CN115895916A - 一种积累麦角新碱的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够积累麦角新碱的基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为能够产生麦角新碱和lysergic acidα‑hydroxyethylamide(缩写为LAH)的雀稗麦角菌，所述基因工程菌株为将雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶(g5173)进行突变而制备得到的基因工程菌株，相对于出发菌株，所述基因工程菌株只积累麦角新碱而不积累LAH。

Description

一种积累麦角新碱的菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种能够积累麦角新碱而不产生LAH的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

麦角碱类化合物是一类重要的药源分子，很多天然或半合成的麦角碱类化合都已经被应用于临床治疗帕金森症，阿尔茨海默病和垂体瘤等人类重大疾病。其中麦角新碱(CAS:60-79-7)是最早被应用于临床治疗的天然麦角碱类化合物，可以特异性的作用于子宫平滑肌。被作为临床一线药物应用于产后出血及子宫修复不良的治疗，安全性好、性价比高，具有广阔的市场前景。该药物于1998年被收入国家基本药品目录，此后也被世界卫生组织列入基本药物标准清单。但受限于现有生产工艺，麦角新碱的产能远远不能满足市场需求，曾一度停产，被国家卫计委列入临床必须、市场供应短缺的药品目录当中。因此急需开发麦角新碱生产新工艺，以满足目前国内供应的缺口。

目前麦角新碱的生产依赖于大田种植和微生物发酵两种方式。传统的生产方式是将麦角菌分生孢子喷洒在大田种植的黑麦上，形成菌核并从中分离提取麦角新碱。生产周期长，不可控因素多，很难实现高产稳产。近年来兴起的微生物发酵方式大大缩短了生产周期，但发酵过程中会产生大量副产物LAH，限制了麦角新碱的产出效率，同时增加了分离提纯成本，大大影响生产效率和经济效益。本发明通过对真菌进行基因工程改造，使其能够高效积累麦角新碱而不产生LAH，实现生产工艺的提质增效，从而开发一种生产麦角新碱的新方法。

发明内容

本发明提供了一种基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为雀稗麦角菌(Claviceps paspali)。

本发明的基因工程菌株Cp-Δg5173为将雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶(g5173)进行基因突变所得到的。

本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因插入或基因取代的方式导致基因功能或活性丧失。

在优选的实施方式中，对g5173进行基因突变为将g5173基因进行基因敲除。

在一个实施方式中，所述基因突变可以采用本领域常规的技术操作来实现，例如，通过同源重组的方式进行基因敲入或基因敲除从而导致基因功能或活性丧失；或者，采用基因编辑的方式，如锌指核酸内切酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR技术对上述基因进行突变从而导致基因功能或活性丧失。

所述FAD依赖的单加氧酶是指雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶，本发明中不对该基因的序列做强制性的限定；在优选的实施方式中，所述FAD依赖的单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；在其他的实施方式中，所述FAD依赖的单加氧酶还包括与SEQ IDNo.1所示序列具有高度同源性或同一性的序列，并且来源于雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶；优选的，所述高度同源性或同一性包括与目的序列的同源性或同一性至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％或至少60％的序列。

在一个实施方式中，所述FAD依赖的单加氧酶的核酸序列如SEQ ID No.2所示；在其他的实施方式中，所述FAD依赖的单加氧酶来源于雀稗麦角菌，并且SEQ ID No.2具有至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％或至少60％的序列同源性或序列同一性。

在一个实施方式中，所述雀稗麦角菌包括Claviceps paspali RRC1481、CCC130、ATCC13892和DSMZ 833中的一种或任意几种。

另一方面，本发明还提供了利用所述基因工程菌株生产麦角新碱的方法，所述方法包括将所述菌株接种至培养基中进行发酵的步骤。

在一个实施方式中，发酵条件如下：发酵温度24℃～29℃、发酵时间8～14天。

本发明中，所述基因工程菌株与野生型雀稗麦角菌相比，只积累麦角新碱而不积累LAH(lysergic acidα-hydroxyethylamide)，发酵完毕后，更便于分离和纯化麦角新碱。

