CN116103348A - 六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 - Google Patents

六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药合成领域，具体涉及六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法。该制备方法以式A1化合物为起始原料，

Description

六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法
技术领域
本申请是申请号为201810220506.1、申请日为2018.03.16的中国发明专利《六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法其中间体及其制备方法》的分案申请，本发明涉及医药合成领域，具体涉及六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法。
背景技术
具有下列式Z结构的化合物为化学名称为(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3- 醇：
属于六氢呋喃并呋喃醇衍生物的一种，是抗艾滋病药物达芦那韦的中间体。
达芦那韦原研厂家泰博特克药品有限公司的中国专利申请号分别为02817639.1(申请日：2002-9-6)和200580010400 .X提供了上述(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，其中原料为如下的式(3)化合物，
式(3)化合物由起始原料式(1)化合物制备。
达 芦 那 韦 仿 制 药 厂 家 日 本 住 友 化 学 株 式 会 社 的 中 国 专利 申 请 号 为 200380109926 .4提供了上述(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，其中起 始原料为如下的式VⅢ化合物，
日本住友化学株式会社在手性构型的产生上，选择了使用手性配体催化剂，虽然这的确是构建手性构型的方法，但是，不太适合产业化。
达芦那韦仿制药厂家瑞士Lonza Ltd公司的欧洲专利申请EP2634180A1(申请日：2012-1-3)涉及使用羰基还原酶多肽或含有羰基还原酶多肽的微生物实现羰基还原为羟基，来构建达芦那韦中间体的手性，其说明书中列举了许多种可以商业化购买的酶如酿酒酵母YNL331C等，并且提及如下式Ia所示的化合物是比较合适的构型，
考虑到(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇是制备达芦那韦药物的关键中间体，有必要开发出更多的该关键中间体的制备方法，该方法不仅能获得高收率和高DE值的 该关键中间体，而且成本低，反应条件温和，适合产业化。
发明内容
本发明的制备(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的方法从起始原料的选择和手性构型的构建上着手，研究开发出了不同于上述已有专利申请中的起始原料制备达芦 那韦关键中间体的制备方法。本发明的制备方法采用酶法来构建手性，成本低，反应条件温 和，为该达芦那韦关键中间体的制备提供了另一条适合产业化的路线。
为实现本发明的技术目的，本发明提供了如下的技术方案：
首先，本发明第一方面提供了一种(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇中间 体化合物的制备方法，由式B化合物或式B-2化合物经酶法还原反应构建手性制备，
其中，R1为氢或羟基保护基；
所述酶是一种生物酶 ，如醛酮还原酶 ，其中 ，醛酮还原酶来源于Saccharomyceskudriavzevii菌株。其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有醛酮还原酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有醛酮还原酶活性的蛋白质；其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。醛酮还原酶可以来自于基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。
所述酶的投料量可以为50-100g/L，所述反应温度可以为25-37℃。
所述酶法还原反应中可以选择性加入辅酶，所述辅酶为NADP+或NADPH。
所述酶法还原反应中可以选择性加入葡萄糖脱氢酶。
所述酶法还原反应在溶剂存在的条件下进行，所述溶剂为水或缓冲溶液与有机溶剂组成的混合溶剂。
所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。
所述有机溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或几种。
