CN117751184A - 亚胺还原酶突变体、亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亚胺还原酶突变体,以及这种亚胺还原酶突变体用于制备(S)‑尼古丁的制备方法。发明第一个目的是提供了一种亚胺还原酶突变体,解决现有技术使用酶得不到S构型的尼古丁,以及现有技术中酶活性低的问题,这种突变体可以将底物麦思明或4‑(甲胺基)‑1‑(吡啶‑3‑基)丁酮催化还原为(S)‑尼古丁。本发明第二个目的是提供这种亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶,具体是亚胺还原酶突变酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶,这种共表达酶应用与制备(S)‑尼古丁,降低了酶催化制备(S)‑尼古丁的成本。
Description
本发明涉及医药化工领域,具体涉及一种亚胺还原酶突变体,以及这种突变体的应用,还涉及这种亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶以及这种共表达酶的应用。
(S)-尼古丁是一种存在茄科植物的生物碱,也是烟草的重要成分。虽然有化学合成法的相关报道,但是合成的是(R,S)-尼古丁,经拆分后才能获得(S)-尼古丁。所以化学合成成本比从烟叶中提取烟碱的成本要高。
使用酶催化的方式催化制备(S)-尼古丁,大大降低制备的成本,而且绿色环保。
Koichi Mitsukura等人在2010年发现Streptomyces sp.GF3587和3546的亚胺还原酶(Org.Biomol.Chem.,2010,8,4533-4535)。使用这两种酶将2-MPN还原为S-2MP或者R-2MP。
专利WO2014174505公开使用sp.GF3587和3546制备尼古丁的方法。反应底物为4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,转化率仅有23%,而且仅能制备(R)-尼古丁。
专利WO2020098978中公开了使用亚胺还原酶制备(S)-尼古丁方法。亚胺还原酶催化麦思明为去甲烟碱,去甲烟碱甲基化后得到(S)-尼古丁。使用的酶转化率在8小时后的可以达到77%,24小时后达 到99%,专利中使用的酶来自Enzymicals。
现在公开使用酶催化制备(S)-尼古丁的技术,酶活性不够,或者仅能制备(R)-尼古丁。为此需要一种新的亚胺还原酶,能够催化底物制备(S)-尼古丁,而且酶的活性更高,在较高的底物起始浓度下,具有较高的转化率和光学纯度。
另外,亚胺还原酶是一种依赖辅酶NADPH的氧化酶,而专利WO2014174505、WO2020098978中的亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶都是单独制备后混合使用,这种方式增加了制备酶的步骤,提高了获得酶的成本。李骥璇等(生物技术通报,2019,35(1):105-111)公开了S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成,可以将亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共同表达,降低了使用酶的成本。但是李骥璇等公开的共表达系统仅公开了催化2-MPN还原为S-2MP的反应,而且一般的葡萄糖脱氢酶的活性要大于亚胺还原酶,共表达系统的亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶是等量的,这使得葡萄糖脱氢酶过量,在实际生产中,过量的酶易引起乳化,给后面的提纯带来不便。为了解决这个问题,需要一种活性更高的亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶一起形成共表达酶,并且能够催化底物生成(S)-尼古丁。
[发明内容]
本发明第一个目的是提供了一种亚胺还原酶突变体,解决现有技术使用酶得不到S构型的尼古丁,以及现有技术中酶活性低的问题,这种突变体可以将底物麦思明或4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮催化还原为(S)-尼古丁。
本发明第二个目的是提供这种亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶,具体是亚胺还原酶突变酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶,这种共表达酶应用与制备(S)-尼古丁,降低了酶催化制备(S)-尼古丁的成本。
为了达到发明目的,本发明的技术方案如下:
亚胺还原酶突变体,与氨基酸序列SEQ ID NO:1相比,存在残基差异包括V171、A172、Y230中的一个或多个。
SEQ ID NO:1是来源于气单胞菌Aeromonas veronii的野生型亚胺还原酶,经过突变后得到本发明的亚胺还原酶突变体,突变点包括V171、A172、Y230中的一个或多个。通过对比催化底物麦思明的活性,突变后的亚胺还原酶的活性是野生型的酶的活性31到50倍。
所述残基差异包括V171Y/N/A/S、A172V/F、Y230G/A/T中的一个或多个。
残基差异还包括:
亚胺还原酶突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105、107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、 SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:167。
。本发明的亚胺还原酶突变体用于制备(S)-尼古丁,在合适的条件下,亚胺还原酶突变体催化底物I
或底物II
