CN107312768B - 一种固定化单宁酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种固定化单宁酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化单宁酶的制备及应用工艺，具体来说是一种耐用型固定化单宁酶的制备，及采用固定化单宁酶水解单宁酸，制备没食子酸的工艺方法。本发明的固定化单宁酶，在生产没食子酸时，能解决原有单宁酶应用时，催化批次少、单宁酸残留高、转化率低等问题，本发明提供了一种耐用型固定化单宁酶的制备，及在没食子酸生产中的应用新工艺。

Description

一种固定化单宁酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说是一种耐用型固定化单宁酶的制备及采用固定化单宁酶制备没食子酸的新工艺。
背景技术
中国是五倍子种植大国，五倍子提取物的产量位居世界前列。五倍子提取物中的主要成分为单宁酸。单宁酸分子是葡萄糖与没食子酸形成的酯结构。
没食子酸是一种重要的化工中间体，通常是由没食子酸水解制备而来。由单宁酸制备没食子酸的工艺主要有：(1)酸或碱性条件下，加热水解；(2)生物发酵法；(3)酶法。目前国内几个主要厂家的生产工艺仍是以酸或碱性条件下加热水解，但这种工艺能耗高、污水多、单宁酸转化率低、安全性差。而生物发酵法生产周期较长，且单宁酸通常水解不完全。酶法则是使用单宁酶进行催化水解。单宁酶(Tannase,EC3.1.1.20)，全称单宁酯酰水解酶，能将单宁酸水解为没食子酸和葡萄糖。
采用酶法也有两个明显的问题：(1)采用游离的单宁酶，使用成本较高；(2)采用固定化的单宁酶，使用成本低，但单宁酸转化率也低。
如何解决固定化单宁酶单宁酸转化率低的问题，既需要改进固定化方法，也需要更合适的应用工艺。本发明的耐用型固定化单宁酶，解决了固定化单宁酶的耐用性问题，降低了使用成本，同时，发明了一种新的应用方法，大大提高了单宁酸的转化率。本发明的固定化单宁酶催化反应方程式如下：
Figure BDA0001377805720000011
发明内容
针对现有固定化单宁酶，催化批次少、单宁酸残留高、转化率低等问题，本发明提供了一种耐用型固定化单宁酶的制备，及在没食子酸中的应用新工艺。
为了实现上述目的，本申请采取的技术手段如下：
一种固定化单宁酶，采用胺基型载体。
制备所述的固定化单宁酶的方法，具体步骤如下：
(1)胺基型载体的制备；
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备环氧型基球，再将环氧型基球与有机胺进行反应，得到胺基型载体；
具体步骤为：将分散剂和去离子水作为分散相；将单体、交联剂、致孔剂、引发剂混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，调节粒度，在一定温度下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮或乙醇淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。将有机胺配置一定浓度，加入环氧型基球，在一定温度下进行胺化反应。反应结束，洗净残液，得胺基型载体。
所述的大孔吸附树脂环氧型基球在悬浮聚合中所选用的单体是甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、葡萄糖五甲基丙烯酸酯、葡萄糖四甲基丙烯酸酯、葡萄糖三甲基丙烯酸酯、葡萄糖二甲基丙烯酸酯中的一种或几种组合；
所述的大孔吸附树脂环氧型基球在悬浮聚合中所选用的交联剂是二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、衣康酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯、三聚异氰酸烯丙酯中的一种或多种组合；
所述的环氧型基球的环氧值在300～500umol/g(环氧值高说明载体上的固定化基团较多，有利于酶的固定化，但环氧值过高，导致载体功能基团太多而交联度不够，影响载体的强度)；孔径在50～100nm(孔径大有利于底物在孔道内的扩散，但孔径过大，载体强度低)；强度测试时，浊度小于200(浊度越大，载体强度越差，影响固定化酶的使用寿命)；粒径在100-1000um；含水量在35-85％。
(2)胺基型载体的预处理；
将步骤(1)所制得的胺基型载体用磷酸缓冲溶液进行处理，处理后，用戊二醛溶液进行活化；
具体为：将胺基型载体放至层析柱中，用1～10倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至1～10倍体积的戊二醛溶液(浓度为0.5～5％)中，在10～40℃下搅拌0.5～24h；过滤，用1～10倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)单宁酶酶液的固定化；
将游离型的单宁酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有单宁酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的单宁酶酶液重量的0.05～0.5倍，在20-30℃下振荡15-40h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的单宁酶。
