CN109796434B - 硫培南侧链的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫培南侧链的合成方法。该合成方法包括以下步骤：以
为原料采用酮还原酶还原生成
进而通过单加氧酶氧化生成
对
进行对甲苯磺酰基保护后，再通过硫酰基保护得到目标产物
Description
技术领域
本发明涉及物质合成技术领域，具体而言，涉及一种硫培南侧链的合成方法。
背景技术
硫培南是一种广谱抗生素，可被命名为(5R,6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-7-氧代-3-[[(1R,3S)-四氢-1-氧-3-噻吩基]硫]-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸。人们已对硫培南及其某些前药进行了各种临床前及临床研究。硫培南侧链作为合成硫培南的关键中间体已被广泛应用。以下是硫培南侧链应用比较广泛的合成路线之一，采用四氢噻吩-3-酮为起始原料，经过生物转化合成R构型的醇中间体。再通过上Ts保护羟基，使用OXONE氧化，得到反式构型的氧化物。再通过硫酰基保护，得到目标产物。[Organic ProcessResearch and Development,2010,vol. 14,#1,p.188-192]文献中有第一步合成方法。[Journal of Organic Chemistry,1992,vol.57,# 16,p.4352-4361]文献中有后三步合成路线。
但是，上述合成方法存在一系列的技术问题：首先传统路线第一步采用了生物转化达到88％收率，但从第一步产品的结构来看，其水溶性非常好，不易从水相中萃取出来。实际重复文献时我们也发现使用乙酸乙酯萃取虽然可以得到目标产量，但由于乙酸乙酯萃取效率较低，需要耗费大量的时间及溶剂，且收率偏低。其次，第三步中使用OXONE氧化，收率为77％，de值在80～90％。其中，第三步5～10％的顺式异构体要在最后一步多次析晶才能除去。第三步收率偏低，且氧化的选择性不高。
发明内容
本发明旨在提供一种硫培南侧链的合成方法，以解决现有技术中硫培南侧链的合成需要耗费大量溶剂的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种硫培南侧链的合成方法。该合成方法包括以下步骤：以
为原料采用酮还原酶还原生成
进而通过单加氧酶氧化生成
对
进行对甲苯磺酰基保护后，再通过硫酰基保护得到目标产物
进一步地，以
为原料采用酮还原酶还原生成
后的反应体系终止反应后直接用于加入单加氧酶氧化生成
进一步地，以
为原料采用酮还原酶还原生成
后的反应体系终止反应后进行
的浓缩纯化，然后
用于加入单加氧酶氧化生成
进一步地，将通过单加氧酶氧化生成
后的体系浓缩除水，用二氯甲烷稀释体系，同时将酶变性，抽滤后得到的二氯甲烷溶液投入对甲苯磺酰基保护反应。
进一步地，酮还原酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
进一步地，单加氧酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
进一步地，以
为原料采用酮还原酶还原生成
的步骤中，还原反应的温度为 10～37℃，优选为15～35℃。
进一步地，以
为原料采用酮还原酶还原生成
的步骤中，当
剩余≤1％，终止反应，将反应体系在温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，加入乙酸乙酯后过滤；过滤后的溶液继续于温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，得到黄色油状液体即为
进一步地，
通过单加氧酶氧化生成
的温度为10～37℃，pH为6.5～9.5，反应过程中持续向体系内鼓入空气；优选的，
通过单加氧酶氧化生成
的温度为 20～35℃，pH为7.5～8.5；优选的，
的转化率大于等于99％后终止反应，将反应体系于温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，加入二氯甲烷后过滤除去变性的酶，再将二氯甲烷于温度＜40℃，压力≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到
进一步地，合成方法的路线如下：
应用本发明的技术方案，使用酮还原酶和单加氧酶，分别进行第一步和第二步两步生物转化，再将第二步氧化产物进行Ts(对甲苯磺酰基)保护后，最后通过硫酰基保护得到目标产物，由于第一步和第二步均为生物转化，不需要通过乙酸乙酯萃取，减少了乙酸乙酯的用量。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
针对背景技术中记载的技术问题，本发明旨在提出新型的硫培南侧链的合成路线及一系列技术方案，优化上述传统路线中第一步萃取效率低，收率较低和第三步收率偏低，氧化后 de值偏低等问题。
本发明中，合成方法的路线如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种硫培南侧链的合成方法。该合成方法包括以下步骤：以
为原料采用酮还原酶还原生成
进而通过单加氧酶氧化生成
对
进行对甲苯磺酰基保护后，再通过硫酰基保护得到目标产物
应用本发明的技术方案，使用酮还原酶和单加氧酶，分别进行第一步和第二步两步生物转化，再将第二步氧化产物进行Ts(对甲苯磺酰基)保护后，最后通过硫酰基保护得到目标产物，由于第一步和第二步均为生物转化，不需要通过乙酸乙酯萃取，减少了乙酸乙酯的用量。
根据本发明一种典型的实施方式，以
为原料采用酮还原酶还原生成
后的反应体系终止反应后直接用于加入单加氧酶氧化生成
也就是说，由于第二步也是生物转化反应，第一步反应结束的体系可以直接用于第二步反应，实现了两步生物转化连投，同时避免了第一步萃取效率的问题，提高了产量，大大节省了生产时间并节约了大量溶剂，减少了浓缩的能耗和浓缩后大量的三废。
当然，也可是以
为原料采用酮还原酶还原生成
后的反应体系终止反应后进行
的浓缩纯化，然后
用于加入单加氧酶氧化生成
优选的，以
为原料采用酮还原酶还原生成
的步骤中，当
