CN107586793B - 制备具有多个手性中心的醇化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备具有多个手性中心的醇化合物的方法。该方法包括以下步骤：
在酮还原酶的作用下在反应体系中反应生成
其中，R1、R2分别为甲基或乙基，R3为叔丁氧羰基或者苄氧羰基，n＝0或1。应用本发明的技术方案，酮还原酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，可以高效生产手性醇，并可以选择性的拆分，一步获得具有多个手性中心的手性醇化合物；而且底物相对廉价，产物纯度高的特点，适合推广用于手性醇的工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及手性化合物合成技术领域，具体而言，涉及一种制备具有多个手性中心的醇化合物的方法。
背景技术
手性醇是一类手性碳上连有羟基的旋光性化合物，广泛用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。手性醇的合成方法主要包括物理分离法、拆分法及不对称还原法。其中，化学拆分常用酒石酸等拆分剂进行多次拆分，所得产物化学纯度可达到99％以上，但其缺点就是拆分收率极低，只有不到10％；另外，手性拆分剂价格较高，大大地增加了生产成本；操作较为复杂，且后处理不利用环境保护。利用酮类化合物的不对称还原合成手性醇的方法是目前生产手性醇的一种重要方法，其理论产率可高达100％，包括化学不对称还原法和生物不对称还原法。其中，化学不对称还原法主要是利用手性金属配合物作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已部分用于工业生产，但是该反应过程需要高压加氢、手性金属配合物合成复杂并且价格昂贵，产物中存在重金属的残留导致产物分离困难，环境污染较大，应用受到一定的限制；而生物催化不对称还原法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，避免了产物中的重金属残留，对环境友好，弥补了化学方法的不足，是一种绿色高效经济的方法。用于不对称还原的生物催化剂主要包括微生物全细胞和氧化还原酶，如专利申请CN201510026759.1公开了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基还原酶，并以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，用于不对称还原前手性羰基化合物之类手性醇；如专利CN201010599376.0公开了一种来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)NRRLB-16638的氧化还原酶作为羰基还原酶催化剂用于不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇；酶法还原具有比全细胞催化产物选择性更高、反应易处理等优点。
尽管如此，通过一步反应仅能获得含一个手性中心的手性醇化合物。而含有多个连续手性中心的结构单元常见于各种天然产物和人工合成的手性药物中，但由于异构体的数量随着手性中心的数目成指数上升，由此导致高选择性的合成多个手性中心的单一异构体非常困难，一直以来是不对称催化研究领域最具挑战性的课题之一。
也就是说，现有技术中生产手性醇仍存在下列问题：1)通常需要手性金属催化剂，生产成本高；2)产物的光学纯度较难达到要求；3)大量使用有机试剂，造成环境污染严重；4)不能一步获得两个几多个手性中心的产品。
发明内容
本发明旨在提供一种制备具有多个手性中心的醇化合物的方法，以解决现有技术中生产手性醇不能一步获得具有两个及多个手性中心产品的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种制备具有多个手性中心的醇化合物的方法。该方法包括以下步骤：
在酮还原酶的作用下在反应体系中反应生成
其中，R1、R2分别为甲基或乙基，R3为叔丁氧羰基或者苄氧羰基，n＝0或1。
进一步地，酮还原酶的氨基酸序列为选自如下之一的序列：1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有高度立体选择性将
转化成
的酮还原酶活性的氨基酸序列。
进一步地，反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。
进一步地，反应体系中
的摩尔浓度为50mM～500mM。
进一步地，辅酶为NADH。
进一步地，辅酶再生体系包括：D-葡萄糖、辅酶NAD+和葡萄糖脱氢酶GDH；或甲酸根化合物、辅酶NAD+和甲酸脱氢酶FDH；或异丙醇、辅酶NAD+和醇脱氢酶ADH。
进一步地，缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
进一步地，反应体系中还包括促溶剂，促溶剂的加入量为反应体积的1％～15％V/V。
进一步地，促溶剂为聚乙二醇PEG-400、二甲基亚砜、异丙醇、水、乙腈、甲醇或甲基叔丁基醚。
进一步地，反应体系的pH值为6.0～8.0，反应体系的反应温度为20℃～45℃。
应用本发明的技术方案，酮还原酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，可以高效生产手性醇，并可以选择性的拆分，一步获得具有多个手性中心的手性醇化合物；而且底物相对廉价，产物纯度高的特点，适合推广用于手性醇的工业生产。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
针对背景技术中提到的具有多个手性中心化合物的生产方法存在的一系列问题，本发明提出下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种制备具有多个手性中心的醇化合物的方法。该方法包括以下步骤：
其中，R1、R2分别为甲基或乙基，R3为叔丁氧羰基或者苄氧羰基，n＝0或1，优选的，酮还原酶的氨基酸序列为选自如下之一的序列：
1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有高度立体选择性将
转化成
的酮还原酶活性的氨基酸序列。
其中，高度立体选择性在本发明中是本领域通用的含义，优选e.e值≥90％，de值≥90％。