步骤(1)中所述的环氧型基球是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂环氧型基球中的一种或两种组合。
步骤(3)中所述的游离型单宁酶酶液为黑曲霉或米曲霉来源的单宁酶酶液。
步骤(3)中所得到的固定化单宁酶的酶活力为50～250u/g。
固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用。
固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用，具体步骤如下：
(1)将固定化单宁酶装至层析柱中，制得酶床层；
(2)配置浓度为1～20％(w/V)的单宁酸溶液作为底物，让单宁酸溶液匀速流过步骤(1)制备的酶床层中，流速为0.1～2BV/h(BV为酶床层体积倍数)，柱内温度控制在20-60℃，酶床层连续流过2～50BV的单宁酸溶液后，用去离子水0.2～10BV冲洗酶床层；冲洗后的酶床层继续用于下一批次使用；
(3)将步骤(2)中从酶床层流出的料液，去结晶精制得没食子酸。
步骤(1)中所述的将固定化单宁酶装至层析柱中，其中层析柱中酶床层的径高比为1/(1～20)。
关于本发明的创新点，可以通过下述方面阐述：
(1)采用了胺基型载体作为固定化单宁酶的载体，并提供了所选胺基型载体的制备工艺。这种载体功能基团高，采用共价键进行酶的固定化，酶的稳定性好，酶不易脱落和衰减。因为载体强度好，不易破碎，生产中流失少。载体孔径大，有利于底物和产物的扩散，能提高单宁酸转化率，减少杂质对酶的污染。
(2)目前市场上，未见有固定化单宁酶商品出售。从资料报道的固定化单宁酶看，也很少提供酶的使用寿命。本发明的固定化单宁酶，使用寿命周期在300批，连接载体和酶的共价键牢固，固定化酶的载体强度好，不易破碎流失，耐污染。大幅降低了没食子酸的生产成本。
(3)本发明首次采用柱状固定床式反应器来使用固定化单宁酶。曾有文献报道，将固定化单宁酶加入单宁酸溶液中搅拌使用，但本发明在实验研究过程中发现，反应产物没食子酸对单宁酶的酶活性有抑制作用，从而导致搅拌式的单宁酸转化率低，同时搅拌式使用更易导致固定化单宁酶颗粒的破碎和流失。本发明采用固定床式柱状反应器的使用方法，结合本发明的固定化单宁酶较高的酶活，底物单宁酸在床层中能高效催化，从而在床层内的停留时间不需要很长，并且转化率更高，酶颗粒破碎更少。
现有没食子酸生产中，因为水解反应是可逆反应，通过化学法，单宁酸的转化率低，通常反应中单宁酸的转化率低于90％。而采用本发明的固定化单宁酶催化后，反应液中单宁酸转化率可以达到98％。这既提高了单宁酸转化率，也减少了产品中的杂质。
综上所述，本发明的固定化单宁酶利用单宁酸制备了产物没食子酸，该法提高了单宁酸的转化率，使得成本降低，而且所制得的产品质量较好。
附图说明
图1为实施例三固定化单宁酶使用寿命的考察(以连续两批残留浓度高于0.8g/L为终点判断标准)；
图2为实施例一固定化单宁酶催化时单宁酸转化率随批次的变化关系。
具体实施方式
本发明通过图表对比和实施例来阐明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯苯、致孔剂、引发剂混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，调节粒度，在一定温度下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在320umol/g；孔径80nm；强度测试时，浊度180；粒径400um；含水量55％。将环氧型基球与乙二胺进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用2倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至8倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为1％)中，在20℃下搅拌20h；过滤，用2倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)单宁酶酶液的固定化；
将游离型的来源于黑曲霉的单宁酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有单宁酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的单宁酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振荡20h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的单宁酶。所得到的固定化单宁酶的酶活力为70u/g。
固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用，具体步骤如下：
(1)将固定化单宁酶装至层析柱中，制得酶床层，酶床层高径比在10/1；
(2)配置浓度为4％(w/V)的单宁酸溶液作为底物，让单宁酸溶液匀速流过步骤(1)制备的酶床层中，流速为0.8BV/h(BV为酶床层体积倍数)，柱内温度控制在45℃，酶床层连续流过25BV的单宁酸溶液后，用去离子水10BV冲洗酶床层；冲洗后的酶床层继续用于下一批次使用；
(3)将步骤(2)中从酶床层流出的料液，去结晶精制得没食子酸。清洗后的酶床层用于下一批催化反应。
