CN107034206B - 一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶‑凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法。该制备方法中，制备所述酶‑凝集素结合物纳米颗粒的原料包括酶、凝集素和交联剂。所述原料还包括磁性纳米粒子和/或还原剂。以重量份数计，各原料的配比可为下述1)或2)：1)酶10份、凝集素50～500份、交联剂0.1～300份和还原剂0～1份；2)酶10份、凝集素50～500份、磁性纳米粒子1～100份、交联剂0.1～300份和还原剂0～1份。本发明酶‑凝集素结合物纳米颗粒在常规催化反应温度下分散于水溶液中，具有较高的催化活性；酶结合的凝集素能够吸引糖类底物，进一步提高了结合物的水相活性；酶‑凝集素‑磁性纳米粒子结合物纳米颗粒中酶分子被凝集素所吸附，同时与凝集素、磁性纳米粒子共价交联，在保持催化活性的基础上赋予了该催化剂可回收的特性。

Description

一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法，属于固定化酶技术领域。
背景技术
酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、反应条件温和等特点，已广泛应用于医药、食品加工及精细化学品合成等领域。游离态酶的最大缺点是其不稳定性，在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失；而且酶反应后，会在溶液中残留，造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯，这些都大大阻碍了酶工业的发展。
纳米生物催化系统是指基于酶与纳米结构整合的系统，如纳米硅，聚合物纳米凝胶，纳米孔材料，纳米花催化剂，自组装纳米反应器及高分子-酶纳米结合物等等。纳米生物催化系统实现了酶在催化体系中的纳米级分散，对底物与酶之间的传质过程起到了极大地推动作用。凝集素是一种从动植物细胞中分离的，能够选择性地结合糖或糖蛋白的蛋白。磁性纳米粒子载体是纳米生物催化中较为常用的一种载体，然而具有易使酶分子失活等特性，无法构建高效使用的多酶—磁性纳米粒子体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶-凝集素结合物纳米颗粒及其制备方法，该酶-凝集素结合物纳米颗粒在常规催化反应温度下分散于水溶液中，具有较高的催化活性，添加磁性纳米粒子后，磁性纳米粒子和凝集素的结合使得该纳米颗粒在保持催化活性的同时还可以多次重复利用，克服了磁性纳米粒子容易使酶失活的问题。
本发明提供的酶-凝集素结合物纳米颗粒的制备方法，制备所述酶-凝集素结合物纳米颗粒的原料包括酶、凝集素和交联剂。
上述的方法中，所述原料还可包括磁性纳米粒子，磁性纳米粒子和凝集素的结合使得该纳米颗粒在保持催化活性的同时还可以多次重复利用，克服了磁性纳米粒子容易使酶失活的问题。
上述的方法中，所述原料还可包括还原剂，所述还原剂的加入可使交联后的酶-凝集素结合物纳米颗粒更加稳定，减少使用过程中酶的流失。
上述的方法中，以重量份数计，各原料的配比可为下述1)或2)：
1)酶10份、凝集素50～500份、交联剂0.1～300份和还原剂0～1份；
2)酶10份、凝集素50～500份、磁性纳米粒子1～100份、交联剂0.1～300份和还原剂0～1份。
上述的方法中，当所述原料中不包括磁性纳米粒子时，以重量份数计，各原料的配比可为下述a)-f)中的任一种：
a)酶10份、凝集素110份、交联剂0.4～300份、还原剂0～0.4份；
b)酶10份、凝集素110份、交联剂0.4～200份、还原剂0～0.4份；
c)酶10份、凝集素110份、交联剂200～300份、还原剂0～0.4份；
d)酶10份、凝集素110份、交联剂200份、还原剂0份；
e)酶10份、凝集素110份、交联剂0.4份、还原剂0.4份；
f)酶10份、凝集素110份、交联剂300份、还原剂0.4份。
上述的方法中，当所述原料中包括磁性纳米粒子时，以重量份数计，各原料的配比可为下述a)-c)中的任一种：
a)酶10份、凝集素55～110份、磁性纳米粒子20份、交联剂0.4份和还原剂0.4份；
b)酶10份、凝集素110份、磁性纳米粒子20份、交联剂0.4份和还原剂0.4份；
c)酶10份、凝集素55份、磁性纳米粒子20份、交联剂0.4份和还原剂0.4份。
