CN110964709A - 一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法 - Google Patents

一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法，属于酶固定化领域。本发明选用的固定化载体用于固定化米曲霉单宁酶时，能够固定化米曲霉单宁酶具有优异的活力和酶活回收率。且本发明选用的固定化载体为价格低廉且性质稳定的树脂材料，投入生产中有利于降低产品成本，同时，制备的苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂(ECR‑1030M树脂)固定化米曲霉单宁酶活力高、保藏稳定性好、循环使用次数多，能够作为一种新型固定化酶制剂投入到工业应用。

Description

一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法
技术领域
本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法。
背景技术
单宁酶(Tannase，EC 3.1.1.20)是一种主要由丝状真菌产生的诱导酶，可高效水解没食子酰单宁、鞣花单宁以及没食子酸烷基酯等化合物，因而在没食子酸生产、速溶茶除沉淀、果汁脱涩、单宁废水去污等方面有着广阔的应用前景。然而，由于米曲霉单宁酶生产成本较高，且使用率和稳定性较差，因而目前尚难以实现规模化应用。采用有效的固定化技术制备固定化单宁酶，不仅可以将单宁酶多次循环使用从而降低单宁酶使用成本，而且还可以提高单宁酶的理化性质及生物稳定性，因而对于实现单宁酶的连续催化和工业应用具有重要意义。
目前，已报道的单宁酶固定化载体主要是壳聚糖和海藻酸钙\钠两种材料，另外如单宁微球、微乳凝胶、玉米芯等仅有少量报道。这些固定化载体虽然有的具有较高的酶活回收率，但材料成本较高，难以实现规模化生产和工业化应用；有的材料虽然成本低廉，但固定化酶活力及使用效率较低，不具备产业化意义。树脂材料由于类型多、成本低且具有稳定的理化性质，已作为酶载体用于酶制剂的固定化研究，且很多已实现了商业化生产，如CN201510380655.0公开了以交链苯乙烯型非极性大孔吸附树脂为黑曲霉单宁酶固定化载体，但是仍存在固定化单宁酶活力以及酶活回收率低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法。本发明提供的固定化方法制得的固定化米曲霉单宁酶具有优异的活力和酶活回收率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种米曲霉单宁酶的固定化方法，包括以下步骤：
将固定化载体浸于戊二醛水溶液中活化，得到活化载体，所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂、环氧基型共价偶联树脂、胺基型阴离子吸附树脂、极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂、十八烷基型大孔吸附树脂或环氧基型共价偶联树脂；
将所述活化载体、米曲霉单宁酶和PBS缓冲液混合，进行固定化，使米曲霉单宁酶固定于活化载体中。
优选地，所述二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂的粒径为300～700μm，孔径为25nm，比表面积＞100m2/g。
优选地，所述活化载体和米曲霉单宁酶的料酶比为1g：10～30mL。
优选地，所述固定化的时间为2～10h，温度为室温。
优选地，所述固定化载体与戊二醛水溶液的用量比为1g:10～30mL，所述戊二醛水溶液的浓度为2～5％。
优选地，所述米曲霉单宁酶的制备方法包括以下步骤：
将米曲霉接种于PDA斜面培养基中进行活化培养，得到活化菌种；
将所述活化菌种进行接种，得到接种剂；
将所述接种剂在发酵培养基中进行发酵培养后提取，得到粗酶；
将所述粗酶液进行超滤浓缩，得到米曲霉单宁酶。
优选地，所述活化培养的温度为28～30℃，时间为72～90h。
优选地，所述发酵培养的温度为28～30℃，时间为90～108h。
优选地，所述固定化载体使用前进行预处理，
当所述固定化载体为胺基型阴离子吸附树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗1h；②2.5％盐酸溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④4％NaOH溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；
当所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗1h；②4％NaOH溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④5％盐酸溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；
