CN115521948A

CN115521948A - 一种单宁酶在制备没食子酸中的应用

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Publication number: CN115521948A
Application number: CN202210721984.7A
Authority: CN
Inventors: 张国秀; 徐元喜; 徐红; 张辉; 白挨玺
Original assignee: Nanjing Bestzyme Bio Engineering Co ltd
Current assignee: Nanjing Bestzyme Bio Engineering Co ltd
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2022-12-27
Also published as: WO2022268194A1

Abstract

本发明公开了一种单宁酶在制备没食子酸中的应用，属于酶工程技术领域，所述应用包括如下步骤：1)配制浓度为25％‑35％(w/v)的单宁酸溶液，调节单宁酸溶液pH至4.0‑5.0；2)取步骤1)得到的单宁酸溶液添加到反应釜中，按照36‑54U/g的底物添加量加入单宁酶，水解生成没食子酸。本发明所用的单宁酶来源于黑曲霉ATCC13496，其氨基酸序列与SEQIDNO:13或其成熟多肽具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性。本发明还公开了利用黑曲霉CICC2462菌株表达单宁酶的氨基酸序列制备单宁酶的方法。

Description

一种单宁酶在制备没食子酸中的应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种单宁酶在制备没食子酸中的应用。

背景技术

单宁酶(Tannase,E.C.3.1.1.20)，又称鞣酸酶，是一种单宁酰基水解酶，该酶对带有两个苯酚基的酸，如鞣酸具有水解作用，可水解没食子酰单宁及没食子酸烷基酯，生成没食子酸、葡萄糖及烷基醇等小分子物质。基于对单宁物质的高效水解作用，单宁酶在食品、饮料、酿酒、医药、化工等领域得到了广泛的应用研究。

能够产生单宁酶的微生物来源十分丰富，主要是真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，尤其是曲霉属中的黑曲霉、米曲霉和黄曲霉(Sunny D,Gunjan M,Kumar SA.Recenttrends and advancements in microbial tannase-catalyzed biotransformationoftannins:a review.International Microbiology,2018,21.)。现有技术对单宁酶发酵生产研究的重点多集中在曲霉和青霉上，常通过诱变育种选育和改良生产菌株以及通过优化发酵条件等途径来提高发酵产酶活力(LV Rodríguez-Durán,Valdivia-Urdiales B,Contreras-Esquivel JC,et al.Novel strategies for upstreamanddownstreamprocessing oftannin acyl hydrolase.Enzyme research,2011,2011:823619.)。然而通常由此方法生产的单宁酶普遍存在生产效率较低、生产成本较高的问题，而且酶的组分混杂等因素明显限制了单宁酶的规模化工业应用。由于单宁酶种类繁多且不同来源的酶的性质相差很大，找到一种合适的单宁酶应用于某一特定的领域的难度是非常大的。有文献和专利报道了利用基因工程手段构建重组菌来生产单宁酶，但这些酶对塔拉单宁的水解效果并不明显，而且利用单宁酶水解塔拉单宁来高效生产没食子酸的工业化应用还没有被报道。

没食子酸作为一种重要的精细化学品，广泛应用在食品、化工、医药等领域。目前工业化制备没食子酸方法(酸法和碱法)，虽然具有工艺成熟等优点，但制备过程也会产生大量的废水和废盐，带来严重的环境污染(中国专利文献CN106242966 B和CN108003012A)。随着环保监管的加强，化学法制备没食子酸的工艺已不适应发展的需求。因此，近年来，国内外相继开展了单宁酶法的研究，有文献报道，利用微生物发酵法制备没食子酸，但这种方法生产周期长，水解不完全。中国专利文献CN1083532A在此基础上进行了改进，通过先培养微生物，后加入原料来制备没食子酸，但此方法同样存在生产周期长、产品得率低的问题，而且操作复杂，不适合大规模生产，且无法与化学法相竞争(Lokeswari N,JayaRK.Optimization of Gallic Acid Production from Terminalia Chebula byAspergillus niger.Journal of Chemistry,2007,4(2):287-293.)。到目前为止，还没有直接利用单宁酶来制备没食子酸的工业化应用报道，其主要原因有三个方面：1)没有找到合适的可以高效水解塔拉单宁的酶和相应的序列；2)没有开发其对应的生产菌株且能够有效降低生产成本；3)没有开发相应的没食子酸制备工艺。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种新型单宁酶在高效制备没食子酸中的应用。

所述单宁酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:13或其成熟多肽具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性。

在优选的实施例中，所述单宁酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13所示多肽的成熟多肽，所述单宁酶来源于黑曲霉ATCC 13496，最适反应温度为65-75℃，最适反应pH为4.0-5.0。

所述单宁酶的多核苷酸序列包括：1)SEQ ID NO:5的多核苷酸序列；和/或，2)SEQID NO:5的cDNA序列；和/或，3)在非常严格条件下与1)或2)的多核苷酸序列或其全长互补链杂交的多核苷酸序列。本领域技术人员可以理解的是，因为遗传编码中熟知的简并性，所以编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可被设计并且利用常规技能制备，优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域中熟知的。

现有技术中已公开了数以万计的单宁酶编码序列，例如NCBI上公开了来源于不同菌株的单宁酶编码基因共18000多条，仅来源于黑曲霉Aspergillus nigerATCC 13496的单宁酶就有十几种，但是至今为止还未有研究发现性能优异、可适用于没食子酸大规模工业化生产的单宁酶品种。有文献报道了Aspergillus nigerATCC 13496能够产单宁酶(SharmaS,Bhat TK,Dawra RK.Isolations,purification and properties of tannase fromAspergillus niger van Tieghem.World Journal ofMicrobiology&Biotechnology,1999)，但该文献还公开了Aspergillus niger ATCC 13496来源的单宁酶是胞内酶，由于胞内酶的产量低，无法进行产业化应用，所以该文献给了本领域技术人员反向的教导，至今没有对Aspergillus nigerATCC 13496来源的单宁酶的进一步研究。发明人通过大量筛选验证实验，提供了一种Aspergillus nigerATCC 13496来源的单宁酶，其为胞外分泌的单宁酶(本发明中将其编号为Tan3)，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，该单宁酶的性质显著优于现有技术中的单宁酶。

所述单宁酶Tan3具有以下化学性质：

1)作用：作用于缩酚酸键而进行水解；

2)分子量：约80万Da(通过SDS-PAGE测定)；

3)温度稳定性：直到65℃稳定性依旧保持在90％以上(pH4.0、30分钟热处理)；

4)最适温度：约70℃；

5)最适pH：约4.0；

6)耐酸性：在pH2.5条件下，持续5小时，酶活性损失在2％以内(30℃)；

7)底物特异性：良好地作用于鞣酸，作用于没食子酸酯。

在本发明一个具体实施方式中，本发明利用黑曲霉CICC 2462及上述序列制备出酶活高(酶活可达到1560.0U/mL)、热稳定好的单宁酶，该单宁酶在较高的温度范围内仍能保持酶活较长时间，并且该单宁酶能够持续水解浓度高达30％的塔拉单宁，显示出了良好的底物耐受性。

本发明还提出了利用前述单宁酶来高效制备没食子酸的方法，具体包括如下步骤：

1)配制浓度为25％-35％(w/v)的单宁酸溶液，调节单宁酸溶液pH至4.0-5.0；

2)取步骤1)得到的单宁酸溶液添加到反应釜中，按照36-54U/g的底物添加量加入单宁酶，水解生成没食子酸。

在一个具体实施方式中，所述没食子酸的制备方法如下：

1)称取1-2质量份数塔拉粉原料置于原料浸提罐中，加3-5倍质量份数的纯净水充分搅拌溶解；

2)30-35℃下，搅拌浸提6-8小时，离心过滤，得到单宁酸浸提液；

3)单宁酸浸提液加热浓缩至单宁酸浓度至25％-35％(w/v)，浓缩液调pH至4.0-5.0；

4)取步骤3)中浓度为25％-35％(w/v)的单宁酸浸提液添加到反应釜中，按照36U/g-54U/g的底物添加量，加入本发明的单宁酶，水解生成没食子酸，水解全程控制反应温度在35℃-40℃。

在另一个具体实施方式中，所述没食子酸的制备方法如下：

1)称取2公斤塔拉粉原料置于原料浸提罐中，加10公斤的纯净水；

2)常温35℃下，搅拌浸提6小时，离心过滤，得到单宁酸浸提液约9L；

3)9L单宁酸浸提液浓缩至单宁酸浓度至30％；

4)取上述底物浓度约30％(w/v)的单宁酸浸提液浓缩液500ml至反应釜，调pH至4.0，加入单宁酶酶液，每克底物的酶液添加量是36U，水浴控制反应温度40℃，反应8个小时后，检测底物单宁酸减少量和产物没食子酸生成量，计算转化率。

本发明所述的单宁酶能在高达30％(w/v)浓度的单宁底物下持续水解单宁生成没食子酸，而且水解周期短，彻底水解仅需8小时，转化率高达99.5％，制备的没食子酸纯度为99％，使得利用该单宁酶可较好的应用于工业化量产没食子酸，而且相比于化学法制备没食子酸具有明显优势。

专利文献CN108003012A报道的化学法制备没食子酸，操作复杂，反应过程需要高温高压和大量的酸碱。本发明提出的利用前述单宁酶来高效制备没食子酸的方法，相比于上述方法而言，操作简单，反应不需要高温高压，而且不会大量用到酸碱，带来大量废水和废盐，严重污染环境。专利文献CN1083532A报道的微生物法制备没食子酸，操作复杂，反应周期长达35小时以上，转化率仅在73％左右，水解底物浓度仅在8％左右，不适合大规模生产，本发明提出的制备没食子酸的方法操作更加简单可控，水解底物浓度可以达到30％，转化率高达99.5％，周期仅8小时左右。综合以上来看，本发明提出的利用前述单宁酶来高效制备没食子酸的方法具有明显优势，可较好的应用于工业化量产没食子酸。

本发明还提出了一种制备单宁酶的方法，所述方法利用黑曲霉CICC 2462菌株表达单宁酶的氨基酸序列，所述单宁酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:13或其成熟多肽具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性；优选地，所述单宁酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13所示多肽的成熟多肽。利用黑曲霉CICC 2462菌株表达本发明的单宁酶，产物的酶活高，生产成本低，有利于工业化生产。

单宁酶(Tannase,E.C.3.1.1.20)：又称鞣酸酶。一种单宁酰基水解酶，该酶对带有两个苯酚基的酸，如鞣酸具有水解作用。该酶可由霉菌，如黑曲霉、米曲霉生产。优选地，单宁酶来自曲霉菌属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)；更优选地所述的单宁酶氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们被称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母密码或三字母密码，其中氨基酸序列以标准氨基至羧基末端取向(即，N→C)呈现。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生两种或更多种由相同多核苷酸表达的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。在本发明具体实例中，SEQ ID NO:5编码的蛋白预测为583个氨基酸，使用SignalP程序版本3.0(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10:1-6)，预测了19个残基的信号肽，预测的成熟蛋白含有564个氨基酸，具有61.8kDa的预测分子量和4.64的等电点。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。当以预设参数使用CLUSTALW算法比对时，具体序列具有与指定参考序列的氨基酸残基至少一定百分比相同的氨基酸残基。CLUSTALW算法的预设参数为：缺失计数为与参考序列相比不相同的残基。包括在任何末端发生的缺失。例如，缺失C末端的五个氨基酸残基的变体500个氨基酸残基多肽具有相对于亲本多肽的99％(495/500个相同残基×100)的序列一致性百分比，此类变体由语言“具有与亲本至少99％序列一致性的变体”涵盖。

