CN116948999B - 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 - Google Patents
酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116948999B CN116948999B CN202311215633.XA CN202311215633A CN116948999B CN 116948999 B CN116948999 B CN 116948999B CN 202311215633 A CN202311215633 A CN 202311215633A CN 116948999 B CN116948999 B CN 116948999B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- ketoreductase
- dehydrogenase
- formula
- coenzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 title description 5
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 title description 5
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 95
- CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N darunavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1[C@@H]2CCO[C@@H]2OC1)C1=CC=CC=C1 CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229960005107 darunavir Drugs 0.000 claims abstract description 23
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 79
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 79
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 49
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 33
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical group NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims description 23
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 21
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 21
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N triethanolamine hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN(CCO)CCO HHLJUSLZGFYWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229940122440 HIV protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012220 PCR site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100433693 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) AAD14 gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186339 Thermoanaerobacter Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035045 associative learning Effects 0.000 description 1
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 1
- 229930188620 butyrolactone Natural products 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004296 chiral HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N gamma-butyrolactone Natural products O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000004030 hiv protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229940068586 prezista Drugs 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Substances [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000009901 transfer hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。本发明将以筛选得到的源于Saccharomyces cerevisiae S288C的野生型酮还原酶进行突变,获得酮还原酶突变体,第一次将其应用于达芦那韦中间体的合成,与野生型酮还原酶相比,本发明所述酮还原酶突变体对底物(酮化合物II)的反应具有更高的酶活力和立体选择性,酶用量明显减少,反应产物I的异构体纯度大幅度提高,能够更好的满足工业化生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。
背景技术
达芦那韦(darunavir)是FDA批准用于抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的新药,是第二代HIV蛋白酶抑制剂,可以阻断HIV病毒复制的蛋白酶,当与其他抗HIV药物联用时,可以降低病毒载量,提高免疫能力。达芦那韦是由强生公司的子公司爱尔兰的泰博特克药品公司(Tibotec)开发,于2006年7月首次在美国上市,其商品名为:Prezista,化学名为:[(1R, 5S,6R)-2,8-二氧双环[3.3.0]-癸烷-6-基]-N-[(2S,3R)-4-[(4-氨基苯基)磺酰基-(2-甲基丙基)氨基]-3-羟基-1-苯基-丁烷-2-基]氨基甲酸酯。达芦那韦已在美国、欧盟及其他国家和地区上市。
手性化合物I是合成达芦那韦的中间体,其具有如图1所示的结构式。该化合物及其异构体的合成包括手性催化和酮还原酶催化合成。
文献More, Ganesh V., et al. "Ru-catalyzed asymmetric transferhydrogenation of α-acyl butyrolactone via dynamic kinetic resolution:Asymmetric synthesis of bis-THF alcohol intermediate of darunavir."Tetrahedron Letters 66 (2021): 152831.研究了手性钌配体催化剂(R,R)-Ru-FsDPEN构建化合物I异构体的方法,因用到昂贵的重金属催化剂不太适合产业化;