当所述固定化载体为极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂或十八烷基型大孔吸附树脂时，所述预处理为：①乙醇振荡浸泡2h；②过滤；③丙酮振荡浸泡2h；④过滤；⑤水振荡冲洗至无有机溶剂残留；⑥过滤备用；
当所述固定化载体为环氧基型共价偶联树脂或环氧基型共价偶联树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗2h；②用PBS缓冲液振荡平衡3次；③过滤备用。
本发明还提供了上述技术方案所述的固定化方法制得的固定化米曲霉单宁酶。
本发明提供了一种米曲霉单宁酶的固定化方法，包括以下步骤：将固定化载体浸于戊二醛水溶液中活化，得到活化载体，所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂、环氧基型共价偶联树脂、胺基型阴离子吸附树脂、极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂、十八烷基型大孔吸附树脂或环氧基型共价偶联树脂；将所述活化载体、米曲霉单宁酶和PBS缓冲液混合，进行固定化，使米曲霉单宁酶固定于活化载体中。本发明选用的固定化载体用于固定化米曲霉单宁酶时，能够固定化米曲霉单宁酶具有优异的活力和酶活回收率。且本发明选用的固定化载体为价格低廉且性质稳定的树脂材料，投入生产中有利于降低产品成本，同时，制备的苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂(ECR-1030M树脂)固定化米曲霉单宁酶活力高、保藏稳定性好、循环使用次数多，能够作为一种新型固定化酶制剂投入到工业应用。实施例的数据表明，在最优固定化米曲霉单宁酶工艺条件：戊二醛浓度3.5％，固定化时间5.5h，料酶比1︰16(g/mL)下制备的固定化米曲霉单宁酶活力最高，为1480.5±32.6U/g，远优于现有技术中公开的固定化单宁酶活力为942.0U/g(参见CN201510380655.0)。同时，在最优条件下制备固定化米曲霉单宁酶，酶活回收率为64.5％，固定化米曲霉单宁酶在4℃下保藏至20d和30d时，仍分别具有超过80％和70％的酶活力，固定化米曲霉单宁酶循环使用6次后，仍具有超过80％的酶活力，说明该工艺制备的固定化米曲霉单宁酶具有良好的保藏稳定性并可以高活力多次使用。
附图说明
图1为不同树脂载体制备的固定化米曲霉单宁酶活力柱状图；
图2为ECR-1030M树脂固定化米曲霉单宁酶酶活力随保藏时间的变化图；
图3为ECR-1030M树脂固定化米曲霉单宁酶的循环使用次数图。
具体实施方式
本发明提供了一种米曲霉单宁酶的固定化方法，包括以下步骤：
将固定化载体浸于戊二醛水溶液中活化，得到活化载体，所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂、环氧基型共价偶联树脂、胺基型阴离子吸附树脂、极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂、十八烷基型大孔吸附树脂或环氧基型共价偶联树脂；
将所述活化载体、米曲霉单宁酶和PBS缓冲液混合，进行固定化，使米曲霉单宁酶固定于活化载体中。
本发明将固定化载体浸于戊二醛水溶液中活化，得到活化载体，所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂、环氧基型共价偶联树脂、胺基型阴离子吸附树脂、极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂、十八烷基型大孔吸附树脂或环氧基型共价偶联树脂。本发明对所述固定化载体的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可，具体如采用杭州创科生物科技有限公司生产的MI-150IDA(羧基型阳离子吸附树脂)、MC-150EP(环氧基型共价偶联树脂)、MI-BN4(胺基型阴离子吸附树脂)、MA-P9(极性芳基型静电吸附树脂)、MA-NP6(非极性芳基型静电吸附树脂)、ECR-1030M(二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂)、ECR-8806M(十八烷基型大孔吸附树脂)或ECR-4204M(环氧基型共价偶联树脂)即可。
在本发明中，所述二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂的粒径优选为300～700μm，孔径优选为25nm，比表面积优选为＞100m2/g。
在本发明中，所述固定化载体使用前优选进行预处理，
当所述固定化载体为胺基型阴离子吸附树脂时，所述预处理优选为：①水振荡冲洗1h；②2.5％盐酸溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④4％NaOH溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；
