、庚烷、乙酸乙酯、石油醚和乙醚、氯仿和乙酸乙酯。在一些实施方案中，合适的有机溶剂包括己烷。在一些实施方案中，可以将合适的有机溶剂以10:1的比率(10份全细胞肉汤-1份有机溶剂)添加到来自包含本公开的经修饰的宿主细胞的发酵物的全细胞肉汤中并搅拌30分钟。在某些此类实施方案中，可以分离有机级分并用等体积的酸性水(pH 2.5)萃取两次。然后可分离有机层并在浓缩器(减压的旋转蒸发器或薄膜蒸发器)中干燥以获得粗制大麻素或大麻素衍生物晶体。在某些此类实施方案中，可以将粗制晶体加热或暴露于光线以使粗制大麻素或大麻素衍生物脱羧。在某些此类实施方案中，可以将粗制晶体加热到105℃持续15分钟，接着加热到145℃持续55分钟以使粗制大麻素或大麻素衍生物脱羧。在某些此类实施方案中，可以使粗制结晶产物在合适的溶剂(例如，正戊烷)中再溶解和重结晶并过滤以去除所有不可溶物质。在某些此类实施方案中，然后可以例如通过旋转蒸发去除溶剂，以产生纯的结晶产物。
在一些实施方案中，所述大麻素或大麻素衍生物是纯的，例如至少约40％的纯度、至少约50％的纯度、至少约60％的纯度、至少约70％的纯度、至少约80％的纯度、至少约90％的纯度、至少约95％的纯度、至少约98％或大于98％的纯度，其中在大麻素或大麻素衍生物的上下文中“纯的”可以指不含其他大麻素或大麻素衍生物、大分子、污染物等的大麻素或大麻素衍生物。
制备大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法
一方面，本公开提供了用于制备大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法。在某些此类实施方案中，所述方法可包括在培养基中培养本公开的经修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，本公开的经修饰的宿主细胞是毕赤酵母属。所述方法可包括分离和/或纯化所表达的如本文所述的经工程改造的变体。
在一些实施方案中，制备经工程改造的变体的方法包括分离或纯化经工程改造的变体的步骤。本公开的经工程改造的变体可以在如本文所述的经修饰的宿主细胞中表达，并且使用用于蛋白质纯化的公知技术中的任何一种或多种从经修饰的宿主细胞和/或培养基中分离，所述技术尤其包括溶菌酶处理、超声处理、过滤、盐析、超速离心和色谱法。用于分离本公开的经工程改造的变体的色谱技术可尤其包括反相色谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳和亲和色谱法。在一些实施方案中，使用亲和色谱法。
在一些实施方案中，在本公开的经修饰的宿主细胞中表达的本公开的经工程改造的变体可以以各种形式制备和使用，包括但不限于粗提取物(例如，无细胞裂解物)、粉末(例如，摇瓶粉末)、冻干物、用甘油或另一种冷冻保护剂制备的冷冻储备液，以及基本上纯的制剂(例如，DSP粉末)。
在一些实施方案中，在本公开的经修饰的宿主细胞中表达的本公开的经工程改造的变体可以纯化形式制备和使用。通常，用于纯化特定的经工程改造的变体的条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等因素，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。
产生大麻素或大麻素衍生物的无细胞方法
本公开的方法可涉及使用由本公开的经修饰的宿主细胞表达或过表达的本文公开的经工程改造的变体进行大麻素或大麻素衍生物(诸如本文公开的那些)的无细胞产生。在一些实施方案中，本文公开的经工程改造的变体在用于产生大麻素或大麻素衍生物的无细胞系统中使用。在某些此类实施方案中，本公开的经工程改造的变体是分离的和/或纯化的。在一些实施方案中，用于产生大麻素或大麻素衍生物的适当原材料可以与本文公开的经工程改造的变体一起在合适的反应容器中混合以实现反应。本文公开的经工程改造的变体可以组合使用以实现从适当原材料完全合成大麻素或大麻素衍生物。在一些实施方案中，从包含本文公开的经工程改造的变体的无细胞反应混合物中回收大麻素或大麻素衍生物。
在一些实施方案中，然后纯化回收的大麻素或大麻素衍生物，诸如本文公开的那些。在某些此类实施方案中，包含本文公开的经工程改造的变体的无细胞反应混合物可以用合适的有机溶剂萃取以提供大麻素或大麻素衍生物。合适的有机溶剂包括但不限于己烷、庚烷、乙酸乙酯、石油醚和乙醚、氯仿和乙酸乙酯。在一些实施方案中，合适的有机溶剂包括己烷。在一些实施方案中，可以将合适的有机溶剂以10:1的比率(10份反应混合物-1份有机溶剂)添加到包含本文公开的一种或多种多肽的无细胞反应混合物中并搅拌30分钟。在某些此类实施方案中，可以分离有机级分并用等体积的酸性水(pH 2.5)萃取两次。然后可分离有机层并在浓缩器(减压的旋转蒸发器或薄膜蒸发器)中干燥以获得粗制大麻素或大麻素衍生物晶体。在某些此类实施方案中，可以将粗制晶体加热或暴露于光线以使粗制大麻素或大麻素衍生物脱羧。在某些此类实施方案中，可以将粗制晶体加热到105℃持续15分钟，接着加热到145℃持续55分钟以使粗制大麻素或大麻素衍生物脱羧。在某些此类实施方案中，可以使粗制结晶产物在合适的溶剂(例如，正戊烷)中再溶解和重结晶并过滤以去除所有不可溶物质。在某些此类实施方案中，然后可以例如通过旋转蒸发去除溶剂，以产生纯的结晶产物。
在一些实施方案中，当从包含本文公开的一种或多种经工程改造的变体的无细胞反应混合物中回收大麻素或大麻素衍生物时，回收的大麻素或大麻素衍生物是盐形式。在某些此类实施方案中，所述盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化回收的大麻素或大麻素衍生物的盐。
在一些实施方案中，通过LC-MS分析测定通过本文公开的经工程改造的变体进行的大麻素或大麻素衍生物的无细胞产生。在某些此类实施方案中，通过从真实标准确定的保留时间和多反应监测(MRM)转换来鉴定每种大麻素或大麻素衍生物。
在一些实施方案中，当从包含本文公开的一种或多种多肽和/或经工程改造的变体的无细胞反应混合物中回收大麻素或大麻素衍生物时，回收的大麻素或大麻素衍生物是盐形式。在某些此类实施方案中，所述盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，然后如本文所公开的那样纯化回收的大麻素或大麻素衍生物的盐。
本公开的非限制性实施方案的实施例
本文公开的本发明主题的实施方案单独地或与一个或多个其他实施方案组合可以是有益的。在不限制前面的描述的情况下，下面提供了本公开的某些非限制性实施方案，编号为I-1至I-132。如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，可以使用每个单独编号的实施方案或与任何前述或以下单独编号的实施方案组合。这旨在为实施方案的所有此类组合提供支持，并且不限于下面明确提供的实施方案的组合。
本公开的一些实施方案具有实施方案I的性质：
实施方案I-1.一种大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
实施方案I-2.如实施方案I-1所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含与SEQ ID NO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-3.如实施方案I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在信号多肽、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个氨基酸取代。
实施方案I-4.如实施方案I-3所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述信号多肽中包含至少一个氨基酸取代。
实施方案I-5.如实施方案I-3或I-4所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述FAD结合结构域中包含至少一个氨基酸取代。
实施方案I-6.如实施方案I-3至I-5中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述BBE结构域中包含至少一个氨基酸取代。
实施方案I-7.如实施方案I-3至I-6中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代。
实施方案I-8.如实施方案I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。
实施方案I-9.如实施方案I-8所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、M61、S62、L71、I97、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。
实施方案I-10.如实施方案I-8或I-9所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：L49、K50、N56、N57、V125、L132、V149、W161、K165、S170、L171、A172、N196、A235、K260、L268、T310、F316、L326、G378、S428、Y499、N527、H543和H544。
实施方案I-11.如实施方案I-8或I-9所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R541、H542、R543和H544。
实施方案I-12.如实施方案I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、N57、M61、L71、S170、A172、Y175、N196、H208、A235、K260、G378、K389和R543。
实施方案I-13.如实施方案I-12所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：N57、S170、A172、N196、A235、K260和G378。
实施方案I-14.如实施方案I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
实施方案I-15.如实施方案I-14所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、M61H、M61S、M61W、S62Q、L71A、L71Q、I97V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
实施方案I-16.如实施方案I-14或I-15所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：L49E、L49Q、K50T、N56E、N57D、V125E、L132M、V149I、W161R、K165A、S170T、L171I、A172V、N196Q、N196T、N196V、A235P、K260W、K260C、L268I、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、S428L、Y499M、Y499V、N527E、H543E和H544E。
实施方案I-17.如实施方案I-14或I-15所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
实施方案I-18.如实施方案I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、N57D、M61W、L71H、S170T、A172V、Y175F、N196V、H208T、A235P、K260W、G378T、K389E和R543E。
实施方案I-19.如实施方案I-18所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N57D、S170T、A172V、N196V、A235P、K260W和G378T。
实施方案I-20.如实施方案中I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ IDNO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ IDNO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
实施方案I-21.如实施方案I-20所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ IDNO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ IDNO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ IDNO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ IDNO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
实施方案I-22.如实施方案I-20或I-21所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ IDNO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ IDNO:198、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:232。
实施方案I-23.如实施方案I-20或I-21所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
实施方案I-24.如实施方案I-1或I-2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:202和SEQ IDNO:230。
实施方案I-25.如实施方案I-24所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:160、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:198。
实施方案I-26.如实施方案I-1至I-19中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29或至少30个氨基酸取代。
实施方案I-27.如实施方案I-1至I-26中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个不变氨基酸。
实施方案I-28.如实施方案I-27所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述FAD结合结构域中包含至少一个不变氨基酸。
实施方案I-29.如实施方案I-28所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述FAD结合结构域中包含至少1个不变氨基酸、至少2个不变氨基酸、至少3个不变氨基酸、至少4个不变氨基酸、至少5个不变氨基酸、至少6个不变氨基酸、至少7个不变氨基酸、至少8个不变氨基酸、至少9个不变氨基酸、至少10个不变氨基酸、至少11个不变氨基酸、至少12个不变氨基酸、至少13个不变氨基酸、至少14个不变氨基酸或至少15个不变氨基酸。
