CN115960983A - 一种酶催化合成丙谷二肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酶催化合成丙谷二肽的方法，所述方法包括以下步骤：将L‑丙氨酸甲酯盐酸盐和L‑谷氨酰胺混合溶液通入装有酶聚合物复合体的反应柱中进行连续反应，得到丙谷二肽；所述酶聚合物复合体为氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物形成的复合体。本发明的方法可以进行连续性生产，不仅提高了产能，还提高了酶的利用率，产物收率高，后处理简单，废水少，降低了生产成本，符合节能减排、绿色环保的工业生产要求。

Description

一种酶催化合成丙谷二肽的方法

技术领域

本发明属于医药化工技术领域，涉及一种酶催化合成丙谷二肽的方法。

背景技术

丙谷二肽(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)是一种重要二肽，可在体内分解为L-谷氨酰胺和L-丙氨酸，这一特性使经由肠外营养输液补充L-谷氨酰胺成为可能，丙谷二肽分解释放出的氨基酸作为营养物质存储在身体相应的部位并随机体的需要进行代谢。

目前已报道的文献主要有化学合成和酶催化合成，化学合成路线比较的长，收率也相对比较的低，并且所使用到的原辅料在一定程度上有毒性，对环境有一定的污染。

CN110382705A公开了在氨基酸酯酰基转移酶存在下，以L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物合成丙谷二肽的方法，该方法最后得到的是反应上清液，未进行精细化处理得到纯品。本领域在该反应方法的后处理时，一般需要进行超滤除酶，再进行纳滤除盐，再进行二次超滤，最后的超滤液进行浓缩得到粗品，再进行精制得到成品，即，该方法的后处理会十分繁琐，并且转化率也比较低(85.7％-94.5％)。

CN104561202A公开一种酶催化合成丙谷二肽的制备方法，包括L-丙氨酸甲酯的合成，丙谷二肽的合成，酶的失活，过滤，丙谷二肽粗品一的制备，丙谷二肽粗品二的制备，后处理过程繁琐，最终产品收率仅为83％-87％。

CN104163849A公开了酶催化反应液的后处理方法，主要依靠陶瓷膜进行超纳滤，再加入大量的水进行洗涤去除酶，此方法需要大量水，洗出的水又无法进行套用，在一定的程度上增加环保处理污水的成本。

因此，在本领域中，期望开发一种收率高，并且后处理简单、废水少的丙谷二肽合成方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶催化合成丙谷二肽的方法，所述方法中将氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物形成的复合体作为反应柱的填装材料，可以进行连续性生产，不仅提高了产能，还提高了酶的利用率，产物收率高，后处理简单，废水少，降低了生产成本，符合节能减排、绿色环保的工业生产要求。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种酶催化合成丙谷二肽的方法，所述方法包括以下步骤：将L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺混合溶液通入装有酶聚合物复合体的反应柱中进行连续反应，得到丙谷二肽；

所述酶聚合物复合体为氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物形成的复合体。

在本发明中，利用氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物形成的复合体作为反应柱的填装材料，可以进行连续性生产，提高了产能，提高了酶的利用率，产物收率高，后处理简单，废水少，降低了生产成本，符合节能减排、绿色环保的工业生产要求。

在本发明中，相比传统的树脂，微孔聚合物材料通过它独特的结构，具有较高的比表面积和较强的吸附能力，且能够有选择性进行吸附等特点。通过替换传统的树脂进行吸附固化，不仅提高了固化的效率，而且能够有选择性的吸附有效的酶，并且吸附后的酶不易脱落，装填后的柱子可以进行连续性生产，不仅提高了产能，还提高了酶的利用率。

在本发明中，氨基酸酯酰基转移酶经微孔聚合物材料固定化后，反应后处理不需要进行除酶，也不需要纳滤二次超滤，微孔材料不但可以吸附酶，也能吸附一定量的盐，还可以吸附颜色，因此反应液的后处理特别简单，只要通过简单浓缩后析晶即可。