剩余≤1％，终止反应，将反应体系在温度为 40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，加入乙酸乙酯后过滤；过滤后的溶液继续于温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，得到黄色油状液体即为
根据本发明一种典型的实施方式，将通过单加氧酶氧化生成
后的体系浓缩除水，用二氯甲烷稀释体系，同时将酶变性，抽滤后得到的二氯甲烷溶液投入对甲苯磺酰基保护反应。这样的处理操作十分简便，收率可以得到提高。
根据本发明一种典型的实施方式，酮还原酶(例如，NCBI，WP_020944327.1，Acetobacter pasteurianus)的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列： MARVAGKVAIVSGAANGIGKATAQLLAKEGAKVVIGDLKEEDGQKAVAEIKAAGG EAAFVKLNVTDEAAWKAAIGQTLKLYGRLDIAVNNAGIAYSGSVESTSLEDWRRVQSINLD GVFLGTQVAIEAMKKSGGGSIVNLSSIEGLIGDPMLAAYNASKGGVRLFTKSAALHCAKSGY KIRVNSVHPGYIWTPMVAGLTKEDAAARQKLVDLHPIGHLGEPNDIAYGILYLASDESKFVT GSELVIDGGYTAQ。使用该酮还原酶，可以将第一步底物浓度从100/L提高到了300g/L，大大提高了生产效率。优选的，以
为原料采用酮还原酶还原生成
的步骤中，还原反应的温度为10～37℃，优选为15～35℃。
根据本发明一种典型的实施方式，单加氧酶(例如，NCBI，AAN37494.1，Rhodococcus sp. Phi1)的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列： MTAQISPTVVDAVVIGAGFGGIYAVHKLHNEQGLTVVGFDKADGPGGTWYWNRYP GALSDTESHLYRFSFDRDLLQDGTWKTTYITQPEILEYLESVVDRFDLRRHFRFGTEVTSAIY LEDENLWEVSTDKGEVYRAKYVVNAVGLLSAINFPDLPGLDTFEGETIHTAAWPEGKNLAG KRVGVIGTGSTGQQVITALAPEVEHLTVFVRTPQYSVPVGNRPVTKEQIDAIKADYDGIWDS VKKSAVAFGFEESTLPAMSVSEEERNRIFQEAWDHGGGFRFMFGTFGDIATDEAANEAAASF IRSKIAEIIEDPETARKLMPTGLYAKRPLCDNGYYEVYNRPNVEAVAIKENPIREVTAKGVVTE DGVLHELDVLVFATGFDAVDGNYRRIEIRGRNGLHINDHWDGQPTSYLGVTTANFPNWFMV LGPNGPFTNLPPSIETQVEWISDTVAYAERNEIRAIEPTPEAEEEWTQTCTDIANATLFTRGDS WIFGANVPGKKPSVLFYLGGLGNYRNVLAGVVADSYRGFELKSAVPVTA。
该酶催化效率高，有机溶剂耐受性好，底物浓度可达到100g/L，转化率可达到99％以上。该酶立体选择性好，转化的产物de值＞99％，顺式异构体比例＜0.5％，解决了传统路线中de 值只有90％的缺点。优选的，
通过单加氧酶氧化生成
的温度为10～37℃，pH 为6.5～9.5，反应过程中持续向体系内鼓入空气；优选的，
通过单加氧酶氧化生成
的温度为20～35℃，pH为7.5～8.5；优选的，
的转化率大于等于99％后终止反应，将反应体系于温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，加入二氯甲烷后过滤除去变性的酶，再将二氯甲烷于温度＜40℃，压力≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
第一步：向1L四口瓶内加入四氢噻吩-3-酮200g，异丙醇400ml(2vol)，搅拌均匀，再加入酮还原酶酶液100ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)，NAD 2g(1％wt)，升温至30℃搅拌反应，约16h后，跟踪反应至四氢噻吩-3-酮剩余≤1％，停止反应。将体系于T(温度) ＝40～45℃，P(压力)≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入500ml乙酸乙酯后过滤。过滤后溶液继续于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，得到黄色油状液体。纯度：99％，ee值：100％，外标收率98％。
第一步：向500ml四口瓶内加入四氢噻吩-3-酮40g，异丙醇80ml(2vol)，搅拌均匀，再加入酮还原酶酶液20ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)，NAD 0.4g(1％wt)，升温至10℃搅拌反应，约30h后，跟踪反应至四氢噻吩-3-酮剩余≤1％，停止反应。将体系于T(温度) ＝40～45℃，P(压力)≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml乙酸乙酯后过滤。过滤后溶液继续于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，得到黄色油状液体。纯度：99％，ee值：100％，外标收率97％。
第一步：向500ml四口瓶内加入四氢噻吩-3-酮50g，异丙醇100ml(2vol)，搅拌均匀，再加入酮还原酶酶液25ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)，NAD 0.5g(1％wt)，升温至37℃搅拌反应。36h后体系跟踪转化率至92％不再转化，补加酮还原酶酶液5ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)继续跟踪体系至四氢噻吩-3-酮剩余≤1％，停止反应。将体系于T(温度)＝40～45℃， P(压力)≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入150ml乙酸乙酯后过滤。过滤后溶液继续于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，得到黄色油状液体。纯度：99％， ee值：100％，外标收率97％。