实施方案I-30.如实施方案I-27至I-29中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述BBE结构域中包含至少一个不变氨基酸。
实施方案I-31.如实施方案I-30所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述BBE结构域中包含至少1个不变氨基酸、至少2个不变氨基酸、至少3个不变氨基酸、至少4个不变氨基酸、至少5个不变氨基酸、至少6个不变氨基酸、至少7个不变氨基酸、至少8个不变氨基酸、至少9个不变氨基酸、至少10个不变氨基酸、至少11个不变氨基酸、至少12个不变氨基酸、至少13个不变氨基酸、至少14个不变氨基酸或至少15个不变氨基酸。
实施方案I-32.如实施方案I-1至I-19中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：A28、F34、L35、C37、L64、N70、P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248、V251、V259、Q276、F312、S313、L323、C341、F352、S354、F380、K381、I382、K383、D385、Y386、I391、M412、L415、G419、M422、I425、I430、P431、P433、H434、R435、G437、Y440、W443、Y444、I445、I464、Y465、M468、T469、Y471、V472、P476、R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。
实施方案I-33.如实施方案I-32所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：C37、N70、I93、C99、E117、S120、F127、D131、G156、E157、Y159、G174、C176、G182、G183、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、R195、D202、D206、G214、W228、G234、F238、L248、Q276、S313、L323、S354、K381、K383、D385、G419、M422、R435、Y440、W443、Y444、Y471、P476、N513、F514、N528和Q534。
实施方案I-34.如实施方案I-1至I-33中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个不变氨基酸。
实施方案I-35.如实施方案I-1至I-34中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，所述经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生的大麻二酚酸(CBDA)的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
实施方案I-36.如实施方案I-1至I-35中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，所述经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)的量比由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
实施方案I-37.如实施方案I-1至I-36中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述经工程改造的变体以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)。
实施方案I-38.如实施方案I-1至I-37中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
实施方案I-39.如实施方案I-1至I-19或I-26至I-38中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在N末端、C末端或在N末端和C末端两者包含截短。
实施方案I-40.如实施方案I-39所述的经工程改造的变体，其中所述截短的经工程改造的变体包含信号多肽或膜锚定物。
实施方案I-41.如实施方案I-39或I-40所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体缺乏天然信号多肽。
实施方案I-42.如实施方案I-39至I-41中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在C末端包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸的截短。
实施方案I-43.一种核酸，所述核酸包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列。
实施方案I-44.一种核酸，所述核酸包含编码大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:49、SEQID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQID NO:231和SEQ ID NO:233。
实施方案I-45.如实施方案I-43或I-44中任一项所述的核酸，其中所述核苷酸序列是密码子优化的。
实施方案I-46.一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括将如实施方案I-43至I-45中任一项所述的一种或多种核酸引入宿主细胞中。
实施方案I-47.一种载体，所述载体包含如实施方案I-43至I-45中任一项所述的一种或多种核酸。
实施方案I-48.一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括将如实施方案I-47所述的一种或多种载体引入宿主细胞中。
实施方案I-49.一种用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含如实施方案I-43至I-45中任一项所述的一种或多种核酸。
实施方案I-50.如实施方案I-49所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽的核苷酸序列。
实施方案I-51.如实施方案I-50所述的经修饰的宿主细胞，其中所述GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-52.如实施方案I-50或I-51所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种异源核酸包含编码所述GOT多肽的核苷酸序列。
实施方案I-53.如实施方案I-49所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列。
实施方案I-54.如实施方案I-53所述的经修饰的宿主细胞，其中所述NphB多肽包含与SEQ ID NO:294具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-55.如实施方案I-49至I-54中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码四酮化合物合酶(TKS)多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种含有编码橄榄醇酸环化酶(OAC)多肽的核苷酸序列的异源核酸。
实施方案I-56.如实施方案I-55所述的经修饰的宿主细胞，其中所述TKS多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-57.如实施方案I-55或I-56所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含三种或更多种异源核酸，所述三种或更多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列。
实施方案I-58.如实施方案I-55至I-57中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述OAC多肽包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:48具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-59.如实施方案I-55至I-58中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含三种或更多种异源核酸，所述三种或更多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列。
实施方案I-60.如实施方案I-49至I-59中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码酰基活化酶(AAE)多肽的核苷酸序列。
实施方案I-61.如实施方案I-60所述的经修饰的宿主细胞，其中所述AAE多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-62.如实施方案I-60或I-61所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列。
实施方案I-63.如实施方案I-49至I-62中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含以下的一者或多者：a)一种或多种包含编码HMG-CoA合酶(HMGS)多肽的核苷酸序列的异源核酸；b)一种或多种包含编码截短的3-羟基-3-甲基-戊二酰基-CoA还原酶(tHMGR)多肽的核苷酸序列的异源核酸；c)一种或多种包含编码甲羟戊酸激酶(MK)多肽的核苷酸序列的异源核酸；d)一种或多种包含编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽的核苷酸序列的异源核酸；e)一种或多种包含编码焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD1)多肽的核苷酸序列的异源核酸；或f)一种或多种包含编码异戊烯二磷酸异构酶(IDI1)多肽的核苷酸序列的异源核酸。
实施方案I-64.如实施方案I-63所述的经修饰的宿主细胞，其中所述IDI1多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-65.如实施方案I-63或I-64所述的经修饰的宿主细胞，其中所述tHMGR多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-66.如实施方案I-63至I-65中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述HMGS多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-67.如实施方案I-63至I-66中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述MK多肽包含与SEQ ID NO:39具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-68.如实施方案I-63至I-67中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PMK多肽包含与SEQ ID NO:37具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-69.如实施方案I-63至I-68中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述MVD1多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-70.如实施方案I-49至I-69中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列。
实施方案I-71.如实施方案I-70所述的经修饰的宿主细胞，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-72.如实施方案I-49至I-71中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码丙酮酸脱羧酶(PDC)多肽的核苷酸序列。
实施方案I-73.如实施方案I-72所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PDC多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-74.如实施方案I-49至I-73中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸合酶(GPPS)多肽的核苷酸序列。
实施方案I-75.如实施方案I-74所述的经修饰的宿主细胞，其中所述GPPS多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-76.如实施方案I-49至I-75中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码KAR2多肽的核苷酸序列。
实施方案I-77.如实施方案I-76所述的经修饰的宿主细胞，其中所述KAR2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-78.如实施方案I-76或I-77所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种异源核酸包含编码KAR2多肽的核苷酸序列。
实施方案I-79.如实施方案I-49至I-78中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDI1多肽的核苷酸序列。
实施方案I-80.如实施方案I-79所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PDI1多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-81.如实施方案I-49至I-80中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IRE1多肽的核苷酸序列。
实施方案I-82.如实施方案I-81所述的经修饰的宿主细胞，其中所述IRE1多肽包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:296具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-83.如实施方案I-49至I-82中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码ERO1多肽的核苷酸序列。