本发明酶法还原反应的生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
进一步，本发明提供的(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇中间体化合物的制备方法，由式B化合物经酶法还原反应构建手性，进一步上保护基反应制备，
其中，R1的定义与上述相同，R2为羟基保护基，所述酶与上述相同。
上述制备方法中，所述R1较优选地为C2-11的直链或支链酰基，苯甲酰基或苯环上单 取代或多取代的苯甲酰基，所述单取代或多取代基为烷基，烷氧基，硝基或氰基。
本发明第二方面提供了(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b] -3-醇的制备方法，由上述中间体式C化合物经进一步的还原和关环反应制备，
其中，R1的定义与上述相同。
本发明提供的(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，或者由上述制备得到的中间体式Cp化合物经进一步的还原和关环反应制备，
其中，R1，R2的定义与上述相同。
本发明提供的(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，可以由制备得到的式C-2或式Cp-2化合物经选择性分离后，进一步经关环反应制备。
本发明上述式B化合物由式A2化合物经酰化反应制备，反应式如下：
其中，R1为C2-11的直链或支链酰基苯甲酰基或苯环上单取代或多取代的苯甲酰基，所述单取代或多取代基为烷基，烷氧基，硝基或氰基。
本发明上述式A2化合物由式A1化合物经卤化反应制备，反应式如下：
其中，X为卤素。
本发明一种(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，比较优选的实施方式为：由卤化反应，酰化反应，酶法还原反应，进一步还原和关环反应制备，
其中，X为卤素，R1的定义与权利要求1中的相同，所述酶为醛酮还原酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有醛酮还原酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有醛酮还原酶活性的蛋白质。
本发明一种(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，比较优选的另 一种实施方式为，由卤化反应，酰化反应，酶法还原反应，上保护基反应，进一步还原和关环 反应制备，
其中，X为卤素，R1的定义与权利要求1中的相同 ，R2的定义与权利要求2中的相同；所述酶的定义与上述相同。
本发明上述经酶法构建手性中心后，对羟基进行保护，提供了(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的中间体化合物，结构式如下：
其中，R1,R3为氢或羟基保护基，R2为羟基保护基。所述羟基保护基为烷基，硅烷基，C2-11的酰基，C4-9的环烯基，芳基，芳烷基，芳酰基，苯基，取代苯基。所述硅烷基为四甲基硅 烷基，三甲基硅烷基，三乙基硅烷基，三正丁基硅烷基，叔丁基二甲基硅烷基。所述烷基为 C1-C8的烷基。所述芳基为苯基，呋喃基，噻吩基或吲哚基。所述取代苯基为烷基取代的苯基，烷氧基烷基取代的苯基，硝基烷基取代的苯基或卤素取代的苯基。所述烷基取代的苯基 为苄基，二苯甲基，三苯甲基；所述烷氧基烷基取代的苯基为对甲氧基苄基；所述硝基烷基取代的苯基为对硝基苄基；所述卤素取代的苯基为对氯苯基。
所述羟基保护基较优选地为苯甲酰基，苯环上单取代或多取代的苯甲酰基，叔丁基或苄基。
本发明上述还原反应涉及对另一个羰基进行还原为半缩酮产物的方法 ，反应式为：
上述两个反应可直接用通式表示为：
R3为R2或氢。R1，R2的定义与上述相同。
上述半缩酮产物可经分离，也可不经分离进一步应用到下一步反应。如经关环反应制备(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的方法，
R3为R2或氢。R1，R2的定义与上述相同。
所述还原为半缩醛的还原反应使用的还原剂可以为硼类还原剂，铝类还原剂或硅锂类还原剂。如硼氢化钠，氰基硼氢化钠，四氢铝锂，红铝，氢化铝锂，二异丁基氢化铝，二异丙基氨基锂，六甲基二硅基氨基锂。
所述关环反应的试剂为本领域常见的酸或碱。
本发明比较优选的实施方式有：先构建手性中心，选择性上羟基保护基，后还原为半缩酮产物，进行关环反应制备(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇，
R3为R2或氢。R1，R2的定义与上述相同。
然而，本发明的实施方式也可以为先还原为半缩酮产物，后构建手性中心，经选择性分离后，最后进行关环反应制备(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇，
R3为R2或氢。R1，R2的定义与上述相同。
本发明上述酰化反应中，
优选的 ，R1为C2-11的直链或支链酰基苯甲酰基或苯环上单取代或多取代的苯甲酰基。