非常严格条件：意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准Southern印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“约”指引用值的±10％。

本发明的有益效果包括：

1)本发明提供一种可以高效水解塔拉单宁的单宁酶，该单宁酶的酶学性质优越，在pH2.5条件下，持续5小时酶活性损失在2％以内(30℃)，能在高达30％(w/v)浓度的单宁底物下持续水解单宁生成没食子酸，且转化率大于99.0％，使得其可以应用于大规模工业化酶法制备没食子酸；

2)本发明提出了一种单宁酶的生产方法，本发明实施例的黑曲霉CICC 2462可以利用本发明的单宁酶序列制备出酶活高(酶活可达到1560.0U/mL)、热稳定好的单宁酶，在较高的温度范围内仍能保持酶活较长时间，并且该单宁酶对底物耐受性好，与直接利用天然生产菌株发酵相比，本方法制备工艺简单、稳定，生产效率高，生产成本较高，而且酶组分单一，有专利报道利用毕赤酵母来表达单宁酶，但在这个过程中需求持续补加大量的甲醇，甲醇有毒且不易分离，很显然，本发明制备单宁酶的方法可以避免这样的问题；

3)目前工业化制备没食子酸的方法(酸法和碱法)，虽然具有工艺成熟等优点，但制备过程也会产生大量的废水和废盐，带来严重的环境污染。有文献和专利报道利用微生物法来制备没食子酸，但此方法存在生产周期长、产品得率低的问题，而且操作复杂，不适合大规模生产，且无法与化学法相竞争，到目前为止，还没有直接利用单宁酶来制备没食子酸的工艺报道，本发明公开一种酶水解制备没食子酸的方法，可以在高达30％(w/v)浓度的单宁底物下持续水解单宁生成没食子酸，在生产周期和转化率上和化学法相当，而且操作简单，条件温和，对环境友好，非常适合大规模化生产应用。

附图说明

图1是本发明pGla-amds质粒图谱。

图2是本发明单宁酶重组黑曲霉表达菌株摇瓶培养发酵液SDS-PAGE。

图3是本发明不同来源单宁酶的最适温度测定。

图4是本发明不同来源单宁酶的最适pH测定。

图5是本发明单宁酶Tan3的温度稳定性。

图6是本发明单宁酶Tan3的耐酸性测试。

图7是重组单宁酶酶法水解单宁酸产没食子酸曲线。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

实施例1单宁酶表达质粒的构建

所述单宁酶表达质粒的构建方法包含以下几个部分：

1)将pUC57质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；

2)选择标记amdS表达盒，由GenScript公司合成，所述amdS表达盒的序列见SEQ IDNO:1；

3)含有黑曲霉糖化酶基因gla启动子和终止子的DNA片段，由GenScript公司合成，序列见SEQ ID NO:2；

4)单宁酶基因分别来源于黑曲霉Aspergillus niger CBS 513.88、黑曲霉Aspergillus niger An76、黑曲霉Aspergillus nigerATCC 13496、泡盛曲霉Aspergilluskawachii IFO 4308、黑曲霉Aspergillus nigerFJ0118、米曲霉Aspergillus oryzaeRIB40、烟曲霉AspergillusfumigatusAf293和红色青霉Penicillium rubens Wisconsin54-1255(核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3～10，氨基酸序列为SEQ ID NO:11-18)，分别将这些基因命名为tan1、tan2、tan3、tan4、tan5、tan6、tan7、tan8，并由GenScript公司合成这些基因。

首先分别用引物amdS-F与amdS-R、gla-F与gla-R通过PCR扩出带有重组臂的amdS表达盒和含有gla启动子和终止子的DNA片段，通过Gibson Master Mix Kit(E2611，NewEngland Biolabs)将上述线性化pUC57载体、amdS表达盒和gla启动子与终止子DNA片段进行重组得到pGla-amdS质粒，测序确认序列正确。该质粒可通过AflII和XhoI位点线性化后用于单宁酶基因的插入。

进一步地，单宁酶表达盒构建如下：用引物对tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、tan1F/tan1R、PCR扩出带有重组臂的tan1～tan8基因，再通过Gibson Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)分别将tan1～tan8基因与线性化的pGla-amdS质粒进行重组分别得到ptan1-amdS、ptan2-amdS、ptan3-amdS、ptan4-amdS、ptan5-amdS、ptan6-amdS、ptan7-amdS、ptan8-amdS共8个质粒，经测序确认序列。这些质粒可通过HindIII位点线性化后用于原生质体转化。

相关引物序列如下：

表1本发明实施例1中用到的引物

实施例2单宁酶表达盒的转化整合

采用原生质体转化法将本发明实施例1中的单宁酶表达盒导入黑曲霉CICC 2462菌株中(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC)，具体操作步骤如下：

(1)原生质体的制备：在营养丰富的TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％、酵母浸膏0.2％、蛋白胨0.5％、NaCl 0.2％、蔗糖3％，pH 5.8)中接种黑曲霉菌丝体，培养48h后采用Mira-cloth(Calbiochem公司)过滤收集菌丝体并用0.7M NaCl(pH 5.8)洗涤；待菌丝体滤干后转移至含纤维素酶(Sigma)1％、蜗牛酶(Sigma)1％和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液(pH 5.8)中，在30℃、65rpm酶解3h；然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm、4℃温和离心10min后，弃上清，将附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1MD-Sorbitol、50mM CaCl₂、10mM Tris，pH 7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。

(2)原生质体转化：将10μl(浓度为：1000ng/μl)用HindIII线性化得到的含单宁酶表达盒的DNA片段加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min，然后分3次共加入900μl PEG溶液，混匀后室温放置25min，然后在室温离心10min、3000rpm，弃上清，将附着于管壁上的原生质体重悬于1ml STC溶液中，与预先降温至45℃左右的乙酰胺培养基(蔗糖3％、KCl 0.05％、K₂HPO₄·3H₂O 0.1％、FeSO₄0.001％、MgSO₄0.0244％、乙酰胺0.06％、CsCl0.34％)混合并铺平板，待平板凝固后放入34℃培养箱中培养4-5天，将转化子挑至新的乙酰胺培养基平板中放入34℃培养箱中再培养4-5天，长出的转化子称为阳性转化子。

实施例3单宁酶重组表达菌株的摇瓶培养及酶活测定

1.单宁酶酶活力的测定

1)酶活性单位定义

在30℃、pH值为5.0的条件下，每分钟降解没食子酸丙酯(PG)溶液解释放1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

2)试剂

所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的二级水。

2.1 0.1mol/L磷酸氢二钠-0.05mol/L柠檬酸缓冲液

准确称取十二水合磷酸氢二钠73.56g，准确称取一水合柠檬酸20.45g，加入800ml水溶解，溶解后定容至2000ml，调节pH为5.0，4℃冷藏保存一个月。

2.2 0.5mol/l的KOH溶液

准确称取KOH 28.055g，加入800ml水溶解，溶解后定容至1000ml，室温储存。

2.3 0.667％(W/V)罗丹宁溶液(甲醇绕丹宁)

准确称取罗丹宁0.667g，加入80ml甲醇溶解，溶解后用甲醇定容至100ml，室温保存15天有效。

2.4没食子酸标准溶液，浓度为10mmol/l

称取无水没食子酸0.1701g，加磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，定容至100ml，4℃冷藏保存15天有效。

2.5没食子酸丙酯(PG)溶液，浓度为10mmol/L

称取没食子酸丙酯0.2122g，再加入80ml磷酸氢二钠-0.05mol/L柠檬酸缓冲液，磁力搅拌加热，直至完全溶解，冷却，并用缓冲液定容至100ml。使用前适当摇匀，注意是否有结晶。若有需要加热溶解后使用，4℃冷藏保存10天有效。

3)测定步骤

3.1没食子酸标准曲线绘制

用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸(0.1-0.05M)缓冲液配制不同浓度的没食子酸标准溶液，从40-240μmol/L配制9个不同浓度梯度。分别取0.5ml的没食子酸稀释后标准溶液与0.3ml甲醇绕丹宁溶液(0.667％W/V)混合，加入到所有试管中，30℃水浴5min，然后将4.2ml的KOH溶液加入至所有试管中，30℃保温10min。以缓冲液代替标准溶液作空白对照，于520nm处测定吸光值(A520)。以浓度(mmol/L)为横坐标，A520为纵坐标绘制标准曲线。

3.2试样溶液的制备

液体样品可以直接用缓冲液稀释至待测酶液中单宁酶活0.03-0.15U/ml之间。

3.3样品测定

1)取4支洁净的试管，1支为空白管、3支测试管。向各管中加入0.25ml PG溶液30℃水浴5-10min，然后向测定管中间隔15s加入0.25ml待测酶液，30℃水浴下反应5min；

2)向所有试管中以间隔15s加入0.3ml甲醇绕丹宁溶液(0.667％，W/V)，保温5min；

3)向所有试管中加入4.2ml KOH溶液(0.5M)，向空白管中加入0.25ml酶液，在30℃条件下放置10min后(以最后一个样品加入KOH溶液计时)，以空白管归零，于520nm处测定各管溶液吸光值。

试样酶活的计算：

XD＝(△A520-b)×0.5×n/0.25/t/k

XD—试样稀释液中单宁酶的活力，U/ml；

△A520—酶反应液的吸光度-酶空白样的吸光度；

K—标准曲线的斜率；

b—标准曲线的截距；

1/0.25—换算成1ml酶液；

t—酶解反应时间，5min；

0.5—0.5ml酶液

n—试样的稀释倍数。

单宁酶黑曲霉重组表达菌株的酶活测定及蛋白电泳分析：

将本发明实施例2中单宁酶黑曲霉重组表达菌株阳性转化子分别接种至50ml YPM培养基(酵母提取物0.2％，蛋白胨0.2％，麦芽糖2％)的摇瓶中，34℃、220rpm摇床培养6天，离心收集发酵液上清，对获得的样品按照上述单宁酶活性测定法进行活性测定，结果示于下表2中。结果显示不同来源的单宁酶酶活性差异显著。发酵液处理后的样品进行蛋白电泳(SDS-PAGE)检测，结果示于图2中，不同来源的单宁酶分子量大小均在80kDa附近。