实施方案I-84.如实施方案I-83所述的经修饰的宿主细胞，其中所述ERO1多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-85.如实施方案I-49至I-84中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含编码PEP4多肽的一个或多个基因的缺失或下调。
实施方案I-86.如实施方案I-85所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PEP4多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-87.如实施方案I-49至I-86中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽的一个或多个基因的缺失或下调。
实施方案I-88.如实施方案I-87所述的经修饰的宿主细胞，其中所述ROT2多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-89.如实施方案I-49至I-88中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是真核细胞。
实施方案I-90.如实施方案I-89所述的经修饰的宿主细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。
实施方案I-91.如实施方案I-90所述的经修饰的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母。
实施方案I-92.如实施方案I-91所述的经修饰的宿主细胞，其中所述酿酒酵母是酿酒酵母的蛋白酶缺陷菌株。
实施方案I-93.如实施方案I-49至I-92中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种整合到所述经修饰的宿主细胞的染色体中。
实施方案I-94.如实施方案I-49至I-92中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种保持在染色体外。
实施方案I-95.如实施方案I-49至I-94中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种与诱导型启动子可操作地连接。
实施方案I-96.如实施方案I-49至I-94中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种与组成型启动子可操作地连接。
实施方案I-97.如实施方案I-49至I-96中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，所述经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
实施方案I-98.如实施方案I-49至I-97中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，所述经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
实施方案I-99.如实施方案I-49至I-98中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，所述经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高的生物质产率相比更快的生长速率和/或更高的生物质产率，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
实施方案I-100.如实施方案I-49至I-99中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，所述经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高的生物质产率相比快至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％的生长速率和/或更高的生物质产率，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
实施方案I-101.如实施方案I-49至I-100中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，与由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
实施方案I-102.如实施方案I-49至I-101中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
实施方案I-103.一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括：a)在培养基中培养如实施方案I-49至I-102中任一项所述的经修饰的宿主细胞。
实施方案I-104.如实施方案I-103所述的方法，其中所述方法包括：b)回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。
实施方案I-105.如实施方案I-103或I-104所述的方法，其中所述培养基包含羧酸。
实施方案I-106.如实施方案I-105所述的方法，其中所述羧酸是未取代的或经取代的C3-C18羧酸。
实施方案I-107.如实施方案I-106所述的方法，其中所述未取代的或经取代的C3-C18羧酸是未取代的或经取代的己酸。
实施方案I-108.如实施方案I-103或I-104所述的方法，其中所述培养基包含橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物。
实施方案I-109.如实施方案I-103或I-104所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、次大麻二酚酸或次大麻二酚。
实施方案I-110.如实施方案I-103至I-109中任一项所述的方法，其中所述培养基包含可发酵糖。
实施方案I-111.如实施方案I-103至I-109中任一项所述的方法，其中所述培养基包含经预处理的纤维素原料。
实施方案I-112.如实施方案I-103至I-109中任一项所述的方法，其中所述培养基包含非发酵碳源。
实施方案I-113.如实施方案I-112所述的方法，其中所述非发酵碳源包含乙醇。
实施方案I-114.如实施方案I-103至I-113中任一项所述的方法，其中所述大麻素或所述大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。
实施方案I-115.如实施方案I-103至I-113中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如实施方案I-49至I-102中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，并且其中如实施方案I-49至I-102中任一项所述的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但是缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
实施方案I-116.如实施方案I-103至I-115中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如实施方案I-49至I-102中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，并且其中如实施方案I-49至I-102中任一项所述的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但是缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
实施方案I-117.如实施方案I-103至I-116中任一项所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如实施方案I-49至I-102中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，在相似培养条件下生长相同时间长度。
实施方案I-118.如实施方案I-103至I-117中任一项所述的方法，其中所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
实施方案I-119.一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括使用如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体。
实施方案I-120.如实施方案I-119所述的方法，其中所述方法包括回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。
实施方案I-121.如实施方案I-119或I-120所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、次大麻二酚酸或次大麻二酚。
实施方案I-122.如实施方案I-119至I-121中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体，其中如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
实施方案I-123.如实施方案I-119至I-121中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括使用具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体，其中如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
实施方案I-124.如实施方案I-119至I-123中任一项所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体，其中如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
实施方案I-125.如实施方案I-119至I-124中任一项所述的方法，其中所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
实施方案I-126.一种筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述方法包括：a)将宿主细胞群体分成对照群体和试验群体；b)在所述对照群体中共表达具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽和对比大麻素合酶多肽，其中具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽可以将大麻萜酚酸(CBGA)转化为第一大麻素，即大麻二酚酸(CBDA)，而对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为不同的第二大麻素；c)在所述试验群体中共表达所述经工程改造的变体和所述对比大麻素合酶多肽，其中与具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽一样，所述经工程改造的变体可以将CBGA转化为相同的第一大麻素，即大麻二酚酸(CBDA)，并且其中所述对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为所述第二大麻素并且在所述试验群体和所述对照群体中以相似水平表达；d)测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素即大麻二酚酸(CBDA)与所述第二大麻素的比率；并且e)以mg/L或mM计，测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素的量。
实施方案I-127.如实施方案I-126所述的方法，其中所述试验群体经鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体，其中改善的体内性能通过在相似培养条件下相同时间长度内，与由所述对照群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率相比，由所述试验群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率增加而得以证明。
实施方案I-128.如实施方案I-126或I-127所述的方法，其中通过在相似培养条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，与由所述对照群体产生的量相比，由所述试验群体产生更大量的所述第一大麻素，将所述试验群体鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体。
实施方案I-129.如实施方案I-126至I-128中任一项所述的方法，其中所述大麻素合酶多肽是四氢大麻酚酸合酶多肽。
实施方案I-130.如实施方案I-129所述的方法，其中所述四氢大麻酚酸合酶多肽包含与SEQ ID NO:44具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案I-131.如实施方案I-126至I-130中任一项所述的方法，其中所述第二大麻素是四氢大麻酚酸(THCA)。
实施方案I-132.如实施方案I-126至I-131中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的变体是如实施方案I-1至I-42中任一项所述的经工程改造的变体。
表1中提供了本文公开的氨基酸序列和核苷酸序列。当提及属和/或种时，该序列不应被解释为仅限于指定的属和/或种，而是还包括表达所述序列的其他属和/或种。表1中公开的序列的直向同源物也可被本公开所涵盖。表1中表示为密码子优化的核苷酸序列是为在酿酒酵母中表达而密码子优化的。在表1中，用作序列末端的“*”表示终止密码子。关于OAC*，“*”表示序列中存在突变。
表1：本公开的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003470646560001931
Figure BDA0003470646560001941
Figure BDA0003470646560001951
Figure BDA0003470646560001961
Figure BDA0003470646560001971
Figure BDA0003470646560001981
Figure BDA0003470646560001991
Figure BDA0003470646560002001