直接或经过化学反应得到(S)-尼古丁。
合适的条件是指当底物为麦斯时,将底物I、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、缓冲液与亚胺还原酶混合后,反应得到化合物III(S)-去甲烟碱。
优选的,底物I的载量为10g/L至300g/L;酶的浓度为1g/L至10g/L;辅酶的用量为1g/L;葡萄糖脱氢酶的用量为2g/L;pH的范围为6至7;反应的温度为23℃至30℃;反应时间为15小时至24小时。
优选的,底物I的载量包括10g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L;
催化底物I使用的酶的浓度为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、 7g/L、8g/L、9g/L、10g/L。
催化底物I时的反应温度为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃。
催化底物I时的反应时间15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时。
化合物III(S)-去甲烟碱甲基化得到(S)-尼古丁。如(S)-去甲烟碱与甲酸/甲醛反应得到(S)-尼古丁。
催化麦思明得到(S)-去甲烟碱,再经甲基化得到(S)-尼古丁的反应如下:
底物II环化后经亚胺还原酶的催化得到(S)-尼古丁;
或底物II的盐经脱盐、环化经亚胺还原酶的催化得到(S)-尼古丁;
所述底物II的盐包括盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、二氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐。
底物II可环化为烯胺化合物或亚胺正离子化合物,结构如下:
亚胺还原酶催化时的合适条件为将底物II、辅酶、葡萄糖、葡萄 糖脱氢酶、缓冲液与亚胺还原酶混合后,反应得到(S)-尼古丁。
优选的,底物II的载量为10g/L至300g/L;酶的浓度为1g/L至10g/L;辅酶的用量为1g/L;葡萄糖脱氢酶的用量为2g/L;pH的范围为6至7;反应的温度为23℃至30℃;反应时间为15小时至24小时。
优选的,底物II的载量包括10g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L;
催化底物II使用的酶的浓度为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L。
催化底物II时的反应温度为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃。
催化底物II时的反应时间15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时。
氨基酸序列SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105、107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、 SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:167。
对应核酸序列选自SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:168。
一种表达载体,包括以上的核酸。
一种载体细胞,以上的核苷酸或包括以上核酸的载体。
一种亚胺还原酶突变体的生产方法。将所述的亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达。用同时含有亚胺还原酶突变体基因与葡萄糖脱氢酶基因的细胞生产共表达酶。
具体来说,可以将这些核苷酸序列接入质粒中,如pET-30a(+), 制备成载体。
将这些重组后的载体转入工程细菌,如大肠杆菌BL21(DE3),制备得到载体细胞。
亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的基因在同一个工程细菌中表达,制备成共表达酶。解决了单独制备葡萄糖脱氢酶的成本,亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶共同表达实现体系中辅酶的重复使用。
一种具体的制备亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达酶的方法:通过带有限制性内切酶位点的引物将葡萄糖脱氢酶基因从载体上扩增下来,分别用限制性内切酶BamHI和XhoI对带有亚胺还原酶基因片段的载体和扩增的葡萄糖脱氢酶基因片段进行双酶切,胶回收酶切片段,并用T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,获得同时含有亚胺还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组菌,将上述重组菌培养,然后诱导、离心收集菌体、重悬,重悬后对细胞进行超声破碎,再将破碎后溶液进行冷冻干燥,获得亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶粉。
将亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达酶应用于制备(S)-尼古丁:在合适条件下,亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达酶催化底物I
或底物II
直接或经过化学反应得到(S)-尼古丁。