在其他的实施方式中，本发明所述的方法还包括分离或纯化麦角新碱的步骤。

另一方面，本发明还提供了一种制备麦角新碱的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株发酵生产麦角新碱的步骤。进一步的，所述方法还包括对麦角新碱进行分离或纯化的步骤。

另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法。

本发明所述的构建方法包括对出发菌株雀稗麦角菌(Claviceps paspali)的FAD依赖的单加氧酶(g5173)进行基因突变的步骤。

另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌在制备或生产麦角新碱中的应用。

在一个实施方式中，本发明的基因工程菌株为雀稗麦角菌(Claviceps paspali)Cp-Δg5173，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.23899，保藏日期为2021年12月31日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1.质粒pJJL-13图谱。

图2.工程菌株构建示意图，其中，A：构建策略示意图；B：用引物yanzheng-F/yanzheng-R引物对进行基因组PCR验证结果，M为DNA marker，泳道1-6为候选的Cp-Δg5173工程菌株，泳道7为出发菌株雀稗麦角菌。

图3.Cp-Δg5173工程菌株与野生型菌株次级代谢产物HPLC分析。

图4.野生型菌株次级代谢产物HRESIMS分析，其中A：化合物1的质谱结果及推测分子式；B:化合物2的质谱结果及推测分子式。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。

PDB液体培养基：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟。

酶解液：称取0.1～0.5g Lysing Enzyme(Sigma产品，产品目录号：L1412)、0.01～0.2g溶壁酶(广东省微生物研究所)溶解于5～20mL的0.5～0.8M KCl水溶液中，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段和凝胶回收是采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司V-ELUTE Gel MiniPurification Kit(ZPV202)。

PDB顶层琼脂：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，0.2M蔗糖，5g/L琼脂糖，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟后50℃保温。

PDA平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟，待冷却至约60℃制备平板。

PDAS平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，0.1～0.5M蔗糖，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟，待冷却至约60℃制备平板。

种子培养基：5～30g/L甘露醇，5～20g/L琥珀酸，0.5～5g/L热榨黄豆饼粉，0.2～2g/L KH₂PO₄，0.05～0.5g/L 7H₂O，余量为去离子水，用氨水调节至pH 4.0～6.0，121℃高压灭菌20分钟。

发酵培养基：60～150g/L山梨醇，15～50g/L琥珀酸，0.05～1g/L酵母抽提物，5～40g/L玉米浆干粉，0.001～0.004g/L FeSO₄，0.005～0.02g/L ZnSO₄，0.2～1g/L MgSO₄·7H₂O，余量为去离子水,用氨水调节至pH 4.0～6.0，121℃高压灭菌20分钟。

实施例1、g5173基因打靶元件g5173-KO1的构建

本实施方式中，来自雀稗麦角菌的FAD依赖的单加氧酶(g5173)所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核酸序列如SEQ ID No.2所示。

根据雀稗麦角菌基因组信息设计并合成如下引物：

U-g5173-F:5’-CTGAGAAAGGGCTTCACTCT-3’；

U-g5173-R:5’-GAATCAGAGCTCCATCATGTCTTGAACTCGCAGTGTTCAACCTC-3’；

D-g5173-F:5’-CATGTAGCAAACGGTTGAAACGACCCTTTTCGTCGCTCGTGT-3’；

D-g5173-R:5’-CCCGTGAAATCTACTGCCAT-3’；

yanzheng-F:5’-GCAGGATCTCTTACCTTGGCT-3’；

yanzheng-R:5’-AATCTCTCGCCTCTTGTCGTC-3’。

以雀稗麦角菌(Claviceps paspali)基因组DNA为模板，采用pfu DNA聚合酶(Vazyme,产品目录号:P525)进行PCR扩增，用引物对U-g5173-F/U-g5173-R可以扩增获得大小约为1.2kb的g5173基因的上游同源臂U-g5173，用引物对D-g5173-F/D-g5173-R可以扩增获得大小为1.2kb的g5173基因下游同源臂D-g5173。以质粒pJJL-13为模板(质粒示意图参见图1)，用引物对hph-F(5’-CAAGACATGATGGAGCTCTG-3’)和hph-R(5’-ATCCCGGTCGGCATCTACT-3’)进行PCR扩增潮霉素抗性基因作为筛选标记，即hph片段。