第一步：向500mL四口瓶内加入四氢噻吩-3-酮50g，异丙醇100ml(2vol)，搅拌均匀，再加入酮还原酶酶液25ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)，NAD 0.5g(1％wt)，升温至15℃搅拌反应，约20h后，跟踪反应至四氢噻吩-3-酮剩余≤1％，停止反应。将体系于T(温度) ＝40～45℃，P(压力)≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入150ml乙酸乙酯后过滤。过滤后溶液继续于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，得到黄色油状液体。纯度：99％，ee值：100％，外标收率98％。
第一步：向500mL四口瓶内加入四氢噻吩-3-酮50g，异丙醇100ml(2vol)，搅拌均匀，再加入酮还原酶酶液25ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)，NAD 0.5g(1％wt)，升温至35℃搅拌反应，约20h后，跟踪反应至四氢噻吩-3-酮剩余≤1％，停止反应。将体系于T(温度) ＝40～45℃，P(压力)≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入150ml乙酸乙酯后过滤。过滤后溶液继续于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，得到黄色油状液体。纯度：99％，ee值：100％，外标收率98％。
第二步：向1L四口瓶内加入250ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入30g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇15ml(0.5vol)，NAD 0.3g(1％wt)，单加氧酶酶液30ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液3m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.0。控温30℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度6L/h)，反应20h后，跟踪体系转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤ -0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入300ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第二步：向500ml四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.0。控温10℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应36h后，跟踪体系至转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞97％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率92％。
第二步：向500ml四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.0。控温37℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应20h后，跟踪体系至转化率大于等于97％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞97％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率90％。
第二步：向500ml四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至6.5。控温30℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应38h后，跟踪体系至转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞97％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第二步：向500ml四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至9.5。控温30℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应44h后，跟踪体系至转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率91％。
第二步：向500mL四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.0。控温20℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应26h后，跟踪体系转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤ -0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第二步：向500mL四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.0。控温35℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应22h后，跟踪体系转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤ -0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第二步：向500mL四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至7.5。