所述酰化反应的试剂为取代苯酸类化合物或其盐，所述取代苯酸类化合物取代基可以为烷基，烷氧基，硝基，氰基等，所述取代可以为单取代或多取代。
所述酰化反应中可以加入覆酸剂，所述覆酸剂为碱类，有机碱或无机碱均可以 ，如 三乙胺，碳酸钠，碳酸钾，碳酸氢钠等。
所述R1为其他取代基如叔丁基可以通过式A3化合物转化或由式A2化合物与叔丁酸反应，式A3化合物由式A2化合物反应制备，
上述式A2化合物由式A1化合物经卤化反应制备，反应式如下：
其中，X为卤素。
本发明卤化反应所用试剂为氢卤酸等。
本发明(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇制备方法也能够通过卤化反应，酶法还原反应，酰化反应，还原关环反应制备，反应式如下：
其中，X为卤素，R1的定义与上述相同。
本发明提供的(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法，采用酶法构建手性，能够高收率，高光学纯度的制备得到产物。虽然现有技术如上述欧洲申请中已公开 羰基还原酶多肽或含有羰基还原酶多肽的微生物实现羰基还原为羟基，然而，本发明使用 的酶具备更显著地优势，体现在更高光学纯度的制备得到产物和更适宜的反应条件上。本发明的(3R ,3aS ,6aR)-六氢呋喃并[2 ,3-b]-3-醇的制备方法适宜于工业化生产。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的六氢呋喃并呋喃醇衍生物的制备方法、其中间体及其制备方法进行详细说明。需要理解的是，这些实施例描述只是为进一步详细说明本发明的特征，而不是对本发明范围或本发明权利要求范围的限制。
实施例1：
将式A1化合物，二氯甲烷，加入到反应瓶中，冷却降温，称取溴素，加入二氯甲烷稀释，将稀释后的溴素转移至滴加漏斗中，缓慢滴加，控制内温。滴毕，保温反应，控制内温。加入水，控制温度，静置，分液。下层有机相放入另一反应瓶，加入水，萃取，分液。下层有机相放入另一反应瓶中，加入5％NaHCO3水溶液萃取，分液。下层有机相放入另一反应瓶中，合并上层水相加入二氯甲烷，萃取，分液。弃水相合并有机相，加入水，萃取，分液，弃水相，下层有机相，置于旋转蒸发仪浓缩至无溶剂流出，收率90-95％。
实施例2：
向反应瓶中投入丙酮，式A2化合物(X为溴) ，苯甲酸，搅拌，降温。将三乙胺加入到滴加罐中，开始缓慢滴加，控制内温。滴毕后，升温至室温，搅拌反应。反应结束后，抽滤，抽滤后，将滤液转移至蒸馏瓶中进行减压蒸馏，控制温度50-60℃，至蒸馏瓶出现固体成糊状，加入乙酸乙酯带蒸。往蒸馏瓶中加入乙酸乙酯搅拌均匀至溶解，将蒸馏瓶中的料液转移到反应瓶中，往反应瓶中加入饱和食盐水洗涤，静置，分液，合并水层，加入乙酸乙酯萃取，静置，分层，弃水层，合并有机层，往有机层中加入无水硫酸钠搅拌干燥，抽滤。将滤液转移至反应瓶中进行减压蒸馏，控制温度50-60℃，至反应液出现固体成糊状，加入部分乙酸乙酯搅拌回流溶清，控制温度50-60℃，将正庚烷加入到滴加罐中，缓慢滴加到反应瓶中，滴毕。缓慢降温后，保温搅拌，抽滤，将目标固体粗品烘干，收率70-75％。
实施例3：
醛酮还原酶基因工程菌全细胞的制备
重组醛酮还原酶基因工程菌 ，具 体制备方法是 ：选择 来源于Saccharomyceskudriavzevii的醛酮还原酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成) ，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E .coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表 达载体；将重组表达载体转入E.col i BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组醛酮还原酶的重组醛酮还原酶基因工程菌。
将重组醛酮还原酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到 0 .1 m M ，置 于 25 ℃下继续培养 20 h 。最 后通过高速离心得到来源于Saccharomyces kudriavzevii的醛酮还原酶基因工程菌全细胞。采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全 细胞进行超声破碎，得到来源于Saccharomyces kudriavzevii的醛酮还原酶基因工程菌全 细胞的破碎酶液。醛酮还原酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，醛酮还原酶基因 的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
经诱导表达后在45kDa处有明显的蛋白条带，表明醛酮还原酶在重组菌中得到了高效表达。
测定醛酮还原酶纯蛋白的酶活性，反应体系为0 .25ml，包括Tris-HCl，pH为8.0，2mmol/L NADPH，0 .1mmol/L底物以及适量酶，测定340nm处吸光度的减少，酶活力单位(U)定义为：在上述条件下，每分钟催化1umol NADPH氧化所需的酶量。