将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-g5173片段、hph片段和D-g5173片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以U-g5173-F/D-g5173-R作为引物对扩增获得大小约为5kb的g5173基因打靶元件g5173-KO片段，可用于g5173的基因敲除工作。

实施例2、g5173基因缺失雀稗麦角菌菌株Cp-Δg5173的构建

将工程菌株雀稗麦角菌接种于PDA平板，28℃培养2～4天。用接种铲挖取1cm*3cm的菌块，充分碾碎至新鲜100mL PDB液体培养基中，在220rpm、25℃培养48～72h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，压干后置于无菌的50mL三角瓶中，根据菌丝重量加入适量酶解液(每1g菌丝加入10mL酶解液)，在30℃、60rpm处理1～3h。将上述酶解后的混合液用500目尼龙布或擦镜纸过滤，收集滤液。4℃、4000rpm离心20min收集原生质体，10mL预冷的STC(STC组成：0.6～0.9M山梨醇，10mM pH 8.0的Tris-HCl，50mM CaCl₂)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。向400μL该原生质体悬液中加入20μL的DNA片段g5173-KO(约0.5～5μg)。再加入100μL冰浴的PSTC(PSTC组成：10～30％PEG6000，10mM pH 8.0的Tris-HCl，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴20min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与20mL的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS平板上进行再生筛选培养，在30℃、黑暗条件下培养5～7天。

从转化筛选平板上挑取生长状况良好的转化子转接至PDA平板上，在30℃培养5天进行传代纯化。取少量稳定传代转化子的菌块提取基因组DNA，用引物对yanzheng-F/yanzheng-R进行PCR验证，同时用雀稗麦角菌菌株的基因组作为对照。阳性转化子能扩增出大小约为5.5kb的条带，对照能扩增大小约为4.7kb的条带。结果如图2所示，M为DNAMarker，1-6泳道分别为6个候选转化子，泳道7为对照菌株雀稗麦角菌。选取阳性转化子进行单孢分离纯化，并再次和再次用引物对yanzheng-F/yanzheng-R进行基因组PCR验证，获得g5173完全敲除的纯种转化子，记为Cp-Δg5173，本发明的基因工程菌株Cp-Δg5173为将雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶(g5173)进行基因突变所得到的，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.23899，保藏日期为2021年12月31日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

实施例3、雀稗麦角菌菌株Cp-Δg5173发酵产物分析

选取基因工程菌株Cp-Δg5173转化子和对照菌株雀稗麦角菌分别接种PDA培养基，24～29℃培养3～8天。用接种铲挖取1cm*1cm～2cm*3cm的菌块，充分碾碎至含种子培养基的摇瓶(装液量15～50ml/250ml)，24～28℃、150～250rpm培养2～6天。而后按5～25％接种量接种至含发酵培养基的摇瓶(装液量15～50ml/250ml)，24～29℃、150～250rpm培养8～14天。

吸取2mL发酵液至EP管中，12000rpm离心5min。吸取0.25mL上清液至新的2mL EP管，加入1mL 50％～80％的乙腈水溶液，稀释5倍，混合均匀，12000rpm离心5min。用0.22ul的滤膜过滤后采用高效液相色谱分析方法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析。安捷伦C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)；流动相A：0.5～2g/L的碳酸铵，用乙酸调至pH 8.0；流动相B：50％～100％乙腈水溶液；流速1.2mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；梯度洗脱：0-15min 13％-43％B，15-16min 43％B，16-17min13％B。结果如图3所示，野生型雀稗麦角菌种累积主要产物化合物1和2。而基因工程菌株Cp-Δg5173中仅累积化合物1。进一步利用HRESIMS对化合物1和2进行分析(图4)，可见化合物1的[M+H]⁺信号为326.1862，推测分子式为C₁₉H₂₃N₃O₂，与麦角新碱相符合。化合物2的[M+H]⁺信号为312.1709，推测分子式为C₁₈H₂₁N₃O₂，与LAH相符合。

