CN112195198B - 一种制备d-泛解酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用NAD还原酶生产D‑泛解酸的方法。本发明首次利用较为廉价的NAD辅酶驱动反应高效地实现了D‑泛解酸的生产。本发明所有原料和酶在一个反应器内一步反应即可制备D‑泛解酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，催化反应基本上不受产物D‑泛解酸的抑制，高浓度的转化可以获得高收率。因此本发明简化了工艺，采用价格低廉的NAD辅酶而大大降低了成本，有利于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种手性D-泛解酸的制备方法。
背景技术
D-泛解酸是一种重要的化工原料，主要用于合成B族维生素泛酸钙，化妆品原料泛醇，医药原料高泛酸，以及辅酶A等多种化学品，其结构式如下所示：
现行的泛解酸合成主要是通过化学法和酶法水解动力学拆分来实现。在工业生产上，化学法步骤繁琐，污染环境；而酶法水解动力学拆分需要使用DL-泛解酸内酯作为原料，再利用具有手性选择性的泛解酸内酯水解酶将DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯水解为D-泛解酸，然后将D-泛解酸回收后经酸化重新形成D-泛解酸内酯，理论最高收率只能达到50%。因此，开发更为环保的D-泛解酸不对称合成方法具有重要的应用价值。
生物工作者对使用还原法来进行D-泛解酸的不对称合成也做了一些尝试。以酮基泛解酸作为底物，使用具有手性选择性的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）还原酶可以将其还原为D-泛解酸。如下反应式所示。
在中国专利文献CN110396505A公开了酮基泛解酸内酯还原酶及其应用，中国专利文献CN110396506A公开了源自Nocardia asteroides的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用，以及中国专利文献CN110396508A公开了源自Nocardia cyriacigeorgica的L-泛解酸内酯脱氢酶及应用，其中涉及的还原酶都是NADPH依赖型的。但是，NADPH还原酶需要使用价格昂贵的NADPH作为辅酶驱动反应，在工业上受限很大，因此有必要进一步研究成本更低的泛解酸合成方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单易行的合成D-泛解酸的方法，使用较为廉价的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）辅酶驱动反应，该方法操作简单，条件温和，可大幅度降低生产成本。
本发明提供一种以酮基泛解酸作为底物，使用较为廉价的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）辅酶驱动反应，在NADH还原酶的作用下制备D-泛解酸的方法，合成路径如下所示：
上述反应中酮基泛解酸作为底物，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，在催化酶的作用下生成D-泛解酸。
因此，本发明提供一种合成D-泛解酸的方法，其是酮基泛解酸作为底物，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，在酶的作用下生成D-泛解酸。
其中，采用的酶是NAD还原酶，在一个具体实施方式中，所述NADH还原酶可以是从天津工微生物科技有限公司可以购买的商品编号为GW005的酶制品。
在具体实施方式中，由反应液、酮基泛解酸、NADH还原酶和NADH组成反应体系。
更具体的，所述反应液：含有葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的Tris-HCl，优选地，反应液为：0.5 M Tris-HCl（pH为8.0），0.6 M 葡萄糖，0.5 mg/mL 葡萄糖脱氢酶。
在具体实施方式中，酮基泛解酸在反应体系中的浓度为200-800 mM，优选为400-600 mM，最优选为500 mM。
在具体实施方式中，NADH还原酶在反应体系中的浓度为0.5-1.5 mg/mL，优选为0.8-1.2mg/mL，最优选为1.0 mg/mL。
在具体实施方式中，NADH在反应体系中的浓度为0.5-1.5 mM，优选为0.8-1.2 mM，最优选为1.0 mM；
反应条件：25-34℃、100-300 rpm反应8至16小时，优选地反应条件为30℃、200rpm反应12小时。