优选的,将底物I、辅酶、葡萄糖、缓冲液与亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶混合后,反应得到化合物III(S)-去甲烟碱,然后将化合物III(S)-去甲烟碱甲基化得到(S)-尼古丁,
底物II环化后经亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶催化得到(S)-尼古丁;
或底物II的盐经脱盐、环化经亚胺还原酶的催化得到(S)-尼古丁;
所述底物II的盐包括盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、二氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐。
相对于现有技术,本发明取得的有益效果:
1、经本发明亚胺还原酶突变体催化底物II或其盐为(S)-尼古丁,转化率为99.9%,化学纯度为99.9%,底物的载量为300g/L。
2、本发明的亚胺还原酶突变体可以催化底物I为(S)-去甲烟碱,酶的活性更高,且提高了底物的载量。
3、通过本发明的亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶,在同一个工程菌中一起表达两种酶,在使用亚胺还原酶制备(S)-尼古丁的 体系中实现辅酶循环再生的同时,减少了再次制备葡萄糖脱氢酶的步骤,降低了成本。
图1为(S)-(3-吡咯烷-2-基)吡啶的合成路线图;
图2为(S)-(3-吡咯烷-2-基)吡啶标准品的反相非手性HPLC图谱;
图3为底物麦斯明标准品的反相非手性HPLC图谱;
图4为实施例5反应中控的反相非手性HPLC图谱(SEQ ID NO:1样品);
图5为(R,S)-(3-吡咯烷-2-基)吡啶的正相手性HPLC图谱;
图6为(S)-(3-吡咯烷-2-基)吡啶标准品的正相手性HPLC图谱;
图7为实施例5合成的(S)-(3-吡咯烷-2-基)吡啶的正相手性HPLC图谱(SEQ ID NO:1样品);
图8为实施例5合成的(S)-(3-吡咯烷-2-基)吡啶的正相手性HPLC图谱(SEQ ID NO:17样品);
图9为亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达质粒图谱;
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述 的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 亚胺还原酶的表达及酶粉制备
(1)将来源于气单胞菌Aeromonas veronii的野生型亚胺还原酶的编码基因SEQ ID NO:2送至南京金斯瑞公司进行密码子优化和全基因合成,连接入质粒pET-30a(+)中;将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上,置于37℃下培养过夜;挑取转化子进行测序验证,将验证正确的转化子命名为E.coli BL21/pET30a-No.2。
(2)将上述重组菌E.coli BL21/pET30a-No.2接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃下培养过夜;取1mL菌液接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃下培养3h,然后加入50μL 1M IPTG,25℃下诱导16小时;离心(4000rpm,4℃,10min)收集菌体,加入4倍体积的PBS缓冲液(pH=7.0)重悬,重悬后对细胞进行超声破碎,再将溶液进行冷冻干燥,获得亚胺还原酶酶粉,野生型亚胺还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2 亚胺还原酶突变体文库的构建
本实施例以野生型亚胺还原酶的编码基因SEQ ID NO:1为模板,使用随机突变试剂盒(碧云天)进行易错PCR,引物见下表,使用DNA片段回收试剂盒(上海生工)并按照说明书回收上述易错PCR产物。
分别用限制性内切酶NdeI和BamHI对易错PCR产物和pET-30a(+)质粒进行双酶切,将回收的酶切产物用T4 DNA连接酶连接在线性化pET-30a(+)质粒中,22℃下连接1小时。将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(上海生工),37℃过夜培养,获得随机突变文库。
表1 易错PCR引物序列
序列编号 | 引物序列 |
SEQ ID NO:169 | TATA CATATGCGCCATCTGAGCGTGATTGG |
SEQ ID NO:170 | TTC GGATCCTTACTGCGCCGCGCCGTTGC |
突变文库经过筛选后,将获得的有益突变酶基因SEQ ID NO:37作为模板进行定点饱和突变及再次进行易错PCR,进行多轮次的建库与筛选。
实施例3 亚胺还原酶突变体的初筛
(1)挑取文库中的菌落至96孔微量培养板上,培养板的每孔含有150μL LB液体培养基和50μg/mL卡那霉素,将菌体置于37℃、220rpm摇床中培养过夜;将20μL菌液转接至含有380μL LB液体培养基和50μg/mL卡那霉素的96孔板中,继续在37℃、220rpm的摇床中培养2~3h,添加IPTG至终浓度为0.4mM进行诱导,然后降温至25℃培养过夜(至少16小时)。
(2)将96孔板离心(10min,4000rpm,25℃)收集菌体,用200μL裂解液(含1g/L溶菌酶和0.5g/L硫酸多粘菌素B)重悬菌体,于25℃、600rpm下振荡2h进行裂解,裂解后的细胞碎片通过离心 (4000rpm,4℃,10min)进行沉淀,获得上清液即粗酶液,用于酶标仪进行活性初筛。