实施例二
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚异氰酸烯丙酯、二乙烯苯、致孔剂、引发剂混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，调节粒度，在一定温度下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在330umol/g；孔径70nm；强度测试时，浊度160；粒径300um；含水量65％。将环氧型基球与丁二胺进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用5倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至8倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为5％)中，在30℃下搅拌24h；过滤，用10倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)单宁酶酶液的固定化；
将游离型的来源于米曲霉的单宁酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有单宁酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的单宁酶酶液重量的0.2倍，在30℃下振荡15h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的单宁酶。所得到的固定化单宁酶的酶活力为110u/g。
固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用，具体步骤如下：
(1)将固定化单宁酶装至层析柱中，制得酶床层，酶床层高径比在20/1；
(2)配置浓度为6％(w/V)的单宁酸溶液作为底物，让单宁酸溶液匀速流过步骤(1)制备的酶床层中，流速为0.8BV/h(BV为酶床层体积倍数)，柱内温度控制在50℃，酶床层连续流过16.7BV的单宁酸溶液后，用去离子水10BV冲洗酶床层；冲洗后的酶床层继续用于下一批次使用；
(3)将步骤(2)中从酶床层流出的料液，去结晶精制得没食子酸。清洗后的酶床层用于下一批催化反应。
实施例三
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚异氰酸烯丙酯、致孔剂、引发剂混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，调节粒度，在一定温度下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在330umol/g；孔径70nm；强度测试时，浊度160；粒径300um；含水量65％。将环氧型基球与己二胺进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用6倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至6倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为0.8％)中，在25℃下搅拌20h；过滤，用6倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)单宁酶酶液的固定化；
将游离型的单宁酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有单宁酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的单宁酶酶液重量的0.2倍，在30℃下振荡20h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的单宁酶。所得到的固定化单宁酶的酶活力为95u/g。
固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用，具体步骤如下：
(1)将固定化单宁酶装至层析柱中，制得酶床层，酶床层高径比在20/1；
(2)配置浓度为6％(w/V)的单宁酸溶液作为底物，让单宁酸溶液匀速流过步骤(1)制备的酶床层中，流速为0.8BV/h(BV为酶床层体积倍数)，柱内温度控制在50℃，酶床层连续流过16.7BV的单宁酸溶液后，用去离子水10BV冲洗酶床层；冲洗后的酶床层继续用于下一批次使用；
(3)将步骤(2)中从酶床层流出的料液，去结晶精制得没食子酸。清洗后的酶床层用于下一批催化反应。
实施例四
(1)胺基型载体的制备；
将分散剂和去离子水作为分散相；将甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、致孔剂、引发剂混合均匀，为有机相。将有机相加入至分散相中，调节粒度，在一定温度下进行悬浮聚合。聚合反应结束，用丙酮淋洗致孔剂。筛分出合适的粒度，得环氧型基球。环氧型基球的环氧值在330umol/g；孔径70nm；强度测试时，浊度160；粒径300um；含水量65％。将环氧型基球与丁二胺进行反应，得到胺基型载体。
(2)胺基型载体的预处理；