本发明首次利用较为廉价的NAD辅酶驱动反应高效地实现了D-泛解酸的生产。本发明工艺简单，所有原料和酶在一个反应器内一步反应即可制备D-泛解酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，催化反应基本上不受产物D-泛解酸的抑制，在一个具体实验中表明，反应体系底物消耗量为98%，得到产物D-泛解酸的收率为98%。因此，本发明可以在高浓度水平转化，可以获得高收率，简化了提取工艺，且采用价格低廉的NAD辅酶而大大降低了成本，有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1：实施例2中D-泛解酸作为标准品和反应产物的液相色谱比较图。
图2：实施例2的反应产物的质谱检测图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、NADH还原酶制备D-泛解酸活性筛选测定
将酮基泛解酸、NADH和NADH还原酶蛋白溶液（购自天津工微生物科技有限公司用于氨基酸还原反应的NADH还原酶，商品编号为GWOR001-GWOR096，共96种不同的NADH还原酶）溶解于20 mM（pH 7.5）磷酸缓冲液中，定量为1 mL。酮基泛解酸在反应体系中的浓度为100 mM，NADH在反应体系中的浓度为1 mM，NADH还原酶蛋白溶液浓度为1 mg/mL。
采用分光光度计（仪器型号：UV-1800PC型）在线监测5 min后，根据NADH在340 nm的消光系数（6.22 cm-1mmol-1）计算酶活。发现在测定的96种不同的NADH还原酶中，GWOR005酶在催化NAD与酮基泛解酸反应生成NADH与泛解酸的活性最高，比活力为5 U/mg。其中，酶的比活力（U/mg）=（OD340nm×1000）/（6.22 cm-1·mmol-1×1 cm×5 min×1mg·mL-1×0.001mL）。
实施例2、使用NADH还原酶制备D-泛解酸
基于实施例1的结果，进一步进行如下实验。
反应体系（100 ml）：由反应液、酮基泛解酸、NADH还原酶和NADH组成。
其中，反应液：0.5 M Tris-HCl（pH为8.0），0.6 M 葡萄糖，0.5 mg/mL 葡萄糖脱氢酶；酮基泛解酸在反应体系中的浓度为500 mM；NADH还原酶：采用如实施例1中所使用的GW005商品酶（购自天津工微生物科技有限公司），在反应体系中的浓度为1 mg/mL；NADH在反应体系中的浓度为1 mM。
反应条件：30℃、200 rpm反应12小时。
产物检测：反应结束后将反应体系稀释10倍后HPLC检测产物浓度。
HPLC色谱条件：仪器型号：Shimadzu LC2030；色谱柱：Greenherbs C18，4.6×250mm，5 µm；柱温：25 ℃；紫外检测波长：210 nm；采集时间：10 min；进样量：5 µL；流速：1.00mL/min；
采用D-泛解酸作为标准品，标准品色谱图见图1，D-泛解酸标准品的出峰时间为6.1 min；在相同条件下反应产物出峰位置为6.1 ± 0.1 min以内，可以认定为同一物质。
在上述实验中，根据出峰位置收集D-泛解酸对应的洗脱峰，通过质谱一步验证产物表征。实验得到的质谱图（MS）见图2，由图可知产物的分子量与D-泛解酸吻合。
经过上述检测，结果表明，用GWOR005时，其产物为D-泛解酸；反应体系底物消耗量为98%（约490 mM），得到产物D-泛解酸的量为490 mM，收率为98%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人
士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种合成D-泛解酸的方法，其特征在于：以酮基泛解酸作为底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，于含有葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的Tris-HCl的反应液中，在NADH还原酶的作用下生成D-泛解酸；所述NADH还原酶是GWOR005。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酮基泛解酸在反应体系中的浓度为200-800 mM。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NADH还原酶在反应体系中的浓度为0.5-1.5 mg/mL。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述NADH还原酶在反应体系中的浓度为0.8-1.2mg/mL。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述NADH还原酶在反应体系中的浓度为1.0mg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在反应体系中的浓度为0.5-1.5 mM。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，其反应条件为：25-34℃、100-300rpm反应8至16小时。
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