表2不同来源单宁酶重组表达菌株的酶活测定

菌株	序列来源	酶活U/ml
			Ptan1-amdS	AspergillusnigerCBS513.88(SEQ ID NO:3)	1342
Ptan2-amdS	AspergillusnigerAn76(SEQ ID NO:4)	50
			Ptan3-amdS	AspergillusnigerATCC13496(SEQ ID NO:5)	1560
Ptan4-amdS	AspergilluskawachiiIFO4308(SEQ ID NO:6)	1804
			Ptan5-amdS	AspergillusnigerFJ0118(SEQ ID NO:7)	239
Ptan6-amdS	AspergillusoryzaeRIB40(SEQ ID NO:8)	3099
			Ptan7-amdS	AspergillusfumigatusAf293(SEQ ID NO:9)	348
Ptan8-amdS	PenicilliumrubensWisconsin54-1255(SEQ ID NO:10)	37
			CICC2462(对照)		0

实施例4不同来源单宁酶酶学性质测定

1)最适反应温度

按照上述单宁酶活性测定法，使反应温度在20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃进行反应。用以显示最高活性的温度的值作为100％的相对活性来表示各测定结果(图3)。结果分析显示Tan1、Tan3、Tan4和Tan6最适反应温度在70℃附近，而Tan2、Tan5和Tan7最适反应温度在60℃附近，Tan8最适反应温度在50℃附近。

2)最适反应pH

按照上述单宁酶活性测定法，使用10mM没食子酸丙酯作为底物，在各缓冲液(磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH2.5、3.0、4.0、5.0、磷酸缓冲液pH6.0、7.0、8.0)中，30℃、5分钟的反应条件下进行测定。用以显示出最大活性值的pH的值作为100％的相对活性来表示各测定结果(图4)。结果分析显示Tan1最适反应pH在7.0附近，Tan2和Tan4最适反应pH在6.0附近，Tan5、Tan6、Tan7和Tan8最适反应pH在5.0附近，而Tan3最适反应pH在4.0附近。

实施例5不同来源单宁酶对单宁酸的水解反应

使用10％的单宁酸作为底物。分别取500ml 10％的单宁酸溶液添加到反应釜中，分别向反应釜中加900U的单宁酶Tan1、Tan2、Tan3、Tan4、Tan5、Tan6、Tan7和Tan8。所有反应仅控制初始pH为4.0，反应过程中不控制pH，所有反应过程中控制温度在40℃左右。每隔2小时取样检测反应液中单宁酸的减少量，反应18小时后停止反应。根据单宁酸的减少量来计算转化率，根据转化率来判断不同来源单宁酶对单宁酸的水解程度，结果见表3。根据结果可以看出，不同来源单宁酶对单宁酸的水解活性差异显著。Tan3对单宁酸的水解活性最高，在不控制反应过程中pH的情况下，转化率可以到达98.5％。根据Tan3对单宁酸的水解反应可以看出，此反应过程不会用到大量的酸碱，反应条件温和，而且转化率可以到达90％以上。由此，Tan3非常适合利用酶水解法来制备没食子酸。

表3不同来源单宁酶对单宁酸的水解反应

实施例3中，酶活测定用的底物是没食子酸丙酯，是化学合成的简单小分子化合物；水解反应采用底物是单宁酸，是天然复杂的大分子化合物。不同酶对不同底物的亲和力是不一样的，所以造成了酶活性差别。实施例3中的部分酶酶活比Tan3高，是针对于没食子酸丙酯底物而言，说明这些酶对没食子酸丙酯的亲和力高于Tan3；而本实施例中，水解反应采用的是单宁酸，Tan3的水解率明显高于其他酶，说明Tan3对单宁酸的亲和力明显高于其他酶。

实施例6单宁酶Tan3的酶学性质测定

1)温度稳定性

50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)中，30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃的各温度下，酶热处理30分钟后，用上述单宁酶活性测定法测定残留活性。用未进行热处理的活性作为100％的残留活性表示各测定结果(图5)。65℃、30分钟的热处理下，具有90％以上的残留活性，直至65℃都稳定。

2)耐酸性测试

在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH2.5条件下，30℃分别处理1、2、3、4、5小时后，用0.2M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)稀释5倍，用上述单宁酶活性测定法测定活性。用以出现最大活性值的pH值作为100％的相对活性来表示各测定结果(图6)。根据结果可知在pH2.5条件下，持续5小时，酶活性损失在2％以内(30℃)，这表明单宁酶Tan3在酸性条件下非常稳定。利用单宁酶水解单宁酸来制备没食子酸正是在酸性条件下进行的，而且随着没食子酸的生成，反应pH会逐渐下降然后趋于稳定(没食子酸逐渐饱和)，单宁酶Tan3的耐酸性能充分说明了本发明的酶Tan3非常适合酶法制备没食子酸。

3)金属离子和抑制剂的影响

50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)中，分别加入20mM的各种金属离子和EDTA，30℃下30分钟处理后，用上述单宁酶活性测定法测定活性。其结果示于表4。以不添加时的活性作为100％的相对活性表示各测定结果。根据结果可以看出单宁酶Tan3不受金属离子和EDTA的抑制。

表4金属离子和抑制剂对Tan3的影响

实施例7利用不同来源单宁酶制备没食子酸

1)称取2公斤塔拉粉原料置于原料浸提罐中，加入10L纯净水；

3)9L单宁酸浸提液加热浓缩至单宁酸浓度至30％(w/v)，浓缩液调pH至4.0。单宁酸含量和纯度采用HPLC方法检测：色谱柱：C18(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：25℃；流动相：乙腈/水＝2：98(水中含0.065％三氟乙酸乙腈中含0.05％三氟乙酸)；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：278nm；没食子酸含量和纯度采用HPLC方法检测：色谱柱：C18(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：25℃；流动相：乙腈/水＝2：98(水中含0.065％三氟乙酸乙腈中含0.05％三氟乙酸)；流速：0.8ml/min；进样量：10μl；检测波长：274nm；

4)分别取上述底物浓度为30％(w/v)的单宁酸浸提液浓缩液500ml添加到反应釜中，按照36U/g底物的添加量，分别向反应釜中加5400U的单宁酶Tan3、Tan5、Tan7、Tan8。反应过程中不控制pH，控制温度在40℃左右。每隔2小时取样检测反应液中单宁酸的减少量，根据单宁酸的减少量来计算转化率，反应结束后检测样品没食子酸的含量，根据没食子酸的生成量和单宁酸的减少量来确定最终转化率，结果见图7。

结果表明单宁酶Tan5、Tan7和Tan8对塔拉单宁的水解效果非常差，转化率最高仅30％左右，而单宁酶Tan3在同等条件下能在高达30％(w/v)浓度的单宁底物下持续水解塔拉单宁生成没食子酸，而且水解周期短，水解彻底仅需8小时，转化率高达99.5％，水解后的样品经活性炭脱色和真空干燥处理，检测没食子酸纯度为99％，使得利用该单宁酶可较好的应用于工业化量产没食子酸，而且相比于化学法制备没食子酸具有明显优势。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

<110> 南京百斯杰生物工程有限公司

<120> 一种单宁酶在制备没食子酸中的应用

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2724

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctagatctac gccaggaccg agcaagccca gatgagaacc gacgcagatt tccttggcac 60

ctgttgcttc agctgaatcc tggcaatacg agatacctgc tttgaatatt ttgaatagct 120

cgcccgctgg agagcatcct gaatgcaagt aacaaccgta gaggctgaca cggcaggtgt 180

tgctagggag cgtcgtgttc tacaaggcca gacgtcttcg cggttgatat atatgtatgt 240

ttgactgcag gctgctcagc gacgacagtc aagttcgccc tcgctgcttg tgcaataatc 300

gcagtgggga agccacaccg tgactcccat ctttcagtaa agctctgttg gtgtttatca 360

gcaatacacg taatttaaac tcgttagcat ggggctgata gcttaattac cgtttaccag 420

tgccgcggtt ctgcagcttt ccttggcccg taaaattcgg cgaagccagc caatcaccag 480

ctaggcacca gctaaaccct ataattagtc tcttatcaac accatccgct cccccgggat 540

caatgaggag aatgaggggg atgcggggct aaagaagcct acataaccct catgccaact 600

cccagtttac actcgtcgag ccaacatcct gactataagc taacacagaa tgcctcaatc 660

ctgggaagaa ctggccgctg ataagcgcgc ccgcctcgca aaaaccatcc ctgatgaatg 720

gaaagtccag acgctgcctg cggaagacag cgttattgat ttcccaaaga aatcggggat 780

cctttcagag gccgaactga agatcacaga ggcctccgct gcagatcttg tgtccaagct 840

ggcggccgga gagttgacct cggtggaagt tacgctagca ttctgtaaac gggcagcaat 900

cgcccagcag ttagtagggt cccctctacc tctcagggag atgtaacaac gccaccttat 960

gggactatca agctgacgct ggcttctgtg cagacaaact gcgcccacga gttcttccct 1020

gacgccgctc tcgcgcaggc aagggaactc gatgaatact acgcaaagca caagagaccc 1080

gttggtccac tccatggcct ccccatctct ctcaaagacc agcttcgagt caaggtacac 1140

cgttgcccct aagtcgttag atgtcccttt ttgtcagcta acatatgcca ccagggctac 1200

gaaacatcaa tgggctacat ctcatggcta aacaagtacg acgaagggga ctcggttctg 1260

acaaccatgc tccgcaaagc cggtgccgtc ttctacgtca agacctctgt cccgcagacc 1320

ctgatggtct gcgagacagt caacaacatc atcgggcgca ccgtcaaccc acgcaacaag 1380

aactggtcgt gcggcggcag ttctggtggt gagggtgcga tcgttgggat tcgtggtggc 1440

gtcatcggtg taggaacgga tatcggtggc tcgattcgag tgccggccgc gttcaacttc 1500

ctgtacggtc taaggccgag tcatgggcgg ctgccgtatg caaagatggc gaacagcatg 1560

gagggtcagg agacggtgca cagcgttgtc gggccgatta cgcactctgt tgagggtgag 1620

tccttcgcct cttccttctt ttcctgctct ataccaggcc tccactgtcc tcctttcttg 1680

ctttttatac tatatacgag accggcagtc actgatgaag tatgttagac ctccgcctct 1740

tcaccaaatc cgtcctcggt caggagccat ggaaatacga ctccaaggtc atccccatgc 1800

cctggcgcca gtccgagtcg gacattattg cctccaagat caagaacggc gggctcaata 1860

tcggctacta caacttcgac ggcaatgtcc ttccacaccc tcctatcctg cgcggcgtgg 1920

aaaccaccgt cgccgcactc gccaaagccg gtcacaccgt gaccccgtgg acgccataca 1980

agcacgattt cggccacgat ctcatctccc atatctacgc ggctgacggc agcgccgacg 2040

taatgcgcga tatcagtgca tccggcgagc cggcgattcc aaatatcaaa gacctactga 2100

acccgaacat caaagctgtt aacatgaacg agctctggga cacgcatctc cagaagtgga 2160

attaccagat ggagtacctt gagaaatggc gggaggctga agaaaaggcc gggaaggaac 2220

tggacgccat catcgcgccg attacgccta ccgctgcggt acggcatgac cagttccggt 2280

actatgggta tgcctctgtg atcaacctgc tggatttcac gagcgtggtt gttccggtta 2340

cctttgcgga taagaacatc gataagaaga atgagagttt caaggcggtt agtgagcttg 2400

atgccctcgt gcaggaagag tatgatccgg aggcgtacca tggggcaccg gttgcagtgc 2460

aggttatcgg acggagactc agtgaagaga ggacgttggc gattgcagag gaagtgggga 2520

agttgctggg aaatgtggtg actccatagc taataagtgt cagatagcaa tttgcacaag 2580

aaatcaatac cagcaactgt aaataagcgc tgaagtgacc atgccatgct acgaaagagc 2640

agaaaaaaac ctgccgtaga accgaagaga tatgacacgc ttccatctct caaaggaaga 2700

atcccttcag ggttgcgttt ccag 2724

<210> 2

<211> 997

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gccattggcg gaggggtccg gacggtcagg aacttagcct tatgagatga atgatggacg 60