Figure BDA0003470646560002011
Figure BDA0003470646560002021
Figure BDA0003470646560002031
Figure BDA0003470646560002041
Figure BDA0003470646560002051
Figure BDA0003470646560002061
Figure BDA0003470646560002071
Figure BDA0003470646560002081
Figure BDA0003470646560002091
Figure BDA0003470646560002101
Figure BDA0003470646560002111
Figure BDA0003470646560002121
Figure BDA0003470646560002131
Figure BDA0003470646560002141
Figure BDA0003470646560002151
Figure BDA0003470646560002161
Figure BDA0003470646560002171
Figure BDA0003470646560002181
Figure BDA0003470646560002191
Figure BDA0003470646560002201
Figure BDA0003470646560002211
Figure BDA0003470646560002221
Figure BDA0003470646560002231
Figure BDA0003470646560002241
Figure BDA0003470646560002251
Figure BDA0003470646560002261
Figure BDA0003470646560002271
Figure BDA0003470646560002281
Figure BDA0003470646560002291
Figure BDA0003470646560002301
Figure BDA0003470646560002311
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实施例
提出下列实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制作和使用本公开的完整公开内容和描述，并非旨在限制发明者视为其公开内容的内容范围且非旨在表示以下实验为进行的全部或唯一实验。已努力确保有关所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应对一些实验误差和偏差进行说明。除非另有说明，否则份为重量份，分子量为重均分子量，温度是以摄氏度计且压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；bp，碱基对；nt，核苷酸；等等。
实施例1：CBDAS文库设计、构建和转化
CBDAS酶的饱和诱变文库由Twist Biosciences合成。该文库基于CBDASco5的全长DNA序列(SEQ ID NO:2)，该序列编码野生型CBDAS序列。合成每个构建体，在构建体的5’末端与GAL1启动子的3’末端具有75bp同源性，并且在构建体的3’末端与tTDH1终止子具有75bp同源性。文库以96孔板形式排列，其中每个孔含有编码单个位置的所有可能的氨基酸变体的构建体的混合物，不包括天然氨基酸和终止密码子。除了起始甲硫氨酸和终止密码子外，所有氨基酸位置都以这种方式变化。氨基酸变体由高频密码子编码(表1)。
实施例2：竞争测定菌株
为了在与第二种大麻素合酶竞争的情况下评价变体CBDAS构建体，使用菌株S478。表5中描述的菌株S478含有从加料的橄榄醇酸(OA)产生CBGA所需的所有工程改造以及支持CBDAS表达的伴侣蛋白和分泌途径工程改造特征。另外，菌株S478含有在pGAL10启动子控制下的整合THCAS构建体。使用本文所述的酵母转化方法将文库构建体整合在第二基因座处。将单菌落直接接种到96孔测定板中。完成后，提取样品并通过LC-MS进行测定。竞争测定数据示于表2中。
一旦在初始n＝1次筛选中鉴定到命中物，就将它们从预培养孔中重新敲击到琼脂上，并对变体合酶进行PCR扩增和Sanger测序以鉴定因果突变。在多种情况下，特别是对于改良最多的酶，观察到相同的突变恢复多次，具有显著相似的竞争比率。这种结果增加了我们对筛选系统的可靠性和鉴定的突变的功效的信心。
总共在初始n＝1轮中筛选了6,528个菌落。在这些菌落中，4,410显示CBDA滴度降低>50％。这是相对高水平的功能丧失。对三种不同蛋白质的先前研究已证实，大约33％的突变严重丧失功能(活性降低>90％)。(Crit Rev Biochem Mol Biol.2007年9月-10月；42(5):10.1080/10409230701597642.)。将相同的度量应用于初始CBDAS筛选数据显示，测试的所有克隆物的45.6％具有这种严重的功能丧失。这种令人惊讶的结果是工程改造这种分泌型植物酶困难程度的指示。大麻毛状体与酵母细胞非常不同，并且有理由推测这些差异可使酶去稳定，导致对突变更敏感。这进一步突出了鉴定使CBDAS适应酵母环境的环境依赖性功能获得性突变的重要性。
表2：竞争测定数据
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实施例3：非竞争测定菌株
在非竞争菌株背景即菌株S487中进一步评价选择的构建体。表5中描述的菌株S487含有从加料的橄榄醇酸产生CBGA所需的所有工程改造以及支持CBDAS表达的伴侣蛋白和分泌途径工程改造特征。从选择的竞争菌株PCR扩增变体CBDAS构建体，并使用本文所述的酵母转化方法将其整合到S487中。还在菌株S510中测试了这些构建体的子集。表5中描述的菌株S510含有从加料的橄榄醇酸产生CBGA所需的所有工程改造以及支持CBDAS表达的更有限的一组伴侣蛋白和分泌途径工程改造特征。将来自转化的单菌落直接接种到96孔测定板中。完成后，提取样品并通过LC-MS进行测定。该测定的数据示于表3和表4中。
总共在竞争背景中筛选了6,528个变体，并复制可能的命中物以证实。然后在非竞争测定中测试所有验证的命中物以评估实际性能。
考虑到菌株S699-S791，在覆盖53个位置(所有残基的近10％)的68种不同变体中CBDA滴度提高(在野生型S579的标准偏差之外)。对结构模型的初步作图显示，许多突变增加了暴露于溶剂的残基的亲水性，这可以改善酶在水性(非毛状体)环境中的溶解度。另外，一些变体展示出不期望的THCA产生的减少。而且，通过光密度(OD)测量的生长在大多数变体中得到改善。野生型CBDAS的表达使菌株患病，因此这是理想的结果。在S487背景中提高滴度的构建体子集也在S510背景中进行了测试，S510含有更有限的一组伴侣蛋白和分泌途径工程改造特征。在该菌株中测试的20个突变中，14个比野生型菌株S1100提高了滴度，6个降低了滴度。该结果表明在S487背景中鉴定的一些但不是全部突变需要更广泛的伴侣蛋白和分泌途径工程改造的支持才能发挥功能。
表3：非竞争测定(ND＝未做)
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表4：非竞争测定(对于表4中的所有数据，n＝4或更大；ND＝未做)
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*绝对值和％THCA可以因实验而改变，因此应该将值与其相同的实验对照进行比较。进行四个单独的实验，在“实验”栏中示出了每个组。
**在多个菌株具有相同突变的情况下(例如，S942、S943)，它们代表进行比较的不同转化克隆物。
实施例的一般方法
酵母转化方法
在优化的醋酸锂(LiAc)转化中，用标准分子生物学技术将包含本文公开的一种或多种异源核酸的每种DNA构建体(例如，表5中详述的构建体)整合到酿酒酵母(CEN.PK2，菌株S4)中。简言之，使细胞在酵母提取物右旋糖蛋白胨(YPD)培养基中在30℃下振荡(200rpm)生长过夜，在YPD中稀释到OD600为0.175，并使其生长到OD600为0.6-0.8。以96孔板形式，每孔使用1.67mL培养物进行转化。通过离心收获总培养物体积，在等体积的无菌水中洗涤，再次离心，并在等体积的100mM LiAc中洗涤。将细胞再次离心，去除上清液，并将细胞重悬于由80μL 50％PEG、12μL 1M LiAc、3.3μL煮沸的鲑精DNA、5μL PCR扩增的文库DNA和19.7μL水组成的转化混合物中(按转化次数缩放)。在42℃热激40分钟后，在YPD培养基中过夜回收细胞，之后接种在选择性培养基上。用对菌落样品的整合具有特异性的引物，通过菌落PCR证实DNA整合以证实高整合率。
酵母培养条件
将包含本文公开的文库构建体核酸的酵母菌落(经修饰的宿主细胞)挑取到含有360μL的YPD(10g/L酵母提取物、20g/L Bacto蛋白胨、20g/L右旋糖(葡萄糖))的96孔微量滴定板中并用透气膜密封物密封。将细胞在30℃下在高容量微量滴定板培养箱中在1000rpm振荡和80％湿度下培养2天(称为“预培养物”)，直至培养物达到碳耗尽。通过从饱和培养物中取出15μL并稀释到360μL新鲜培养基中，将生长饱和的培养物次代培养到含有YPGAL和橄榄醇酸或己酸，或橄榄醇酸衍生物或除己酸以外的羧酸(10g/L酵母提取物、20g/L Bacto蛋白胨、20g/L或40g/L半乳糖、1g/L葡萄糖和1mM橄榄醇酸或2mM己酸，或1mM橄榄醇酸衍生物或2mM除己酸以外的羧酸)的新板中，并用透气薄膜密封物密封。在提取和分析之前，将生产培养基中经修饰的宿主细胞在高容量微量滴定板振荡器中在30℃下以1000rpm和80％湿度再培养5天。完成后，将25μL全细胞肉汤稀释到975μL甲醇中，用箔密封物密封，并以1200rpm振荡60秒以提取大麻素或大麻素衍生物。振荡后，将板以1000 x g离心60秒以去除所有固体。离心后，去除密封物并将10μL上清液转移到含有240μL甲醇的新鲜测定板中，用箔密封物密封，以900rpm振荡60秒，并通过LC-MS分析。
分析方法
用LC-MS质谱仪(Agilent 6470)，使用Phenomenex Kinetex苯基-己基2.1 x30mm、2.6μm分析柱，用以下梯度(流动相A：含0.1％甲酸的LC-MS级水；流动相B：含0.1％甲酸的LC-MS级乙腈)分析样品：
时间(分钟) ％B
0 40
0.1 40
0.55 58
1.45 58
1.46 40
1.75 40
质谱仪以负离子多反应监测模式操作。通过从真实标准确定的保留时间和多反应监测(MRM)转换来鉴定每种大麻素或大麻素衍生物:
Figure BDA0003470646560003411
Figure BDA0003470646560003421
回收和纯化
用合适的有机溶剂萃取来自包含本公开的经修饰的宿主细胞的培养物的全细胞肉汤以提供大麻素或大麻素衍生物。合适的有机溶剂包括但不限于己烷、庚烷、乙酸乙酯、石油醚和乙醚、氯仿和乙酸乙酯。将合适的有机溶剂(诸如己烷)以10:1的比率(10份全细胞肉汤-1份有机溶剂)添加到来自包含本公开的经修饰的宿主细胞的发酵物的全细胞肉汤中并搅拌30分钟。分离有机级分并用等体积的酸性水(pH 2.5)萃取两次。然后分离有机层并在浓缩器(减压的旋转蒸发器或薄膜蒸发器)中干燥以获得粗制大麻素或大麻素衍生物晶体。然后可以将粗制晶体加热到105℃持续15分钟，接着加热到145℃持续55分钟以使粗制大麻素或大麻素衍生物脱羧。使粗制结晶产物在合适的溶剂(例如，正戊烷)中再溶解和重结晶并通过1μm过滤器过滤以去除所有不可溶物质。然后例如通过旋转蒸发去除溶剂，以产生纯的结晶产物。
大麻素或大麻素衍生物的体外酶测定和无细胞产生
在一些实施方案中，将经修饰的宿主细胞，例如经修饰的酵母细胞在含有360μL的YPD(10g/L酵母提取物、20g/L Bacto蛋白胨、20g/L右旋糖(葡萄糖))的96孔微量滴定板中培养并用透气膜密封物密封。然后将细胞在30℃下在高容量微量滴定板培养箱中在1000rpm振荡和80％湿度下培养3天，直至培养物达到碳耗尽。然后将生长饱和的培养物次代培养到200mL的YPGAL培养基中，直至OD600为0.2，并在30℃下振荡孵育20小时。然后通过在4℃下以3000 x g离心5分钟收获细胞。然后将收获的细胞重悬于50mL缓冲液(50mMTris-HCl、1mM EDTA、0.1M KCl，pH 7.4，125单位Benzonase)中，然后进行裂解(EmulsiflexC3，Avestin,INC.，60巴，10min)。通过离心(10,000×g，10min，4℃)去除细胞碎片。随后，再将上清液进行超速离心(150,000×g，1h，4℃，Beckman Coulter L-90K，TI-70)。然后将所得膜级分重悬于3.3mL缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM MgCl2，pH 8.0，10％甘油)中并用组织研磨器使其溶解。然后，将0.02％(v/v)的相应膜制剂溶解在反应缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2，pH 8.5)和底物(500μM橄榄醇酸、500μM GPP)中至总体积为50μL并且在30℃下孵育1小时。然后通过添加两个反应体积的乙酸乙酯，接着涡旋和离心来萃取测定物。将有机层蒸发30分钟，重悬于乙腈/H2O/甲酸(80:20:0.05％)中并用
Figure BDA0003470646560003422
-MC柱(0.22μm孔径，PVDF膜材料)过滤。然后经由LC-MS检测大麻素或大麻素衍生物和/或回收并纯化。
在生物反应器中的酵母培育
使包含本文公开的经修饰的宿主细胞的单酵母菌落在125mL烧瓶中的15mL含50mM琥珀酸盐(pH 5.0)和2％葡萄糖的Verduyn培养基(最初由Verduyn等人描述，Yeast 8(7):501-17)中在30℃下，以200rpm振荡生长到OD600在4至9之间。然后向培养物中添加甘油至浓度为20％并将1mL小瓶的经修饰的宿主细胞悬浮液储存在-80℃下。将1-2小瓶经修饰的宿主细胞解冻并使其在含有50mM琥珀酸盐(pH 5.0)和4％蔗糖的Verduyn培养基中生长24小时，然后在相同培养基中次代培养至OD600读数为0.1。在30℃下振荡生长24小时后，使用65mL培养物接种1.3升含585mLVerduyn发酵培养基的发酵罐(Eppendorf DASGIP生物反应器)，所述发酵培养基含有20g/L半乳糖，补充有己酸(2mM)、除己酸以外的羧酸(2mM)、橄榄醇酸(1mM)或橄榄醇酸衍生物(1mM)。聚α-烯烃可以作为萃取剂添加到发酵罐中。在添加NH4OH的情况下将发酵罐维持在30℃和pH 5.0。在初始分批阶段，以每分钟每体积0.5体积空气(VVM)为发酵罐通气，并逐渐搅拌以维持30％的溶解氧。在初始糖被消耗之后，溶解氧的升高触发在每升10g半乳糖剂量的脉冲中以每小时每升10g半乳糖进行半乳糖+己酸的加料(800g半乳糖/升+9.28g己酸/升)(可替代地，不是为本文公开的经修饰的宿主细胞进行己酸加料，而是向经修饰的宿主细胞进行橄榄醇酸、橄榄醇酸衍生物或除己酸以外的羧酸加料)。