现有专利中已涉及利用酶催化合成化合物I,欧洲专利EP2634180A1涉及使用不同羰基还原酶来催化制备多种手性达芦那韦中间体,并且提及化合物I及其异构体的合成,其中16种羰基还原酶均为来自Codexis Inc.的商业酶,其中包括来自Saccharomyces cerevisiaeYNL331C的酮还原酶催化反应合成化合物I,并披露了该酮还原酶相关信息(该专利已被撤销);CN110372641B (同族专利WO2019196263A1),以及CN110272398B(同族专利WO2019174176A1),披露用来自Saccharomyces kudriavzevii的醛酮还原酶催化合成多种达芦那韦手性中间体,包括提及化合物I的制备。
但是上述专利中存在所用酶的选择性还不够理想、酶活力偏低,投料浓度低,投酶量大,原料转化不完全等问题,导致成本高,反应物需分离产物和剩余原料等。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用。
本发明提供了酮还原酶在达芦那韦中间体合成中的应用,所述酮还原酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明提供了酮还原酶突变体,其包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有如下i)~vii)所示突变中的至少一种:
第235位色氨酸突变为酪氨酸;或
第249位甲硫氨酸突变为苯丙氨酸或异亮氨酸;或
第250位谷氨酸突变为天冬氨酸或丝氨酸;或
第257位谷氨酸突变为天冬氨酸或丝氨酸;或
第259位亮氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸;或
第272位谷氨酸突变为丝氨酸;或
第319位赖氨酸突变为精氨酸或组氨酸。
进一步的,本发明所述的酮还原酶突变体,其包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸和如下所示突变中的至少一种:
第257位谷氨酸突变为天冬氨酸;或
第259位亮氨酸突变为丙氨酸;或
第272位谷氨酸突变为丝氨酸;或
第319位赖氨酸突变为组氨酸。
更进一步的,本发明所述酮还原酶突变体包括:
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸,第259位亮氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酸突变为丝氨酸;或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸,第257位谷氨酸突变为天冬氨酸和第259位亮氨酸突变为丙氨酸;或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸,第257位谷氨酸突变为天冬氨酸,第259位亮氨酸突变为丙氨酸和第272位谷氨酸突变为丝氨酸;或
如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸,第257位谷氨酸突变为天冬氨酸,第259位亮氨酸突变为丙氨酸,第272位谷氨酸突变为丝氨酸和第319位赖氨酸突变为组氨酸。
本发明以筛选得到的源于Saccharomyces cerevisiaeS288C的野生型酮还原酶进行突变,获得酮还原酶突变体,第一次将其应用于达芦那韦中间体的合成,与野生型酮还原酶相比,本发明所述酮还原酶突变体对底物(酮化合物II)的反应具有更高的酶活力和立体选择性,酶用量明显减少,反应产物I的异构体纯度大幅度提高,能够更好的满足工业化生产需求。并且本发明中,酮还原酶突变位置的不同,获得的突变体的转化率以及最终产物异构体纯度存在差异,其中,以如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸替换为酪氨酸,第257位谷氨酸替换为天冬氨酸,第259位亮氨酸替换为丙氨酸和第272位谷氨酸替换为丝氨酸(W235Y/E257D/L259A/E272S)的转化率最高;以如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸替换为酪氨酸,第257位谷氨酸替换为天冬氨酸,第259位亮氨酸替换为丙氨酸,第272位谷氨酸替换为丝氨酸和第319位赖氨酸替换为组氨酸(W235Y/E257D/L259A/E272S/K319H)的产物异构体纯度最好。
本发明提供了组合物,其包括组合物1或组合物2中的任意一种,
所述组合物1包括:辅酶再生酶和酮还原酶;
所述组合物2包括:辅酶再生酶和本发明所述的酮还原酶突变体;
所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种;
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示;
所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了酮还原酶制剂、酮还原酶突变体酶制剂,或所述组合物制剂,所述制剂可以为固体、液体或半固体,所述制剂中还可以包括稳定剂、表面活性剂、缓冲液等,用于维持或协助所述酶的保存或发挥作用。
本发明提供了生物材料,其包括如下A)~D)所示中的至少一种:
A)、编码本发明所述的酮还原酶变体或本发明所述的组合物的核酸;
B)、含有A)所述核酸的重组载体;
C)、转化或转染如B)所述重组载体的宿主细胞;
D)、培养如C)所述的宿主细胞获得的混合物。
本发明所述的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中,所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列,如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是载体(如表达或克隆载体)的一部分,或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得,或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。
在本发明中,所述核酸可以是经优化的也可以是未经优化的,这些优化包括但不限于:密码子使用偏好性,消除不利于表达的二级结构(如发夹结构),改变GC含量,CpG二核苷酸含量,mRNA的二级结构,隐蔽剪接位点,早期多聚腺苷化位点,内部核糖体进入位点和结合位点,负CpG岛,RNA不稳定区,重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点等。
本发明中还提供了包含所述核酸的转录单元,所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段,所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点,例如启动子的增强子,poly(A)信号等。
本发明所述重组载体,是指重组的核酸载体,是一种重组DNA分子,其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对原核细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子,核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子,增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主,载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用,或者,在一些情况下,自己整合进入基因组。在本说明书中,“质粒”和“载体”有时可以交换通用,因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而,本发明意图包括表达载体的这样的其它形式,其发挥等价作用,其在本领域是已知的或将变为已知的,包括但不限于:质粒,噬菌体颗粒,病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。具体实施例中,所述核酸可构建于各种原核表达载体中,例如,pET系列载体,本发明的具体实施例中为pET28a。