上述的方法中，所述酶是指常用的催化用酶，可选自南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B)、褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa Lipase)、米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase)、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosus Lipase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、乙醇脱氢酶(Ethanoldehydrogenase)、细胞色素C(Cytochrome C)、葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase)、辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase)、过氧化氢酶(Catalase，具体可为牛肝过氧化氢酶)和漆酶(Laccase)中的至少一种；
优选地，所述酶可采用多酶体系(如双酶体系)，多酶体系由酶彼此嵌合而成，它有利于一系列反应的继续进行，具体可采用现有的可起到协同作用的双酶体系，多酶体系经过凝集素拉近酶间距，强化了中间产物在酶之间的传递速率，可提高双酶体系的活性及底物亲和性。更优选地，所述酶可选自氧化-还原双酶体系，即所述酶由氧化酶和还原酶组成，所述氧化酶可为乙醇脱氢酶、细胞色素C和葡萄糖氧化酶中的任意一种，所述还原酶可为辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和漆酶中的任意一种，具体可为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶组成的双酶体系、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶组成的双酶体系；所述氧化酶和所述还原酶的质量比可1：(0.1～10)，具体可为1：(1～4)，如葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶(质量比具体可为1：4)、葡萄糖氧化酶和牛肝过氧化氢酶(质量比具体可为1：1)、乙醇脱氢酶和过氧化氢酶(质量比具体可为1：2)、葡萄糖氧化酶和漆酶(质量比具体可为1：1)等。
上述的酶-凝集素结合物纳米颗粒中，所述凝集素能与下述至少一种糖或糖蛋白结合：N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-甘露糖、N-乙酰-L-岩藻糖、β-乳糖、半乳糖基-β-(1-3)-N-乙酰-D-半乳糖胺、D-葡萄糖、N-乙酰-葡糖胺和N-乙酰-神经氨酸；所述凝集素可为来自菜豆、刀豆、大豆和小麦胚芽中的一种或多种组合的凝集素。
上述的酶-凝集素结合物纳米颗粒中，所述交联剂可为下述a)-c)中的任一种：
a)端醛基或端琥珀酰亚胺酯聚醚类的嵌段共聚物，数均分子量为4400～12600；所述嵌段共聚物的嵌段结构具体为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯；
b)端醛基或端琥珀酰亚胺酯聚乙二醇，数均分子量为2000～10000；
c)戊二醛。
上述的酶-凝集素结合物纳米颗粒中，所述磁性纳米粒子可为Fe、Co、Ni及其合金类、铁氧体类或氮化铁类；所述铁氧体类可为四氧化三铁、Y-三氧化铁或MeFe204，其中Me＝Co、Ni或Mn；氮化铁类可为FeN、Fe2N、ε-Fe3N或Fe16N2。
所述还原剂是指可将亚胺(西弗碱)结构还原为胺的还原剂，包括但不限于硼氢化钠或氰基硼氢化钠，所述还原剂与交联剂的选取有关，具体地，当所述交联剂的端基为醛基时可加入还原剂，所述交联剂的端基为琥珀酰亚胺时无需加入交联剂。
上述的方法中，制备工艺如下：
1)将酶和凝集素加入缓冲溶液中，搅拌；
2)在步骤1)得到的体系中加入交联剂，发生交联反应；
3)将步骤2)得到的体系干燥，即可得到所述酶-凝集素结合物纳米颗粒。
上述的方法中，步骤1)中，所述搅拌的时间可为0.5～1小时，具体可为2小时；转速可为150～600rad/min，具体可为250rad/min；
每1mg凝集素可加入(0.5～3)mL的缓冲溶液，具体地，每1mg凝集素可加入0.5～2mL、0.5～1mL、1～2mL、0.5mL、1mL或2mL的缓冲溶液；
所述缓冲溶液pH值可为7～10，具体可为7～9、7～8、8～9、7、8或9；所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐可为磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠)、硼酸-硼砂缓冲溶液(盐选自硼酸钠或硼酸钾)或碳酸盐缓冲溶液(碳酸盐选自碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢盐选自碳酸氢钠或碳酸氢钾)；所述缓冲溶液的浓度可为10mM～100mM，具体可为10mM；