结果表明，重组的基因工程醛酮还原酶较欧洲专利(EP2634180A1)序列的醛酮还原酶活性提高了20％以上，较未突变的醛酮还原酶活性提高了50％以上。
本发明实施例中所使用的醛酮还原酶基因工程菌全细胞均采用此方法制备。
本发明实施例及对比例中所使用的葡萄糖脱氢酶均为购自于sigma-aldrich的商品酶。
对映异构体过量表达的ee值的算法为:
ee(syn)＝([R ,R]-[S ,S])/([R ,R]+[S ,S])
ee(anti)＝([R ,S]-[S ,R])/([R ,S]+[S ,R])，de＝{([R ,S]+[S ,R])-([R ,R]+[S ,S])}/{([R ,S]+[S ,R])+([R ,R]+[S ,S])}。
酶法还原反应，反应式：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，在摇瓶中用260mL灭菌后的磷酸钾缓冲溶液悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞破碎酶液 ，投入葡萄糖脱氢酶 ，超声50min破碎细胞 ，再向摇瓶中加入25g的葡萄糖，0 .42g的NADP+ ，再称取8g的反应物，溶于40mL的DMSO中，将溶有底物的DMSO溶液缓慢倒入摇瓶中，反应2h后补加12g的葡萄糖，投入醛酮还原酶基因工程菌全细胞的量为75g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，得到目标产物的转化液，转化率为97.8％。
步骤2：对步骤1得到的目标产物的转化液进行纯化，向反应体系中加入等体积的乙酸乙酯，37℃下萃取15min，重复3次，离心收集乙酸乙酯层，向收集的乙酸乙酯层中加入5％的无水硫酸镁震荡15min后过滤除去硫酸镁，再将除水后的乙酸乙酯层进行高温减压浓缩，得到目标产物7 .41g，de值为96 .2％，ee(anti)值为99 .5％。
实施例4：
向500ml干燥洁净的四口烧瓶加入固体式B化合物(R1为苯甲酰基)(20 .00g) ，加入 甲苯，搅拌，氮气保护下真空置换，氮气保护下冷却，氮气保护下向恒压滴加漏斗中加入甲苯，氮气保护下向恒压滴加漏斗中加入70％红铝溶液(26 .50g，26 .00ml) ，准备完毕，待反应 液冷至-15～-10℃后，开始滴加红铝，控温，滴毕，保温；向1000ml洁净的四口烧瓶依次加入 纯水和乙酸乙酯，搅拌状态下向1000ml洁净的四口烧瓶加入硫酸后，冷却，保温完毕，将反 应液滴入硫酸溶液中，反应液控温，硫酸溶液控温0～10℃，滴毕，加入乙酸乙酯后搅拌；向 洁净的1000ml四口烧瓶加入10％碳酸氢钠水溶液，冷却，停止搅拌，反应液静置分层，上层 有机层转入10％碳酸氢钠水溶液后搅拌；下层酸水层加入乙酸乙酯提取，静置分层，酸水层 弃去，二次乙酸乙酯层一并转入10％碳酸氢钠水溶液中搅拌，控温，静置分层，向碱水层加 入乙酸乙酯提取，搅拌，控温，向碱洗过的有机层加入纯水洗涤，搅拌，控温，分层，水洗有机 层待用，水洗水层用提取乙酸乙酯继续提取，静置分层，水层舍去，合并有机层，加入硫酸钠 干燥，抽滤，乙酸乙酯淋洗，滤液于40-70℃下减压浓缩，得到油状物约17g，收率84 .33％。
实施例5：
于反应瓶中依次加入甲醇(10 .00ml) ，式C化合物(R1为苯甲酰基) (1 .00g) ，降温 至-15～-5℃，滴加氢氧化钠水溶液(10 .00ml) ，滴毕，保温搅拌至原料反应完全，滴加10％ 硫酸水溶液(4 .00g) ，滴加结束，继续保温反应，保温结束后，开始滴加饱和碳酸钠水溶液调 节pH，升温减压蒸馏除去甲醇后，加入甲基叔丁基醚萃取，分去有机层，水层加入氯化钠至饱和，再加入二氯甲烷萃取，水层分去待回收，有机层减压蒸馏除二氯甲烷，得产物0.38g， 收率73.77％。
实施例6：
酶的制备与实施例3中的方法相同。
步骤1：反应在5L烧杯中进行，反应体系控制为2L，在摇瓶中用1 .7L灭菌后的磷酸钾缓冲溶液悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，超声50min破碎细胞，再向烧杯中加入25g的葡萄糖，0 .42g的NADP+，再称取80g的底物，溶于300mL的DMSO中，将溶 有底物的DMSO溶液缓慢倒入摇瓶中，反应2h后补加12g的葡萄糖，投入醛酮还原酶基因工程 菌全细胞的量为75g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为37℃；转 化反应在烧杯中进行，磁子的转速控制为200r/min，转化时间为12h，得到目标化合物的转 化液，转化率为97 .8％。
步骤2：对步骤1得到的含有达鲁那韦中间体式Ⅷ化合物的转化液进行纯化，纯化步骤如实施例3，得到目标化合物77 .10g，所制备的目标化合物的de值为95 .3％，ee(anti) 值为99 .6％。