本发明的宿主细胞,其转化或转染所述重组载体,使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞,这样转化的宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。
进一步的,所述转化的方法包括:化学转化和电转化;所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。
更进一步的,本发明提供的宿主细胞,其来源包括植物、动物、细菌、真菌、噬菌体或病毒,本发明对此不做限定。本发明的一些具体实施例中,所述宿主为细菌,具体的为大肠杆菌,更具体的为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供了如下i)~iv)所示中的至少一种在达芦那韦中间体合成中的应用:
i)、氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的酮还原酶;
ii)、本发明所述的酮还原酶突变体;
iii)、本发明所述的组合物;
iv)、本发明所述的生物材料。
本发明提供了达芦那韦中间体的制备方法,包括利用如下I)~IV)所示中的至少一种进行达芦那韦中间体合成:
I)、氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的酮还原酶;
II)、本发明所述的酮还原酶突变体;
III)、本发明所述的组合物;
IV)、本发明所述的生物材料。
进一步的,本发明所述的制备方法,包括如下步骤:
在催化剂、辅酶再生酶、辅底物、辅酶存在的条件下,将如式II所示的底物反应生成如式I所示的达芦那韦中间体;
式I和式II所示的结构如下:
式I;
式II;
其中,
所述催化剂为如SEQ ID NO:1所示的酮还原酶或本发明所述的酮还原酶突变体中的任意一种;所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述辅酶再生酶包括葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种;
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示;
所述辅底物包括异丙醇、葡萄糖或甲酸铵;
所述辅酶为NADP。
更进一步的,本发明所述的制备方法中,
所述辅酶再生酶为异丙醇脱氢酶,则辅底物为异丙醇;
所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶,则辅底物为葡萄糖;
所述辅酶再生酶为甲酸脱氢酶,则辅底物为甲酸铵。
具体的,本发明中,
所述底物的浓度为0.05g/ml~0.1g/ml;
含有所述催化剂的菌体的浓度为0.025g/ml~0.05g/ml;
含有所述辅酶再生酶的菌体的浓度为0.005g/ml~ 0.02g/ml;
异丙醇的浓度为50μL/ml;
所述葡萄糖的浓度为0.05g/ml~0.1g/ml;
所述甲酸铵的浓度为0.05g/ml;
所述NADP在反应体系中,使用的是质量分数5%的NADP水溶液,其用量为3μl/ml~5μl/ml;
所述反应的缓冲液为0.1M pH 7.5三乙醇胺缓冲液;
所述反应的条件为20℃~50℃、pH为4~10,优选反应温度为30℃、反应液pH为7.5;
所述底物需要在反应前需要溶解于DMSO,底物在DMSO中的浓度为0.5g/ml~1g/ml。
本发明的具体实施例中,在1ml的反应体系中,酮还原酶突变体酶液加入125μL(酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应体系中的含有酮还原酶或酮还原酶突变体的菌体的浓度为0.025g/ml;异丙醇脱氢酶酶液加入100μL(所述酶液中含有的菌体浓度为200g/l=0.2g/ml),对应的含有所述异丙醇脱氢酶的菌体的浓度为0.02g/ml;加入异丙醇50μL,对应浓度为50μl/ml;5% NADP水溶液加入5μL,对应的浓度为5μl/ml;原料(底物)加入50mg,对应的浓度为0.05g/ml(此时,酮还原酶突变体酶液中菌体与原料的浓度比为0.5:1),且原料利用100μL DMSO溶解后加入,原料在DMSO中的溶解浓度为0.5g/ml;
本发明的具体实施例中,在1ml的反应体系中,酮还原酶或酮还原酶突变体酶液加入250μL(所述酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应的含有酮还原酶或酮还原酶突变体的菌体的浓度为0.05g/ml;异丙醇脱氢酶酶液加入100μL(酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应的含有所述异丙醇脱氢酶的菌体的浓度为0.02g/ml;加入异丙醇50μL,对应浓度为50μl/ml;5% NADP水溶液加入5μL,对应的用量为5μl/ml;原料(底物)加入50mg,对应的浓度为0.05g/ml(此时,含有酮还原酶或酮还原酶突变体酶液中菌体与原料的浓度比为1:1),原料利用100μL DMSO溶解后加入,原料在DMSO中的溶解浓度为0.5g/ml;
本发明的另一些具体的实施例中,在20ml的反应体系中,酮还原酶或酮还原酶突变体酶液加入5mL(所述酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应体系中含有酮还原酶或酮还原酶突变体的菌体的浓度为0.05g/ml;异丙醇脱氢酶酶液加入2mL(酶液中含有的菌体浓度0.2g/ml),对应体系含有所述异丙醇脱氢酶的菌体的浓度为0.02g/ml;加入异丙醇1mL,对应浓度为50μl/ml;5% NADP水溶液加入100μL,对应的用量为5μl/ml;原料(底物)加入2g,对应的浓度为0.1g/ml(此时,含有酮还原酶或酮还原酶突变体酶液中菌体与原料的浓度比为0.5:1),此时,原料利用2mL DMSO溶解后加入,原料在DMSO中的溶解浓度为1g/ml;
本发明的另一些具体的实施例中,在20ml的反应体系中,酮还原酶突变体酶液加入5mL(所述酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应体系含有酮还原酶或酮还原酶突变体的菌体的浓度为0.05g/ml;葡萄糖脱氢酶酶液加入1mL(酶液中含有的菌体浓度0.2g/ml),对应的含有所述葡萄糖脱氢酶的菌体的浓度为0.01g/ml;加入葡萄糖2g,对应浓度为0.1g/ml;5% NADP水溶液加入100μL,对应的用量为5μl/ml;原料(底物)加入2g,对应的浓度为0.1g/ml(此时,酮还原酶突变体酶液中菌体与原料的浓度比为0.5:1),原料利用2mL DMSO溶解后加入,原料在DMSO中的溶解浓度为1g/ml;
本发明的另一些具体的实施例中,在20ml的反应体系中,酮还原酶突变体酶液加入5mL(所述酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应的含有酮还原酶或酮还原酶突变体的菌体的浓度为0.05g/ml;甲酸脱氢酶酶液加入2mL(酶液中含有的菌体浓度0.2g/ml),对应的含有所述甲酸脱氢酶的菌体的浓度为0.02g/ml;加入甲酸铵1g,对应浓度为0.05g/ml;5%NADP水溶液加入100μL,对应的用量为5μl/ml;原料(底物)加入2g,对应的浓度为0.1g/ml(此时,酮还原酶突变体酶液中菌体与原料的浓度比为0.5:1),原料利用2mL DMSO溶解后加入,原料在DMSO中的溶解浓度为1g/ml;