步骤2)中，所述交联反应的时间可为1～24小时，具体可为2小时；所述还原反应的温度可为20～30℃，具体可为25℃；
步骤3)中，所述干燥可为冻干，所述冻干的时间可为24～72小时，具体可为48小时。
上述的方法中，所述方法在步骤1)中还包括在所述缓冲溶液中加入磁性纳米粒子的步骤。
上述的方法中，所述方法在步骤2)中所述交联反应之后还包括加入还原剂发生还原反应的步骤；所述还原反应的时间可为1～24小时，具体可为24小时；所述还原反应温度可为20～30℃，具体可为25℃。
上述的方法中，所述方法在步骤3)中所述干燥之前还包括去除小分子的步骤，具体为水洗或透析(所述原料中包括磁性纳米粒子时水洗即可)；所述透析采用透析袋，所述透析袋的截留分子量可为3000～15000，具体可为3500；材质可为再生纤维素(RC)、纤维素酯(CE)或聚偏二氟乙烯(PVDF)。
由上述方法制备得到的产品均在本发明的保护范围内。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明酶-凝集素结合物纳米颗粒在常规催化反应温度下分散于水溶液中，具有较高的催化活性。
(2)本发明在添加磁性纳米粒子后制备得到的酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒中的酶分子被凝集素所吸附，同时与凝集素、磁性纳米粒子共价交联，赋予了该催化剂可回收的特性，重复效果好。
(3)本发明酶-凝集素结合物纳米颗粒采用双酶体系，双酶体系经过凝集素拉近酶间距，强化了中间产物在酶之间的传递速率，从而提高双酶体系的活性及底物亲和性。
(4)本发明酶-凝集素结合物纳米颗粒中酶结合的凝集素能够吸引糖类底物，进一步提高了结合物的水相活性，在工业酶催化领域具有广泛的应用前景。
(5)本发明制备方法反应条件温和，虽然对酶分子进行了共价修饰，但仍保留了大部分酶活，且催化剂效率高，易于重复使用，每次催化成本较低，较易于工业实施和放大。
附图说明
图1为实施例1中制备得到的酶(葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶)-凝集素结合物纳米颗粒的高分辨率透射电镜照片。
图2为实施例1-3中制备得到的酶-凝集素结合物纳米颗粒和天然酶的催化活性对比图。
图3为实施例5中制备得到的酶-凝集素-磁性纳米粒结合物纳米颗粒多次重复使用的催化活性变化图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7)的配方：磷酸二氢钠0.6036g，磷酸氢二钠2.1964g溶于1L去离子水中，磷酸二氢钠及磷酸氢二钠均购自北京化工厂。
10mM磷酸盐缓冲液(pH为8)的配方：磷酸二氢钠0.0926g，磷酸氢二钠3.3696g溶于1L去离子水中，磷酸二氢钠及磷酸氢二钠均购自北京化工厂。
10mM硼酸-硼砂缓冲液(pH为9)的配方：硼酸1.2368g，溶于2L去离子水中，加NaOH至pH＝9。
下述实施例中酶的比活力：葡萄糖氧化酶(约为10kU/mg)，辣根过氧化物酶(约为1kU/mg)，牛肝过氧化氢酶(约为5kU/mg)如无特殊说明所有酶购自Sigma公司。
刀豆蛋白A即刀豆蛋白凝集素购自Sigma公司。
实施例1、制备酶-凝集素结合物纳米颗粒
一、原料配比
以重量份数计，本实施例中各原料的配比如下：
葡萄糖氧化酶2份、辣根过氧化物酶8份、刀豆蛋白A(凝集素)110份、戊二醛(交联剂)0.4份、硼氢化钠(还原剂)0.4份。
二、制备方法
将上述配比的原料按照如下步骤制备酶-凝集素结合物纳米颗粒：
1)将酶、凝集素加入pH为7的10mM磷酸盐缓冲液(每1mg凝集素加入1mL缓冲溶液)中，25℃下搅拌(250rad/min)反应2小时；
2)在步骤1)得到的体系中加入交联剂，继续反应2小时，经交联反应后加入还原剂，继续反应24小时；
3)将步骤2)得到的体系透析(透析袋的截留分子量为3500，材质为纤维素酯)后冻干48小时即可得到所述酶-凝集素结合物纳米颗粒。
本实施例制备得到的酶-凝集素结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片如图1所示。
三、催化活性测试
以葡萄糖及2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)作为底物在缓冲液中测量酶-凝集素结合物纳米颗粒的生物催化活性，测定方法如下：测活时ABTS的浓度确定为0.5mM，缓冲溶液为pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，温度为25℃。测定GOx或GOx-ConA聚集体的酶促动力学时，测活体系中GOx的浓度为2μg/mL。改变不同的葡萄糖浓度，在HRP浓度大大过量的情况下(100μg/mL)，测定溶液在415nm处吸光度的增长速率。测定GOx-HRP自由酶或GOx-ConA-HRP聚集体的整体反映的酶促动力学时，测活体系中ABTS的浓度同上，但HRP的浓度固定为8μg/mL。
