CN115786418A - 一种固定化酶催化的高纯度(s)-降烟碱的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化酶催化的高纯度(S)‑降烟碱的合成方法，它包括如下步骤：(1)以外消旋(R,S)‑降烟碱为原料，利用固定化酶催化其中的(R)‑降烟碱生成麦斯明；(2)以步骤(1)生成的麦斯明为原料，利用固定化酶催化还原成(R,S)‑降烟碱；通过上述步骤不断消耗外消旋(R,S)‑降烟碱中的(R)‑降烟碱从而得到高纯度的(S)‑降烟碱。本发明通过固定化酶催化转化外消旋(R,S)‑降烟碱生成高浓度(S)‑降烟碱，是一种获得高浓度、高纯度手性(S)‑降烟碱且成本较低的工艺路线，具有较高的工业化应用价值和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及一种固定化酶催化的高纯度(S)-降烟碱的合成方法。
背景技术
生物碱是烟草植株中存在的一类重要的化学成分，其中烟碱在烟草中占总生物碱95％以上的含量。烟碱(Nicotine)又称尼古丁(化学名：1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷，CAS号：54-11-5)具有手性中心，存在手性对映体，即左旋的(S)-烟碱和右旋的(R)-烟碱，是具有重要临床潜在价值的有机中间体。(S)-烟碱及其衍生物是治疗帕金森综合症、阿尔茨海默症、精神分裂、癫痫和抗抑郁的有效药物。在农业上，烟碱被用做杀虫剂和除草剂，是一种高效低毒的广谱农药。此外，(S)-烟碱可用作保健香烟、戒烟膏、治疗关节疼痛和肌肉痉挛外用药的原料。常见的施用方式是嚼片、乳膏、透皮贴剂、片剂、鼻喷雾剂和电子香烟。近年来电子烟行业发展相当迅猛，市场需求量非常巨大，(S)-烟碱作为电子烟的重要活性成分，市场需求也随之激增。
目前市场上所用的(S)-烟碱主要是从烟草等植物中提取纯化，因此受到了原材料、气候，以及周期等多方面因素的影响。且从烟草等植物中提取纯化的(S)-烟碱通常含有很多对人体系统不健康的、潜在致癌的杂质。相反，由化学原料药定向人工合成的得到的外消旋烟碱即(R,S)-烟碱，不会含有天然提纯的(S)-烟碱中存在的杂质，具有纯度高、成本低、产量大、应用广泛等不可替代的优势，但其所用试剂价格昂贵，步骤繁琐，周期长；往往采用低温反应，每一步的分离纯化复杂，处理难度大；同时，制备出的(R,S)-烟碱还需要进一步拆分并破坏非目标产物(R)-烟碱从而得到高纯度的(S)-烟碱，所以成本很高，大规模生产难度大，产品价格高。
目前已经报道的制备(S)-烟碱的化学合成方法包括化学拆分法、不对称氢化法、手性辅助试剂法等。如中国专利CN107406411A公开一种(R,S)-烟碱的合成方法，其反应是以烟酸酯与N-乙烯基-2-吡咯烷酮为起始原料，经过碱催化克莱森缩合、酸性脱羧合环得到中间体麦斯明(CAS号:532-12-7)，麦斯明再经过钯碳加氢还原、Eschweiler–Clarke甲基化反应得到消旋体混合物(R,S)-烟碱。该工艺是目前人工合成烟碱的主流工艺，但该工艺存在一个较大缺点，制备的产物(R,S)-烟碱是(S)-烟碱与(R)-烟碱两种手性对映体的混合物，与天然(S)-烟碱有着本质区别，其在理化性质、药效以及电子烟的体验感上有着较大差别。(S)-烟碱也可通过合成方法获得，现有技术合成(S)-烟碱通常制备(R)-烟碱和(S)-烟碱外消旋混合物后拆分获得。如专利CN111511726A报道了外消旋烟碱的合成，并利用L-DBTA进行手性拆分得到(S)-烟碱；但该方法需要对混合物进行拆分，工艺复杂，反应条件苛刻，得到的产物收率低。因此，开发一种获得高纯度手性(S)-烟碱的工艺路线，具有较高的工业化应用价值和经济效益。
目前，也有利用酶作为生物催化剂将麦斯明在生物酶体系下催化还原得到具有高光学纯度的中间体-(S)-降烟碱(CAS号：494-97-3)，最后发生氨甲基化反应得到(S)-烟碱的生物合成方法，如专CN112409327A报道了一种高光学纯度烟碱的制备方法，该方法先采用烟酸酯和乙烯基吡咯烷酮制备得到麦斯明，麦斯明在生物酶体系下催化还原得到具有高光学纯度的中间体-(S)-降烟碱，最后发生氨甲基化反应得到(S)-烟碱，但该方法存在使用的酶复杂、种类多，且酶使用后无法重复利用的问题。专利CN113272289A公开了利用亚胺还原酶还原麦斯明生成(S)-降烟碱，将(S)-降烟碱进行甲基化形成(S)-烟碱，但该方法同样存在需要制备两种酶且酶无法重复使用的问题。专利WO2020098978 A1公开了使用亚胺还原酶还原3-(1-吡咯啉-2-基)吡啶，以葡萄糖脱氢酶/葡萄糖为辅酶再生系统，进行(S)-烟碱的催化反应，浓度为400mM时，24h转化率达99.6％，ee值为99.8％；最优的亚胺还原酶在底物浓度为1M时，24h转化率仅52.4％，ee值为99.6％。其不耐受高浓度底物3-(1-吡咯啉-2-基)吡啶，不利于放大生产，生产成本也偏高。