tgtctggcct cggaaaagga tatatgggga tcatgatagt actagccata ttaatgaagg 120

gcatatacca cgcgttggac ctgcgttata gcttcccgtt agttatagta ccatcgttat 180

accagccaat caagtcacca cgcacgaccg gggacggcga atccccggga attgaaagaa 240

attgcatccc aggccagtga ggccagcgat tggccacctc tccaaggcac agggccattc 300

tgcagcgctg gtggattcat cgcaatttcc cccggcccgg cccgacaccg ctataggctg 360

gttctcccac accatcggag attcgtcgcc taatgtctcg tccgttcaca agctgaagag 420

cttgaagtgg cgagatgtct ctgcaggaat tcaagctaga tgctaagcga tattgcatgg 480

caatatgtgt tgatgcatgt gcttcttcct tcagcttccc ctcgtgcaga tgaggtttgg 540

ctataaattg aagtggttgg tcggggttcc gtgaggggct gaagtgcttc ctccctttta 600

gacgcaactg agagcctgag cttcatcccc agcatcatta cacctcagca cttaagacta 660

gtacgcgtct cgagatctag agggtgactg acacctggcg gtagacaatc aatccatttc 720

gctatagtta aaggatgggg atgagggcaa ttggttatat gatcatgtat gtagtgggtg 780

tgcataatag tagtgaaatg gaagccaagt catgtgattg taatcgaccg acggaattga 840

ggatatccgg aaatacagac accgtgaaag ccatggtctt tccttcgtgt agaagaccag 900

acagacagtc cctgatttac ccttgcacaa agcactagaa aattagcatt ccatccttct 960

ctgcttgctc tgctgatatc actgtcattc aatgcat 997

<210> 3

<211> 1725

<212> DNA

<213> Aspergillus niger CBS 513.88

<400> 3

atgcgttcac ccgcctgggc tcccatagcc accacagcct ttgcggcatt ggcaaatgct 60

gcaactccct ccacgttggc agagctttgc actgattcca tcgtgaaggc agctctacca 120

ccatctgagt tcatccaagg cataacaatt gactcagact ccgtgacgac agaagtcgta 180

acaaacagca gtgtctccag cgagttctac cccagcgcca caatcaatta ttgcaatgtc 240

acattcgcct actcccacga tggcattgac ggtgaccaag tccttttgga aatctggctt 300

cctgcaccca cggatttcca aaaccgctgg ctctccactg gtggaggagg ttatgccatt 360

aactccggag accagtcgct gccgggaggc gtaatgtacg gtgctgcgtc aggtatgacg 420

gatggtggtt ttggaggatt ttcaaacaat gcggacacgg ctatgctgtt ggcaaatggc 480

acccttgact acgagacgct ttacatgttt gcatacaaag cgcatcggga gcttagtttg 540

attggaaaag ccttgacccg caatgtatac gggatgagcg acagcgataa gctgtatgca 600

tattatcaag gctgctctga aggaggccgt gaaggttgga gtcaagtgca gcgcttcggt 660

gatgaatggg atggagccat tattggcgct ccagctttcc gatggtcatt ccaacagacg 720

cagcatcttt attccaacgt cgtcgagaag acactggatt actacccacc cccctgtgag 780

ctggacaaga tcgtcaacga gaccatcgct gcctgtgatg ccatggacgg aaaggtagat 840

tgggtggttg cacggaccga tctctgcttg ctcgacttcg acattagtac catcgagggt 900

aagccctact cgtgcgctgc atcaaggggt acccctgcac agaatggcac ggtctccgcc 960

aagggtatcg aagtcgcaaa aaccatcatc aatggattgc atgattcgca gggtcgccgg 1020

gtctactttt cctaccagcc aacggccgcc ttcgatgacg ctgagacgca gtacaactcc 1080

acgacaggtc agtgggggct ggatatcgat cagctcggag gcgaatatat tgctctcttg 1140

gtagacaaga acggcactac actagacagc ctggatggtg tcacctatga taccctcaag 1200

gactggatga tctcgggcct gcaggaatac tacagcacct tgcagaccac ttggccggac 1260

ctcacgccct tccacgaagc aggaggcaaa gtcatccatt tccacggtga tgccgacttc 1320

agtattccca ccgccgcatc catccgctat tgggaatcag tacgcagcat catgtacccc 1380

aatcaagact ataactccag tgccgaggcg cttaacgagt ggtaccgtct gtacactgtc 1440

ccaggagcgg gtcattgtgc gaccaacgat gctatgccca acggcccctt cccacagacg 1500

aacatggctg tgatgatcga ctgggtggag aatggagtag tacctacaac gctcaatgcg 1560

accgtgctcc agggagagaa cgaaggacag aaccaacagc tttgtgcctg gccactgcgg 1620

cccttgtgga ccaacaacgg aaccaccatg gagtgcgtgt acaaccagcg ttcgattgat 1680

agctggcatt atgacttgga tgcggttcct atgcctgtgt actaa 1725

<210> 4

<211> 1746

<212> DNA

<213> Aspergillus niger An76

<400> 4

atgcgcaagt ccactcgcgc agttgtcgct gctctggcag cagccactgc tcaggctagt 60

tccctgtccg atctctgcac tgtttccaat gttcagtccg cccttccttc caacggcacc 120

ctcctgggaa tcaacttgat cccctccgcc gtcactgcca acaccgtcac cgatgccagc 180

tctggcatgg gtagctccgg ctcctacgac tactgcaatg tcactgttac ctacacccac 240

accgggaagg gtgacaaggt tgtcgtgaag tacgccctgc ccgctccttc cgacttcaag 300

aatcgtttct acgttgccgg tggtggtggt ttctccctgt ccagcgatgc tactggcggt 360

ctcgagtacg gtgctgcctc cggcgccacc gacgccggct acgacgcctt ctcctacagc 420

tatgatgaag tcgtcctcta cggcaacggc tcgatcaact gggatgctac ttacatgttc 480

tcctaccagg ctcttggtga aatgaccaag atcgccaagc ccctgacccg tggtttctac 540

ggtctctcca gcgacaagaa gatttacacc tactacgagg gctgttccga tggtggtcgt 600

gagggtatga gtcaggtcca gcgctgggga gatgaatatg acggtgtcat tgccggtgcc 660

cctgccttcc gctttgctca gcagcaggtc caccatgtct tccctgccac tattgaacac 720

accatggact actaccctcc cccttgcgaa cttgacaaga tcgtcaacgc taccattgaa 780

gcctgtgacc ctctcgacgg ccgtaccgat ggtgttgtct cccgtactga cctttgcatg 840

ctgaacttca acctcacctc catcattggc gagtcctact actgcgctga acagaactac 900

acctccctgg gctttggctt cagcaagcgt gctgaaggca gcactactag ctaccagccc 960

gcccagaacg gcagcgtcac cgctgagggt gttgctctcg cccaggccat ctacgacggt 1020

cttcacgact ctaacggcaa gcgtgcctac ctctcgtggc agatcgccgc tgagctgtcc 1080

gatggtgaca ccgagtacga ctccaccact gactcctgga ctctgagcat cccctccacc 1140

ggtggcgagt acgtgaccaa gttcgtgcag ctcctcaaca tcgataacct ggagaacctt 1200

gacaacgtca cctacgacac cctggttgac tggatgaaca tcggtatgat tcgctacatt 1260

gacagtctcc agaccaccgt catcgacctc accaccttca aggagtccgg tggcaagatg 1320

atccactacc acggtgaatc cgaccccagt atccccaccg cctcgtccgt ccactactgg 1380

caggctgtcc gtcaggccat gtaccccaac accacctaca cccagtccct gcaggatatg 1440

tccaactggt accagctcta cctcgtcccc ggcgctgctc actgcggtac caactccctc 1500

cagcctggtc cttaccccga ggacaacatg gagatcatga tcgactgggt tgaaaacggc 1560

aacaagcctt cccgcctcaa cgccaccgtc tcctccggta cctatgctgg tgagacccag 1620

atgctttgcc aatggccttc tcgtcctctc tggaacagca actccagctt ctcttgtgtt 1680

cacgactcca agtcccttgc tacttgggac tacacttttg atgctttcaa gatgcccgtt 1740

ttctaa 1746

<210> 5

<211> 1752

<212> DNA

<213> Aspergillus niger ATCC 13496

<400> 5

atgagaaccg ccctcggggt cctggccggg gccacgacca ttgctctatc caaggcagcc 60

agtctggcgg atgtctgtac taccagccac gccaagtcgt ccttgcctag cagcgatgag 120

attgaaggtc tcgagatcga cacttcatcc atcaccgctg gtgctgtcta caatgcttcc 180

acatcgggta gctacttctt cccggctgct tcctacagct actgcaacgt gaccctctcg 240

tacactcggc ctggtcttga tacccccttc ctgttggagc tctggttgcc cgctcccgag 300

gactaccaaa accggtggct gtccacaggt ggtggtggct ttgccatcaa ctctggatcc 360

agctccctgc cgggtggtgt gatgtatgga gctgcagcag gtatcacgga tggtggcttc 420

ggaggcttcg acacacagtt cgacgctgtc ttcctcgaag ccaacggtac catcaactac 480

gaggcgttgt attcatttgg ctacctcgct catcacgagc tcactgtcgt cggcaaagcc 540

ttcagccgca acttctacag cgtcggtgac tccaagatct acgcctacta ccaaggttgt 600

tcggaaggtg gccgcgaagg ttggagccag gtgcaacgct atgcagacca gtgggatgga 660

gccgttatcg gtgctcctgc cttccggtac ggtcaacaac aagtgaacca cctgtacccc 720

gacgtggttg agcacactct gggctactac cctcccactt gcgaattgga aaagatcgtc 780

aacttgacca ttgcggcgtg cgatgccctg gacggccgtg tcgatggcgt ggtggctcgt 840

accgacctgt gcaagctgca cttcaacgtg aactcgaccg tcggtgcccc ttactcctgc 900

ccggcctcta cctccacgac agtcctcaag aagcgcactt cgatgtctaa caccaccccc 960

gcccagaacg gcaccgtttc tgctatcggt gccgccgcag ccagcaagat gctcgacggc 1020

ctgcgcaccc tggacggccg ccgtgcttac atctggtacc agccctcctc cacctttgac 1080

gatgcccaga cccagtacaa ctacgacacc ggaaaatggg agttggatat tacctccctg 1140

ggcggtgaat gggtcgcccg cttcctggag ctgcgcgatg cagacaatct ctccagcctg 1200

gacaacgtca cgtacgatac cctgaaggag tggatggagc tcggctggca gcgctacgag 1260

gacagcctcc agaccacctg gcccgacttg accccgttcc aatcagccgg tggaaagatt 1320