控温30℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应22h后，跟踪体系转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤ -0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第二步：向500mL四口瓶内加入83ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)，再加入10g第一步的产品(由实施例1中200g反应制备)。加入异丙醇5ml(0.5vol)，NAD 0.1g(1％wt)，单加氧酶酶液10ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)，酮还原酶酶液1m l(0.1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.5。控温30℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度2L/h)，反应24h后，跟踪体系转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤ -0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入100ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到第二步的产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第三步：向1L四口瓶内加入50g第二步的产品，500ml二氯甲烷，降温到-5℃。再加入84.3g(2eq)三乙胺和83.4g(1.05eq)对甲苯磺酰氯。反应结束后，用70ml 6N盐酸淬灭反应，之后体系用150ml二氯甲烷萃取两次。有机相合并用150ml饱和食盐水洗后分液，有机相用20g无水硫酸镁干燥。干燥后的有机相于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分。得到黄色固体(第三步的产品)，纯度＞98％，外标收率85％。
第四步：向1L四口瓶内加入40g第三步的产品和400ml丙酮，再加入18.73g(1.5eq)硫代乙酸钾。那个体系升温至回流，反应结束后降温至室温抽滤。滤饼用400ml丙酮洗涤一次。合并有机相于T＜40℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分。得到的固体用300ml乙酸乙酯：正庚烷＝2：8的溶液重结晶。抽滤得到白色固体。纯度＞99％，de值100％，含量＞99％，外标收率80％。
实施例2
第一步和第二步连续进行：向1L四口瓶内加入四氢噻吩-3-酮100g，异丙醇200ml(2vol)，搅拌均匀，再加入酮还原酶酶液50ml(SEQ ID NO：1，0.5wt，1g/ml)，NAD 1g(1％wt)，升温至30℃搅拌反应，至四氢噻吩-3-酮剩余≤1％，停止反应。向1L四口瓶加入550ml磷酸钠冲液(100mmol/L，pH＝8.0)单加氧酶酶液100ml(SEQ ID NO：2，1wt，1g/ml)搅拌均匀，调pH至8.0。控温30℃搅拌反应，反应过程中持续向体系内鼓入空气(通气速度10L/h)至转化率大于等于99％后停止反应。后处理将体系于T＝40～45℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至基本无馏分，加入1000ml二氯甲烷后过滤除去变性的酶。再将二氯甲烷于T＜40℃，P≤-0.06Mpa 条件下浓缩至无馏分。得到Step 2产品，纯度＞98％，de值＞99％(顺式异构体＜0.5％)，外标收率93％。
第三步：向2L四口瓶内加入100g第二步的产品
1000ml二氯甲烷，降温到-5℃。再加入168.6g(2eq)三乙胺和166.8g(1.05eq)对甲苯磺酰氯。反应结束后，用140ml6N盐酸淬灭反应，之后体系用300ml二氯甲烷萃取两次。有机相合并用300ml饱和食盐水洗后分液，有机相用40g无水硫酸镁干燥。干燥后的有机相于T＜40℃，P≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分。得到黄色固体
纯度＞98％，外标收率86％。
第四步：向1L四口瓶内加入60g第三步的产品
和600ml丙酮，再加入28.1g(1.5eq)硫代乙酸钾。那个体系升温至回流，反应结束后降温至室温抽滤。滤饼用600ml 丙酮洗涤一次。合并有机相于T＜40℃，P≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分。得到的固体用 450ml乙酸乙酯：正庚烷＝2：8的溶液重结晶。抽滤得到白色固体
纯度＞99％，de 值100％，含量＞99％，外标收率79％。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1.使用自主研发的酮还原酶，将第一步底物浓度从[Organic Process Researchand Development,2010,vol.14,#1,p.188-192]文献中100g/L提高到了300g/L，大大提高了生产效率；
2.开发了第一步后处理方法，减少乙酸乙酯萃取效率低的问题，大大节省溶剂用量，收率可提高至98％；
3.由于第二步也是生物转化反应，第一步反应结束的体系可以直接用于第二步，实现了两步生物转化连投，同时避免了第一步萃取效率的问题，提高了产量，大大节省了生产时间并节约了大量溶剂，减少了浓缩的能耗和浓缩后大量的三废；
4.第二步使用自主研发的单加氧酶，该酶催化效率高，有机溶剂耐受性好，底物浓度可达到100g/L，转化率可达到99％以上，该酶立体选择性好，转化的产物de值＞99％，顺式异构体比例＜0.5％，解决了传统路线中de值只有90％的缺点；
5.两步生物转化结束后，将体系浓缩除水，用二氯甲烷稀释体系，同时将酶变性，抽滤后得到的二氯甲烷溶液可连投第三步Ts保护，后处理操作十分简便，并且两步总收率可达到 90％以上，比传统路线62.5％(88％*71％)大大提高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120> 硫培南侧链的合成方法