在本发明的另一些实施例中,在2L的反应瓶中,反应体系为1L,酮还原酶突变体酶液加入250mL(所述酶液中含有的菌体浓度为0.2g/ml),对应体系含有酮还原酶突变体的菌体的浓度为0.05g/ml;葡萄糖脱氢酶酶液加入50mL(酶液中含有的菌体浓度0.2g/ml),对应的含有所述葡萄糖脱氢酶的菌体的浓度为0.01g/ml;加入葡萄糖100g,对应浓度为0.1g/ml;5% NADP水溶液加入6mL,对应的用量为6μl/ml;原料(底物)加入100g,对应的浓度为0.1g/ml(此时,酮还原酶突变体酶液中菌体与原料的浓度比为0.5:1),原料利用100mLDMSO溶解后加入,原料在DMSO中的溶解浓度为1g/ml;
本发明中,对所述的制备方法进行了优化,辅酶循环系统的筛选,所述辅酶循环系统包括:
由辅酶再生酶异丙醇脱氢酶和其辅底物异丙醇组成的辅酶循环系统;
由辅酶再生酶葡萄糖脱氢酶和其辅底物葡萄糖组成的辅酶循环系统;
由辅酶再生酶甲酸脱氢酶和其辅底物甲酸铵组成的辅酶循环系统;
这三种辅酶循环系统进行筛选,结果表明,以由辅酶再生酶葡萄糖脱氢酶和其辅底物葡萄糖组成的辅酶循环系统的底物转化效果最好,转化成本最低。
本发明中,对所述的制备方法进行了优化,还包括对反应pH和温度的优化,实验结果表明在反应温度为20℃~50℃、pH为4~10的范围内,温度为30℃、pH为7.5时转化率最好,产物异构体纯度最好。
本发明中,所述酮还原酶、酮还原酶突变体、辅酶再生酶均通过将目的基因与载体重组获得重组载体后构建基因工程菌株,所述基因工程菌株经培养和诱导获得上所述酶,将上述酶用于达芦那韦中间体的合成中,与化学合成相比较,合成步骤简单、成本低。
进一步的,本发明中,所述培养利用的培养基为任何可使菌体生长并诱导产生前述酶的培养基,优选LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L,蒸馏水溶解,pH7.0),培养方法和培养条件可以根据宿主类型和培养方法、实验条件等因素的不同按需调整。
本发明将以筛选得到的源于Saccharomyces cerevisiaeS288C的野生型酮还原酶进行突变,获得酮还原酶突变体,第一次将其应用于达芦那韦中间体的合成,与野生型酮还原酶相比,本发明所述酮还原酶突变体对底物(酮化合物II)的反应具有更高的酶活力和立体选择性,酶用量明显减少,反应产物I的异构体纯度大幅度提高,能够更好的满足工业化生产需求。
附图说明
图1是化合物I的结构式;
图2是化合物II合成中间产物化合物I的过程。
具体实施方式
本发明提供了酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
野生型酮还原酶氨基酸序列为:MTDLFKPLPEPPTELGRLRVLSKTAGIRVSPLILGGASIGDAWSGFMGSMNKEQAFELLDAFYEAGGNCIDTANSYQNEESEIWIGEWMASRKLRDQIVIATKFTGDYKKYEVGGGKSANYCGNHKRSLHVSVRDSLRKLQTDWIDILYIHWWDYMSSIEEVMDSLHILVQQGKVLYLGVSDTPAWVVSAANYYATSHGKTPFSVYQGKWNVLNRDFERDIIPMARHFGMALAPWDVMGGGRFQSKKAMEERKKNGEGLRTFVGGPEQTELEVKISEALTKIAEEHGTESVTAIAIAYVRSKAKNVFPLIGGRKIEHLKQNIEALSIKLTPEQIEYLESIVPFDVGFPKSLIGDDPAVTKKLSPLTSMSARIAFDN(SEQ ID NO:1);
野生型酮还原酶的核苷酸序列为:atgactgacttgtttaaacctctacctgaaccacctaccgaattgggacgtctcagggttctttctaaaactgccggcataagggtttcaccgctaattctgggaggagcttcaatcggcgacgcatggtcaggctttatgggctctatgaataaggaacaggcctttgaacttcttgatgctttttatgaagctggaggtaattgtattgatactgcaaacagttaccaaaatgaagagtcagagatttggataggtgaatggatggcatcaagaaaactgcgtgaccagattgtaattgccaccaagtttaccggagattataagaagtatgaagtaggtggtggtaaaagtgccaactactgtggtaatcacaagcgtagtttacatgtgagtgtgagggattctctccgcaaattgcaaactgattggattgatatactttacattcactggtgggattatatgagttcaatcgaagaagttatggatagtttgcatattttagttcagcagggcaaggtcctatatttaggagtatctgatacacctgcttgggttgtttctgcggcaaattactacgctacatctcatggtaaaactccttttagcgtctatcaaggtaaatggaatgtattgaacagggactttgagcgtgatattattccaatggctaggcattttggtatggctctagccccatgggatgtcatgggaggtggaagatttcagagtaaaaaagcaatggaagaacggaagaagaatggagagggtctgcgtacttttgtgggtggccccgaacaaacagaattggaggttaaaatcagcgaagcattgactaaaattgctgaggaacatggaacagagtctgttactgctatcgctattgcctatgttcgctctaaagcgaaaaatgttttcccattgattggaggaaggaaaattgaacatctcaagcagaacattgaggctttgagtattaaattaacaccggaacaaatagaatacctggaaagtattgttccttttgatgttggctttcccaaaagtttaataggagatgacccagcggtaaccaagaagctttcacccctcacatcgatgtctgccaggatagcttttgacaattag(SEQ ID NO:2);
葡萄糖脱氢酶BsGDH核苷酸序列:atgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacaggagctgcttcagggctcggaaaggcgatggccattcgcttcggcaaggagcaggcaaaagtggttatcaactattatagtaataaacaagatccgaacgaggtaaaagaagaggtcatcaaggcgggcggtgaagctgttgtcgtccaaggagatgtcacgaaagaggaagatgtaaaaaatatcgtgcaaacggcaattaaggagttcggcacactcgatattatgattaataatgccggtcttgaaaatcctgtgccatctcacgaaatgccgctcaaggattgggataaagtcatcggcacgaacttaacgggtgcctttttaggaagccgtgaagcgattaaatatttcgtagaaaacgatatcaagggaaatgtcattaacatgtccagtgtgcacgaagtgattccttggccgttatttgtccactatgcggcaagtaaaggcgggataaagctgatgacagaaacattagcgttggaatacgcgccgaagggcattcgcgtcaataatattgggccaggtgcgatcaacacgccaatcaatgctgaaaaattcgctgaccctaaacagaaagctgatgtagaaagcatgattccaatgggatatatcggcgaaccggaggagatcgccgcagtagcagcctggcttgcttcgaaggaagccagctacgtcacaggcatcacgttattcgcggacggcggtatgacacaatatccttcattccaggcaggccgcggttaa(SEQ ID NO:3);