本发明的制备方法能够使得产物收率达到总收率高达85％以上，纯度达到99％以上，可达到成品的质量要求，不仅减少了传统酶反应液的后处理，还减少了精制步骤。从工艺的角度看此方法简单，连续性比较高，在一定的程度上减少了生产成本，也避免了传统酶反应时使用大量水的问题，减少了污水排放。

在本发明中，所述氨基酸酯酰基转移酶为根据CN104480075A中所述的方法进行制备得到酶。即所述氨基酸酯酰基转移酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。编码所述氨基酸酯酰基转移酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1：

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SEQ ID NO:2：

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优选地，所述微孔聚合物包括超交联聚合物(HCP)、共轭微孔聚合物(CMP)、固有微孔性聚合物(PIM)、三嗪骨架(CTF)或多孔芳族骨架(PAF)中的任意一种，优选超交联聚合物或固有微孔性聚合物。

优选地，所述酶聚合物复合体中氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物的质量比为1:0.01-1:0.1，例如1:0.01、1:0.02、1:0.03、1:0.05、1:0.07、1:0.09或1:0.1。

优选地，所述酶聚合物复合体的制备方法为：将氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物于溶剂中进行搅拌吸附，过滤，得到所述酶聚合物复合体。

优选地，所述搅拌的温度为0-50℃，例如0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃。

优选地，所述溶剂为去离子水。

优选地，在所述酶聚合物复合体的制备过程中使得体系的pH为1-12，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

优选地，所述pH利用无机碱进行调节，所述无机碱包括有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氨水、碳酸钠、碳酸铵或碳酸氢钠中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的摩尔比为1:1.0-1:2.0，例如1:1.0、1:1.2、1:1.4、1:1.5、1:1.7、1:1.9或1:2.0。

优选地，所述混合溶液中L-丙氨酸甲酯盐酸盐的质量百分比浓度为2％-10％，例如2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

优选地，所述混合溶液的pH为7.0-10.0，例如7.0、7.3、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5、8.8、9.0、9.4、9.8或10.0。如果pH太低酶催化反应比较的慢，收率比较的低，pH太高会有杂质生成，

优选地，所述反应柱的柱径比为1:2-1:15，例如1:2、1:3、1:5、1:7、1:8、1:10、1:12、1:14或1:15。在本发明中如果反应柱的柱径比太大，则在柱子里停留的时间比较的长，会有杂质生成，会影响产品纯度。

在本发明中所述柱径比是指直径与高度的比值。

优选地，所述连续反应的温度为0-50℃(例如0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃)，连续反应的停留时间(反应液在反应柱内反应的时间)为1-10小时(例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时)。

优选地，所述连续反应结束后，进行后处理，所述后处理包括减压蒸馏和析晶。

优选地，所述析晶的溶剂包括小分子醇类溶剂、酮类溶剂或醚类中任意一种或至少两种组合。

作为本发明的优选技术方案，所述酶催化合成丙谷二肽的方法包括以下步骤：将L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺混合溶液通入装有酶聚合物复合体的反应柱中进行连续反应，得到丙谷二肽；

其中，所述微孔聚合物包括超交联聚合物、共轭微孔聚合物、同有微孔性聚合物、三嗪骨架或多孔芳族骨架中的任意一种，所述酶聚合物复合体中氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物的质量比为1:0.01-1:0.1，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的摩尔比为1:1.0-1:2.0，所述混合溶液中L-丙氨酸甲酯盐酸盐的质量百分比浓度为2％-10％，所述混合溶液的pH为7.0-10.0，所述反应柱的柱径比为1:2-1:15，所述连续反应的温度为0-50℃，连续反应的停留时间为1-10小时。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的合成方法使用氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物形成的复合体作为反应柱的填装材料，可以进行连续性生产，不仅提高了产能，还提高了酶的利用率，产物收率高达85％以上，纯度达到90％以上，后处理简单，废水少，降低了生产成本，符合节能减排、绿色环保的工业生产要求。

附图说明

图1为实施例1制备得到的产品的液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明实施例中对于产物进行液相色谱检测的色谱条件如下：