attcacgtgc atggcgagtc cgaccccagt atcccgaccg gttcgtccgt gcattatcac 1380

gagtccgtcc gccagatcat gtaccccggc atgtcgttca acgagagctc cgaggctctg 1440

aatgaatgga accgattgta tctgatccct ggtgcggcgc actgcgcgtc tagcactacc 1500

cagcctaatg ggccgttccc gcagactacc ctcgagactc tgatccaatg ggtcgaggga 1560

ggcgtcttcc cgacccgctt gaatgccacc gtgctggctg gtgagcgtga gggtgagcag 1620

cagcagttgt gcgcgtggcc cttgcgtccc ctgtggaaga acaacggcac cgtcatggac 1680

tgcgtgtttg atgaggcgtc gtataagacc tgggtttatg attttgatgc gtacaagctg 1740

cccctgtact ag 1752

<210> 6

<211> 1725

<212> DNA

<213> Aspergillus kawachii IFO 4308

<400> 6

atgcgctccc ccgcctgggc ctccatcgcc atcaccgcct tcgccgccct ggccaacgcc 60

ggtaccccct ccaccctggc cgagctgtgc accgactcca tcgtcaaggc cgccctgccc 120

ccctccgagt tcatcaaggg tatcaccatc gactccgact ccgtcaccac cgaggtcgtc 180

accaactcct ccttctcctc cgagttctac ccctccgcca ccatcgacta ctgcaacgtc 240

accttcgcct actcccacga cggtatcgac ggtgaccagg tcctgctgga gatctggctg 300

cccgccccca ccaacttcaa gaaccgctgg ctgtccaccg gtggtggtgg ttacgccatc 360

aactccggtg accagtccct gcccggtggt gtcatgtacg gtgccgcctc cggtatgacc 420

gacggtggtt tcggtggttt ctccaacaac gccgacaccg ccatgctgct ggccaacggt 480

accctgaact acgagaccct gtacatgttc gcctacaagg cccaccgcga gctgtccctg 540

ctgggtaagg ccctgacccg caacgtctac ggtatgtccg actccgacaa gctgtacgcc 600

tactaccagg gttgctccga gggtggtcgc gagggttggt cccaggtcca gcgcttcggt 660

gacgagtggg acggtgccat catcggtgcc cccgccttcc gctggtcctt ccagcagacc 720

cagcacctgt actccaacat cgtcgagaag accctggact actacccccc cccctgcgag 780

ctggacaaga tcgtcaacga gaccatcgcc gcctgcgacg ccatggacgg taaggtcgac 840

tgggtcgtcg cccgcaccga cctgtgcctg ctggacttcg acatctccac catcgagggt 900

aagccctact cctgcgccgc ctcccgcggt acccccgccc agaacggtac cgtctccgcc 960

aagggtatcg aggtcgccaa gaccatcatc aacggtctgc acgactccca gggtcgccgc 1020

gtctacttct cctaccagcc caccgccgcc ttcgacgacg ccgagaccca gtacaactcc 1080

accaccggtc agtggggtct ggacatcgac cagctgggtg gtgagtacat cgccctgctg 1140

gtcgacaaga acggtaccac cctggactcc ctggacggta tcacctacga caccctgaag 1200

gactggatga tctccggtct gcaggagtac tactccaccc tgcagaccac ctggcccgac 1260

ctgaccccct tccacaacgc cggtggtaag gtcatccact tccacggtga cgccgacttc 1320

tccatcccca ccgccgcctc catccgctac tgggagtccg tccgctccat catgtacccc 1380

aacaaggact acaactcctc cgccgaggcc ctgaacgagt ggtaccgcct gtacaccgtc 1440

cccggtgccg gtcactgcgc caccaacgac gccatgccca acggtccctt cccccagacc 1500

aacatggccg tcatgatcga ctgggtcgag aacggtgtcg tccccaccac cctgaacgcc 1560

accgtcctgc agggtgagaa cgagggtcag aaccagcagc tgtgcgcctg gcccctgcgc 1620

cccctgtgga ccaacaacgg taccaccatg gagtgcgtct acaaccagcg ctccatcgac 1680

tcctggcact acgacctgga cgccgtcccc atgcccgtct actaa 1725

<210> 7

<211> 1713

<212> DNA

<213> Aspergillus niger FJ0118

<400> 7

atgtccaagt tcctcctttg gaccgtctcc gcggcggccc tcgcgcgcgc cgcgactctc 60

gagcaggtct gtaccgttgc tcacgcaaag gccgccgtgc ccgcatccgg cctggtgcag 120

ggtgtggtca ccaacccttc cagtgtcact gcggttcccg tctacaatga atccacctct 180

ggatccgact actacccggc cggaacctat gattactgca atatcaccat gacttattct 240

catgctggca aggacgacag cgtcctgctg caattctgga tgcccactcc cgatgacttc 300

cagaaccgct gggtgtctac cggtggcttt ggctttgcca tcaacgttgc ctccaacgtg 360

cctgctggtc ttccctacgg tgccgtcgcc ggccggaccg acggtggctt tggcagcttc 420

gacactcagt tctcctctgt gtaccccctg gtgaatggta ccgccaacta cgatgccctc 480

tacatgttcg gctaccaggc ccaccacgag atgtcctcca tcggcaaggc gttcaccaag 540

aacttctaca gcatgtctga caagctctac gcctactacc agggttgctc cgagggtggt 600

cgtgagggct ggagtcaggt gcagcgcttc cccgaggagt gggatggtgc cgtcattggt 660

gctcctgcca tccgctatgg ccagcagcag gtcaaccacc tggtgcccca ggtcgtggaa 720

cagaccctcg attactaccc tgaaaactgc gagttctccg agatggtgac tctgattatc 780

gatgcctgtg atgaactcga tggccgtaag gatggcgtca tcggccgcac cgatctgtgc 840

cagctcaact tcgacctcaa gtccaccatc ggtaagcctt acgcctgcaa cgccaccacc 900

agcatgggtg tgaccacccc ggcccagaac ggcaccatca ctgcggaggg tgtgcgcgtc 960

gctcagacca tcctggacgg attgaaggac tctcagggtc gtcaggccta cttctggtac 1020

cgcattggct cggagttcag cgatgcagag actacctacg actcgaccac cggcacctac 1080

ggtatcgaca tctccgagct gggtggtgag tgggtgactc acggactgca gctgctggac 1140

ctcgacaacc tctccactct ggacaacgtc acctacgaca ccctgcgtga ctggatgctc 1200

gagggtctcc agcgctacga ggatgtcctg cagaccacct ggcccgacct gtcccgcttc 1260

caggctgcag gtggcaaggt catccactac cacggtgaat cggacaacag catccctccc 1320

gcgtcttcgg tgcgctactt cgagtccgtc cgcgacacca tgttccccaa caagacctac 1380

aacgcctcgg ttgaagccct gaacgagttc taccgtctct acctggttcc cggtgcctcc 1440

cactgcaaca ccaactctct gcagcccaac ggaccctacc cccagaactc ccttggcgac 1500

ctgatgaatt gggtcgagaa gggcatcgag ccggtgactc tgaacggcac ggtgctgagc 1560

ggcgatctcg agggagagga gcagaagatc tgctcgtggc ctctgcgtcc tttgtggaag 1620

aacaacggca cggagatgga gtgcgtgtac gaccagaagt cgattgacac atggttgtat 1680

gatctggatg cgtatgacat tccgatctat tag 1713

<210> 8

<211> 1722

<212> DNA

<213> Aspergillus oryzae RIB40

<400> 8

atgcgctccg ccctgaacat cctggccggt gccgccaccc tgaccgtcgc ccaggccgcc 60

tccctgtccg acgtctgcac caactcccac gtcaagtccg ccctgccctc catcgacctg 120

atcaacggtc tggtcatcga cccctcctcc atcaccacca acgccgtcta caacgcctcc 180

acccccggtg gtgactactt ccccgccgcc tccgcctacg acttctgcaa cgtcaccctg 240

acctacgccc accccggtcg caacgaccgc gtccacctga agctgtggat gcccgccccc 300

gaccagttcc agaaccgctg gctgtccacc ggtggtggtg gtttcgccat caaccacgac 360

gagcagcagc tgcccggtgg tgtccagtac ggtgccgccg ccggtatcac cgacggtggt 420

ttcggttcct tctacaccca gttcgaccag gtcttcctgc tggccaacgg taccatcaac 480

tacgaggccc tgtacatgtt cggttaccag gcccaccacg agctgtccgt catcggtaag 540

gccctgacca agaacttcta cggtaccggt gacgccaagc tgtacgccta ctggcagggt 600

tgctccgagg gtggtcgcga gggtttctcc caggtccagc gcttccagga gttcgacggt 660

gccgtcatcg gtgcccccgc cctgcgctac ggtcagcagc aggccaacca cctgtacggt 720

aacctggtcg agcacaccct gaagtactac ccccccccct gcgagctgga gaagatcgtc 780

aacctgacca tcaccgcctg cgaccgcctg gacggtcgct ccgacggtgt cgtctcccgc 840

accgacctgt gcaagctgca cttcaacatc aactccacca tcggtgcccc ctactcctgc 900

cccgcctcca ccaccaccac cggtaccacc cccgcccaga acggtaccgt ctccgccctg 960

ggtgccgccg ccgcccgcaa gatgctggac ggtctgcgca ccctggactc ccgccgcgcc 1020

tacatcttct accagccctc cgccaccttc gacgacgccc agaccaagta caaccccgag 1080

accaagcagt tcgagctgga ggtctccgcc tacgccgccg agtggatccc ccgcttcctg 1140

cagctgcaga actacaccct gtcctccctg gagaacgtca cctacgacac cctgaaggac 1200

tggatggagc tgggttggca gcgctacgag gacgtcctgc agaccacctg gcccgacctg 1260

acccccttcc agtccgccgg tggtaaggtc ctgcactacc acggtgagtc cgacccctcc 1320

atccccgccg gttcctccgt ccactaccac gagtccgtcc gcaagaccat gtaccccaac 1380

atgtccttca acgagtccaa ccaggccctg aacgagtgga accgcctgtt cctggtcccc 1440

ggtgccgccc actgcgcctc ctccaccgac cagcccaacg gtcccttccc ccaggccacc 1500

ctgaagaccc tgatcgagtg ggtcgagaac tccatcgtcc ccgagaccct gaacggtacc 1560

gtcctggacg gtgaccacaa gggtgagcag cagcagatct gcgcctggcc cctgcgcccc 1620

ctgtggaccg agaacggtac cgtcatgaac tgcgtctacg accaggcctc cctggacacc 1680

tgggactacg agttcgacgc ctaccgcatc cccctgtact aa 1722

<210> 9

<211> 1767

<212> DNA

<213> Aspergillus fumigatus Af293

<400> 9

atgcgcatct cctacggttc cgccgtcgcc gccctggccg ccgccgccaa cgccgcctcc 60