异丙醇脱氢酶TbIPADH核苷酸序列为:atgaaaggttttgcaatgctcagtatcggtaaagttggctggattgagaaggaaaagcctgctcctggcccatttgatgctattgtaagacctctagctgtggccccttgcacttcggacattcataccgtttttgaaggcgccattggcgaaagacataacatgatactcggtcacgaagctgtaggtgaagtagttgaagtaggtagtgaggtaaaagattttaaacctggtgatcgcgttgttgtgccagctattacccctgattggcggacctctgaagtacaaagaggatatcaccagcactccggtggaatgctggcaggctggaaattttcgaatgtaaaagatggtgtttttggtgaattttttcatgtgaatgatgctgatatgaatttagcacatctgcctaaagaaattccattggaagctgcagttatgattcccgatatgatgaccactggttttcacggagctgaactggcagatatagaattaggtgcgacggtagcagttttgggtattggcccagtaggtcttatggcagtcgctggtgccaaattgcgtggagccggaagaattattgccgtaggcagtagaccagtttgtgtagatgctgcaaaatactatggagctactgatattgtaaactataaagatggtcctatcgaaagtcagattatgaatctaactgaaggcaaaggtgtcgatgctgccatcatcgctggaggaaatgctgacattatggctacagcagttaagattgttaaacctggtggcaccatcgctaatgtaaattattttggcgaaggagaggttttgcctgttcctcgtcttgaatggggttgcggcatggctcataaaactataaaaggcgggctatgccccggtggacgtctaagaatggaaagactgattgaccttgttttttataagcgtgtcgatccttctaagctcgtcactcacgttttccggggatttgacaatattgaaaaagcctttatgttgatgaaagacaaaccaaaagacctaatcaaacctgttgtaatattagcataa(SEQ ID NO:4);
甲酸脱氢酶BstFDH核苷酸序列为:atggcgaccgtcctctgcgtgctctaccccgatcccgtcgacggctatccgccgcactacgtgcgcgacacgattccggtcatcacgcgatacgcggacggacaaaccgcgccgacgccggccggcccgcccggtttccggcccggcgaactcgtcggctcggtgtccggcgcgctcgggctgcgcggctacctggaagcgcacggtcacacgctgatcgtgacgagtgacaaggacggccccgattccgaattcgaacgccggctgcccgacgcggacgtggtgatttcgcagccgttctggcccgcgtacctgaccgccgaacggatcgcccgcgcgccgaagctcaggctcgcgctgacggccggcatcggctccgatcatgtcgatctcgacgccgcggcgcgcgcacacatcaccgtcgcggaagtcaccggctcgaacagcatcagcgtggccgaacacgtggtgatgacgacgctcgcgctggtgcgcaactacctgccgtcgcatgcgatcgcgcagcaaggcggctggaacatcgccgattgcgtgtcgcgcagctacgacgtcgaagggatgcacttcggcacggtcggcgcgggacgcatcggtctcgcggtgttgcgccggctgaagccgttcggcctgcacctgcactacacacagcggcaccggctcgacgccgcgatcgagcaggaactcgggctcacgtatcacgccgatcccgcgtcgctcgccgccgcggtcgacatcgtcaacctgcagatcccgctgtatccgtcgaccgagcacctgttcgacgcggcgatgatcgcgcggatgaaacgcggcgcgtacctgatcaacaccgcgcgcgcgaagctggtcgatcgcgatgccgtggtgcgcgcggtcacgtccggccatctcgccggctacggcggcgacgtgtggtttccgcagcccgcgccggccgatcacccgtggcgcgcgatgccgttcaacgggatgacgccgcacatctccggcacgtcgctgtcggcgcaggcgcgctatgcggccggcacgctggagatcctgcagtgctggttcgacggccggccgatccgcaatgaatacctgatcgtcgacggcggcacgctcgcgggaacgggcgcgcagtcgtaccggctgacatga(SEQ ID NO:5);
葡萄糖脱氢酶BsGDH氨基酸序列为:MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG(SEQID NO:6);
异丙醇脱氢酶TbIPADH氨基酸序列为:MKGFAMLSIGKVGWIEKEKPAPGPFDAIVRPLAVAPCTSDIHTVFEGAIGERHNMILGHEAVGEVVEVGSEVKDFKPGDRVVVPAITPDWRTSEVQRGYHQHSGGMLAGWKFSNVKDGVFGEFFHVNDADMNLAHLPKEIPLEAAVMIPDMMTTGFHGAELADIELGATVAVLGIGPVGLMAVAGAKLRGAGRIIAVGSRPVCVDAAKYYGATDIVNYKDGPIESQIMNLTEGKGVDAAIIAGGNADIMATAVKIVKPGGTIANVNYFGEGEVLPVPRLEWGCGMAHKTIKGGLCPGGRLRMERLIDLVFYKRVDPSKLVTHVFRGFDNIEKAFMLMKDKPKDLIKPVVILA(SEQ ID NO:7);
甲酸脱氢酶BstFDH氨基酸序列为:MATVLCVLYPDPVDGYPPHYVRDTIPVITRYADGQTAPTPAGPPGFRPGELVGSVSGALGLRGYLEAHGHTLIVTSDKDGPDSEFERRLPDADVVISQPFWPAYLTAERIARAPKLRLALTAGIGSDHVDLDAAARAHITVAEVTGSNSISVAEHVVMTTLALVRNYLPSHAIAQQGGWNIADCVSRSYDVEGMHFGTVGAGRIGLAVLRRLKPFGLHLHYTQRHRLDAAIEQELGLTYHADPASLAAAVDIVNLQIPLYPSTEHLFDAAMIARMKRGAYLINTARAKLVDRDAVVRAVTSGHLAGYGGDVWFPQPAPADHPWRAMPFNGMTPHISGTSLSAQARYAAGTLEILQCWFDGRPIRNEYLIVDGGTLAGTGAQSYRLT(SEQ ID NO:8)。
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1 工程菌的构建及表达
本发明中,酮还原酶突变体在不对称还原底物(酮化合物II)制备手性产物(化合物I),具体方法为将含酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得湿菌体、然后制备所需生物催化剂,用于催化底物II还原,获得目标产物I,合成途径如图2所示。
一、野生型酮还原酶重组工程菌的构建
野生型酮还原酶来源于Saccharomyces cerevisiaeS288C,其氨基酸序列(NCBIID: NP_014068.1)如SEQ ID NO:1所示,编码该氨基酸的核苷酸序列(NCBI ID:NM_001183169.1)如SEQ ID NO:2所示,通过全基因合成酮还原酶基因,在基因的两端分别引入NdeI和XhoI位点,并克隆到pET28a载体上,获得重组载体pET28a-kred。构建好的重组质粒经过化学转化方法,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板,37℃下培养8~12h,挑取单克隆细胞,获得可以诱导表达酮还原酶的重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-kred。