进一步，对工程菌株Cp-Δg5173代谢产物的分离与纯化，菌株发酵结束使用减压抽滤装置分离菌液和菌体，菌液用氨水碱化至pH 8～11之间后用二氯甲烷萃取，有机相浓缩获得粗提物浸膏；使用100-200目硅胶粉与浸膏拌样(硅胶粉：样品＝1:1～1:2)，300-400目硅胶粉装柱(减压柱，柱体积＝为拌样硅胶体积5～6倍)，干法装柱，干法上样；选择流动相为二氯甲烷：甲醇体系，梯度设置为二氯甲烷：甲醇＝100:1～1：1，每个组分洗脱4～6个柱体积，每半个柱体积接一瓶，蒸干后用乙腈溶解过膜HPLC分析，分析方法同前。选取含有目标化合物的组分，通过半制备液相分离[制备方法：0-10.0min 27％B，10.1-17min35％-43％B，流动相A：0.5～2g/L的碳酸铵，用乙酸调至pH 8.0；流动相B：50％～100％乙腈水溶液；流速2mL/min；柱温30℃；检测波长254nm]在保留时间7.3min获得化合物1，即麦角新碱。利用所得的麦角新碱标准品对发酵结果进行初步定量，工程菌株Cp-Δg5173麦角新碱的发酵摇瓶产量达到3～4g/L；相对而言，野生型对照菌株麦角新碱的发酵摇瓶产量为1.6～1.8g/L左右。

化合物1波谱数据如下：

麦角新碱，Ergometrine(1)；¹H NMR(600MHz,Methanol-d₄)δ7.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.18(d,J＝7.2Hz,1H),7.11(d,J＝7.7Hz,1H),6.99(d,J＝1.6Hz,1H),6.47(d,J＝2.3Hz,1H),4.59(s,1H),4.02(m,1H),3.63–3.58(m,2H),3.56(d,J＝5.6Hz,2H),3.35(1H,overlapped MeOD),3.22(dd,J＝11.4,5.4Hz,1H),2.86(t,J＝11.0Hz,1H),2.74–2.69(m,2H),2.68(s,3H),1.19(d,J＝6.8Hz,3H)。¹³C NMR(151MHz,MeOD)δ174.4,137.3,135.7,128.1,127.4,123.7,120.1,119.7,112.8,111.1,109.8,66.1,64.3,56.5,48.5,44.3,43.6,27.4,17.1。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，在不脱离本发明精神和范围内，本领域技术人员都可以在此基础上做出各种改动与变型，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为雀稗麦角菌(Clavicepspaspali)，其特征在于，所述基因工程菌株为将雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶进行基因突变得到。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因突变包括通过基因缺失、基因插入或基因取代的方式导致基因功能或活性丧失的步骤。

3.一种利用权利要求1或2所述的基因工程菌株生产麦角新碱的方法，所述方法包括将所述基因工程菌株接种至培养基中进行发酵的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离或纯化麦角新碱的步骤。

5.一种制备麦角新碱的方法，所述方法包括利用权利要求1或2所述的基因工程菌株发酵生产麦角新碱的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离或纯化麦角新碱的步骤。

7.权利要求1或2所述的基因工程菌株的构建方法。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括对出发菌株雀稗麦角菌(Claviceps paspali)的FAD依赖的单加氧酶进行基因突变的步骤。

9.权利要求1或2所述的基因工程菌株在制备或生产麦角新碱中的应用。

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