色谱柱：Kromasil 100-5C18，长度：250mm，内径：4.6mm，流动性A：辛烷磺酸钠：乙腈＝95:5，流动性B：甲醇，流动性C：乙腈。

以下制备例中使用的氨基酸酯酰基转移酶根据CN104480075A中实施例1和实施例2制备得到。

对比制备例1

在本制备例中，制备酶聚合物复合体，制备方法包括以下步骤：

向500mL的反应瓶中加入100mL去离子水，2g共价有机骨架(负载型COF，型号：COF-08，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)使用氨水调pH＝9.0，控制反应温度18℃，加入100g氨基酸酯酰基转移酶液(酶的浓度为3％)搅拌吸附4小时，过滤，得到酶聚合物复合体17.1g。

制备例1

在本制备例中，制备酶聚合物复合体，制备方法包括以下步骤：

向500mL的反应瓶中加入100mL去离子水，1g固有微孔性聚合物(型号：PIM-1，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，使用氢氧化钠调pH＝11.0，控制反应温度16℃，加入100g氨基酸酯酰基转移酶液搅拌吸附3小时，过滤，得到酶聚合物复合体17.5g。

制备例2

在本制备例中，制备酶聚合物复合体，制备方法包括以下步骤：

向500mL的反应瓶中加入100mL去离子水，10g多孔芳族骨架(型号：PAF-23，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，使用氨水调pH＝10，控制反应温度4℃，加入100g氨基酸酯酰基转移酶液(酶的浓度为3％)搅拌吸附2小时，过滤，得到酶聚合物复合体17.9g。

制备例3

在本制备例中，制备酶聚合物复合体，制备方法包括以下步骤：

向500mL的反应瓶中加入100mL去离子水，5g三嗪骨架(型号：CTF-CX，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，使用碳酸氢钠调pH＝7.5，控制反应温度35℃，加入100g氨基酸酯酰基转移酶液(酶的浓度为3％)搅拌吸附2小时，过滤，得到酶聚合物复合体17.3g。

制备例4

在本制备例中，制备酶聚合物复合体，制备方法包括以下步骤：

向500mL的反应瓶中加入100mL去离子水，5g共轭微孔聚合物(型号：SCMP-1，厂家：西安齐岳生物科技有限公司)使用氨水调pH＝9.5，控制反应温度15℃，加入100g氨基酸酯酰基转移酶液(酶的浓度为3％)搅拌吸附4小时，过滤，得到酶聚合物复合体17.6g。

制备例5

在本制备例中，制备酶聚合物复合体，制备方法包括以下步骤：

向500mL的反应瓶中加入100mL去离子水，1g超交联多孔离子聚合物(型号：KAPMHCP，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)使用氨水调pH＝8.5，控制反应温度17℃，加入100g氨基酸酯酰基转移酶液(酶的浓度为3％)搅拌吸附3小时，过滤，得到酶聚合物复合体16.9g。

实施例1

在本实施例中，利用酶聚合物复合体催化合成丙谷二肽，具体包括以下步骤：

先将制备例1制备得到的酶聚合物复合体22g装入柱子中(柱径比为1:8)备用，向1L的三口瓶中加入300mL纯化水，L-谷氨酰胺22g，开启搅拌，降温至10℃，使用5g 25％氨水调pH＝8.5，加入L-丙氨酸甲酯盐酸盐23.0g(L-谷氨酰胺：L-丙氨酸甲酯盐酸盐摩尔比＝1:1.1)，控制温度5℃使用蠕动泵缓慢泵入柱子中，控制流入时间2小时，同时滴加18g 25％氨水使三口瓶中的pH保持在pH＝8.5，泵入完毕后使用50mL纯化水进行冲洗柱子，柱子另一端得到的反应液，进行浓缩除去水，得到粘稠的液体，控制温度30℃滴加入6倍L-谷氨酰胺的甲醇，搅拌1小时，进行过滤，干燥，得到白色结晶性粉末：29.9g，纯度：99.3％，摩尔收率：91.6％，产品的液相色谱图如附图1所示，装有酶聚合物复合体的柱子可继续反复利用(可以进行连续生产50批，这些批的收率在85-90％，酶可以进行重复套用)。