二、突变体酮还原酶重组质粒及工程菌的构建
1、突变位点的选择
以SEQ ID NO:1所示酮还原酶氨基酸序列为模板,使用SWISS-MODEL在线建模,并进行在线评估,使用pymol分析酮还原酶模型,并结合NCBI数据库的氨基酸序列分析,选择W235、M249、E250、E257、L259、E272、K319进行定点突变。
2、定点突变获得酮还原酶突变体
以构建的pET28a-kred重组质粒(其中,酮还原酶核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示)为模板,设计含有突变点的突变引物对,进行PCR定点突变。突变引物的设计方法为选取需要突变的氨基酸位点上下游各15~20bp的一段碱基序列,将突变位点的碱基替换为突变后的氨基酸的密码子,作为PCR的正向引物,其反向互补序列即为PCR反向引物。
PCR反应体系:正向引物1μL,反向引物1μL,模板DNA 1μL,PrimeSTAR Max Premix(2×) 12.5μL,超纯水9.5μL。
PCR反应程序:95℃ 5min,循环30次(95℃ 15s,55℃15s,72℃ 2min),72℃10min。
DpnI消化:在PCR产物中加入1μL Dpn I,37℃消化2h。
3、酮还原酶突变体基因工程菌的构建
将DpnI消化后的PCR产物经PCR纯化试剂盒进行纯化后,采用化学转化方法,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上,37℃培养12~18h后,挑取转化平板上的单菌落进行菌落PCR,并对目标基因进行测序验证,获得酮还原酶基因工程菌突变体。
三、辅酶再生酶基因工程菌的构建
葡萄糖脱氢酶基因工程菌:Bacillus subtilis葡萄糖脱氢酶BsGDH(NCBI ID:NC_000964.3, SEQ ID NO:3)通过全基因合成获得,并通过双酶切连接到pET-28a载体上,获得重组质粒pET28a-BsGDH,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组葡萄糖脱氢酶大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-BsGDH。
异丙醇脱氢酶基因工程菌:Thermoanaerobacter brockii异丙醇脱氢酶TbIPADH(NCBI ID: NC_010321.1, SEQ ID NO:4)通过全基因合成获得,并通过双酶切连接到pET-28a载体上,获得重组质粒pET28a-TbIPADH,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组异丙醇脱氢酶大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-TbIPADH。
甲酸脱氢酶基因工程菌:Burkholderia stabilis甲酸脱氢酶BstFDH (NCBI ID:EU825923.1, SEQ ID NO:5)通过全基因合成获得,并通过双酶切连接到pET-28a载体上,获得重组质粒pET28a-BstFDH,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组甲酸脱氢酶大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-BstFDH。
四、野生型酮还原酶、突变体酮还原酶、辅酶再生基因工程菌的诱导表达及生物催化剂制备
种子液培养:将酮还原酶野生型、酮还原酶突变体、辅酶再生酶基因工程菌接种分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养12~16h。
酶的诱导表达:种子液以体积分数1%(v/v)接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,200rpm培养2~3h,OD600在0.6~0.8之间时加入诱导剂IPTG,IPTG的终浓度为0.2mM,25℃培养20h。
生物催化剂制备:诱导培养结束后,发酵液通过高速离心获得基因工程菌全细胞湿菌体。湿菌体用0.1M pH7.5的三乙醇胺-盐酸缓冲液悬浮(湿菌体浓度为200g/L),然后采用超声破碎或者均质机破碎方法对菌悬液进行破碎,得到酶液。酶液再通过真空冷冻干燥制备成酶粉,后续实施例试验利用酶液进行进一步的试验验证,酶液浓度按湿菌体计,为上述200g/L。
实施例2 突变体的筛选、条件反应优化及在达芦那韦中间体合成中的应用
一、酮还原酶突变体筛选
以实施例1获得的酮还原酶野生型或突变体酶液为催化剂、异丙醇脱氢酶酶液为辅酶再生酶,以底物酮化合物II为原料,以异丙醇为辅底物,以NADP为辅酶;反应体积为1ml,其中酮还原酶酶液125μL(1ml体系中,对应菌体的浓度为0.025g/ml)(酶底比0.5/1,湿菌体与原料比)或250μL(1ml体系中,对应菌体的浓度为0.05g/ml)(酶底比1/1,湿菌体与原料比),异丙醇脱氢酶酶液100μL(1ml体系中,对应菌体浓度为0.02g/ml),异丙醇50μL(1ml体系中,对应浓度为50μl/ml),5% NADP水溶液5μL(1ml体系中,5% NADP浓度为5μl/ml),原料50mg用溶剂DMSO 100μL溶解后加入(1ml体系中,原料(底物)的浓度为0.05g/ml),0.1MpH7.5三乙醇胺-盐酸缓冲液625μL(酶底比0.5/1,湿菌体与原料比)或500μL(酶底比1/1,湿菌体与原料比),30℃反应24h,取样处理,样品HPLC分析转化率和产物I构型的异构体纯度,筛选结果如表2所示。
HPLC分析方法:色谱柱waters symmetry C18 4.6mm´250mm´5μm CL-0125, 柱温25℃,流速1ml/min,检测波长230nm,进样量5μL,流动相A:0.1%(v/v)磷酸;流动相B:乙腈,梯度见表1。
手性HPLC分析方法:色谱柱DAICH CHIRALPAK AD-H 4.6mm´250mm´5μm CL-0132,流动相正己烷:异丙醇:TFA=90:10:0.1,柱温25℃,流速1ml/min,进样量10μL,检测波长230nm。
转化率=A[产物I]×100%/(A[化合物II]+A[产物I]),其中A:代表HPLC峰面积;
产物I的异构体纯度=产物I的峰面积在产物四种异构体峰面积中的占比×100%。
表2.酮还原酶野生型及突变体的筛选反应结果
二、野生型酶和突变体酶不同条件反应测试
以实施例1获得的突变体、酮还原酶野生型或突变体酶液、辅酶再生酶酶液,进行测试反应,反应体积为20ml,酶底比0.5/1(湿菌体与原料比)、原料浓度100g/L,其中,利用三种不同的辅酶再生系统进行反应,具体如下:
(1)以异丙醇脱氢酶/异丙醇为辅酶再生系统反应条件:酮还原酶酶液5mL(20ml体系中,对应菌体的浓度为0.05g/ml)、异丙醇脱氢酶酶液2mL(20ml体系中,对应菌体的浓度为0.02g/ml)、异丙醇1mL(20ml体系中,对应浓度为50μl/ml)、5% NADP水溶液100μL(20ml体系中,5% NADP浓度为5μl/ml)、原料2g(20ml体系中,对应的浓度为0.1g/ml)、溶剂DMSO2mL、0.1M三乙醇胺-盐酸缓冲液10mL;
(2)以葡萄糖脱氢酶/葡萄糖为辅酶再生系统反应条件:酮还原酶酶液5mL(20ml体系中,对应菌体的浓度为0.05g/ml)、葡萄糖脱氢酶酶液1mL(20ml体系中,对应菌体的浓度为0.01g/ml,)、葡萄糖2g(20ml体系中,对应浓度为0.1g/ml)、5% NADP水溶液100μL(20ml体系中,5% NADP的用量为5μl/ml)、原料2g(20ml体系中,对应的浓度为0.1g/ml)、溶剂DMSO2mL、0.1M三乙醇胺-盐酸缓冲液12mL;