<130> PN101363KLY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> Acetobacter pasteurianus
<400> 1
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Glu
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 2
<211> 541
<212> PRT
<213> Rhodococcus sp. Phi1
<400> 2
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
20 25 30
Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
35 40 45
Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
435 440 445
Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
450 455 460
Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
Claims (11)
1.一种硫培南侧链的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：以
为原料采用酮还原酶还原生成
进而通过单加氧酶氧化生成
对
进行对甲苯磺酰基保护后，再通过硫代乙酸钾取代底物中的对甲苯磺酰氧基以得到目标产物
所述酮还原酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列；所述单加氧酶的氨基酸序列为如SEQID NO：2所述的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，以
为原料采用酮还原酶还原生成
后的反应体系终止反应后直接用于加入所述单加氧酶氧化生成
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，以
为原料采用酮还原酶还原生成
后的反应体系终止反应后进行
的浓缩纯化，然后
用于加入所述单加氧酶氧化生成
4.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，将通过所述单加氧酶氧化生成
后的体系浓缩除水，用二氯甲烷稀释体系，同时将酶变性，抽滤后得到的二氯甲烷溶液投入对甲苯磺酰基保护反应。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，以
为原料采用酮还原酶还原生成
的步骤中，还原反应的温度为10～37℃。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述还原反应的温度为15～35℃。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，以
为原料采用酮还原酶还原生成
的步骤中，当
剩余≤1％，终止反应，将反应体系在温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，加入乙酸乙酯后过滤；过滤后的溶液继续于温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，得到黄色油状液体即为
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，
通过单加氧酶氧化生成
的温度为10～37℃，pH为6.5～9.5，反应过程中持续向体系内鼓入空气。
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，
通过单加氧酶氧化生成
的温度为20～35℃，pH为7.5～8.5。
10.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，
的转化率大于等于99％后终止反应，将反应体系于温度为40～45℃，压力≤-0.08Mpa条件下浓缩至无馏分，加入二氯甲烷后过滤除去变性的酶，再将二氯甲烷于温度＜40℃，压力≤-0.06Mpa条件下浓缩至无馏分，得到
11.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法的路线如下：
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Non-Patent Citations (3)
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| 2-Thioalkyl Penems: An Efficient Synthesis of Sulopenem, a (5R,6S)-6-(1 (R)-Hydroxyethyl)-2-[ (cis-1-oxo-3-thiolanyl)thio]-2-penem Antibacterial;Robert A. Volkmann, et al.;《J. Org. Chem.》;19921231;第57卷;4352-4361 * |
| Baeyer-Villiger 单加氧酶的蛋白质改造及其催化氧化反应研究新进展;郑禾等;《有机化学》;20181228;第39卷;903-915 * |
| Highly Enantioselective Reduction of a Small Heterocyclic Ketone: Biocatalytic Reduction of Tetrahydrothiophene-3-one to the Corresponding (R)-Alcohol;Jack Liang,et al.;《Organic Process Research & Development》;20090112;第14卷;188-192 * |
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