实施例2

在本实施例中，利用酶聚合物复合体催化合成丙谷二肽，具体包括以下步骤：

先将制备例2制备得到的酶聚合物复合体22g装入柱子中(柱径比为1:6)备用，向1L的三口瓶中加入300mL纯化水，L-谷氨酰胺22g，开启搅拌，降温至5℃，使用5g 25％氨水调pH＝8.5，加入L-丙氨酸甲酯盐酸盐31.4g(L-谷氨酰胺：L-丙氨酸甲酯盐酸盐摩尔比＝1:1.5)，控制温度5℃使用蠕动泵缓慢泵入柱子中，控制流入时间3小时，同时滴加24.6g 25％氨水使三口瓶中的pH保持在pH＝8.5，泵入完毕后使用50mL纯化水进行冲洗柱子，柱子另一端得到的反应液，进行浓缩除去水，得到粘稠的液体，控制温度30℃滴加入6倍L-谷氨酰胺的甲醇，搅拌1小时，进行过滤，干燥，得到白色结晶性粉末：28.3g，纯度：99.5％，摩尔收率：86.7％，装有酶聚合物复合体的柱子可继续反复利用(可以进行连续生产50批，这些批的收率在85-90％，酶可以进行重复套用)。

实施例3

在本实施例中，利用酶聚合物复合体催化合成丙谷二肽，具体包括以下步骤：

先将制备例3制备得到的酶聚合物复合体22g装入柱子中(柱径比为1:4)备用，向1L的三口瓶中加入300mL纯化水，L-谷氨酰胺22g，开启搅拌，降温至5℃，使用5g 25％氨水调pH＝8.5，加入L-丙氨酸甲酯盐酸盐31.4g(L-谷氨酰胺：L-丙氨酸甲酯盐酸盐摩尔比＝1:1.5)，控制温度5℃使用蠕动泵缓慢泵入柱子中，控制流入时间1.5小时，同时滴加26.8g25％氨水使三口瓶中的pH保持在pH＝9.0，泵入完毕后使用50mL纯化水进行冲洗柱子，柱子另一端得到的反应液，进行浓缩除去水，得到粘稠的液体，控制温度30℃滴加入6倍L-谷氨酰胺的甲醇，搅拌1小时，进行过滤，干燥，得到白色结晶性粉末：29.5g，纯度：99.2％，摩尔收率：90.4％，装有酶聚合物复合体的柱子可继续反复利用(可以进行连续生产50批，这些批的收率在85-90％，酶可以进行重复套用)。

实施例4

先将制备例4制备得到的酶聚合物复合体22g装入柱子中(柱径比为1:2)备用，向1L的三口瓶中加入300mL纯化水，L-谷氨酰胺22g，开启搅拌，降温至10℃，使用5g 25％氨水调pH＝8.5，加入L-丙氨酸甲酯盐酸盐23.0g(L-谷氨酰胺：L-丙氨酸甲酯盐酸盐摩尔比＝1:1.1)，控制温度10℃使用蠕动泵缓慢泵入柱子中，控制流入时间2.5小时，同时滴加26.8g25％氨水使三口瓶中的pH保持在pH＝9.0，泵入完毕后使用50mL纯化水进行冲洗柱子，柱子另一端得到的反应液，进行浓缩除去水，得到粘稠的液体，控制温度30℃滴加入6倍L-谷氨酰胺的甲醇，搅拌1小时，进行过滤，干燥，得到白色结晶性粉末：28.5g，纯度：99.3％，摩尔收率：87.3％，装有酶聚合物复合体的柱子可继续反复利用(可以进行连续生产50批，这些批的收率在85-90％，酶可以进行重复套用)。