当所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂时，所述预处理优选为：①水振荡冲洗1h；②4％NaOH溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④5％盐酸溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；
当所述固定化载体为极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂或十八烷基型大孔吸附树脂时，所述预处理优选为：①乙醇振荡浸泡2h；②过滤；③丙酮振荡浸泡2h；④过滤；⑤水振荡冲洗至无有机溶剂残留；⑥过滤备用；
当所述固定化载体为环氧基型共价偶联树脂或环氧基型共价偶联树脂时，所述预处理优选为：①水振荡冲洗2h；②用PBS缓冲液振荡平衡3次；③过滤备用。
在本发明中，所述固定化载体与戊二醛水溶液的用量比优选为1g:10～30mL，所述戊二醛水溶液的浓度优选为2～5％，更优选为3.5％。
在本发明中，所述活化的温度优选为室温，时间优选为4h。
活化完成后，本发明优选滤出树脂，得到所述活化载体。
得到活化载体后，本发明将所述活化载体、米曲霉单宁酶和PBS缓冲液混合，进行固定化，使米曲霉单宁酶固定于活化载体中。
在本发明中，所述活化载体和米曲霉单宁酶的料酶比优选为1g：10～30mL，更优选为1g：16mL。
在本发明中，所述固定化时间优选为2～10h，更优选为5.5h，温度优选为室温。
在本发明中，所述米曲霉单宁酶的制备方法优选包括以下步骤：
将米曲霉接种于PDA斜面培养基中进行活化培养，得到活化菌种；
将所述活化菌种进行接种，得到接种剂；
将所述接种剂在发酵培养基中进行发酵培养后提取，得到粗酶；
将所述粗酶液进行超滤浓缩，得到米曲霉单宁酶。
本发明将米曲霉接种于PDA斜面培养基中进行活化培养，得到活化菌种。在本发明中，所述PDA斜面培养基优选为广东环凯微生物科技有限公司的产品。
在本发明中，所述活化培养的温度优选为28～30℃，时间优选为72～90h。
得到活化菌种后，本发明将所述活化菌种进行接种，得到接种剂。在本发明中，所述接种剂中活化菌种的浓度优选为1.0×106～1.5×106cfu/mL。在本发明的具体实施例中，所述接种剂优选为：配制0.85％生理盐水，分装若干25mL含玻璃珠的三角瓶，10mL/瓶。灭菌并冷却后，取活化菌种置于三角瓶中，封口并于150r/min振摇30min，使菌体均匀分散在生理盐水中，即得接种剂。
得到接种剂后，本发明将所述接种剂在发酵培养基中进行发酵培养后提取，得到粗酶。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为28～30℃，时间优选为90～108h。本发明优选在发酵培养第24h和48h时振荡发酵培养基(翻曲)1min。
在本发明中，所述发酵培养基优选包括以下重量百分含量的组分：水40～60％，麸皮30～40％，蔗糖5～7％，单宁酸5～6％，硝酸铵2～4％，氯化锰0.2～0.4％和氯化钙0.1～0.3％，更优选为水50％，麸皮35％，蔗糖6％，单宁酸5.5％，硝酸铵3％，氯化锰0.3％，氯化钙0.2％。
在本发明的具体实施例中，所述提取优选为发酵培养结束后，向三角瓶中加入100mL蒸馏水，150r/min振荡30min充分浸提单宁酶，然后将瓶中内容物倒入离心瓶中，5000r/min离心15min，取上清液，即为粗酶液。
得到粗酶液后，本发明将所述粗酶液进行超滤浓缩，得到米曲霉单宁酶。在本发明的具体实施例中，所述超滤浓缩优选为用切割分子量(MWCO)10kDa的中空纤维膜对粗酶液进行超滤，超滤浓缩至粗酶液容积的1/4，去除大部分没食子酸等小分子物质。
本发明还提供了上述技术方案所述的固定化方法制得的固定化米曲霉单宁酶。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的固定化米曲霉单宁酶及其固定化方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1实验过程
1.1菌种与培养基
米曲霉(Aspergillus oryzae)，肇庆学院食品微生物实验室4℃斜面保藏。
活化培养基：将PDA培养基粉末(广东环凯微生物科技有限公司)依说明书配好后分装试管，灭菌后做成PDA斜面若干，4℃冷藏备用。
发酵培养基：水50％，麸皮35％，蔗糖6％，单宁酸5.5％，硝酸铵3％，氯化锰0.3％，氯化钙0.2％，置于250mL三角瓶，搅拌均匀。上述百分数均为质量百分比。
1.2主要药品
单宁酸、戊二醛、没食子酸丙酯(PG)及其他常规药品均为国产分析纯；PG标准液配制：准确称取0.042g PG，先以2滴无水乙醇溶解，再用100mL水定容，现用现配；选用8种树脂(购自杭州创科生物科技有限公司)作为单宁酶固定化载体，各树脂特点见表1。
表1树脂载体一览表
Figure BDA0002339128750000071
1.3试验方法
1.3.1菌种活化
无菌条件下，将米曲霉接种于PDA斜面培养基中，30℃培养72h，即得活化菌种。
1.3.2接种剂制备