本实施例中酶-凝集素结合物纳米颗粒的生物催化活性为等当量天然酶的34％，如图2所示。
实施例2、制备酶-凝集素结合物纳米颗粒
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.4份戊二醛交联剂替换为300份端醛基PEG(即醛基-聚乙二醇-醛基，CHO-PEG-CHO)(Mn＝2000)，制备得到的酶-凝集素结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片与实施例1无实质差别，生物催化活性为等当量天然酶的61％，如图2所示。
实施例3、制备酶-凝集素结合物纳米颗粒
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.4份戊二醛交联剂替换为200份端琥珀酰亚胺酯PEG(琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯，NHS-PEG-NHS)(Mn＝2000)，不使用还原剂，制备得到的酶-凝集素结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片与实施例1无实质差别，其生物催化活性为等当量天然酶的63％，如图2所示。
实施例4、制备酶-凝集素结合物纳米颗粒
将实施例1中的缓冲液分别改为pH为8的10mM磷酸盐缓冲液、pH为9的10mM硼酸-硼砂缓冲液、pH为10的10mM硼酸-硼砂缓冲液，其余配方和步骤与实施例1相同，制备得到的酶-凝集素结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片与实施例1无实质差别，得到的产物的水相催化活性与实施例1相当。
实施例5、制备酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒
一、原料配比
以重量份数计，本实施例中各原料的配比如下：
葡萄糖氧化酶2份、辣根过氧化物酶8份、刀豆蛋白A(凝集素)110份、Fe3O4磁性纳米粒子20份、戊二醛(交联剂)0.4份、硼氢化钠(还原剂)0.4份。
二、制备方法
将上述配比的原料按照如下步骤制备酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒：
1)将凝集素、酶和Fe3O4磁性纳米粒子加入pH为7的50mM磷酸盐缓冲液(每1mg凝集素加入1mL缓冲溶液)中，25℃下搅拌反应(250rad/min)2小时，
2)在步骤1)得到的体系中加入交联剂，继续反应2小时，经交联反应后加入还原剂，继续反应24小时；
3)将步骤2)得到的体系水洗3次后冻干48小时即可得到所述酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒。
本实施例制备得到的酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片与实施例1无实质差别。
三、催化活性
以葡萄糖及2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐作为底物在缓冲液中测量酶-凝集素结合物的生物催化活性为等当量天然酶的28％(测定方法同实施例1)，经过10次重复使用，酶活性保留>91％，如图3所示。
实施例6、制备酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒
操作步骤同实施例5，不同之处在于：0.4份戊二醛交联剂替换为200份端琥珀酰亚胺酯PEG(琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯，NHS-PEG-NHS)(Mn＝2000)，不使用还原剂，制备得到的酶-凝集素结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片与实施例1无实质差别，其生物催化活性为等当量天然酶的55％，经过10次重复使用，酶活性保留>80％。
实施例7、制备酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒
操作步骤同实施例5，不同之处在于：酶替换为10份葡萄糖氧化酶及10份牛肝过氧化氢酶。本实施例制备得到的酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒的高分辨透射电镜的照片与实施例1无显著差别。
催化活性：以质量计3000份葡萄糖为底物，通空气条件下进行反应。75分钟后葡萄糖转化率为98％，以转化率计，活性为同条件下葡萄糖氧化酶单酶的300％，为同条件下葡萄糖氧化酶及牛肝过氧化氢酶的110％。经过三次重复使用，酶活性保留>88％。