(3)以甲酸脱氢酶/甲酸盐为辅酶再生系统反应条件:酮还原酶酶液5mL(20ml体系中,对应菌体的浓度为0.05g/ml)、甲酸脱氢酶酶液2mL(20ml体系中,对应菌体的浓度为0.02g/ml)、甲酸铵1g(20ml体系中,对应浓度为0.05g/ml)、5% NADP水溶液100μL(20ml体系中,5% NADP的用量为5μl/ml)、原料2g(20ml体系中,对应的浓度为0.1g/ml)、溶剂DMSO2mL、0.1M三乙醇胺-盐酸缓冲液11mL。设定温度磁力搅拌反应24h,过程调节pH至设定值,反应结束取样处理,样品HPLC分析转化率和产物I构型的异构体纯度,结果如表3所示。
表3.野生型酶和突变体酶不同条件反应测试结果
三、酮还原酶突变体W235Y/E257D/L259A/E272S/K319H不对称还原底物II制备产物I
根据实施例1中方法获得的突变体W235Y/E257D/L259A/E272S/K319H,以及制备的突变体酶液250mL(1L体系中,对应菌体的浓度为0.05g/ml)、葡萄糖脱氢酶酶液50 mL(1L体系中,对应菌体的浓度为0.01g/ml),加入到2L三口反应瓶中,再加入0.1M pH7.5三乙醇胺缓冲液600mL,加入葡萄糖100g(1L体系中,对应浓度为0.1g/ml),5% NADP水溶液 6mL(1L体系中,5% NADP的用量为6μl/ml),原料化合物II 100g(1L体系中,对应的浓度为0.1g/ml)溶于100mL DMSO后加入,30℃搅拌反应,反应过程中控制pH7.5,反应24h取样,HPLC分析转化率>99.5%,反应液加入1000mL水,然后加入1000mL乙酸乙酯萃取三次,离心分液,合并有机相,有机相经减压蒸馏、析晶、抽滤,滤饼烘箱干燥,获得81.2g产物I,异构体纯度98.50%,HPLC纯度99.61%。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.酮还原酶突变体,其特征在于,所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第235位色氨酸突变为酪氨酸,第257位谷氨酸突变为天冬氨酸,第259位亮氨酸突变为丙氨酸,第272位谷氨酸突变为丝氨酸和第319位赖氨酸突变为组氨酸。
2.组合物,其特征在于,包括辅酶再生酶和权利要求1所述的酮还原酶突变体;
所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶、异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶中的任意一种;
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.生物材料,其特征在于,包括如下A)~C)所示中的至少一种:
A)、编码权利要求1所述的酮还原酶突变体的核酸;
B)、含有A)所述核酸的重组载体;
C)、转化或转染如B)所述重组载体的宿主细胞。
4.如下i)~iii)所示中的至少一种在将如式II所示的底物反应生成如式I所示的达芦那韦中间体中的应用:
i)、权利要求1所述的酮还原酶突变体;
ii)、权利要求2所述的组合物;
iii)、权利要求3所述的生物材料;
其中,式I所示的达芦那韦中间体的和式II所示的底物的结构如下:
式I;
式II。
5.达芦那韦中间体的制备方法,其特征在于,包括利用如下I)~III)所示中的至少一种将如式II所示的底物反应生成如式I所示的达芦那韦中间体:
I)、权利要求1所述的酮还原酶突变体;
II)、权利要求2所述的组合物;
III)、权利要求3所述的生物材料;
其中,式I所示的达芦那韦中间体的和式II所示的底物的结构如下:
式I;
式II。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法的反应过程还包括辅底物和辅酶;
所述辅底物为异丙醇、葡萄糖或甲酸铵中的任意一种;
所述辅酶为NADP;
当所述辅酶再生酶为异丙醇脱氢酶,则辅底物为异丙醇;
当所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶,则辅底物为葡萄糖;
当所述辅酶再生酶为甲酸脱氢酶,则辅底物为甲酸铵。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,
所述底物的浓度为0.05g/ml~0.1g/ml;
所述异丙醇的浓度为50μL/ml;
所述葡萄糖的浓度为0.05g/ml~0.1g/ml;
所述甲酸铵的浓度为0.05g/ml;
所述NADP为质量分数5%的NADP水溶液,其用量为3μl/ml~6μl/ml;
反应的条件为20℃~50℃、pH为4~10;
所述底物在反应前需要溶解于DMSO。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311215633.XA CN116948999B (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
CN202311653068.5A CN117625567A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311215633.XA CN116948999B (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311653068.5A Division CN117625567A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116948999A CN116948999A (zh) | 2023-10-27 |
CN116948999B true CN116948999B (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=88449588
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311215633.XA Active CN116948999B (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
CN202311653068.5A Pending CN117625567A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311653068.5A Pending CN117625567A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN116948999B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2634180A1 (en) * | 2012-03-01 | 2013-09-04 | Lonza Ltd. | Enzymatic process for the preparation of butyrolactones |
CN110272398A (zh) * | 2018-03-16 | 2019-09-24 | 江苏瑞科医药科技有限公司 | 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 |
CN110372641A (zh) * | 2018-04-12 | 2019-10-25 | 江苏瑞科医药科技有限公司 | 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 |
CN111057725A (zh) * | 2019-07-01 | 2020-04-24 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 酮还原酶在制备(s)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的用途及制备 |
CN111662889A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-15 | 南京朗恩生物科技有限公司 | 一种用于生产达芦那韦中间体的酮还原酶突变体 |