实施例7：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，在摇瓶中用250mL灭菌后的去离子水悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2 .5mol/L的葡萄糖10mL，0 .26g的NADP+，再称取10g的底物，溶于30mL乙酸丁酯中，将溶有底物的乙酸丁酯溶液 缓慢倒入摇瓶中，反应1h后补加2 .5mol/L的葡萄糖10mL，投入醛酮还原酶基因工程菌全细胞的量为75g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为37℃；转化反应 在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，得到目标化合物的转化液，转 化率为97.8％。
步骤2：对步骤1得到的目标化合物的转化液进行纯化，向反应体系中加入等体积的乙酸乙酯，37℃下萃取15min，重复3次，离心收集乙酸乙酯层，向收集的乙酸乙酯层中加入5％的无水硫酸镁震荡15min后过滤除去硫酸镁，再将除水后的乙酸乙酯层进行高温减压浓缩 ，得到目标化合物9 .55g ，所制备的目标化合物的de值为99 .1％ ，对映 异构体的ee (anti)值为99 .7％。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ2 .269～2 .301(m，1H，J＝6Hz) ，2 .367～2 .404 (m，1H) ，2 .954～2 .993(m，1H，J＝6Hz) ，3 .438～3 .466(m，1H) ，3 .520～3.549(m，1H) ，4 .227～4 .269(m，1H) ，4 .298～4 .326(m，1H) ，4 .391～4 .420(m，1H)。MS(ESI) ：m/z 210 .03[M+H]+。
实施例8：
步骤1：反应在5L烧杯中进行，反应体系控制为2L，在烧杯中用1 .5L灭菌后的去离子水悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞 ，投入葡萄糖脱氢酶 ，加入2 .5mol/L的葡萄糖100mL，3g的NADP+，再称取100g的底物，溶于300mL乙酸丁酯中，将溶有底物的乙酸乙酯溶液缓慢倒入烧杯中，反应1h后补加2 .5mol/L的葡萄糖100mL，投入醛酮还原酶基因工程菌全细 胞的量为100g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为28℃；转化反应 在烧杯中进行，磁子的转速控制为200r/min，转化时间为12h，得到目标物的转化液，转化率 为97 .8％。
步骤2：对步骤1得到的目标物的转化液进行纯化，纯化步骤如实施例3，得到目标物9 .42g，所制备的目标物的de值为96 .9％，对映异构体的ee(anti)值为99 .4％。
实施例9：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，在摇瓶中用250mL灭菌后的去离子水悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2 .5mol/L的葡萄糖10mL和0 .26g的NADP+，再称取10g的底物，溶于30mL乙酸丁酯中，将溶有底物的乙酸丁酯溶液缓慢倒入摇瓶中，反应1h后补加2 .5mol/L的葡萄糖10mL，投入醛酮还原酶基因工程菌全细胞的量为75g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，得到含目标化合物的转化液，转化率为97 .8％。
步骤2：对步骤1得到的目标化合物的转化液进行纯化，纯化步骤如实施例3，得到目标化合物9 .37g，所制备的目标化合物的de值为97 .1％，ee(anti)值为99 .5％。
实施例10：
步骤1：反应在5L烧杯中进行，反应体系控制为2L，在烧杯中用1 .6L灭菌后的去离子水悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2 .5mol/L的葡萄糖100mL 和2 .5g的NADP+，再称取100g的底物，溶于200mL乙酸丁酯中，将溶有底物的乙酸丁酯溶液缓 慢倒入烧杯中，反应1h后补加2 .5mol/L的葡萄糖100mL，投入醛酮还原酶基因工程菌全细胞 的量为50g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为25℃；转化反应在 烧杯中进行，磁子的转速控制为200r/min，转化时间为12h，得到含有目标化合物的转化液， 转化率为97 .8％。
步骤2：对步骤1得到的目标化合物的转化液进行纯化，纯化步骤如实施例3，目标化合物93 .1g，所制备的目标化合物的de值为95 .6％，ee(anti)值为99 .6％。
实施例11：对照实施例