ctggccgacg tctgcaccat ctcccacgtc cagtccgtcc tgccctccaa cggtaccctg 120

ctgggtatca acgtcatccc ctccgccgtc accgcctccg ccgtctacaa ctccacctcc 180

tccggtggta tgggtggtat gggtggttcc aactccgcca actaccccta ctgcaacgtc 240

accgtcacct acacccaccc cggtaagggt gacaaggtcg tcgtcaagta cgccttcccc 300

cagccctccg acttcaagaa ccgcttctac gtcgccggtg gtggtggtta ctccctgtcc 360

tccgacgcca ccggtggtct ggagtacggt gccgcctccg gtgccaccga cgccggttac 420

gacgccttct cctactccta cgacgaggtc gtcctgtacg gtaacggttc catcaactgg 480

gacgccacct acatgttcgc ctaccaggcc ctgggtgaga tgaccaccct gggtaagacc 540

ctgacccgca acttctacgg tctgtcctcc gacgccaaga tctacaccta ctacgagggt 600

tgctccgacg gtggtcgcga gggtatgtcc caggtccagc gctacggtga cctgtacgac 660

ggtgccatca ccggtgcccc cgccttccgc tacgcccagc agcaggtcca ccacgtcttc 720

tcctccgtcg tcgagaagac cctggactac tacccccccc cctgcgagct ggccaagatc 780

gtcaacgcca ccatcgaggc ctgcgacccc ctggacggtc gcaccgacgg tgtcgtctcc 840

cgcaccgacc tgtgcaagct gcacttcgac ctgtccaaga tcatcggtga gccctactac 900

tgcgccgcca agacctccac ctccctgggt ttcggtttct ccaagcgcca ggccgccggt 960

tccaccacct cctaccagcc cgcccagaac ggtaccgtca ccaaggaggg tgtcgccgtc 1020

gccaaggcca tctacgacgg tctgcacaac acccagggtc agcgcgccta cctgtcctgg 1080

cagatcgcct ccgagttctc cgacgccacc accgagtgga acaacgacac cggttcctgg 1140

gagctgtcca tcccctccac cggtggtgag ttcgtcacca agttcgtcca gctgctggac 1200

ctggacaacc tgtccaccct ggacaacgtc acctacgaca ccctggtcga gtggatgaac 1260

accgccatgg tccgctacat ggactccctg cagaccaccg tccccgacct gaccaccttc 1320

aagtcctccg gtggtaagct gctgcactac cacggtgagt ccgacccctc catccccgcc 1380

gcctcctccg tccactactg gcagtccgtc cgctccatca tgtaccccgg tgtctccgcc 1440

gccaagtccc tgaaggagct gcaggagtgg taccagttct acctgatccc cggtgccgcc 1500

cactgcggtg ccaactccct gcagcccggt ccctaccccc agaacaacat ggacatcatg 1560

atcgactggg tcgagaacgg tgtccagccc tcccgcctga acaccaccgt ctcctccggt 1620

gactacgccg gtgagaccca gatgctgtgc cagtggccca cccgccccct gtggaaggac 1680

aactccacct tcgactgcgt caacgacgag aagtccatcg agtcctggac ctacaccttc 1740

cccgccttca aggtccccgt ctactaa 1767

<210> 10

<211> 1743

<212> DNA

<213> Penicillium rubens Wisconsin 54-1255

<400> 10

atgcgcctgt cctggggtgc ctccgccgcc gccctggccg cctccgcctc cgccgcctcc 60

ctggccgacg tctgcaccgt ctccaacgtc cagtccgccc tgccctccaa cggtaccctg 120

ctgggtatca acatgatccc ctccaccgtc accgcctccc ccgtctacaa cgcctccgcc 180

ggtatgggtt ccaccgagac ctacacctac tgcaacgtca ccgtcaccta cgagcacacc 240

ggtaagggtg actccgtcgt catcaagtac gccttcccca agccctccga cttcaagaag 300

cgcttctacg tcgccggtgg tggtggtttc tccctgtcct ccgacgccac cggtggtctg 360

gagtacggtg ccgtcggtgg tgccacctcc gccggttacg acgccttcaa caactcctac 420

gacgaggtcg tcctgtacgg taacggtacc atcaactggg acgccaccta catgttcgcc 480

taccaggccc tgggtgagat gaccaagatc ggtaaggtcc tgaccaaggg tttctacggt 540

atggcctcct ccgccaaggt ctacacctac tacgagggtt gctccgacgg tggtcgcgag 600

ggtatgtccc agatccagcg ctacggtgag gagtacgacg gtgccatcac cggtgccccc 660

gccttccgct tcgcccagca gcaggtccac cacgtcttct ccgccgccgc cgagcagacc 720

ctggactact accccccccc ctgcgagctg gccaagatcg tcaacgccac catcgccgcc 780

tgcgaccccc tggacggtcg caccgacggt gtcatctccc gcaccgacct gtgcaagctg 840

aagttcaacc tgacctccat catcggtgag gagtactact gcgccgccgc cacctccacc 900

tccctgggtt tcggtttctc caagcgcgcc gacggttcct ccacctccac cacccccgag 960

cagtccggta aggtcaccgc caagggtgtc caggtcgccc aggccatcta cgacggtctg 1020

cacaactcca agggtgagcg cgcctacctg tcctggcagg tcggttccga gctgtccgac 1080

ggtgacacca cctggaacaa cgccacctcc aagtgggaga tgtccatccc ctccaccggt 1140

ggtgagtacg tcaccaagtt catccagctg ctggacctgg acaacctgtc cgacctggac 1200

aacgtcacct acgacaccct ggtcgactgg atgaacaccg gtatggtccg ctacatggac 1260

tccctgcaga ccaccctgcc cgacctgacc cccttccagt cctccggtgg taagctgctg 1320

cactaccacg gtgagtccga cccctccatc ccctccgcct cctccgtcca ctactggcag 1380

tccgtccgct ccatcatgta cccccacctg tcctcccagg actccctgaa ggagctggcc 1440

gactggtacc agttctacct ggtccccggt gccgcccact gcggtaccaa caagctgcag 1500

cccggtccct accccgagaa caacatgcag accatgatcg actgggtcga gaacgacgtc 1560

aagccctccc gcctgaacgc caccgtctcc tccggtacct acgagggtga gacccagatg 1620

ctgtgccagt ggcccacccg ccccctgtgg aagtccaact ccaccttcca gtgcgtcgac 1680

gacaaggcct ccatcgagtc ctggacctac tccttccccg ccttcaaggt ccccgtctac 1740

taa 1743

<210> 11

<211> 574

<212> PRT

<213> Aspergillus niger CBS 513.88

<400> 11

Met Arg Ser Pro Ala Trp Ala Pro Ile Ala Thr Thr Ala Phe Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Asn Ala Ala Thr Pro Ser Thr Leu Ala Glu Leu Cys Thr Asp

20 25 30

Ser Ile Val Lys Ala Ala Leu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Gln Gly Ile

35 40 45

Thr Ile Asp Ser Asp Ser Val Thr Thr Glu Val Val Thr Asn Ser Ser

50 55 60

Val Ser Ser Glu Phe Tyr Pro Ser Ala Thr Ile Asn Tyr Cys Asn Val

65 70 75 80

Thr Phe Ala Tyr Ser His Asp Gly Ile Asp Gly Asp Gln Val Leu Leu

85 90 95

Glu Ile Trp Leu Pro Ala Pro Thr Asp Phe Gln Asn Arg Trp Leu Ser

100 105 110

Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Asp Gln Ser Leu Pro

115 120 125

Gly Gly Val Met Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Met Thr Asp Gly Gly Phe

130 135 140

Gly Gly Phe Ser Asn Asn Ala Asp Thr Ala Met Leu Leu Ala Asn Gly

145 150 155 160

Thr Leu Asp Tyr Glu Thr Leu Tyr Met Phe Ala Tyr Lys Ala His Arg

165 170 175

Glu Leu Ser Leu Ile Gly Lys Ala Leu Thr Arg Asn Val Tyr Gly Met

180 185 190

Ser Asp Ser Asp Lys Leu Tyr Ala Tyr Tyr Gln Gly Cys Ser Glu Gly

195 200 205

Gly Arg Glu Gly Trp Ser Gln Val Gln Arg Phe Gly Asp Glu Trp Asp

210 215 220

Gly Ala Ile Ile Gly Ala Pro Ala Phe Arg Trp Ser Phe Gln Gln Thr

225 230 235 240

Gln His Leu Tyr Ser Asn Val Val Glu Lys Thr Leu Asp Tyr Tyr Pro

245 250 255

Pro Pro Cys Glu Leu Asp Lys Ile Val Asn Glu Thr Ile Ala Ala Cys

260 265 270

Asp Ala Met Asp Gly Lys Val Asp Trp Val Val Ala Arg Thr Asp Leu

275 280 285

Cys Leu Leu Asp Phe Asp Ile Ser Thr Ile Glu Gly Lys Pro Tyr Ser

290 295 300

Cys Ala Ala Ser Arg Gly Thr Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Ser Ala

305 310 315 320

Lys Gly Ile Glu Val Ala Lys Thr Ile Ile Asn Gly Leu His Asp Ser

325 330 335

Gln Gly Arg Arg Val Tyr Phe Ser Tyr Gln Pro Thr Ala Ala Phe Asp

340 345 350

Asp Ala Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Thr Gly Gln Trp Gly Leu Asp

355 360 365

Ile Asp Gln Leu Gly Gly Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Val Asp Lys Asn

370 375 380

Gly Thr Thr Leu Asp Ser Leu Asp Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Lys

385 390 395 400

Asp Trp Met Ile Ser Gly Leu Gln Glu Tyr Tyr Ser Thr Leu Gln Thr

405 410 415

Thr Trp Pro Asp Leu Thr Pro Phe His Glu Ala Gly Gly Lys Val Ile

420 425 430

His Phe His Gly Asp Ala Asp Phe Ser Ile Pro Thr Ala Ala Ser Ile

435 440 445

Arg Tyr Trp Glu Ser Val Arg Ser Ile Met Tyr Pro Asn Gln Asp Tyr

450 455 460

Asn Ser Ser Ala Glu Ala Leu Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Tyr Thr Val

465 470 475 480

Pro Gly Ala Gly His Cys Ala Thr Asn Asp Ala Met Pro Asn Gly Pro

485 490 495

Phe Pro Gln Thr Asn Met Ala Val Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly

500 505 510

Val Val Pro Thr Thr Leu Asn Ala Thr Val Leu Gln Gly Glu Asn Glu

515 520 525

Gly Gln Asn Gln Gln Leu Cys Ala Trp Pro Leu Arg Pro Leu Trp Thr

530 535 540

Asn Asn Gly Thr Thr Met Glu Cys Val Tyr Asn Gln Arg Ser Ile Asp

545 550 555 560

Ser Trp His Tyr Asp Leu Asp Ala Val Pro Met Pro Val Tyr

565 570

<210> 12

<211> 581

<212> PRT

<213> Aspergillus niger An76

<400> 12

Met Arg Lys Ser Thr Arg Ala Val Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ser Leu Ser Asp Leu Cys Thr Val Ser Asn Val Gln

20 25 30

Ser Ala Leu Pro Ser Asn Gly Thr Leu Leu Gly Ile Asn Leu Ile Pro

35 40 45

Ser Ala Val Thr Ala Asn Thr Val Thr Asp Ala Ser Ser Gly Met Gly

50 55 60

Ser Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Cys Asn Val Thr Val Thr Tyr Thr His

65 70 75 80

Thr Gly Lys Gly Asp Lys Val Val Val Lys Tyr Ala Leu Pro Ala Pro

85 90 95

Ser Asp Phe Lys Asn Arg Phe Tyr Val Ala Gly Gly Gly Gly Phe Ser

100 105 110

Leu Ser Ser Asp Ala Thr Gly Gly Leu Glu Tyr Gly Ala Ala Ser Gly

115 120 125

Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asp Ala Phe Ser Tyr Ser Tyr Asp Glu Val

130 135 140

Val Leu Tyr Gly Asn Gly Ser Ile Asn Trp Asp Ala Thr Tyr Met Phe

145 150 155 160

Ser Tyr Gln Ala Leu Gly Glu Met Thr Lys Ile Ala Lys Pro Leu Thr

165 170 175

Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Ser Ser Asp Lys Lys Ile Tyr Thr Tyr Tyr

180 185 190

Glu Gly Cys Ser Asp Gly Gly Arg Glu Gly Met Ser Gln Val Gln Arg

195 200 205

Trp Gly Asp Glu Tyr Asp Gly Val Ile Ala Gly Ala Pro Ala Phe Arg

210 215 220

Phe Ala Gln Gln Gln Val His His Val Phe Pro Ala Thr Ile Glu His

225 230 235 240

Thr Met Asp Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu Leu Asp Lys Ile Val Asn

245 250 255

Ala Thr Ile Glu Ala Cys Asp Pro Leu Asp Gly Arg Thr Asp Gly Val

260 265 270

Val Ser Arg Thr Asp Leu Cys Met Leu Asn Phe Asn Leu Thr Ser Ile

275 280 285

Ile Gly Glu Ser Tyr Tyr Cys Ala Glu Gln Asn Tyr Thr Ser Leu Gly

290 295 300

Phe Gly Phe Ser Lys Arg Ala Glu Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Gln Pro

305 310 315 320

Ala Gln Asn Gly Ser Val Thr Ala Glu Gly Val Ala Leu Ala Gln Ala

325 330 335

Ile Tyr Asp Gly Leu His Asp Ser Asn Gly Lys Arg Ala Tyr Leu Ser

340 345 350

Trp Gln Ile Ala Ala Glu Leu Ser Asp Gly Asp Thr Glu Tyr Asp Ser

355 360 365

Thr Thr Asp Ser Trp Thr Leu Ser Ile Pro Ser Thr Gly Gly Glu Tyr

370 375 380

Val Thr Lys Phe Val Gln Leu Leu Asn Ile Asp Asn Leu Glu Asn Leu

385 390 395 400

Asp Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Val Asp Trp Met Asn Ile Gly Met

405 410 415

Ile Arg Tyr Ile Asp Ser Leu Gln Thr Thr Val Ile Asp Leu Thr Thr

420 425 430

Phe Lys Glu Ser Gly Gly Lys Met Ile His Tyr His Gly Glu Ser Asp

435 440 445

Pro Ser Ile Pro Thr Ala Ser Ser Val His Tyr Trp Gln Ala Val Arg

450 455 460

Gln Ala Met Tyr Pro Asn Thr Thr Tyr Thr Gln Ser Leu Gln Asp Met

465 470 475 480

Ser Asn Trp Tyr Gln Leu Tyr Leu Val Pro Gly Ala Ala His Cys Gly

485 490 495

Thr Asn Ser Leu Gln Pro Gly Pro Tyr Pro Glu Asp Asn Met Glu Ile

500 505 510

Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly Asn Lys Pro Ser Arg Leu Asn Ala

515 520 525

Thr Val Ser Ser Gly Thr Tyr Ala Gly Glu Thr Gln Met Leu Cys Gln

530 535 540

Trp Pro Ser Arg Pro Leu Trp Asn Ser Asn Ser Ser Phe Ser Cys Val

545 550 555 560

His Asp Ser Lys Ser Leu Ala Thr Trp Asp Tyr Thr Phe Asp Ala Phe

565 570 575

Lys Met Pro Val Phe

580

<210> 13

<211> 583

<212> PRT

<213> Aspergillus niger ATCC 13496

<400> 13

Met Arg Thr Ala Leu Gly Val Leu Ala Gly Ala Thr Thr Ile Ala Leu

1 5 10 15

Ser Lys Ala Ala Ser Leu Ala Asp Val Cys Thr Thr Ser His Ala Lys

20 25 30

Ser Ser Leu Pro Ser Ser Asp Glu Ile Glu Gly Leu Glu Ile Asp Thr

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Ala Gly Ala Val Tyr Asn Ala Ser Thr Ser Gly Ser

50 55 60

Tyr Phe Phe Pro Ala Ala Ser Tyr Ser Tyr Cys Asn Val Thr Leu Ser

65 70 75 80

Tyr Thr Arg Pro Gly Leu Asp Thr Pro Phe Leu Leu Glu Leu Trp Leu

85 90 95

Pro Ala Pro Glu Asp Tyr Gln Asn Arg Trp Leu Ser Thr Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Phe Ala Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Gly Val Met

115 120 125

Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Gly Phe Gly Gly Phe Asp

130 135 140

Thr Gln Phe Asp Ala Val Phe Leu Glu Ala Asn Gly Thr Ile Asn Tyr

145 150 155 160

Glu Ala Leu Tyr Ser Phe Gly Tyr Leu Ala His His Glu Leu Thr Val

165 170 175

Val Gly Lys Ala Phe Ser Arg Asn Phe Tyr Ser Val Gly Asp Ser Lys

180 185 190

Ile Tyr Ala Tyr Tyr Gln Gly Cys Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly Trp

195 200 205

Ser Gln Val Gln Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Asp Gly Ala Val Ile Gly

210 215 220

Ala Pro Ala Phe Arg Tyr Gly Gln Gln Gln Val Asn His Leu Tyr Pro

225 230 235 240

Asp Val Val Glu His Thr Leu Gly Tyr Tyr Pro Pro Thr Cys Glu Leu

245 250 255

Glu Lys Ile Val Asn Leu Thr Ile Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gly

260 265 270

Arg Val Asp Gly Val Val Ala Arg Thr Asp Leu Cys Lys Leu His Phe

275 280 285

Asn Val Asn Ser Thr Val Gly Ala Pro Tyr Ser Cys Pro Ala Ser Thr

290 295 300

Ser Thr Thr Val Leu Lys Lys Arg Thr Ser Met Ser Asn Thr Thr Pro

305 310 315 320

Ala Gln Asn Gly Thr Val Ser Ala Ile Gly Ala Ala Ala Ala Ser Lys

325 330 335

Met Leu Asp Gly Leu Arg Thr Leu Asp Gly Arg Arg Ala Tyr Ile Trp

340 345 350

Tyr Gln Pro Ser Ser Thr Phe Asp Asp Ala Gln Thr Gln Tyr Asn Tyr

355 360 365

Asp Thr Gly Lys Trp Glu Leu Asp Ile Thr Ser Leu Gly Gly Glu Trp

370 375 380

Val Ala Arg Phe Leu Glu Leu Arg Asp Ala Asp Asn Leu Ser Ser Leu

385 390 395 400

Asp Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Lys Glu Trp Met Glu Leu Gly Trp

405 410 415

Gln Arg Tyr Glu Asp Ser Leu Gln Thr Thr Trp Pro Asp Leu Thr Pro

420 425 430

Phe Gln Ser Ala Gly Gly Lys Ile Ile His Val His Gly Glu Ser Asp

435 440 445

Pro Ser Ile Pro Thr Gly Ser Ser Val His Tyr His Glu Ser Val Arg

450 455 460

Gln Ile Met Tyr Pro Gly Met Ser Phe Asn Glu Ser Ser Glu Ala Leu

465 470 475 480

Asn Glu Trp Asn Arg Leu Tyr Leu Ile Pro Gly Ala Ala His Cys Ala

485 490 495

Ser Ser Thr Thr Gln Pro Asn Gly Pro Phe Pro Gln Thr Thr Leu Glu

500 505 510

Thr Leu Ile Gln Trp Val Glu Gly Gly Val Phe Pro Thr Arg Leu Asn

515 520 525

Ala Thr Val Leu Ala Gly Glu Arg Glu Gly Glu Gln Gln Gln Leu Cys

530 535 540

Ala Trp Pro Leu Arg Pro Leu Trp Lys Asn Asn Gly Thr Val Met Asp

545 550 555 560

Cys Val Phe Asp Glu Ala Ser Tyr Lys Thr Trp Val Tyr Asp Phe Asp

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Ala Tyr Lys Leu Pro Leu Tyr

580

<210> 14

<211> 574

<212> PRT

<213> Aspergillus kawachii IFO 4308

<400> 14

Met Arg Ser Pro Ala Trp Ala Ser Ile Ala Ile Thr Ala Phe Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Asn Ala Gly Thr Pro Ser Thr Leu Ala Glu Leu Cys Thr Asp

20 25 30

Ser Ile Val Lys Ala Ala Leu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Lys Gly Ile

35 40 45

Thr Ile Asp Ser Asp Ser Val Thr Thr Glu Val Val Thr Asn Ser Ser

50 55 60

Phe Ser Ser Glu Phe Tyr Pro Ser Ala Thr Ile Asp Tyr Cys Asn Val

65 70 75 80

Thr Phe Ala Tyr Ser His Asp Gly Ile Asp Gly Asp Gln Val Leu Leu

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Glu Ile Trp Leu Pro Ala Pro Thr Asn Phe Lys Asn Arg Trp Leu Ser

100 105 110

Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Asp Gln Ser Leu Pro

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Gly Gly Val Met Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Met Thr Asp Gly Gly Phe

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Gly Gly Phe Ser Asn Asn Ala Asp Thr Ala Met Leu Leu Ala Asn Gly

145 150 155 160

Thr Leu Asn Tyr Glu Thr Leu Tyr Met Phe Ala Tyr Lys Ala His Arg

165 170 175

Glu Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Leu Thr Arg Asn Val Tyr Gly Met

180 185 190

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290 295 300

Cys Ala Ala Ser Arg Gly Thr Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Ser Ala