CN111690696A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-22 | 南京朗恩生物科技有限公司 | 一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法 |
CN111705043A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-25 | 南京朗恩生物科技有限公司 | 一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3744836A4 (en) * | 2018-01-22 | 2021-03-10 | Jilin Asymchem Laboratories Co., Ltd. | MUTANT KETOREDUCTASE AND RELATED APPLICATION |
-
2023
- 2023-09-20 CN CN202311215633.XA patent/CN116948999B/zh active Active
- 2023-09-20 CN CN202311653068.5A patent/CN117625567A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2634180A1 (en) * | 2012-03-01 | 2013-09-04 | Lonza Ltd. | Enzymatic process for the preparation of butyrolactones |
CN110272398A (zh) * | 2018-03-16 | 2019-09-24 | 江苏瑞科医药科技有限公司 | 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 |
CN116103348A (zh) * | 2018-03-16 | 2023-05-12 | 江苏瑞科医药科技有限公司 | 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 |
CN110372641A (zh) * | 2018-04-12 | 2019-10-25 | 江苏瑞科医药科技有限公司 | 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 |
CN111057725A (zh) * | 2019-07-01 | 2020-04-24 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 酮还原酶在制备(s)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的用途及制备 |
CN111662889A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-15 | 南京朗恩生物科技有限公司 | 一种用于生产达芦那韦中间体的酮还原酶突变体 |
CN111690696A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-22 | 南京朗恩生物科技有限公司 | 一种生物催化制备达芦那韦中间体的方法 |
CN111705043A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-25 | 南京朗恩生物科技有限公司 | 一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
"An Efficient Synthesis of the Bicyclic Darunavir Side Chain Using Chemoenzymatic Catalysis";Paul S. Riehl et al.,;《American Chemical Society》;第26卷;第2096-2101页 * |
"Biocatalytic routes to anti-viral agents and their synthetic intermediates";Sjoerd Slagman et al.,;《Chem. Soc. Rev》;第50卷;第1968-2009页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116948999A (zh) | 2023-10-27 |
CN117625567A (zh) | 2024-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109055327B (zh) | 醛酮还原酶突变体及其应用 | |
CN108048416B (zh) | 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用 | |
JP2020528745A (ja) | 遺伝子工学菌 | |
CN110551701B (zh) | 羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用 | |
CN112094856B (zh) | 一种转氨酶突变体及其在西格列汀合成中的应用 | |
JP2021506316A (ja) | ネペタラクトールオキシドレダクターゼ、ネペタラクトールシンターゼ、及びネペタラクトンを産生する能力がある微生物 | |
CN109055324B (zh) | 一种改进的酮还原酶及其应用 | |
CN110396507B (zh) | 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶 | |
CN112135905A (zh) | C-8甾醇异构化的优化 | |
CN116948999B (zh) | 酮还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 | |
KR102013058B1 (ko) | 에탄올에서 부탄디올의 생산방법 | |
CN103695443A (zh) | 一种新型羰基还原酶、其基因及应用 | |
CN110607335B (zh) | 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物生物合成方法 | |
CN114908129B (zh) | 用于制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶 | |
KR20160111947A (ko) | 재조합 미생물의 생산 방법 | |
CN115896081A (zh) | 天冬氨酸酶突变体及其应用 | |
KR20190074917A (ko) | 에탄올에서 아세토인의 생산방법 | |
CN112752841B (zh) | 经修饰的甾醇酰基转移酶 | |
CN109943618B (zh) | 一种重组脂肪酶在拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯中的应用 | |
CN113444702A (zh) | 烯酮还原酶突变体及其应用 | |
CN116891838B (zh) | 烯还原酶突变体、其组合物、生物材料及应用 | |
NL2031120B1 (en) | Engineered alpha-guaiene synthases | |
CN110527671B (zh) | 源自Nocardia farcinica的L-泛解酸内酯脱氢酶及其应用 | |
KR102013059B1 (ko) | 에탄올에서 부탄올의 생산방법 | |
CN112410274B (zh) | 一种生产子囊霉素的基因工程菌及其制备方法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |