CN101787356B - 一种glyA基因工程菌构建和固定化使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因工程菌构建和使用方法，尤其是一种glyA基因工程菌构建和固定化使用方法。属于食品包装技术领域。属于生物技术领域。本发明的一种基因工程菌，其特征在于：保藏编号：中国典型培养物保藏中心CCTCC NO：M209295。本发明的基因工程菌酶活效率较高，传代稳定。本发明基因工程菌酶活为宿主菌的50～100倍，对该工程菌进行多次传代培养，该工程菌酶活保持稳定。该工程菌用于酶法生产L-丝氨酸的甘氨酸转化率可达到70～80％。

Description

一种glyA基因工程菌构建和固定化使用方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌构建和固定化使用方法，尤其是一种glyA基因工程菌构建和固定化使用方法。属于食品包装技术领域。属于生物技术领域。

背景技术

L-丝氨酸虽属人体非必需氨基酸，但在生物体氨基酸代谢过程中，L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间环节，参与多种重要物质(如甘氨酸、蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸等氨基酸、嘌呤、胸腺嘧啶类等核酸的碱基、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂等磷脂)的合成，因此又称半必需氨基酸。近来，L-丝氨酸作为一种生化试剂和药剂，在饲料、食品、医药、农业以及化妆品等行业中被广泛的应用，特别是在医药领域，被应用于配置复方氨基酸输液以及营养增补剂，用于合成多种丝氨基酸衍生物，包括抗癌、爱滋病新药及基因工程用保护氨基酸等。

L-丝氨酸的制备方法主要有蛋白质水解提取法、发酵法、化学法和酶法。蛋白质水解法提取L-丝氨酸操作较为复杂，需要大量的洗脱液，所得的氨基酸通常是混合型氨基酸，还需要后续的分离、精制，提取L-丝氨酸后的剩余液往往被浪费，所以该法提取L-丝氨酸不但不经济，而且会对环境造成极大的危害。发酵法生产L-丝氨酸主要是通过传统的遗传育种提高菌种产L-丝氨酸的能力。

目前，利用发酵生产L-丝氨酸的菌种产酸率较低，提取率也较低，因而成本高，价格较贵。化学法合成L-丝氨酸虽然不受原料的限制，可以有多种合成途径，但合成产物具有消旋性，需要对产物进行拆分才能得到L-丝氨酸。所以该法在生产L-丝氨酸中也不常用。

酶法生产L-丝氨酸主要是以现代分子生物学技术为手段，利用基因工程菌高效特异的表达基因glyA【glyA，即丝氨酸羟甲基转移酶基因】，并利用该基因的表达产物在体外特定的环境下对底物进行酶学催化得到目的产物L-丝氨酸的一种方法。由于酶促反应具有高效、特异、温和等特点，故一直受到人们的青睐。常见的酶促反应主要是利用游离的酶对底物进行催化，得到产物后，酶随分离过程的进行而作为残液排出，未能实现酶的连续或重复使用，造成了成本的增加并对环境产生了不利的影响。

因此，本发明拟从构建高效的工程菌入手，通过固定化技术解决酶的重复利用的问题。固定化技术的研究和应用起源于二十世纪60年代，包括细胞固定化技术和酶固定化技术。酶固定化技术是通过物理或化学的方法将酶连接在一定的固相载体上成为固定化酶，从而发挥催化作用。固定化后的酶在保持酶原有催化活性的同时，又可以同一般催化剂一样能回收和反复使用，不仅减少了分离的困难，而且实现了酶生产工艺上连续化和自动化，满足了工业化生产的需要。细胞固定化技术是将完整的细胞连接在固相载体上，免去破碎细胞提取酶的程序，保持了酶的完整性和活性的稳定。一般来说，固定化细胞制备的成本比固定化酶低。随着固定化技术的发展，作为固定化的对象已从酶扩展到微生物、动植物细胞以及各种细胞器。1973年，日本的千田一朗博士首次在工业上成功地应用固定化微生物细胞连续生成L一天冬氨酸。进入20世纪80年代，固定化技术发展到了固定化活细胞，利用固定化活细胞连续生产传统的发酵产品。

发明内容

【要解决的问题】

本发明的目的是：从构建高效的工程菌入手，通过固定化技术解决酶法生产L-丝氨酸中酶的重复利用的问题。

【技术方案】

本发明的一种基因工程菌，其保藏编号：中国典型培养物保藏中心CCTCCNO：M209295。保藏日期：2009年12月7日，该培养物的存活性本保藏中心于2009年12月10日检测完毕，结果为存活。培养物名称及注明的鉴别特征：大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a(+)-glyA。该培养物的存活性本保藏中心于2009年12月10日检测完毕，结果为存活，菌落菌落边缘整齐，表面具有光泽、湿润、光滑、呈灰色，革兰氏染色为阴性，IMViC试验为“+、+、-、-”。

上述的基因工程菌的构建方法，其中，包括如下步骤：

1)设计引物；根据genbank中提供的E.coli k-12 glyA的结构基因的序列(GenBank：AAC75604.1)，利用DNAclub软件设计引物，引物序列为primer1：GATCCATGGTAAAGCGTGAAATGAACAT(划线处为NcoI酶切位点)，Primer2：CCCAAGCTTTTATGCGTAAACCGGGTAA(划线处为Hind III酶切位点)；

2)培养大肠杆菌E.coli k-12到对数期，用试剂盒(购自Generay公司)抽提大肠杆菌k-12的基因组；

3)根据设计的引物以提取的E.coli k-12基因组为模板进行PCR扩增；

4)PCR产物经(Nco I、Hind III双酶切)切回收后连接于表达载体pET28a(+)(购自Novagen公司)，并转化BL21(DE3)(购自Novagen公司)；

5)随机挑选10个不同的转化子，命名为T1～T10，这些转化子个数可以是成千上万，其遗传特性都为Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，T1-T10只是这成千上万的转化子中的10个；

6)分别在盛有50mL的250mL三角瓶中，于180rpm、37℃培养，进入对数期后用IPTG(β-半乳糖苷酶的活性诱导物质)诱导3h，测定工程菌逆向酶活，以未转化的宿主菌BL21(DE3)作为对照，比较两者的酶活；

7)挑选出酶活最高的转化子T7，酶活为宿主菌的50～100倍，并对该工程菌进行100次传代培养，培养条件如步骤6，该工程菌酶活保持在0.35左右；

8)对该工程菌在5L全自动发酵罐进行培养，转速200rpm，温度37℃，pH 7.0，到达对数期后用乳糖进行诱导，乳糖终浓度为0.22g/L，再次培养7h后通过离心收集游离细胞。

游离细胞酶法生产L-丝氨酸的使用方法：对离心后的游离细胞重悬、破碎，利用破细胞液对底物甘氨酸、甲醛进行酶促转化，酶促转化条件：甘氨酸2～2.8mol/L，PLP 0.2～0.4mmol/L，THFA 3～5mmol/L，甲醛8～13mmol/L，pH：6.0～8.0。

上述步骤1)中genebank中E.coli k-12 glyA的登录号为：GenBank：AAC75604.1。

上述步骤3)的扩增条件为：

步骤1：94℃，30sec；

步骤2：94℃，30sec；

步骤3：58℃，45sec；

步骤4：72℃，110sec；

步骤5：重复步骤2～4，循环25～30次

步骤6：72℃，延伸300sec。

上述步骤7)的培养条件为：转速200rpm，温度37℃。

上述的基因工程菌的固定化使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)对转化子T7重新培养，离心收集细胞，用卡拉胶与明胶复合载体对其进行固定。具体配制过程：按比例分别称取一定量的卡拉胶与明胶(卡拉胶∶明胶质量比为2∶3～3∶2)加入到0.1M的磷酸缓冲液中，其终浓度为3-5％，灭菌后冷却至45-50℃，然后加入离心后的菌体混匀(菌体终浓度为150-200g/L)，缓慢流加到2％的KCl溶液中，制备成2-3mm的小球，于4℃固定3～8h。得到固定化细胞球，也可以说成固定化后细胞；

2)固定化后的固定化细胞球于4℃用1～3％的戊二醛处理10～30min；

3)在同一条件下分别测定固定化后工程菌的酶活与游离细胞的酶活，结果显示固定化工程菌的酶活是游离细胞的73％；

4)用固定化后的工程菌与游离细胞在同样条件下进行发酵生产L-丝氨酸的酶促转化，条件为：甘氨酸2～2.8mol/L，PLP 0.2～0.4mmol/L，THFA 3～5mmol/L，甲醛8～13mmol/L，pH：6.0～8.0。结果显示，游离细胞只能做一个批次的转化，而固定化后的工程菌能转化5～7批次，转化效率为游离细胞的90％。

【有益效果】

具体地说，本发明的优点如下：

1.本发明的基因工程菌酶活效率较高，传代稳定。本发明基因工程菌酶活为宿主菌的50～100倍，对该工程菌进行多次传代培养，该工程菌酶活保持稳定。该工程菌用于酶法生产L-丝氨酸的甘氨酸转化率可达到70～80％。

2.本发明的基因工程菌的构建和使用方法简便，其活细胞便于进行固定，固定化方法简便，转化效率高。用卡拉胶与明胶复合载体固定后进行发酵生产L-丝氨酸的酶促转化时，固定化工程菌的酶活是游离细胞的73％，转化效率为游离细胞的90％，而且，游离细胞只能做一个批次的转化，而固定化后的工程菌能转化5～10批次。达到了利用固定化活细胞连续生产L-丝氨酸产品的目的。

3.利用本发明的固定化技术，在酶促转化生产L-丝氨酸的过程中可以节约20-30％的成本。

具体实施方式

在同一条件下分三批测定固定化后工程菌的酶活与游离细胞的酶活，比较酶活的方法采用先测两者的逆向酶活，然后比较两者的逆向酶活。逆向酶活测定反应液中含50mmol/L D-苯基丝氨酸、0.5mmol/L PLP、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)，分别加入1ml OD₆₀₀＝1工程菌悬液或相应的固定化细胞，30℃振荡反应30min，离心所得上清适当稀释后于279nm处测定吸光值。结果如表1：

表1

结果显示固定化酶的酶活是游离细胞的73％。

用固定化后的工程菌进行7个批次的酶促转化，游离细胞在同样条件下对应进行一个批次的转化，并进行比较，转化条件：在1000L的不锈钢转化罐中，甘氨酸投料为170kg，离心后的菌体为60kg或相应的固定化细胞，PLP为20g，THFA为400g，甲醛177kg，pH控制6.0～8.0，温度控制37～42℃，转速80～130rpm。结果如表2：

表2

结果显示固定化细胞转化效率为游离细胞的89％。

在第8～10个批次时，固定化细胞的平均转化率略有下降。10个批次以后固定化细胞的平均转化率大幅下降。

基因工程菌的构建方法实施例1

包括如下步骤：

1)设计引物；根据genbank中提供的E.coli k-12 glyA的结构基因的序列GenBank：AAC75604.1(利用DNAclub软件)设计引物，引物序列为primer1：GATCCATGGTAAAGCGTGAAATGAACAT(划线处为NcoI酶切位点)，Primer2：CCCAAGCTTTTATGCGTAAACCGGGTAA(划线处为Hind III酶切位点)；

2)培养大肠杆菌E.coli k-12到对数期，用试剂盒(购自Generay公司)抽提大肠杆菌k-12的基因组；

3)根据设计的引物以提取的E.coli k-12基因组为模板进行PCR扩增；

4)PCR产物经(Nco I、Hind III双酶切)切回收后连接于表达载体pET28a(+)(购自Novagen公司)，并转化BL21(DE3(购自Novagen公司)；

5)随机挑选10个不同的转化子，命名为T1～T10。这些转化子个数可以是成千上万，其遗传特性都为Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，T1-T10只是这成千上万的转化子中的10个；

6)分别在盛有50mL的250mL三角瓶中，于180rpm、37℃培养，进入对数期后用IPTG(β-半乳糖苷酶的活性诱导物质)诱导3h，测定工程菌逆向酶活，以未转化的宿主菌BL21(DE3)作为对照，比较两者的酶活；

7)挑选出酶活最高的转化子T7，酶活为宿主菌的50～100倍，并对该工程菌进行100次传代培养，培养条件如步骤6，该工程菌酶活保持在0.35左右；

8)对该工程菌在5L全自动发酵罐进行培养，转速200rpm，温度37℃，pH 7.0，到达对数期后用乳糖进行诱导，乳糖终浓度为0.22g/L，再次培养7h后通过离心收集游离细胞。

基因工程菌的固定化实施例1

包括如下步骤：

1)对转化子T7重新培养，离心收集细胞，用卡拉胶与明胶复合载体对其进行固定。具体配制过程：按比例分别卡拉胶∶明胶质量比为2∶3加入到0.1M的磷酸缓冲液中，其终浓度为5％，灭菌后冷却至45℃，然后加入离心后的菌体混匀(菌体终浓度为150g/L)，缓慢流加到2％的KCl溶液中，制备成2-3mm的小球，于4℃固定3h。得到固定化细胞球，也可以说成固定化后细胞；

2)固定化后的固定化细胞球于4℃用1％的戊二醛处理30min；

3)在同一条件下分别测定固定化后工程菌的酶活与游离细胞的酶活，结果显示固定化工程菌的酶活是游离细胞的73％；

4)用固定化后的工程菌与游离细胞在同样条件下进行发酵生产L-丝氨酸的酶促转化，条件为：甘氨酸2.8mol/L，PLP 0.4mmol/L，THFA5mmol/L，甲醛13mmol/L，pH：8.0。结果显示，游离细胞只能做一个批次的转化，而固定化后的工程菌能转化5～7批次，转化效率为游离细胞的90％。

基因工程菌的固定化实施例2

包括如下步骤：

1)对转化子T7重新培养，离心收集细胞，用卡拉胶与明胶复合载体对其进行固定。具体配制过程：按比例分别称取一定量的卡拉胶与明胶(卡拉胶∶明胶质量比为3∶2)加入到0.1M的磷酸缓冲液中，其终浓度为3-5％，灭菌后冷却至50℃，然后加入离心后的菌体混匀(菌体终浓度为150g/L)，缓慢流加到2％的KCl溶液中，制备成2-3mm的小球，于4℃固定8h。得到固定化细胞球，也可以说成固定化后细胞；

2)固定化后的固定化细胞球于4℃用3％的戊二醛处理10min；

3)在同一条件下分别测定固定化后工程菌的酶活与游离细胞的酶活，结果显示固定化工程菌的酶活是游离细胞的73％；

4)用固定化后的工程菌与游离细胞在同样条件下进行发酵生产L-丝氨酸的酶促转化，条件为：甘氨酸2mol/L，PLP 0.2mmol/L，THFA5mmol/L，甲醛13mmol/L，pH：6.0。结果显示，游离细胞只能做一个批次的转化，而固定化后的工程菌能转化5～7批次，转化效率为游离细胞的90％。

基因工程菌的固定化实施例3

包括如下步骤：

1)对转化子T7重新培养，离心收集细胞，用卡拉胶与明胶复合载体对其进行固定。具体配制过程：按比例分别称取一定量的卡拉胶与明胶(卡拉胶∶明胶质量比为2∶2)加入到0.1M的磷酸缓冲液中，其终浓度为4％，灭菌后冷却至48℃，然后加入离心后的菌体混匀(菌体终浓度为180g/L)，缓慢流加到2％的KCl溶液中，制备成2-3mm的小球，于4℃固定5h。得到固定化细胞球，也可以说成固定化后细胞；

2)固定化后的固定化细胞球于4℃用2％的戊二醛处理20min；

3)在同一条件下分别测定固定化后工程菌的酶活与游离细胞的酶活，结果显示固定化工程菌的酶活是游离细胞的73％；

4)用固定化后的工程菌与游离细胞在同样条件下进行发酵生产L-丝氨酸的酶促转化，条件为：甘氨酸2.3mol/L，PLP 0.3mmol/L，THFA3～5mmol/L，甲醛11mmol/L，pH：7.0。结果显示，游离细胞只能做一个批次的转化，而固定化后的工程菌能转化5～7批次，转化效率为游离细胞的90％。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的一个可行性实施例的具体说明，但是该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更，例如，变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围之内。

Claims (4)

1.一种基因工程菌，其特征在于：保藏编号：中国典型培养物保藏中心CCTCC NO：M209295。

2.如权利要求1所述的基因工程菌的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)对该工程菌在全自动发酵罐进行培养，对数期后用乳糖进行诱导，乳糖终浓度为0.22g/L，再次培养7h后通过离心收集游离细胞；

2)对离心后的游离细胞重悬、破碎，利用破细胞液对底物甘氨酸、甲醛进行酶促转化，酶促转化条件：甘氨酸2～2.8mol/L，PLP0.2～0.4mmol/L，THFA3～5mmol/L，甲醛8～13mmol/L，pH：6.0～8.0。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的培养条件为：转速200rpm，温度37℃。

4.如权利要求1所述的基因工程菌的固定化使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)对该工程菌在全自动发酵罐进行培养，对数期后用乳糖进行诱导，乳糖终浓度为0.22g/L，再次培养7h后通过离心收集游离细胞：

2)用卡拉胶与明胶复合载体对游离细胞进行固定，卡拉胶∶明胶质量比为2∶3～3∶2，固定化温度为4℃，时间3～8h；

3)固定化后的细胞于4℃用1～3％的戊二醛处理10～30min，得到固定化细胞球；

4)用固定化细胞球对底物甘氨酸、甲醛进行酶促转化，条件为：甘氨酸2～2.8mol/L，PLP 0.2～0.4mmol/L，THFA3～5mmol/L，甲醛8～13mmol/L，pH：6.0～8.0。