上述原料为商业化的原料或者易制备的原料且价格低廉，可以满足规模化生产的需要。应用本发明的技术方案，酮还原酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地还原作用，可以高效生产手性醇，并可以选择性的拆分，一步获得具有多个(本发明中的“多个”包括两个及两个以上)手性中心的手性醇化合物；而且底物相对廉价，产物纯度高的特点，适合推广用于手性醇的工业生产。
为了使上述反应更加顺利的进行，反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液、。其中，缓冲液使反应体系能够具备良好的pH值。优选的，缓冲液为缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。。反应体系的pH值为6.0～8.0，反应体系的反应温度为20℃～45℃。
根据本发明一种典型的实施方式，反应体系中
的摩尔浓度为50mM～500mM，辅酶的用量为0.001-0.030g/g酮
优选的，辅酶为NAD+，辅酶再生体系包括：D-葡萄糖、辅酶NAD+和葡萄糖脱氢酶GDH；或甲酸根化合物、辅酶NAD+和甲酸脱氢酶FDH；或异丙醇、辅酶NAD+和醇脱氢酶ADH。
促溶剂的作用能够很好地溶解上述原料，以方便反应的进行，根据实际需要，反应体系中还可以包括促溶剂，优选的，促溶剂的加入量为反应体积的1％～15％V/V，促溶剂可以为聚乙二醇PEG-400、二甲基亚砜、异丙醇、水、乙腈、甲醇或甲基叔丁基醚。
优选的，反应完成后进一步包括：将反应体系用硅藻土过滤后，用有机溶剂萃取，得到的有机相经干燥、过滤、浓缩后得到粗品化合物；然后将粗品化合物进行柱层析纯化。优选的，柱层析采用的填料为硅胶，洗脱液为乙酸乙酯：石油醚＝1:20；有机溶剂优选为乙酸乙酯。
根据本发明一种典型的实施方式，进一步包括：对得到的粗品化合物进行GC和HPLC检测。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
(1)投料：向10mL塑料瓶中，加入30mg主原料
100uL DMSO，1.5mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH＝7.0)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；
(2)加酮还原酶：向10mL塑料瓶中，加入1mg辅酶NAD+，1.1mg辅酶NADP+，130mgD-葡萄糖，0.3g酮还原酶主酶KRED和5mg葡萄糖脱氢酶GDH，体系pH＝7.0；
(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应12h；
(4)后处理：体系用2mL乙酸乙酯萃取，静置分液，经气相检测产品
的生成。
共筛选了100种酮还原酶(此100种酮还原酶均是来自文献报道的已知序列人工合成或上述序列经过人工突变得到)，使用上述酮还原酶的反应体系中绝大部分剩余大量原料，没有产品生成，转化率均为0，部分检测结果如表1所示，有两种酶可以转化该底物产生产品，但选择性不好，只有ACCR显示了48％的转化率，较高的ee值及de值。可见并非所有酮还原酶均适用于本发明的一步生成含两个手性中心的手性醇制备反应。
表1酮还原酶的来源及转化率结果
实施例2
(1)投料：向2L反应釜中，加入20g主原料
500mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；
(2)加酮还原酶：向2L反应釜中，加入0.15g的辅酶NAD+，54g的D-葡萄糖，40g酮还原酶ACCR(SEQ ID NO：1)和2g葡萄糖脱氢酶GDH，体系pH＝6.0；
(3)反应：体系于25℃反应，搅拌反应24h；
(4)后处理：体系用200g硅藻土过滤，1.8L乙酸乙酯萃取，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，经柱层析纯化，得到8.2g纯度较高的产品
纯度95.0％，收率41％，ee值99.5％，de值99.2％。
实施例3
(1)投料：向2L反应釜中，加入20g主原料
150mL异丙醇，1L磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝7.5)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；
(2)加酮还原酶：向2L反应釜中，加入0.2g的辅酶NAD+，10g酮还原酶ACCR(SEQ IDNO：1)，体系pH＝7.5；
(3)反应：体系于40℃反应，搅拌反应16h；
(4)后处理：体系用200g硅藻土过滤，1.5L乙酸乙酯萃取，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，经柱层析纯化，得到9.2g纯度较高的产品
纯度92.7％，收率46％，ee值98.7％，de值99％。
实施例4
(1)投料：向10mL反应瓶中，加入1g主原料
5mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝8.0)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；
(2)加酮还原酶：向10mL反应瓶中，加入0.01g的辅酶NAD+，2.7g的D-葡萄糖，40g酮还原酶ACCR-A23Y(SEQ ID NO：7)和2g葡萄糖脱氢酶GDH，体系pH＝8.0；
(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应24h；
(4)后处理：体系用10mL乙酸乙酯萃取，静置分液，经过GC检测，产品
GC体系纯度95.0％，ee值98.7％，de值99.0％。
从以上的描述中，可以看出，本发明中公开的酮还原酶可将酮类化合物还原并拆分，得到较高ee值及de值的手性醇产品，合成方法采用的工艺条件稳定，反应条件温和，整个生产过程中操作简单、污染较低，为不对称还原并拆分酮类化合物一步获得含有两个手性中心的手性醇提供了一种新的思路和方法。本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1)避免了化学合成法中手性金属催化剂的使用，并且原料为商业化的原料或者易制备的原料且价格低廉，极大的降低了生产成本；
2)产物的光学纯度高；
3)避免了大量使用有机试剂，环境友好；
4)一步获得具有多个手性中心的手性醇化合物。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 吉林凯莱英医药化学有限公司