在脉冲之间，加料速率降低到每小时每升5g半乳糖。当溶解氧升高10％时，加料速率恢复为10g L-1小时-1。当经修饰的宿主细胞密度增加时，允许溶解氧达到0％，并且脉冲剂量增加到每升50g半乳糖。通过在体积增加时调整搅拌，将氧输送速率维持在代表每小时每升100mM的满刻度条件的速率下。使用在高加料速率与低加料速率之间交替的算法动态地调整加料速率以满足需求。在低加料速率期间，经修饰的宿主细胞应消耗半乳糖和己酸，或可替代地，消耗橄榄醇酸、橄榄醇酸衍生物或除己酸以外的羧酸，以及在高加料速率期间累积的任何溢出代谢物。溶解氧的升高触发恢复高加料速率。在低加料速率中花费的时间长度反映了在先前的高加料速率脉冲中经修饰的宿主细胞加料过量或不足的程度；然后监测该信息并将其用于上调或下调高加料速率，将低加料速率保持在限定的范围内。
随着时间的推移，加料速率与经修饰的宿主细胞的糖和己酸，或可替代地橄榄醇酸、橄榄醇酸衍生物或除己酸以外的羧酸的需求相匹配。该算法确保除了大麻素或大麻素衍生物以外的发酵产物的最小净累积；生物质；和CO2。在一些实施方案中，该过程持续5至14天。在某些此类实施方案中，每天取出累积的肉汤并测定生物量和大麻素或大麻素衍生物浓度。定期添加NH4H2PO4浓溶液、微量金属和维生素以维持稳态浓度。
表5：实施例中使用的构建体和菌株
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*如果菌株具有亲本菌株，则它是子代菌株。亲本菌株中存在的所有构建体也全部存在于子代菌株中。
**S4是具有基因型MATα的CEN.PK113-1A；URA3；TRP1；LEU2；HIS3；MAL2-8C；SUC2
***S478是用于测试CBDA合酶构建体文库的竞争测定基础菌株。在该菌株中，添加了编码pGAL1_tTDH1空表达盒的核苷酸序列，而亲本S270中的CBDA合酶多肽缺失，产生不含合酶的菌株。在第二基因座处添加了THCA合酶。
****S487和S510是通过竞争测定结果选择的用于测试CBDA合酶构建体的非竞争测定基础菌株。S487具有广泛的伴陪蛋白和分泌途径工程改造，而S510具有一组更小的工程改造。在这些菌株中，添加了编码pGAL1_tTDH1空表达盒的核苷酸序列，而亲本S270中的CBDA合酶多肽缺失，产生不含合酶的菌株。没有THCA合酶。
表6：调控元件和其他元件清单
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Figure BDA0003470646560003631
表6图例：表6中列出了附图中提及的非编码DNA区(调控区和其他区)。侧翼同源区指导在特定基因座处的重组。侧翼同源上游序列用“u”表示，下游用“d”表示。“I”指示基因间整合位点，例如ui7、di7是基因间区7侧翼的区域。使开放阅读框缺失的整合与所示缺失基因具有侧翼同源性，例如uPEP4、dPEP4是PEP4基因侧翼的区域。合成重组序列(SRS)指导在相同基因座处靶向整合的两个DNA构建体的内部重组。接头是用于组装DNA构建体的短序列，它们介于所示部分之间。接头G1、G7、G10、RG1和LTTDH1含有上游DNA部分的最后36bp；在使用这些接头的情况下，假定接头重构从上游部分省略的序列，以产生与下游部分的无缝连接。接头D0和D9是指导DNA构建体进入克隆载体并且不整合到基因组中的末端接头。在部分之间没有示出接头的情况下，连接也是无缝的。
尽管已经参考本公开的具体实施方案描述了本公开，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以做各种变化并且可以替换等同方案。另外，可以做许多修改以使特定情形、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适应本公开的目的、精神和范围。所有此类修改旨在处于所附权利要求书的范围之内。

Claims (170)

1.一种大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含与SEQ IDNO:3具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在信号多肽、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个氨基酸取代。
4.如权利要求3所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述信号多肽中包含至少一个氨基酸取代。
5.如权利要求3或权利要求4所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述FAD结合结构域中包含至少一个氨基酸取代。
6.如权利要求3-5中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述BBE结构域中包含至少一个氨基酸取代。
7.如权利要求3-6中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个表面暴露的氨基酸的取代。
8.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。
9.如权利要求8所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、M61、S62、L71、I97、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、S428、L439、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。
10.如权利要求8或权利要求9所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：L49、K50、N56、N57、V125、L132、V149、W161、K165、S170、L171、A172、N196、A235、K260、L268、T310、F316、L326、G378、S428、Y499、N527、H543和H544。
11.如权利要求8或权利要求9所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R541、H542、R543和H544。
12.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：R31、N57、M61、L71、S170、A172、Y175、N196、H208、A235、K260、G378、K389和R543。
13.如权利要求12所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：N57、S170、A172、N196、A235、K260和G378。
14.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：C12、F17、F18、S20、R31、N33、P43、L49、K50、L51、Q55、N56、N57、L59、M61、S62、V63、S66、L71、S75、I97、L98、S100、V103、T109、Q124、V125、I129、L132、S137、H143、V149、W161、K165、E167、N168、S170、L171、A172、Y175、C180、A181、N196、H208、A235、A250、M256、K260、L268、H309、T310、F316、L326、G378、K389、E406、M412、L415、S428、L439、I445、N466、K474、Y499、N527、P538、R541、H542、R543和H544。
15.如权利要求14所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：M412、L415和I445。
16.如权利要求15所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在氨基酸I445处的氨基酸取代。
17.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在选自由以下组成的组的氨基酸处的至少一个氨基酸取代：M61、G378和K389。
18.如权利要求17所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在氨基酸M61和G378处的氨基酸取代。
19.如权利要求17所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在氨基酸M61和K389处的氨基酸取代。
20.如权利要求17所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在氨基酸G378和K389处的氨基酸取代。
21.如权利要求17所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含在氨基酸M61、G378和K389处的氨基酸取代。
22.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
23.如权利要求22所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、M61H、M61S、M61W、S62Q、L71A、L71Q、I97V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、S428L、L439M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
24.如权利要求22或利要求23所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：L49E、L49Q、K50T、N56E、N57D、V125E、L132M、V149I、W161R、K165A、S170T、L171I、A172V、N196Q、N196T、N196V、A235P、K260W、K260C、L268I、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、S428L、Y499M、Y499V、N527E、H543E和H544E。
25.如权利要求22或利要求23所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
26.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：R31Q、N57D、M61W、L71H、S170T、A172V、Y175F、N196V、H208T、A235P、K260W、G378T、K389E和R543E。
27.如权利要求26所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N57D、S170T、A172V、N196V、A235P、K260W和G378T。
28.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：C12F、F17M、F18T、F18W、S20G、R31Q、N33K、P43E、L49E、L49K、L49Q、K50T、L51I、Q55E、Q55P、N56E、N57D、N57E、L59E、M61H、M61S、M61W、S62N、S62Q、V63M、S66D、L71A、L71H、L71Q、S75D、S75E、I97V、L98V、S100A、V103A、V103F、T109V、Q124D、Q124E、Q124N、V125E、V125Q、I129V、L132M、S137G、H143D、V149I、W161K、W161R、W161Y、K165A、E167P、N168S、S170T、L171I、A172V、Y175F、C180A、A181V、N196Q、N196T、N196V、H208T、A235P、A250T、M256V、K260C、K260W、L268I、H309V、T310A、T310C、F316Y、L326I、G378T、G378S、K389E、E406K、M412Q、L415M、S428L、L439M、I445M、N466D、K474S、Y499M、Y499V、N527E、P538T、R541E、R541V、H542V、R543A、R543E、H544E和H544D。
29.如权利要求28所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M412Q、L415M和I445M。
30.如权利要求29所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含氨基酸取代I445M。
31.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M61W、G378T和K389E。
32.如权利要求31所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W和G378T。
33.如权利要求31所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W和K389E。
34.如权利要求31所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含氨基酸取代G378T和K389E。
35.如权利要求31所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含氨基酸取代M61W、G378T和K389E。
36.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ IDNO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
37.如权利要求36所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ IDNO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ IDNO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ IDNO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ IDNO:198、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ IDNO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
38.如权利要求36或权利要求37所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:142、SEQ IDNO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ IDNO:186、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:230和SEQ IDNO:232。
39.如权利要求36或权利要求37所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:234。
40.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:92、SEQID NO:104、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:202和SEQ ID NO:230。