所以，开发一种获得高浓度、高纯度手性(S)-降烟碱且成本较低的工艺路线，具有较高的工业化应用价值和经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种固定化酶催化的高纯度(S)降烟碱的合成方法，通过固定化酶催化转化外消旋(R,S)-降烟碱生成高浓度(S)-手性降烟碱。
为解决上述技术问题，本发明提供一种固定化酶催化的高纯度(S)-降烟碱的合成方法，它包括如下步骤：
(1)以外消旋(R,S)-降烟碱为原料，利用固定化酶催化其中的(R)-降烟碱生成麦斯明；
(2)以步骤(1)生成的麦斯明为原料，经过所述固定化酶催化还原生成外消旋(R,S)-降烟碱；
通过上述步骤的不断循环从而消耗反应体系中的(R)-降烟碱获得高纯度的(S)-降烟碱。
具体的，所述固定化酶为高(R)选择性单胺氧化酶、亚胺还原酶、葡萄糖脱氢酶、过氧化氢酶和树脂共价结合而得。
具体的，所述树脂是环氧树脂，所述环氧树脂的型号是西安蓝晓的树脂LXTE-600、LXTE-601、LXTE-602、LXTE-603、LXTE-604、LXTE-605、LXTE-606、LXTE-607、LXTE-608、LXTE-609和天津南开和成的树脂ES-1、ES-107、ES-108、ES-103B中的任一种。
具体的，所述高(R)选择性单胺氧化酶选自以下组：
(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；以及
(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列。
具体的，所述亚胺还原酶选自以下组：
(3)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；以及
(4)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列。
具体的，所述高(R)选择性单胺氧化酶选自以下组：
(a)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％，或90％以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
具体的，所述亚胺还原酶选自以下组：
(d)如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(e)与(d)限定的序列互补的多核苷酸；或
(f)与(d)限定的序列具有至少70％，或90％以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
具体的，所述固定化酶的制备方法是向500～2000ml所述高(R)选择性单胺氧化酶的酶液、200～500ml所述亚胺还原酶的酶液、100～300ml所述葡萄糖脱氢酶、100～300ml所述过氧化氢酶的酶液，加入140～600g的K2HPO4·3H2O和14～60g的KH2PO4，搅拌溶解，再加入50～300g环氧树脂，于25℃，180rpm搅拌吸附24h，抽滤，去离子水洗三遍，再用500ml PBS缓冲液(200mM，pH 8.0,包含0.5M的NaCl)，洗2次，抽滤即得所述固定化酶。
具体的，所述固定化酶的酶活范围是200～400U/g。
具体的，所述固定化酶与所述外消旋(R,S)-降烟碱的投料质量摩尔比(M/mol)是(80～200)：1。
具体的，所述反应体系的反应温度是15～40℃。
具体的，所述反应体系的反应时间是16～48小时。
具体的，所述反应体系还包括使用PBS缓冲液(200mM，pH 7.0)维持反应pH在pH6.8～7.2。
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用固定化高选择性、高活性的固定化酶催化转化外消旋(R,S)-降烟碱生成高浓度(S)-降烟碱。该固定化酶不催化(S)-降烟碱只催化(R)-降烟碱，通过本发明不断消耗外消旋(R,S)-降烟碱中的(R)-降烟碱从而得到高纯度的(S)-降烟碱。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对本发明所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是外消旋(R,S)-降烟碱生产高纯度(S)-降烟碱路线图；
图2是高(R)选择性单胺氧化酶E1、亚胺还原酶E2、过氧化氢酶E3、葡萄糖脱氢酶E4的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.