<120> 制备具有多个手性中心的醇化合物的方法
<130> PN74325KLY
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> Acetobacter sp
<400> 1
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Glu
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 2
<211> 324
<212> PRT
<213> Escherichia coli K12 strain
<400> 2
Met Lys Pro Ser Val Ile Leu Tyr Lys Ala Leu Pro Asp Asp Leu Leu
1 5 10 15
Gln Arg Leu Gln Glu His Phe Thr Val His Gln Val Ala Asn Leu Ser
20 25 30
Pro Gln Thr Val Glu Gln Asn Ala Ala Ile Phe Ala Glu Ala Glu Gly
35 40 45
Leu Leu Gly Ser Asn Glu Asn Val Asn Ala Ala Leu Leu Glu Lys Met
50 55 60
Pro Lys Leu Arg Ala Thr Ser Thr Ile Ser Val Gly Tyr Asp Asn Phe
65 70 75 80
Asp Val Asp Ala Leu Thr Ala Arg Lys Ile Leu Leu Met His Thr Pro
85 90 95
Thr Val Leu Thr Glu Thr Val Ala Asp Thr Leu Met Ala Leu Val Leu
100 105 110
Ser Thr Ala Arg Arg Val Val Glu Val Ala Glu Arg Val Lys Ala Gly
115 120 125
Glu Trp Thr Ala Ser Ile Gly Pro Asp Trp Tyr Gly Thr Asp Val His
130 135 140
His Lys Thr Leu Gly Ile Val Gly Met Gly Arg Ile Gly Met Ala Leu
145 150 155 160
Ala Gln Arg Ala His Phe Gly Phe Asn Met Pro Ile Leu Tyr Asn Ala
165 170 175
Arg Arg His His Lys Glu Ala Glu Glu Arg Phe Asn Ala Arg Tyr Cys
180 185 190
Asp Leu Asp Thr Leu Leu Gln Glu Ser Asp Phe Val Cys Leu Ile Leu
195 200 205
Pro Leu Thr Asp Glu Thr His His Leu Phe Gly Ala Glu Gln Phe Ala
210 215 220
Lys Met Lys Ser Ser Ala Ile Phe Ile Asn Ala Gly Arg Gly Pro Val
225 230 235 240
Val Asp Glu Asn Ala Leu Ile Ala Ala Leu Gln Lys Gly Glu Ile His
245 250 255
Ala Ala Gly Leu Asp Val Phe Glu Gln Glu Pro Leu Ser Val Asp Ser
260 265 270
Pro Leu Leu Ser Met Ala Asn Val Val Ala Val Pro His Ile Gly Ser
275 280 285
Ala Thr His Glu Thr Arg Tyr Gly Met Ala Ala Cys Ala Val Asp Asn
290 295 300
Leu Ile Asp Ala Leu Gln Gly Lys Val Glu Lys Asn Cys Val Asn Pro
305 310 315 320
His Val Ala Asp
<210> 3
<211> 352
<212> PRT
<213> Thermoanaerobium brockii
<400> 3
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu
50 55 60
Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln
85 90 95
Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala
130 135 140
Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly
165 170 175
Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys
195 200 205
Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu
210 215 220
Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile
225 230 235 240
Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val
245 250 255
Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu
260 265 270
Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg
290 295 300
Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val
305 310 315 320
Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu
325 330 335
Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala
340 345 350
<210> 4
<211> 272
<212> PRT
<213> Rhodotorula rubra JCM3782
<400> 4