41.如权利要求40所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:198。
42.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ IDNO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ IDNO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:304。
43.如权利要求42所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:302和SEQ ID NO:304。
44.如权利要求43所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ IDNO:300的氨基酸序列。
45.如权利要求1或权利要求2所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:318和SEQ ID NO:320。
46.如权利要求45所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ IDNO:314的氨基酸序列。
47.如权利要求45所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ IDNO:316的氨基酸序列。
48.如权利要求45所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ IDNO:318的氨基酸序列。
49.如权利要求45所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ IDNO:320的氨基酸序列。
50.如权利要求1-35中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29或至少30个氨基酸取代。
51.如权利要求1-35中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸取代。
52.如权利要求1-51中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域、小檗碱桥酶(BBE)结构域或前述各项的组合中包含至少一个不变氨基酸。
53.如权利要求52所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述FAD结合结构域中包含至少一个不变氨基酸。
54.如权利要求53所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述FAD结合结构域中包含至少1个不变氨基酸、至少2个不变氨基酸、至少3个不变氨基酸、至少4个不变氨基酸、至少5个不变氨基酸、至少6个不变氨基酸、至少7个不变氨基酸、至少8个不变氨基酸、至少9个不变氨基酸、至少10个不变氨基酸、至少11个不变氨基酸、至少12个不变氨基酸、至少13个不变氨基酸、至少14个不变氨基酸或至少15个不变氨基酸。
55.如权利要求52-54中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述BBE结构域中包含至少一个不变氨基酸。
56.如权利要求55所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在所述BBE结构域中包含至少1个不变氨基酸、至少2个不变氨基酸、至少3个不变氨基酸、至少4个不变氨基酸、至少5个不变氨基酸、至少6个不变氨基酸、至少7个不变氨基酸、至少8个不变氨基酸、至少9个不变氨基酸、至少10个不变氨基酸、至少11个不变氨基酸、至少12个不变氨基酸、至少13个不变氨基酸、至少14个不变氨基酸或至少15个不变氨基酸。
57.如权利要求1-35中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：A28、F34、L35、C37、L64、N70、P87、I93、C99、R108、R110、G112、E117、G118、S120、P126、F127、D131、D141、W148、G152、A153、L155、G156、E157、Y159、Y160、N163、A173、G174、C176、P177、T178、V179、G182、G183、H184、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、L193、R195、A201、D202、I205、D206、V210、G214、G223、D225、L226、F227、W228、R231、G234、S237、F238、G239、K245、I246、L248、V251、V259、Q276、F312、S313、L323、C341、F352、S354、F380、K381、I382、K383、D385、Y386、I391、G419、M422、I425、I430、P431、P433、H434、R435、G437、Y440、W443、Y444、I464、Y465、M468、T469、Y471、V472、P476、R484、N498、A502、N513、F514、K521、N528、F529、E533、Q534和S535。
58.如权利要求57所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少一个选自由以下组成的组的不变氨基酸：C37、N70、I93、C99、E117、S120、F127、D131、G156、E157、Y159、G174、C176、G182、G183、F185、G187、G188、G189、Y190、G191、P192、R195、D202、D206、G214、W228、G234、F238、L248、Q276、S313、L323、S354、K381、K383、D385、G419、M422、R435、Y440、W443、Y444、Y471、P476、N513、F514、N528和Q534。
59.如权利要求1-58中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个不变氨基酸。
60.如权利要求1-59中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，所述经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生的大麻二酚酸(CBDA)的量大于由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量。
61.如权利要求1-60中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，所述经工程改造的变体从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)的量比由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽从CBGA产生的CBDA的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％。
62.如权利要求1-61中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述经工程改造的变体以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)。
63.如权利要求1-62中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
64.如权利要求1-63中任一项所述的经工程改造的变体，其中在相似条件下相同时间长度内，与由具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述经工程改造的变体以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)。
65.如权利要求1-64中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
66.如权利要求1-35或权利要求50-65中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在N末端、C末端或在N末端和C末端两者包含截短。
67.如权利要求66所述的经工程改造的变体，其中所述截短的经工程改造的变体包含信号多肽或膜锚定物。
68.如权利要求66或权利要求67所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体缺乏天然信号多肽。
69.如权利要求66-68中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在C末端包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸的截短。
70.如权利要求66-68中任一项所述的经工程改造的变体，其中所述经工程改造的变体在C末端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的截短。
71.一种核酸，所述核酸包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列。
72.一种核酸，所述核酸包含编码大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231和SEQ ID NO:233。
73.一种核酸，所述核酸包含编码大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQID NO:211、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQID NO:233、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301和SEQ ID NO:303。
74.一种核酸，所述核酸包含编码大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的核苷酸序列，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:315、SEQID NO:317和SEQ ID NO:319。
75.如权利要求70-74中任一项所述的核酸，其中所述核苷酸序列是密码子优化的。
76.一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括将如权利要求70-75中任一项所述的一种或多种核酸引入宿主细胞中。
77.一种载体，所述载体包含如权利要求70-75中任一项所述的一种或多种核酸。
78.一种制备用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括将如权利要求77所述的一种或多种载体引入宿主细胞中。
79.一种用于产生大麻素或大麻素衍生物的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含如权利要求70-75中任一项所述的一种或多种核酸。
80.如权利要求79所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸橄榄醇酸香叶基转移酶(GOT)多肽的核苷酸序列。
81.如权利要求80所述的经修饰的宿主细胞，其中所述GOT多肽包含与SEQ ID NO:17具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
82.如权利要求80或权利要求81所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种异源核酸包含编码所述GOT多肽的核苷酸序列。
83.如权利要求79所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码NphB多肽的核苷酸序列。
84.如权利要求83所述的经修饰的宿主细胞，其中所述NphB多肽包含与SEQ ID NO:294具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
85.如权利要求79-84中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种含有编码四酮化合物合酶(TKS)多肽的核苷酸序列的异源核酸和一种或多种含有编码橄榄醇酸环化酶(OAC)多肽的核苷酸序列的异源核酸。
86.如权利要求85所述的经修饰的宿主细胞，其中所述TKS多肽包含与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
87.如权利要求85或权利要求86所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含三种或更多种异源核酸，所述三种或更多种异源核酸包含编码TKS多肽的核苷酸序列。
88.如权利要求85-87中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述OAC多肽包含与SEQID NO:21或SEQ ID NO:48具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
89.如权利要求85-88中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含三种或更多种异源核酸，所述三种或更多种异源核酸包含编码OAC多肽的核苷酸序列。
90.如权利要求79-89中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码酰基活化酶(AAE)多肽的核苷酸序列。
91.如权利要求90所述的经修饰的宿主细胞，其中所述AAE多肽包含与SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
92.如权利要求90或权利要求91所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述三种或更多种异源核酸包含编码AAE多肽的核苷酸序列。
93.如权利要求79-92中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含以下的一者或多者：a)一种或多种包含编码HMG-CoA合酶(HMGS)多肽的核苷酸序列的异源核酸；b)一种或多种包含编码截短的3-羟基-3-甲基-戊二酰基-CoA还原酶(tHMGR)多肽的核苷酸序列的异源核酸；c)一种或多种包含编码甲羟戊酸激酶(MK)多肽的核苷酸序列的异源核酸；d)一种或多种包含编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽的核苷酸序列的异源核酸；e)一种或多种包含编码焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD1)多肽的核苷酸序列的异源核酸；或f)一种或多种包含编码异戊烯二磷酸异构酶(IDI1)多肽的核苷酸序列的异源核酸。
94.如权利要求93所述的经修饰的宿主细胞，其中所述IDI1多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
95.如权利要求93或权利要求94所述的经修饰的宿主细胞，其中所述tHMGR多肽包含与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
96.如权利要求93-95中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述HMGS多肽包含与SEQ ID NO:29具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
97.如权利要求93-96中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述MK多肽包含与SEQID NO:39具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
98.如权利要求93-97中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PMK多肽包含与SEQID NO:37具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
99.如权利要求93-98中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述MVD1多肽包含与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
100.如权利要求79-99中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的核苷酸序列。
101.如权利要求100所述的经修饰的宿主细胞，其中所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽包含与SEQ ID NO:31具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
102.如权利要求79-101中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码丙酮酸脱羧酶(PDC)多肽的核苷酸序列。
103.如权利要求102所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PDC多肽包含与SEQ ID NO:35具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
104.如权利要求79-103中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码香叶基焦磷酸合酶(GPPS)多肽的核苷酸序列。
105.如权利要求104所述的经修饰的宿主细胞，其中所述GPPS多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
106.如权利要求79-105中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码KAR2多肽的核苷酸序列。
107.如权利要求106所述的经修饰的宿主细胞，其中所述KAR2多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
108.如权利要求106或权利要求107所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种异源核酸包含编码KAR2多肽的核苷酸序列。
109.如权利要求79-108中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码PDI1多肽的核苷酸序列。
110.如权利要求109所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PDI1多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
111.如权利要求79-110中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码IRE1多肽的核苷酸序列。
112.如权利要求111所述的经修饰的宿主细胞，其中所述IRE1多肽包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:296具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
113.如权利要求79-112中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码ERO1多肽的核苷酸序列。
114.如权利要求113所述的经修饰的宿主细胞，其中所述ERO1多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
115.如权利要求79-114中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述一种或多种异源核酸包含编码FAD1多肽的核苷酸序列。
116.如权利要求115所述的经修饰的宿主细胞，其中所述FAD1多肽包含与SEQ ID NO:298具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
117.如权利要求79-116中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含编码PEP4多肽的一个或多个基因的缺失或下调。
118.如权利要求117所述的经修饰的宿主细胞，其中所述PEP4多肽包含与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
119.如权利要求79-118中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞包含编码ROT2多肽的一个或多个基因的缺失或下调。
120.如权利要求119所述的经修饰的宿主细胞，其中所述ROT2多肽包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
121.如权利要求79-120中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞是真核细胞。
122.如权利要求121所述的经修饰的宿主细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。
123.如权利要求122所述的经修饰的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母。
124.如权利要求123所述的经修饰的宿主细胞，其中所述酿酒酵母是酿酒酵母的蛋白酶缺陷菌株。
125.如权利要求79-124中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种整合到所述经修饰的宿主细胞的染色体中。
126.如权利要求79-124中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种保持在染色体外。
127.如权利要求79-126中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种与诱导型启动子可操作地连接。
128.如权利要求79-126中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述一种或多种核酸中的至少一种与组成型启动子可操作地连接。
129.如权利要求79-128中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，所述经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大于由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
130.如权利要求79-129中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，以mg/L或mM计，所述经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量比由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的大麻素或大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
131.如权利要求79-130中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，所述经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高的生物质产率相比更快的生长速率和/或更高的生物质产率，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
132.如权利要求79-131中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，所述经修饰的宿主细胞具有与包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞的生长速率和/或较高的生物质产率相比快至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％的生长速率和/或更高的生物质产率，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
133.如权利要求79-132中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，与由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
134.如权利要求79-133中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
135.如权利要求79-134中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中在相似培养条件下生长相同时间长度，与由包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述经修饰的宿主细胞以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率从大麻萜酚酸(CBGA)产生大麻二酚酸(CBDA)，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸。
136.如权利要求79-135中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中所述经修饰的宿主细胞以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
137.一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括：
a)在培养基中培养如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述方法包括：
b)回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。
139.如权利要求137或权利要求138所述的方法，其中所述培养基包含羧酸。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述羧酸是未取代的或经取代的C3-C18羧酸。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述未取代的或经取代的C3-C18羧酸是未取代的或经取代的己酸。
142.如权利要求137或权利要求138所述的方法，其中所述培养基包含橄榄醇酸或橄榄醇酸衍生物。
143.如权利要求137或权利要求138所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、次大麻二酚酸或次大麻二酚。
144.如权利要求137-143中任一项所述的方法，其中所述培养基包含可发酵糖。
145.如权利要求137-143中任一项所述的方法，其中所述培养基包含经预处理的纤维素原料。
146.如权利要求137-143中任一项所述的方法，其中所述培养基包含非发酵碳源。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述非发酵碳源包含乙醇。
148.如权利要求137-147中任一项所述的方法，其中所述大麻素或所述大麻素衍生物以大于100mg/L培养基的量产生。
149.如权利要求137-148中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，并且其中如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但是缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
150.如权利要求137-149中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，并且其中如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞和包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸，但是缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞在相似培养条件下培养相同时间长度。
151.如权利要求137-150中任一项所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，在相似培养条件下生长相同时间长度。
152.如权利要求137-151中任一项所述的方法，其中所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
153.如权利要求137-152中任一项所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括培养包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的经修饰的宿主细胞，而不是如权利要求79-136中任一项所述的经修饰的宿主细胞，其中包含一种或多种包含编码具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽的核苷酸序列的核酸的所述经修饰的宿主细胞缺乏包含编码如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体的核苷酸序列的核酸，在相似培养条件下生长相同时间长度。