本发明中，高(R)选择性单胺氧化酶E1来源于Arthrobacter nicotinovorans,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；亚胺还原酶E2来源于Amycolatopsis orientalis，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；过氧化氢酶E3来源于Bacillus pumilus(Gene ID:WP_144458738.1)和葡萄糖脱氢酶E4来源于Exiguobacterium sibiricum(Gene ID:ACB59697.1)，以上四种酶的基因均由基因合成获得，每条基因均连接在载体pET28a上。菌株进行平板培养，最后挑单克隆进行逐级液体培养。首先转入3ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃，220rpm)过夜培养，接种量1％转接到100ml含50μM卡那霉素的LB培养液中，培养4～8h，最后再转入10L发酵罐里进行培养；当细胞OD达25左右时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，然后30℃诱导蛋白表达18小时，最后对发酵液进行高速离心、收集细胞(6000rpm，30min)获得湿菌体600～1000g，-20℃保存待用。取10g湿菌体重悬于100ml PBS缓冲液(50mM，pH 8.0)混合均匀，利用高压均质破碎细胞，12000rpm离心20min，收集上清获得四种酶液。
分别取E1,E2,E3和E4的上清酶液40ul,加入10ul 5*上样染色液，100摄氏度处理10min，12000rpm离心30s，取10ul进行SDS-PAGE验证蛋白的表达情况和份量大小，结果如图2所示，E1，E2，E3和E4蛋白分子量大小分别为49kDa，30kDa，57kDa，29kDa符合预期。
实施例2.
将实施例1获得的高(R)选择性单胺氧化酶酶液(1000ml，酶液活力69.4U/mL)、亚胺还原酶酶液(300ml，酶液活力73.4U/mL)，葡萄糖脱氢酶(200ml，酶液活力81.4U/mL)和过氧化氢酶酶液(150ml，酶液活力82.7U/mL)混合，再加入250g的K2HPO4·3H2O和25g的KH2PO4，搅拌溶解，加入100g环氧树脂载体，25℃，180rpm搅拌吸附24h，抽滤，去离子水洗三遍，再用500ml PBS缓冲液(200mM，pH 8.0，含0.5M的NaCl)洗2次，抽滤，获得固定化复合酶。通过选择不同型号的树脂固定化筛选固定化酶活最高的树脂。
固定化酶活力检测方法如下：
以外消旋(R,S)-降烟碱为底物，检测固定化酶的活力，酶活检测方法为：5mL0.5mol/L外消旋(R,S)-降烟碱、3mmol(0.54g)葡萄糖溶于PBS缓冲液(200mM，pH7.0)定容至50mL,于30℃、200rpm的摇床保温20min，称取1.0g固定化酶加入反应体系中，30℃，200rpm摇床反应20min，静置30S，取2ml上清液，12000rpm离心3min，HPLC检测，根据标准品(S)-降烟碱浓度标准曲线计算酶活反应体系产物(S)-降烟碱的浓度，计算固定化酶活力。
检测不同型号的树脂制备的固定化酶活力，检测结果见下表1：
表1.不同型号的树脂制备的固定化酶活力
| 树脂型号 | 固定化酶活力(U/g) |
| LXTE-600 | 179 |
| LXTE-601 | 312 |
| LXTE-602 | 336 |
| LXTE-603 | 328 |
| LXTE-604 | 349 |
| LXTE-605 | 315 |
| LXTE-606 | 324 |
| LXTE-607 | 281 |
| LXTE-608 | 264 |
| LXTE-609 | 312 |
| ES-1 | 168 |
| ES-103B | 289 |
| ES-107 | 327 |
| ES-108 | 358 |
注：树脂LXTE-600、LXTE-601、LXTE-602、LXTE-603、LXTE-604、LXTE-605、LXTE-606、LXTE-607、LXTE-608、LXTE-609来源于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；树脂ES-1、ES-107、ES-108、ES-103B来源于天津南开和成科技有限公司。
实施例3.