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，在摇瓶中用250mL灭菌后的去离子水悬浮醛酮还原酶基因工程菌全细胞，所用的醛酮还原酶基因工程菌全细胞的醛酮还原酶基因的编码序列如欧洲专利EP2634180中公布序列(即专利EP2634180中的SEQ IDNO 12所示) ，序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成) ，制备方法如实施例3，再加入葡萄糖脱氢酶，加入2 .5mol/L的葡萄糖10mL，0 .26g的NADP+，再称取10g的底物， 溶于30mL乙酸丁酯中，将溶有底物的乙酸丁酯溶液缓慢倒入摇瓶中，反应1h后补加2.5mol/ L的葡萄糖10mL，投入醛酮还原酶基因工程菌全细胞的量为75g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/ min，转化时间为12h。
纯化步骤如实施例3 ，得到目 标化合物8 .11g ，所制备的目标化合物的de值为85 .1％，对映异构体的ee(anti)值为93 .3％。
实施例12：对照实施例
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，在摇瓶中用250mL灭菌后的去离子水悬浮以Saccharomyces kudriavzevii的醛酮还原酶基因工程菌全细胞，所用的醛酮还原酶基因工程菌全细胞的醛酮还原酶基因的编码序列如SEQ ID NO 3所示，(醛酮还原酶基因的编码序列未经人工设计) ，序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合 成) ，制备方法如实施例3，加入葡萄糖脱氢酶，加入2 .5mol/L的葡萄糖10mL，0 .26g的NADP+， 再称取10g的底物，溶于30mL乙酸丁酯中，将溶有底物的乙酸丁酯溶液缓慢倒入摇瓶中，反 应1h后补加2 .5mol/L的葡萄糖10mL，投入醛酮还原酶基因工程菌全细胞的量为75g/L，投入 葡萄糖脱氢酶为25mg/L，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速 控制为200r/min，转化时间为12h。
纯化步骤如实施例3 ，得到目 标化合物7 .73g ，所制备的目标化合物的de值为79 .6％，对映异构体的ee(anti)值为88.7。

Claims (13)

1.一种(3R,3aS,6aR)-六氢呋喃并[2,3-b]呋喃-3-醇中间体化合物的制备方法，其特征在于，包括如下经酶法还原反应制备化合物C-2的步骤：
其中，R1为氢或羟基保护基；
所述酶为醛酮还原酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白质或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有醛酮还原酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有醛酮还原酶活性的蛋白质。
2.一种(3R,3aS,6aR)-六氢呋喃并[2,3-b]呋喃-3-醇中间体化合物的制备方法，其特征在于，包括如下经酶法还原反应制备化合物C-2并进一步上保护基的步骤：
其中，R1的定义与权利要求1中的相同，R2为羟基保护基，所述酶与权利要求1中相同。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述R1为C2-11的直链或支链酰基，苯甲酰基或苯环上单取代或多取代的苯甲酰基，所述单取代或多取代基为烷基，烷氧基，硝基或氰基。
4.一种(3R,3aS,6aR)-六氢呋喃并[2,3-b]呋喃-3-醇的制备方法，其特征在于，包括如下卤化反应，酰化反应，酶法还原反应，进一步还原和关环反应的步骤：
其中，X为卤素，R1的定义与权利要求1中的相同，所述酶与权利要求1中的相同。
5.一种(3R,3aS,6aR)-六氢呋喃并[2,3-b]呋喃-3-醇的制备方法，其特征在于，包括如下卤化反应，酰化反应，酶法还原反应，上保护基反应，进一步还原和关环反应的步骤：
其中，X为卤素，R1的定义与权利要求1中的相同，R2的定义与权利要求2中的相同；
所述酶与权利要求1中的相同。
6.一种(3R,3aS,6aR)-六氢呋喃并[2,3-b]呋喃-3-醇的制备方法，其特征在于，包括如下卤化反应，酶法还原反应，酰化反应，还原关环反应的步骤：
其中，X为卤素，R1的定义与权利要求1中的相同。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醛酮还原酶为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中所述醛酮还原酶基因工程菌全细胞的投入量为10-100g/L，转化温度为25-37℃。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应在溶剂存在的条件下进行。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水或缓冲溶液与有机溶剂组成的混合溶剂。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或几种。
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