154.如权利要求137-153中任一项所述的方法，其中所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
155.一种产生大麻素或大麻素衍生物的方法，所述方法包括使用如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体。
156.如权利要求155所述的方法，其中所述方法包括回收所产生的大麻素或大麻素衍生物。
157.如权利要求155或权利要求156所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸、大麻二酚、次大麻二酚酸或次大麻二酚。
158.如权利要求155-157中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大于在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体，其中如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
159.如权利要求155-158中任一项所述的方法，其中以mg/L或mM计，产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量比在替代方法中产生的所述大麻素或所述大麻素衍生物的量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％或至少1000％，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体，其中如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
160.如权利要求155-159中任一项所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与四氢大麻酚酸(THCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与四氢大麻酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体，其中如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
161.如权利要求155-160中任一项所述的方法，其中所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与THCA比率从CBGA产生CBDA。
162.如权利要求155-161中任一项所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚酸(CBDA)，并且其中与在替代方法中产生的CBDA与大麻环萜酚酸(CBCA)的比率相比，所述方法以增加的CBDA与大麻环萜酚酸的比率产生CBDA，所述替代方法包括使用具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽，而不是如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体，其中如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述大麻二酚酸合酶多肽在相似条件下使用相同时间长度。
163.如权利要求155-162中任一项所述的方法，其中所述方法以约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1、约15:1、约15.5:1、约16:1、约16.5:1、约17:1、约17.5:1、约18:1、约18.5:1、约19:1、约19.5:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约100:1、约150:1、约200:1、约500:1或大于约500:1的CBDA与CBCA的比率从CBGA产生CBDA。
164.一种筛选大麻二酚酸合酶(CBDAS)多肽的经工程改造的变体的方法，所述经工程改造的变体包含具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述方法包括：
a)将宿主细胞群体分成对照群体和试验群体；
b)在所述对照群体中共表达具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CBDAS多肽和对比大麻素合酶多肽，其中具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽可以将大麻萜酚酸(CBGA)转化为第一大麻素，即大麻二酚酸(CBDA)，而对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为不同的第二大麻素；
c)在所述试验群体中共表达所述经工程改造的变体和所述对比大麻素合酶多肽，其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的所述CBDAS多肽一样，所述经工程改造的变体可以将CBGA转化为相同的第一大麻素，即大麻二酚酸(CBDA)，并且其中所述对比大麻素合酶多肽可以将相同CBGA转化为所述第二大麻素并且在所述试验群体和所述对照群体中以相似水平表达；
d)测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素即大麻二酚酸(CBDA)与所述第二大麻素的比率；并且
e)以mg/L或mM计，测量由所述试验群体和所述对照群体两者产生的所述第一大麻素的量。
165.如权利要求164所述的方法，其中所述试验群体经鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体，其中改善的体内性能通过在相似培养条件下相同时间长度内，与由所述对照群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率相比，由所述试验群体产生的所述第一大麻素与所述第二大麻素的比率增加而得以证明。
166.如权利要求164或权利要求165所述的方法，其中通过在相似培养条件下相同时间长度内，以mg/L或mM计，与由所述对照群体产生的量相比，由所述试验群体产生更大量的所述第一大麻素，将所述试验群体鉴定为包含与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的大麻二酚酸合酶多肽相比，具有改善的体内性能的经工程改造的变体。
167.如权利要求164-166中任一项所述的方法，其中所述大麻素合酶多肽是四氢大麻酚酸合酶多肽。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述四氢大麻酚酸合酶多肽包含与SEQ ID NO:44具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
169.如权利要求164-168中任一项所述的方法，其中所述第二大麻素是四氢大麻酚酸(THCA)。
170.如权利要求164-169中任一项所述的方法，其中所述经工程改造的变体是如权利要求1-70中任一项所述的经工程改造的变体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116574700A (zh) * 2023-05-12 2023-08-11 黑龙江八一农垦大学 大麻二酚酸合成酶突变体及其应用
CN116904412A (zh) * 2023-07-25 2023-10-20 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3130763A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Ginkgo Bioworks, Inc. Biosynthesis of cannabinoids and cannabinoid precursors
CN110272900B (zh) * 2019-04-19 2024-03-26 中国人民解放军陆军军医大学 用于制备骨骼发育异常猪模型的sgRNA及其应用
EP4370652A1 (en) * 2021-07-13 2024-05-22 Amyris, Inc. High efficency production of cannabigerolic acid and cannabidiolic acid
CN114657078B (zh) * 2022-01-27 2024-04-02 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种高产大麻二酚酸的酿酒酵母菌株构建方法和应用
CN114591923B (zh) * 2022-05-10 2022-08-30 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用
CN116622784B (zh) * 2023-02-14 2024-03-01 黑龙江八一农垦大学 一种大麻二酚酸合成酶的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105555265A (zh) * 2013-02-28 2016-05-04 全谱实验室有限公司 大麻素的生物合成
CN105935364A (zh) * 2015-03-03 2016-09-14 智能合成生物中心 用于预防或治疗非酒精性肝病的包含人参皂苷f2的组合物
WO2018200888A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Regents Of The University Of California Microorganisms and methods for producing cannabinoids and cannabinoid derivatives
WO2019014490A1 (en) * 2017-07-12 2019-01-17 Biomedican, Inc. PRODUCTION OF CANNABINOIDS IN YEAST
CN109311838A (zh) * 2016-04-15 2019-02-05 蒂温诺特技术有限公司 大麻素前药的生物合成
CN109476625A (zh) * 2016-06-16 2019-03-15 蒂温诺特技术有限公司 用于制备大麻素前药的方法、药物制剂及其用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2356526T3 (es) 2002-10-04 2011-04-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Procedimiento para la producción biológica de 1,3-propanodiol con elevado rendimiento.
DK2235190T3 (en) 2007-12-13 2018-07-23 Danisco Us Inc COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR PRODUCING ISOPRENE
CN102171335A (zh) 2008-04-23 2011-08-31 丹尼斯科美国公司 用于改进微生物产生异戊二烯的异戊二烯合酶变体
KR20110076868A (ko) 2008-07-02 2011-07-06 다니스코 유에스 인크. 분리 조건 및/또는 안전한 작업 범위 하에서의 ｃ5 탄화수소가 없는 이소프렌의 제조 방법 및 조성물

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105555265A (zh) * 2013-02-28 2016-05-04 全谱实验室有限公司 大麻素的生物合成
CN105935364A (zh) * 2015-03-03 2016-09-14 智能合成生物中心 用于预防或治疗非酒精性肝病的包含人参皂苷f2的组合物
CN109311838A (zh) * 2016-04-15 2019-02-05 蒂温诺特技术有限公司 大麻素前药的生物合成
CN109476625A (zh) * 2016-06-16 2019-03-15 蒂温诺特技术有限公司 用于制备大麻素前药的方法、药物制剂及其用途
WO2018200888A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Regents Of The University Of California Microorganisms and methods for producing cannabinoids and cannabinoid derivatives
WO2019014490A1 (en) * 2017-07-12 2019-01-17 Biomedican, Inc. PRODUCTION OF CANNABINOIDS IN YEAST

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BASTIAN ZIRPEL等: "Elucidation of structure-function relationship of THCA and CBDA synthase from Cannabis sativa L", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 284, pages 17 - 26 *
CHIARA ONOFRI等: "Sequence heterogeneity of cannabidiolic- and tetrahydrocannabinolic acid-synthase in Cannabis sativa L. and its relationship with chemical phenotype", PHYTOCHEMISTRY, vol. 116, pages 57 - 68, XP055571457, DOI: 10.1016/j.phytochem.2015.03.006 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116574700A (zh) * 2023-05-12 2023-08-11 黑龙江八一农垦大学 大麻二酚酸合成酶突变体及其应用
CN116574700B (zh) * 2023-05-12 2023-11-14 黑龙江八一农垦大学 大麻二酚酸合成酶突变体及其应用
CN116904412A (zh) * 2023-07-25 2023-10-20 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用
CN116904412B (zh) * 2023-07-25 2024-04-26 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种大麻二酚酸合成酶序列优化的酿酒酵母菌株构建方法和应用

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