本实施例选用实施例2制备的酶活力较高的固定化酶(胺氧化酶、亚胺还原酶、葡萄糖脱氢酶和过氧化氢酶，ES-108树脂制备固定化酶)催化转化外消旋(R,S)-降烟碱生成(S)-降烟碱。
向500mL 0.5mol/L的外消旋(R,S)-降烟碱溶液中加入16g K2HPO4·3H2O、5g的KH2PO4、0.3mol(54g)葡萄糖、0.01mol(6.8g)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐，搅拌均匀，再加入30g固定化酶，反应温度30℃，搅拌转速200rpm，利用2M NaOH调节pH7.0左右，反应30h后，HPLC检测转化率和产物ee值,抽滤收集反应液，加入50mlPBS缓冲液(200mM，pH 7.0)，开启搅拌洗涤固定化酶，抽滤，收集洗涤液，相同操作洗涤2遍，收集的2次洗涤液和前面收集的反应液混合进行下步后处理，回收的固定化酶进行下一批次反应。相同操作，固定化酶重复实验20批。
结果如下表2，在0.5mol/L底物浓度条件下固定化酶重复实验20批次的转化率大于99％，(S)-降烟碱光学纯度(ee)大于99.8％。反应结束后固定化酶可以重复使用。
表2.在0.5mol/L底物浓度条件下固定化酶重复实验20批次的转化率
实施例4.
本实施例选用实施例2制备的酶活力较高的固定化酶(胺氧化酶、亚胺还原酶、葡萄糖脱氢酶和过氧化氢酶，ES-108树脂制备固定化酶)催化转化外消旋(R,S)-降烟碱生成(S)-降烟碱。
向500mL 0.5mol/L的外消旋(R,S)-降烟碱溶液中加入16g K2HPO4·3H2O、5g的KH2PO4、0.6mol(108g)葡萄糖、0.02mol(13g)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐，搅拌均匀，再加入60g固定化酶，利用2M NaOH调节pH7.0左右，反应温度30℃，搅拌转速200rpm，反应30h后，HPLC检测转化率和产物ee值抽滤收集反应液，加入70mlPBS缓冲液(200mM，pH 7.0)，开启搅拌清洗固定化酶，抽滤，收集清洗液，相同操作洗涤2遍，收集的2次清洗液和前面反应液混合进行下步后处理，回收的固定化酶进行下一批次反应。相同操作，固定化酶重复实验20批。
结果如下表3，在1mol/L底物浓度条件下固定化酶重复实验20批次的转化率大于95.1％，(S)-降烟碱光学纯度(ee值)大于99.7％。反应结束后固定化酶可以重复使用。
表3.在1mol/L底物浓度条件下固定化酶重复实验20批次的转化率
| 批次 | 反应时间/h | 转化率/％ | ee值/％ |
| 1 | 30 | 99.2 | 99.8 |
| 20 | 30 | 95.1 | 99.7 |
实施例5.