配制0.85％生理盐水，分装若干25mL含玻璃珠的三角瓶，10mL/瓶。灭菌并冷却后，取一环活化菌种置于三角瓶中，封口并于150r/min振摇30min，使菌体均匀分散在生理盐水中，即得接种剂，接种剂中活化菌种的浓度为1.0×106cfu/mL。
1.3.3单宁酶发酵
取1mL接种剂，均匀喷洒于发酵培养基中，接种剂与发酵培养基的比例为1:15(mL:g)，充分振荡三角瓶使菌体均匀散布于培养基中，30℃培养96h，使米曲霉发酵产单宁酶。期间，分别于24h和48h时振荡培养基(翻曲)1min。
1.3.4单宁酶提取
发酵结束后，向三角瓶中加入100mL蒸馏水，150r/min振荡30min充分浸提单宁酶。然后将瓶中内容物倒入离心瓶中，5000r/min离心15min，取上清液，即为粗酶液。
1.3.5粗酶液超滤浓缩
用切割分子量(MWCO)10kDa的中空纤维膜对粗酶液进行超滤。超滤浓缩至粗酶液容积的1/4左右，可去除大部分没食子酸等小分子物质。
1.3.6单宁酶活力测定
使用紫外分光光度法测定。对于固定化单宁酶活力的测定，用0.2g固定化酶代替0.2mL酶液。
1.3.7固定化载体预处理
1)阴离子交换型树脂(MI-BN4)：①水振荡冲洗1h；②2.5％盐酸溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH接近中性；④4％NaOH溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH接近中性；⑥用PBS缓冲液(0.1mol/L，pH 7，下同)振荡平衡2h；⑦过滤备用。
2)阳离子交换型树脂(MI-150IDA)：①水振荡冲洗1h；②4％NaOH溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH接近中性；④5％盐酸溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH接近中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用。
3)静电吸附和大孔吸附型树脂(MA-P9、MA-NP6、ECR-1030M、ECR-8806M)：①乙醇振荡浸泡2h；②过滤；③丙酮振荡浸泡2h；④过滤；水振荡冲洗至无有机溶剂残留；⑥过滤备用。
4)共价偶联型树脂(MC-150EP、ECR-4204M)：①水振荡冲洗2h；②用PBS缓冲液振荡平衡3次；③过滤备用。
1.3.8单宁酶固定化方法
采用戊二醛交联法。将8种树脂浸于一定浓度的戊二醛水溶液中活化4h，然后滤出树脂，与单宁酶按一定比例加入到PBS缓冲液中，室温下搅拌一定时间使单宁酶固定于树脂中。通过比较固定化单宁酶活力筛选出最佳固定化载体。
1.3.9单宁酶固定化工艺优化
选取戊二醛浓度(X1)、固定化时间(X2)和料酶比(X3)三个因子进行混合水平均匀设计，因子水平如表2所示。
表2均匀设计因子水平
Figure BDA0002339128750000081
1.3.10酶活回收率的测定
在最优工艺条件下制备固定化单宁酶，然后按式(1)计算固定化单宁酶的酶活回收率。
Figure BDA0002339128750000091
式中：固定化酶总活力(U)＝固定化酶活力(U/g)×固定化酶质量(g)；酶液总活力(U)＝酶液活力(U/mL)×酶液体积(mL)；残酶液活力(U)＝滤出固定化酶后的酶液活力(U/mL)×残酶液体积(mL)。
1.3.11固定化单宁酶的保藏稳定性
将固定化单宁酶在4℃下分别保藏0，5，10，15，20，25，30，35，40和45d，然后进行酶活测定，考察固定化单宁酶活力随保藏时间的变化关系。
1.3.12固定化单宁酶的循环使用次数
用0.2g固定化单宁酶水解50mLPG标准液20min，每次水解后将固定化单宁酶滤出、清洗并测定酶活力，然后再投入PG标准液中进行下一次水解，直至酶活力降至不低于初始酶活力的70％，以此考察固定化单宁酶的循环使用次数。
1.3.13数据处理
各试验均平行3次，结果用“均值±标准偏差”表示。用SAS 9.4(SAS InstituteInc，Cary，NC，USA)软件进行数据拟合、模型构建以及回归分析
2结果与分析
2.1最佳树脂载体的选择
图1为不同树脂载体制备的固定化米曲霉单宁酶活力柱状图，由图1可看出，用ECR-1030M树脂制备的固定化单宁酶活力为1465.8U/g，明显高于用其他树脂材料制备的固定化单宁酶的活力，固定化效果非常理想。ECR-1030M树脂是二苯乙烯交联的甲基丙烯酸酯聚合物，为白色球状微粒，粒径为300～700μm，孔径25nm，比表面积＞100m2/g，理化性质稳定，机械稳定性良好，酶固载容量和固定化效率较高，适合固定米曲霉单宁酶。
2.2最优固定化工艺的确定