Met Ser Ser Pro Ser Asp Gly Pro Phe Pro Lys Ala Thr Pro Gln Leu
1 5 10 15
Pro Asn Ser Val Phe Asp Met Phe Ser Met Lys Gly Lys Val Thr Ala
20 25 30
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Phe Ala Ala Ala Glu Ala Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Gly Gly Asp Val Ala Leu Leu Tyr Arg Ser Ala Pro Asn
50 55 60
Met Glu Glu Arg Ser Ala Glu Leu Ala Lys Arg Phe Gly Val Lys Val
65 70 75 80
Lys Ser Tyr Gln Cys Glu Val Thr Glu His Glu Ser Val Lys Gln Ala
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Ile Glu Ala Val Glu Lys Asp Phe Gly Arg Leu Asp Cys Tyr Ile Ala
100 105 110
Asn Ala Gly Gly Gly Val Pro Gly Ser Ile Asn Pro Asp Tyr Pro Leu
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Glu Ala Trp His Lys Thr Gln Ser Val Asn Leu His Ser Thr Phe Tyr
130 135 140
Ala Ala Arg Glu Cys Ala Arg Ile Phe Lys Ala Gln Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Phe Ile Ala Thr Thr Ser Ile Ser Ala Arg Ile Val Asn Val Pro Tyr
165 170 175
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180 185 190
Arg Ser Leu Ala Arg Asp Trp Arg Asn Phe Ala Arg Val Asn Thr Ile
195 200 205
Ser Pro Gly Phe Phe Asp Thr Pro Met Gly Pro Ser Asp Lys Ala Val
210 215 220
Glu Asp Val Leu Tyr Gln Lys Ser Val Leu Gly Arg Ala Gly Asp Val
225 230 235 240
Lys Glu Leu Lys Ala Ala Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asn Ala Ser Thr
245 250 255
Tyr Thr Thr Gly Ala Asp Leu Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Cys Leu Thr
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<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Pichia stipites CBS 6054
<400> 5
Met Thr Asn Asn Pro Ser Ile Thr Ser His Ile Asn Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu
20 25 30
Phe Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ala Gly
35 40 45
Ile Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly Ala Asp Val
50 55 60
Ala Ile Trp Tyr Asn Ser Gln Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys Ile
65 70 75 80
Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Ile Asp Ile Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu
115 120 125
Gly Glu Ser Val Glu Ile Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val Ile
130 135 140
Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys
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Ile Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met Ile Phe Thr Ala Ser Met
165 170 175
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180 185 190
Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala Ile Glu Trp
195 200 205
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Glu Ile Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp Ile Lys Ser Lys Trp Trp Gln
225 230 235 240
Phe Ile Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gln Glu Leu Val Gly Ala
245 250 255
Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp
260 265 270
Leu Ile Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro
275 280
<210> 6
<211> 285
<212> PRT
<213> Pichia stipites CBS 6054
<400> 6
Met Thr Val Glu Thr Ala Thr Ala Pro Gln Ser Met Cys Asn Thr Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ser Leu Pro Ala Ala Asp Pro Val Leu Pro Thr Asn Val Leu
20 25 30
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35 40 45
Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Ser Glu Ala Tyr Leu Gln Ala Gly Ile
50 55 60
Ser Lys Leu Ala Ile Ile Asp Tyr Ala Pro Asn Glu Ala Ala Leu Asp
65 70 75 80
Glu Leu Arg Ser Arg Phe Leu Lys Ser Thr Ile Val Tyr His Asn Cys
85 90 95
Asp Val Arg Lys Ala Asp Gln Val Lys Ser Val Ile Asp Lys Ile Glu
100 105 110
Glu Glu Phe Lys Val Ile Asp Ile Phe Val Ala Asn Ala Gly Ile Ala
115 120 125
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130 135 140
Asn Val Met Asn Val Asp Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Ile Gly Lys Ile Phe Arg Lys Gln Gly Lys Gly Ser Leu Val Met Thr
165 170 175
Ala Ser Met Ser Ala His Ile Val Asn Val Pro Gln Leu Gln Ala Ala
180 185 190
Tyr Asn Ala Ala Lys Ala Gly Val Leu His Leu Gly Lys Ser Leu Ala
195 200 205
Val Glu Trp Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr
210 215 220
Ile Ser Thr Glu Leu Ser Asp Phe Val Pro Thr Glu Met Lys Asn Lys
225 230 235 240
Trp Tyr Ala Leu Thr Pro Gln Gly Arg Gln Gly Ala Pro Arg Glu Leu
245 250 255
Cys Gly Ala Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr
260 265 270
Gly Ser Asp Ile Arg Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ser Val
275 280 285
<210> 7
<211> 253
<212> PRT
<213> Acetobacter sp
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (23)..(23)
<223> SEQ ID NO：1 23位 A突变为Y
<400> 7
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Tyr Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
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35 40 45
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Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Glu
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
Claims (9)
1.一种制备具有多个手性中心的醇化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
其中，R1为甲基，R2为亚甲基或亚乙基，R3为叔丁氧羰基或者苄氧羰基，n=0或1，且所述
为五元环或六元环化合物；
所述酮还原酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还包括辅酶、辅酶再生体系和缓冲液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中
的摩尔浓度为50mM~500mM。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述辅酶为NADH。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生体系包括：
D-葡萄糖、辅酶NAD+和葡萄糖脱氢酶GDH；或
甲酸根化合物、辅酶NAD+和甲酸脱氢酶FDH；或
异丙醇、辅酶NAD+和醇脱氢酶ADH。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还包括促溶剂，所述促溶剂的加入量为反应体积的1%~15%V/V。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述促溶剂为聚乙二醇PEG-400、二甲基亚砜、异丙醇、水、乙腈、甲醇或甲基叔丁基醚。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系的pH值为6.0-8.0，所述反应体系的反应温度为20℃~45℃。
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