将胺基型载体放至层析柱中，用4倍载体床层体积的磷酸缓冲液从上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游离水；再把载体转移至4倍载体床层体积的戊二醛溶液(浓度为3％)中，在30℃下搅拌16h；过滤，用4倍体积的磷酸缓冲液冲洗，抽干。
(3)单宁酶酶液的固定化；
将游离型的来源于黑曲霉的单宁酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤(2)中活化过的胺基型载体加至溶有单宁酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的单宁酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振荡36h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的单宁酶。所得到的固定化单宁酶的酶活力为85u/g。
固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用，具体步骤如下：
(1)将固定化单宁酶装至层析柱中，制得酶床层，酶床层高径比在20/1；
(2)配置浓度为6％(w/V)的单宁酸溶液作为底物，让单宁酸溶液匀速流过步骤(1)制备的酶床层中，流速为0.8BV/h(BV为酶床层体积倍数)，柱内温度控制在50℃，酶床层连续流过16.7BV的单宁酸溶液后，用去离子水10BV冲洗酶床层；冲洗后的酶床层继续用于下一批次使用；
(3)将步骤(2)中从酶床层流出的料液，去结晶精制得没食子酸。清洗后的酶床层用于下一批催化反应。
实验例
对实施例一～四所得的没食子酸产品进行性能测试
纯度、单宁酸残留主要用HPLC检测；色级主要检测方法为中国药典的方法。
对没食子酸产品进行检测，结果如下表所示：
纯度％ 单宁酸残留％ 色级
实施例一 99.4 0.32 2#
实施例二 99.3 0.38 2#
实施例三 99.4 0.27 2#
实施例四 99.2 0.49 2#
使用批次的考察实验：模拟生产过程进行小试反应，让单宁酸料液从装有酶床层的柱床流过。流出产物，固定化酶留在柱床中，经清水清洗后的固定化单宁酶酶床层继续用于下一批的催化反应中。从进单宁酸料液至柱中，到全部放出反应产物，为固定化单宁酶的一个使用批次。使用固定化酶进行催化实验，初始流速快，随着批次的增多，酶逐渐衰减，需要降低反应流速确保产物的质量。实验中以反应流速降至初始流速的一半时，视为酶的寿命终点。达到酶的寿命终点时，固定化单宁酶共使用批次的量，为固定化单宁酶的寿命或酶能使用的批次数。
从实施例和附图对比来看：本发明所得产品，使用批次多，稳定性好，产品质量好，颜色浅。从附图1和图2可知，本发明的固定化单宁酶酶催化时，能达300批以上，使用寿命长；单宁酸残留低，转化率高，单宁酸转化率高于98％。

Claims (6)

1.一种固定化单宁酶，其特征在于，采用胺基型载体；
制备所述的固定化单宁酶的方法，具体步骤如下：
（1）胺基型载体的制备；
将单体和交联剂利用悬浮聚合法，制备环氧型基球，再将环氧型基球与有机胺进行反应，得到胺基型载体；
（2）胺基型载体的预处理；
将步骤（1）所制得的胺基型载体用磷酸缓冲溶液进行处理，处理后，用戊二醛溶液进行活化；
（3）单宁酶酶液的固定化；
将游离型的单宁酶酶液加入至磷酸缓冲溶液中溶解，再将步骤（2）中活化过的胺基型载体加至溶有单宁酶酶液的磷酸盐缓冲液中，活化后的胺基型载体占溶解后的单宁酶酶液重量的0.05~0.5倍，在20-30℃下振荡15-40h后过滤，用磷酸缓冲溶液进行冲洗，得到固定化的单宁酶；
步骤（1）中，所述的环氧型基球是苯乙烯系大孔吸附树脂、丙烯酸系大孔吸附树脂环氧型基球中的一种或两种组合；
所述的环氧型基球环氧值在300~500umol/g，所述的环氧型基球孔径为50-100nm。
2.如权利要求1所述的固定化单宁酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的游离型单宁酶酶液为黑曲霉或米曲霉来源的单宁酶酶液。
3.如权利要求1所述的固定化单宁酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）所得到的固定化单宁酶的酶活力为50~250u/g。
4.如权利要求1所述的固定化单宁酶，其特征在于，固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用。
5.如权利要求4所述的固定化单宁酶，其特征在于，固定化单宁酶在催化单宁酸制备没食子酸方面的应用，具体步骤如下：
（1）将固定化单宁酶装至层析柱中，制得酶床层；
（2）配置浓度为1~20%（w/V）的单宁酸溶液作为底物，让单宁酸溶液匀速流过步骤（1）制备的酶床层中，流速为0.1~2BV/h（BV为酶床层体积倍数），柱内温度控制在20-60℃，酶床层连续流过2~50BV的单宁酸溶液后，用去离子水0.2~10BV冲洗酶床层；冲洗后的酶床层继续用于下一批次使用；
（3）将步骤（2）中从酶床层流出的料液，去结晶精制得没食子酸。
6.如权利要求5所述的利用固定化单宁酶催化单宁酸制备没食子酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的将固定化单宁酶装至层析柱中，其中层析柱中酶床层的径高比为1/(1~20)。
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