本实施例选用实施例2制备的酶活力较高的固定化酶(胺氧化酶、亚胺还原酶、葡萄糖脱氢酶和过氧化氢酶，ES-108树脂制备固定化酶)催化转化外消旋(R,S)-降烟碱生成(S)-降烟碱。
向500mL 0.5mol/L的外消旋(R,S)-降烟碱溶液中加入16g K2HPO4·3H2O、5g的KH2PO4、1.2mol(216g)葡萄糖、0.04mol(27g)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸钠盐，搅拌均匀，再加入100g固定化酶，利用2M NaOH调节pH7.0左右，反应温度30℃，搅拌转速200rpm，反应30h后，HPLC检测转化率和产物ee值抽滤收集反应液，加入100mlPBS缓冲液(200mM，pH 7.0)，开启搅拌洗涤固定化酶，抽滤，收集洗涤液，相同操作洗涤2遍，收集的2次洗涤液和前面收集的反应液混合进行下步后处理，回收的固定化酶进行下一批次反应。相同操作，固定化酶重复实验20批。
结果如下表4，在2mol/L底物浓度条件下固定化酶重复实验20批次的转化率大于86.5％，(S)-降烟碱光学纯度(ee值)大于99.1％。反应结束后固定化酶可以重复使用。
表4.在2mol/L底物浓度条件下固定化酶重复实验20批次的转化率
| 批次 | 反应时间/h | 转化率/％ | ee值/％ |
| 1 | 30 | 97.8 | 99.4 |
| 20 | 30 | 86.5 | 99.1 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (14)
1.一种固定化酶催化的高纯度(S)-降烟碱的合成方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)以外消旋(R,S)-降烟碱为原料，利用固定化酶催化其中的(R)-降烟碱生成麦斯明；
(2)以步骤(1)生成的麦斯明为原料，经过所述固定化酶催化还原生成外消旋(R,S)-降烟碱；
通过上述步骤的不断循环从而消耗反应体系中的(R)-降烟碱获得高纯度的(S)-降烟碱。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述固定化酶为高(R)选择性单胺氧化酶、亚胺还原酶、葡萄糖脱氢酶、过氧化氢酶和树脂共价结合而得。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述树脂是环氧树脂，所述环氧树脂的型号是西安蓝晓的树脂LXTE-600、LXTE-601、LXTE-602、LXTE-603、LXTE-604、LXTE-605、LXTE-606、LXTE-607、LXTE-608、LXTE-609和天津南开和成的树脂ES-1、ES-107、ES-108、ES-103B中的任一种。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述高(R)选择性单胺氧化酶选自以下组：
(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；以及
(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述亚胺还原酶选自以下组：
(3)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；以及
(4)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述高(R)选择性单胺氧化酶选自以下组：
(a)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％，或90％以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述亚胺还原酶选自以下组：
(d)如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(e)与(d)限定的序列互补的多核苷酸；或
(f)与(d)限定的序列具有至少70％，或90％以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
8.根据权利要求4或5或6或7所述的合成方法，其特征在于，所述固定化酶的制备方法是向500～2000ml所述高(R)选择性单胺氧化酶的酶液、200～500ml所述亚胺还原酶的酶液、100～300ml所述葡萄糖脱氢酶、100～300ml所述过氧化氢酶的酶液，加入140～600g的K2HPO4·3H2O和14～60g的KH2PO4，搅拌溶解，再加入50～300g环氧树脂，于25℃，180rpm搅拌吸附24h，抽滤，去离子水洗三遍，再用500ml PBS缓冲液(200mM，pH 8.0,包含0.5M的NaCl)，洗2次，抽滤即得所述固定化酶。
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述高(R)选择性单胺氧化酶、亚胺还原酶、葡萄糖脱氢酶、过氧化氢酶的酶液的酶活范围都在50～100U/mL。
10.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述固定化酶的酶活范围是200～400U/g。
11.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述固定化酶与所述外消旋(R,S)-降烟碱的投料质量摩尔比(M/mol)是(80～200)：1。
12.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系的反应温度是15～40℃。
13.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系的反应时间是16～48小时。
14.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系还包括使用PBS缓冲液(200mM，pH 7.0)维持反应pH在pH 6.8～7.2。
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2022
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|---|---|---|---|---|
| CN116217544A (zh) * | 2023-05-08 | 2023-06-06 | 济南悟通生物科技有限公司 | 一种(s)-降烟碱的合成方法 |
| CN116217544B (zh) * | 2023-05-08 | 2023-08-29 | 济南悟通生物科技有限公司 | 一种(s)-降烟碱的合成方法 |
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