对比例1、制备酶-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒
一、原料配比
以重量份数计，本实施例中各原料的配比如下：
葡萄糖氧化酶2份、辣根过氧化物酶8份、Fe3O4磁性纳米粒子20份、戊二醛(交联剂)0.4份、硼氢化钠(还原剂)0.4份。
二、制备方法
将上述配比的原料按照如下步骤制备酶-凝集素-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒：
1)将酶和Fe3O4磁性纳米粒子加入pH为7的10mM磷酸盐缓冲液(缓冲溶液体积同实施例5)中，25℃下搅拌(250rad/min)反应2小时；
2)在步骤1)得到的体系中加入交联剂，继续反应2小时，经交联反应后加入还原剂，继续反应24小时；
3)将步骤2)得到的体系水洗3次后冻干48小时即可得到所述酶-磁性纳米粒子结合物纳米颗粒。
以葡萄糖及2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐作为底物在缓冲液中测量酶-磁性纳米粒子结合物的生物催化活性，通过该方法制备的酶-磁性纳米粒子结合物不具有生物催化活性(测定方法同实施例1)。

Claims (6)

1.一种酶-凝集素结合物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：制备所述酶-凝集素结合物纳米颗粒的原料包括酶、凝集素和交联剂；
所述原料还包括磁性纳米粒子和/或还原剂；
以重量份数计，各原料的配比为下述1)或2)：
1)酶10份、凝集素50～500份、交联剂0.1～300份和还原剂0～1份；
2)酶10份、凝集素50～500份、磁性纳米粒子1～100份、交联剂0.1～300份和还原剂0～1份；
所述酶为南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、胰凝乳蛋白酶、乙醇脱氢酶、细胞色素C、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和漆酶中的至少一种；
所述凝集素能与下述至少一种糖或糖蛋白结合：N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-甘露糖、N-乙酰-L-岩藻糖、β-乳糖、半乳糖基-β-(1-3)-N-乙酰-D-半乳糖胺、D-葡萄糖、N-乙酰-葡糖胺和N-乙酰-神经氨酸；
所述交联剂为下述a)-c)中的任一种：
a)端醛基或端琥珀酰亚胺酯聚醚类的嵌段共聚物，数均分子量为4400～12600；所述嵌段共聚物的嵌段结构具体为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯；
b)端醛基或端琥珀酰亚胺酯聚乙二醇，数均分子量为2000～10000；
c)戊二醛；
所述酶-凝集素结合物纳米颗粒的制备工艺如下：
1)将酶和凝集素加入缓冲溶液中，搅拌；
2)在步骤1)得到的体系中加入交联剂，发生交联反应；
3)将步骤2)得到的体系干燥，即可得到所述酶-凝集素结合物纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性纳米粒子为Fe、Co、Ni及其合金类、铁氧体类或氮化铁类；所述铁氧体类为四氧化三铁、Y-三氧化铁或MeFe204，其中Me＝Co、Ni或Mn；氮化铁类为FeN、Fe2N、ε-Fe3N或Fe16N2；所述还原剂为硼氢化钠或氰基硼氢化钠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述搅拌的时间为0.5～1小时，转速为150～600rad/min；每1mg凝集素加入(0.5～3)mL的缓冲溶液；所述缓冲溶液pH值为7～10，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液或碳酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液的浓度为10mM～100mM；
步骤2)中，所述交联反应的时间为1～24小时，温度为20～30℃；
步骤3)中，所述干燥为冻干，所述冻干的时间为24小时～72小时。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法在步骤1)中还包括在所述缓冲溶液中加入磁性纳米粒子的步骤。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法在步骤2)中所述交联反应之后还包括加入还原剂发生还原反应的步骤。
6.权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的产品。
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