305 310 315 320

Lys Gly Ile Glu Val Ala Lys Thr Ile Ile Asn Gly Leu His Asp Ser

325 330 335

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485 490 495

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<212> PRT

<213> Aspergillus niger FJ0118

<400> 15

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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165 170 175

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195 200 205

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245 250 255

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275 280 285

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290 295 300

Thr Thr Pro Ala Gln Asn Gly Thr Ile Thr Ala Glu Gly Val Arg Val

305 310 315 320

Ala Gln Thr Ile Leu Asp Gly Leu Lys Asp Ser Gln Gly Arg Gln Ala

325 330 335

Tyr Phe Trp Tyr Arg Ile Gly Ser Glu Phe Ser Asp Ala Glu Thr Thr

340 345 350

Tyr Asp Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Gly Ile Asp Ile Ser Glu Leu Gly

355 360 365

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370 375 380

Ser Thr Leu Asp Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Asp Trp Met Leu

385 390 395 400

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405 410 415

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485 490 495

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

Asp Leu Asp Ala Tyr Asp Ile Pro Ile Tyr

565 570

<210> 16

<211> 573

<212> PRT

<213> Aspergillus oryzae RIB40

<400> 16

Met Arg Ser Ala Leu Asn Ile Leu Ala Gly Ala Ala Thr Leu Thr Val

1 5 10 15

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Ser Ala Leu Pro Ser Ile Asp Leu Ile Asn Gly Leu Val Ile Asp Pro

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Ser Ser Ile Thr Thr Asn Ala Val Tyr Asn Ala Ser Thr Pro Gly Gly

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Trp Asp Tyr Glu Phe Asp Ala Tyr Arg Ile Pro Leu Tyr

565 570

<210> 17

<211> 588

<212> PRT

<213> Aspergillus fumigatus Af293

<400> 17

Met Arg Ile Ser Tyr Gly Ser Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

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165 170 175

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180 185 190

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Gly Arg Thr Asp Gly Val Val Ser Arg Thr Asp Leu Cys Lys Leu His

275 280 285

Phe Asp Leu Ser Lys Ile Ile Gly Glu Pro Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys

290 295 300

Thr Ser Thr Ser Leu Gly Phe Gly Phe Ser Lys Arg Gln Ala Ala Gly

305 310 315 320

Ser Thr Thr Ser Tyr Gln Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Thr Lys Glu

325 330 335

Gly Val Ala Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp Gly Leu His Asn Thr Gln

340 345 350

Gly Gln Arg Ala Tyr Leu Ser Trp Gln Ile Ala Ser Glu Phe Ser Asp

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Ala Thr Thr Glu Trp Asn Asn Asp Thr Gly Ser Trp Glu Leu Ser Ile

370 375 380

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405 410 415

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His Tyr Trp Gln Ser Val Arg Ser Ile Met Tyr Pro Gly Val Ser Ala

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Ala Lys Ser Leu Lys Glu Leu Gln Glu Trp Tyr Gln Phe Tyr Leu Ile

485 490 495

Pro Gly Ala Ala His Cys Gly Ala Asn Ser Leu Gln Pro Gly Pro Tyr

500 505 510

Pro Gln Asn Asn Met Asp Ile Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly Val

515 520 525

Gln Pro Ser Arg Leu Asn Thr Thr Val Ser Ser Gly Asp Tyr Ala Gly

530 535 540

Glu Thr Gln Met Leu Cys Gln Trp Pro Thr Arg Pro Leu Trp Lys Asp

545 550 555 560

Asn Ser Thr Phe Asp Cys Val Asn Asp Glu Lys Ser Ile Glu Ser Trp

565 570 575

Thr Tyr Thr Phe Pro Ala Phe Lys Val Pro Val Tyr

580 585

<210> 18

<211> 580

<212> PRT

<213> Penicillium rubens Wisconsin 54-1255

<400> 18

Met Arg Leu Ser Trp Gly Ala Ser Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ser Leu Ala Asp Val Cys Thr Val Ser Asn Val Gln Ser

20 25 30

Ala Leu Pro Ser Asn Gly Thr Leu Leu Gly Ile Asn Met Ile Pro Ser

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Thr Val Thr Ala Ser Pro Val Tyr Asn Ala Ser Ala Gly Met Gly Ser

50 55 60

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Gly Lys Gly Asp Ser Val Val Ile Lys Tyr Ala Phe Pro Lys Pro Ser

85 90 95

Asp Phe Lys Lys Arg Phe Tyr Val Ala Gly Gly Gly Gly Phe Ser Leu

100 105 110

Ser Ser Asp Ala Thr Gly Gly Leu Glu Tyr Gly Ala Val Gly Gly Ala

115 120 125

Thr Ser Ala Gly Tyr Asp Ala Phe Asn Asn Ser Tyr Asp Glu Val Val

130 135 140

Leu Tyr Gly Asn Gly Thr Ile Asn Trp Asp Ala Thr Tyr Met Phe Ala

145 150 155 160

Tyr Gln Ala Leu Gly Glu Met Thr Lys Ile Gly Lys Val Leu Thr Lys

165 170 175

Gly Phe Tyr Gly Met Ala Ser Ser Ala Lys Val Tyr Thr Tyr Tyr Glu

180 185 190

Gly Cys Ser Asp Gly Gly Arg Glu Gly Met Ser Gln Ile Gln Arg Tyr

195 200 205

Gly Glu Glu Tyr Asp Gly Ala Ile Thr Gly Ala Pro Ala Phe Arg Phe

210 215 220

Ala Gln Gln Gln Val His His Val Phe Ser Ala Ala Ala Glu Gln Thr

225 230 235 240

Leu Asp Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu Leu Ala Lys Ile Val Asn Ala

245 250 255

Thr Ile Ala Ala Cys Asp Pro Leu Asp Gly Arg Thr Asp Gly Val Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Asp Leu Cys Lys Leu Lys Phe Asn Leu Thr Ser Ile Ile

275 280 285

Gly Glu Glu Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Thr Ser Thr Ser Leu Gly Phe

290 295 300

Gly Phe Ser Lys Arg Ala Asp Gly Ser Ser Thr Ser Thr Thr Pro Glu

305 310 315 320

Gln Ser Gly Lys Val Thr Ala Lys Gly Val Gln Val Ala Gln Ala Ile

325 330 335

Tyr Asp Gly Leu His Asn Ser Lys Gly Glu Arg Ala Tyr Leu Ser Trp

340 345 350

Gln Val Gly Ser Glu Leu Ser Asp Gly Asp Thr Thr Trp Asn Asn Ala

355 360 365

Thr Ser Lys Trp Glu Met Ser Ile Pro Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Val

370 375 380

Thr Lys Phe Ile Gln Leu Leu Asp Leu Asp Asn Leu Ser Asp Leu Asp

385 390 395 400

Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Val Asp Trp Met Asn Thr Gly Met Val

405 410 415

Arg Tyr Met Asp Ser Leu Gln Thr Thr Leu Pro Asp Leu Thr Pro Phe

420 425 430

Gln Ser Ser Gly Gly Lys Leu Leu His Tyr His Gly Glu Ser Asp Pro

435 440 445

Ser Ile Pro Ser Ala Ser Ser Val His Tyr Trp Gln Ser Val Arg Ser

450 455 460

Ile Met Tyr Pro His Leu Ser Ser Gln Asp Ser Leu Lys Glu Leu Ala

465 470 475 480

Asp Trp Tyr Gln Phe Tyr Leu Val Pro Gly Ala Ala His Cys Gly Thr

485 490 495

Asn Lys Leu Gln Pro Gly Pro Tyr Pro Glu Asn Asn Met Gln Thr Met

500 505 510

Ile Asp Trp Val Glu Asn Asp Val Lys Pro Ser Arg Leu Asn Ala Thr

515 520 525

Val Ser Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Glu Thr Gln Met Leu Cys Gln Trp

530 535 540

Pro Thr Arg Pro Leu Trp Lys Ser Asn Ser Thr Phe Gln Cys Val Asp

545 550 555 560

Asp Lys Ala Ser Ile Glu Ser Trp Thr Tyr Ser Phe Pro Ala Phe Lys

565 570 575

Val Pro Val Tyr

580

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

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<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

cggacccctc cgccaatggc ggcgcgccaa gcttgcatgc aggcctctgc a 51

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

tgtcattcaa tgcatctgga aacgcaaccc tgaa 34

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

accatgatta cgccaagctt ctagatctac gccaggaccg 40

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gccattggcg gaggggtccg 20

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gggttgcgtt tccagatgca ttgaatgaca gtgatatcag 40

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

agcatcatta cacctcagca atgcgttcac ccgcctgg 38

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gtcaccctct agatctcgag ttagtacaca ggcataggaa ccg 43

<210> 27

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

agcatcatta cacctcagca atgcgcaagt ccactcgc 38

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gtcaccctct agatctcgag ttagaaaacg ggcatcttga aagc 44

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

agcatcatta cacctcagca atgagaaccg ccctcggg 38

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gtcaccctct agatctcgag ctagtacagg ggcagcttgt 40

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

agcatcatta cacctcagca atgcgctccc ccgcctgg 38

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gtcaccctct agatctcgag ttagtagacg ggcatgggga cg 42

<210> 33

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

agcatcatta cacctcagca atgtccaagt tcctcctttg ga 42

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

gtcaccctct agatctcgag ctaatagatc ggaatgtcat acgca 45

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

agcatcatta cacctcagca atgcgctccg ccctgaac 38

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

gtcaccctct agatctcgag ttagtacagg gggatgcggt 40

<210> 37

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

agcatcatta cacctcagca atgcgcatct cctacggt 38

<210> 38

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

gtcaccctct agatctcgag ttagtagacg gggaccttga agg 43

<210> 39

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

agcatcatta cacctcagca atgcgcctgt cctggggt 38

<210> 40

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

gtcaccctct agatctcgag ttagtagacg gggaccttga agg 43

Claims

1.一种单宁酶在制备没食子酸中的应用，其特征在于，所述单宁酶的氨基酸序列与SEQID NO:13或其成熟多肽具有至少95％以上的序列一致性。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单宁酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:13或其成熟多肽具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单宁酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13所示多肽的成熟多肽。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单宁酶来源于黑曲霉ATCC 13496。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单宁酶的最适反应温度为65-75℃，最适反应pH为4.0-5.0。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单宁酶的多核苷酸序列包括：1)SEQ IDNO:5的多核苷酸序列；和/或，2)SEQ ID NO:5的cDNA序列；和/或，3)在非常严格条件下与1)或2)的多核苷酸序列或其全长互补链杂交的多核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用单宁酶制备没食子酸具体包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1)中单宁酸溶液的浓度为30％。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1)中调节单宁酸溶液pH至4.0。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中单宁酶的添加量为36U/g的底物添加量。

11.一种制备单宁酶的方法，其特征在于，所述方法利用黑曲霉CICC 2462菌株表达单宁酶的氨基酸序列，所述单宁酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:13或其成熟多肽具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以上的序列一致性；

优选地，所述单宁酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13所示多肽的成熟多肽。