用DPS 9.0(浙江大学，杭州)构建最优U20(41×52)均匀设计表，试验次数20次，最大迭代次数1000次，寻优时间5min，运行时间18s，中心化偏差CD＝0.1247[22-23]。ECR-1030M树脂按此试验方案制备的固定化单宁酶的酶活力(Y)结果如表3所示。由表3可看出，6号试验所得固定化单宁酶的活力最高，为1470.5±26.3U/g。为进一步寻优，用SAS 9.4对试验结果进行拟合，可得二阶回归模型：Y＝961.95846X1+226.30496X2+66733X3-103.14000X12-32.59500X1X2-10.98405X22-1147.88486X1X3+102.15325X2X3-500116X32-2907.15385。参数估计及显著性分析如表4所示，模型方差分析如表5所示。
表3均匀试验结果
Figure BDA0002339128750000101
表4参数估计及显著性检验
Figure BDA0002339128750000102
表5方差分析
Figure BDA0002339128750000103
由表4可知，戊二醛浓度(X1)和料酶比(X3)分别对响应指标酶活力(Y)有显著(p＜0.05)和极显著(p＜0.01)影响，而固定化时间(X2)则对酶活力影响不显著(p＞0.05)。由表5可知，二阶回归模型显著(p＜0.05)，说明该模型拟合良好，可以用该模型对ECR-1030M树脂固定单宁酶工艺进行分析和预测。
在输出的特征值结果中，显示稳定点为最大值(Stationary point is amaximum)，且当X1＝3.444158，X2＝5.485748，X3＝0.063325时，稳定点预测值(Predictedvalue at stationarypoint)为1483.054648，略高于表3中6号试验结果1470.5。为便于实际操作，选择X1＝3.5，即戊二醛浓度3.5％；X2＝5.5，即固定化时间5.5h；X3＝0.063，取料酶比1︰16(g/mL)，在此工艺条件下做3次平行试验，制备的固定化单宁酶活力为1480.5±32.6U/g，这与稳定点预测值基本一致，表明所构建的二阶回归模型合理、可靠，可以很好地预测实际生产中单宁酶的固定化。
另外，按照最优工艺，在16mL单宁酶液中加入1g ECR-1030M树脂，并以3.5％的戊二醛进行交联，固定5.5h后获得的固定化单宁酶总活力为1480.5U，单宁酶液总活力为4360U，残酶液总活力为2065.4U，求得酶活回收率为64.5％。
2.3固定化单宁酶的保藏稳定性
最优固定化条件下获得的ECR-1030M树脂固定化单宁酶，其酶活力随保藏时间的变化如图2所示。ECR-1030M树脂固定化单宁酶在4℃下保藏期间，随着时间的延长，酶活力不断下降。当保藏至20d时，固定化单宁酶还有81.4％的酶活力；保藏至30d时，固定化单宁酶仍保留了超过70％的酶活力。此后随着时间延长，酶活力下降速度增大，至45d时，仅剩下初始酶活力的1/4。
2.4固定化单宁酶的循环使用次数
图3为ECR-1030M树脂固定化单宁酶的循环使用次数图，由图3可以看出，当固定化单宁酶循环使用6次后，仍具有80.3％的酶活力，而使用10次后还有超过一半的酶活力。这表明该工艺制备的固定化单宁酶可以多次有效循环使用，表现出良好的酶活稳定性，因而有利于工业化应用。
通过固态发酵米曲霉制备出单宁酶，然后进行超滤浓缩。采用戊二醛交联法，以不同类型的树脂材料为载体对超滤浓缩后的单宁酶进行固定化，通过对固定化酶活力的比较，确定二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂ECR-1030M为最佳固定化载体。然后设计均匀试验，分别考察戊二醛浓度、固定化时间及料酶比3个因素对酶活力的影响，并构建二阶回归模型Y＝961.95846X1+226.30496X2+66733X3-103.14000X12-32.59500X1X2-10.98405X22-1147.88486X1X3+102.15325X2X3-500116X32-2907.15385。通过方差分析确定该模型显著，戊二醛浓度和料酶比2个因素对试验结果分别有显著和极显著影响。最后通过极值寻优，确定最优固定化单宁酶工艺条件：戊二醛浓度3.5％，固定化时间5.5h，料酶比1：16(g/mL)，在此条件下制备的固定化单宁酶活力最高，为1480.5±32.6U/g。同时，在最优条件下制备固定化单宁酶，酶活回收率为64.5％。另外，还对固定化单宁酶的保藏稳定性和循环使用次数进行了测定。结果显示，固定化单宁酶在4℃下保藏至20d和30d时，仍分别具有超过80％和70％的酶活力。固定化单宁酶循环使用6次后，仍具有超过80％的酶活力。说明该工艺制备的固定化米曲霉单宁酶具有良好的保藏稳定性并可以高活力多次使用。
该工艺所选用的单宁酶固定化载体为价格低廉且性质稳定的树脂材料，投入生产中有利于降低产品成本。同时，制备的ECR-1030M树脂固定化米曲霉单宁酶活力高、保藏稳定性好、循环使用次数多，因而有望作为一种新型固定化酶制剂投入到工业应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种米曲霉单宁酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将固定化载体浸于戊二醛水溶液中活化，得到活化载体，所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂、环氧基型共价偶联树脂、胺基型阴离子吸附树脂、极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂、十八烷基型大孔吸附树脂或环氧基型共价偶联树脂；