实施例5

先将制备例5制备得到的酶聚合物复合体22g装入柱子中(柱径比为1:10)备用，向1L的三口瓶中加入300mL纯化水，L-谷氨酰胺22g，开启搅拌，降温至10℃，使用5g 25％氨水调pH＝8.5，加入L-丙氨酸甲酯盐酸盐23.0g(L-谷氨酰胺：L-丙氨酸甲酯盐酸盐摩尔比＝1:1.1)，控制温度10℃使用蠕动泵缓慢泵入柱子中，控制流入时间3小时，同时滴加18.6g25％氨水使三口瓶中的pH保持在pH＝8.5，泵入完毕后使用50mL纯化水进行冲洗柱子，柱子另一端得到的反应液，进行浓缩除去水，得到粘稠的液体，控制温度30℃滴加入6倍L-谷氨酰胺的甲醇，搅拌1小时，进行过滤，干燥，得到白色结晶性粉末：29.6g，纯度：99.5％，摩尔收率：90.7％，装有酶聚合物复合体的柱子可继续反复利用(可以进行连续生产50批，这些批的收率在85-90％，酶可以进行重复套用)。

对比例1

本对比例与实施例1不同之处仅在于，使用对比制备例1制备的酶聚合物复合体替代实施例1中使用的制备例1制备得到的酶聚合物复合体。最后得到白色结晶性粉末：26.9g，纯度：99.3％，摩尔收率：82.4％。

对比例2

本对比例与实施例1不同之处仅在于，利用相同质量的普通树脂与氨基酸酯酰基转移酶的复合体代替制备例1制备得到的酶聚合物复合体。最后得到白色结晶性粉末：20.2g，纯度：99.1％，摩尔收率：61.8％。

用普通树脂与氨基酸酯酰基转移酶的复合体的制备方法为：

向500mL的反应瓶中加入100g氨基酸酯酰基转移酶液去离子水，5g树脂(型号：LXTE701氨基树脂，厂家：蓝晓科技)使5g磷酸氢二钾缓冲液，控制反应温度25℃，搅拌吸附24小时，过滤，再使用2％戊二醛进行清洗三次，过滤得到酶聚合物复合体5.5g。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种酶催化合成丙谷二肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺混合溶液通入装有酶聚合物复合体的反应柱中进行连续反应，得到丙谷二肽；

所述酶聚合物复合体为氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物形成的复合体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微孔聚合物包括超交联聚合物、共轭微孔聚合物、固有微孔性聚合物、三嗪骨架或多孔芳族骨架中的任意一种，优选超交联聚合物或固有微孔性聚合物；

优选地，所述氨基酸酯酰基转移酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶聚合物复合体中氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物的质量比为1:0.01-1:0.1。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶聚合物复合体的制备方法为：将氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物于溶剂中进行搅拌吸附，过滤，得到所述酶聚合物复合体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述搅拌的温度为0-50℃；

优选地，所述溶剂为去离子水。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在所述酶聚合物复合体的制备过程中使得体系的pH为1-12；

优选地，所述pH利用无机碱进行调节，所述无机碱包括有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氨水、碳酸钠、碳酸铵或碳酸氢钠中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的摩尔比为1:1.0-1:2.0。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中L-丙氨酸甲酯盐酸盐的质量百分比浓度为2％-10％；

优选地，所述混合溶液的pH为7.0-10.0。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应柱的柱径比为1:2-1:15；

优选地，所述连续反应的温度为0-50℃，连续反应的停留时间为1-10小时；

优选地，所述连续反应结束后，进行后处理，所述后处理包括减压蒸馏和析晶；

优选地，所述析晶的溶剂包括小分子醇类溶剂、酮类溶剂或醚类中任意一种或至少两种组合。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺混合溶液通入装有酶聚合物复合体的反应柱中进行连续反应，得到丙谷二肽；

其中，所述微孔聚合物包括超交联聚合物、共轭微孔聚合物、固有微孔性聚合物、三嗪骨架或多孔芳族骨架中的任意一种，所述酶聚合物复合体中氨基酸酯酰基转移酶与微孔聚合物的质量比为1:0.01-1:0.1，所述L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的摩尔比为1:1.0-1:2.0，所述混合溶液中L-丙氨酸甲酯盐酸盐的质量百分比浓度为2％-10％，所述混合溶液的pH为7.0-10.0，所述反应柱的柱径比为1:2-1:15，所述连续反应的温度为0-50℃，连续反应的停留时间为1-10小时。

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