将所述活化载体、米曲霉单宁酶和PBS缓冲液混合，进行固定化，使米曲霉单宁酶固定于活化载体中。
2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂的粒径为300～700μm，孔径为25nm，比表面积＞100m2/g。
3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述活化载体和米曲霉单宁酶的料酶比为1g：10～30mL。
4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化的时间为2～10h，温度为室温。
5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化载体与戊二醛水溶液的用量比为1g:10～30mL，所述戊二醛水溶液的浓度为2～5％。
6.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述米曲霉单宁酶的制备方法包括以下步骤：
将米曲霉接种于PDA斜面培养基中进行活化培养，得到活化菌种；
将所述活化菌种进行接种，得到接种剂；
将所述接种剂在发酵培养基中进行发酵培养后提取，得到粗酶；
将所述粗酶液进行超滤浓缩，得到米曲霉单宁酶。
7.根据权利要求6所述的固定化方法，其特征在于，所述活化培养的温度为28～30℃，时间为72～90h。
8.根据权利要求6所述的固定化方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～30℃，时间为90～108h。
9.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化载体使用前进行预处理，
当所述固定化载体为胺基型阴离子吸附树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗1h；②2.5％盐酸溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④4％NaOH溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；
当所述固定化载体为羧基型阳离子吸附树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗1h；②4％NaOH溶液振荡冲洗2h；③水洗至pH为中性；④5％盐酸溶液振荡冲洗2h；⑤水洗至pH为中性；⑥用PBS缓冲液振荡平衡2h；⑦过滤备用；
当所述固定化载体为极性芳基型静电吸附树脂、非极性芳基型静电吸附树脂、二苯乙烯/丙烯酸酯基型大孔吸附树脂或十八烷基型大孔吸附树脂时，所述预处理为：①乙醇振荡浸泡2h；②过滤；③丙酮振荡浸泡2h；④过滤；⑤水振荡冲洗至无有机溶剂残留；⑥过滤备用；
当所述固定化载体为环氧基型共价偶联树脂或环氧基型共价偶联树脂时，所述预处理为：①水振荡冲洗2h；②用PBS缓冲液振荡平衡3次；③过滤备用。
10.权利要求1～9任一项所述的固定化方法制得的固定化米曲霉单宁酶。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039298A (zh) * 2015-07-02 2015-11-11 曹庸 一种固定化单宁酶的制备方法
CN107312768A (zh) * 2017-08-14 2017-11-03 山东思科新材料有限公司 一种固定化单宁酶及其制备方法和应用
CN110777129A (zh) * 2019-05-07 2020-02-11 宁波大学 一种单宁酶的共交联固定化方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039298A (zh) * 2015-07-02 2015-11-11 曹庸 一种固定化单宁酶的制备方法
CN107312768A (zh) * 2017-08-14 2017-11-03 山东思科新材料有限公司 一种固定化单宁酶及其制备方法和应用
CN110777129A (zh) * 2019-05-07 2020-02-11 宁波大学 一种单宁酶的共交联固定化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张帅等: "ECR-1030M树脂固定化单宁酶", 《食品工业》 *
杭州创科生物科技有限公司: "ECR-1030M脂肪酶固定化树脂", 《杭州创科生物科技有限公司产品介绍》 *
王挥等: "LX-1000HA树脂固定化单宁酶的工艺优化", 《食品与机械》 *
陈志宏等: "固定化单宁在食品领域的研究与应用", 《食品工业》 *

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