(3)反应混合液的配制:取1mL麦斯明溶液(pH6.0 50mM),0.25mL NADPH溶液(20mM),13.75mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M)置于加样槽中,混匀即得反应混合液。用液体工作站进行液体分装,取酶标板每孔分装150μL反应混合液,然后加入上述粗酶液50μL,并立即于25℃检测340nm处吸光光度值的变化。
酶活性定义:单位时间内生成1μmol产物所需要的酶的用量为一个酶活单位。
其中:
ΔA340:吸光值变化值;
V0:反应总体积;
N:酶液稀释倍数;
T:反应时间;
V1:加酶量;
6.22为NADPH斜率常数
实施例4 亚胺还原酶突变体的复筛
(1)将实施例3中酶活性高于母本的突变体接种于100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养至OD600=0.6时,加入IPTG至终浓度为0.5mM,在25℃下进行诱导表达。诱导16h后,离心(10min,4000rpm,25℃)收集菌体。菌体用超声 破碎仪(JY92-2D,宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞,离心(4℃,10000rpm,20min)获得上清液,部分用于活性检测,剩余上清液进行冷冻干燥,制备酶粉。
(2)取5mL离心管,加入50mg底物麦斯明,加入2mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M)。再向反应瓶中加入0.5mg NADP和90mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入葡萄糖脱氢酶5mg和待筛选粗酶液0.2mL,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应24h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。
选取催化活性优于母本的突变体进行测序,分析突变位点,获得亚胺还原酶突变体的编码基因SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106或108,相应的转氨酶突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105、107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141
SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167所示。
不同亚胺还原酶突变体的活性检测结果见表2。
表2 亚胺还原酶突变体的突变位点与活性检测
注:++表示酶活性是SEQ ID NO:1的1.2至3倍;+++表示酶活性是SEQ ID NO:1的5至10倍;++++表示酶活性是SEQ ID NO:1的11至20倍;+++++表示酶活性是SEQ ID NO:1的21至30倍;++++++表示酶活性是SEQ ID NO:1的31至50倍;
实施例5 表2中标为“++”的亚胺还原酶突变体在制备S-(3-吡 咯烷-2-基)吡啶中的应用
取10mL反应瓶,加入100mg底物麦斯明,加入4mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M),调节pH至6.0。再向反应瓶中加入2.5mg NADP和180mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入10mg葡萄糖脱氢酶和50mg亚胺还原酶突变体酶粉,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应24h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。取反应液500μL,调pH11以上,加1000μL正己烷萃取,取正己烷层过膜后供正相HPLC分析手性。SEQ ID NO:1转化率图谱见图4,SEQ ID NO:1手性检测图谱见图7,SEQ ID NO:17手性检测图谱见图8.
SEQ ID NO:1及活性最高的三个突变体转化率及手性结果如表3所示。
表3
酶 | 转化率% | ee% |
SEQ ID NO:1 | 46.0 | 95.4 |
SEQ ID NO:9 | 78.9 | 99.2 |
SEQ ID NO:11 | 83.1 | 99.6 |
SEQ ID NO:17 | 90.3 | 99.9 |
实施例6 表2中标为“+++”的亚胺还原酶突变体在制备S-(3-吡咯烷-2-基)吡啶中的应用
取10mL反应瓶,加入250mg底物麦斯明,加入4mL磷酸盐 缓冲液(pH6.0 0.1M),调节pH至6.0。再向反应瓶中加入2.5mg NADP和450mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入10mg葡萄糖脱氢酶和50mg亚胺还原酶突变体酶粉,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应24h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。取反应液500μL,调pH11以上,加1000μL正己烷萃取,取正己烷层过膜后供正相HPLC分析手性。
SEQ ID NO:1及活性最高的三个突变体转化率及手性结果如表4所示。
表4
酶 | 转化率% | ee% |
SEQ ID NO:1 | 18.7 | 95.1 |
SEQ ID NO:25 | 98.1 | 99.3 |
SEQ ID NO:31 | 98.1 | 99.7 |
SEQ ID NO:33 | 90.3 | 99.6 |
实施例7 表2中标为“++++”的亚胺还原酶突变体在制备S-(3-吡咯烷-2-基)吡啶中的应用
取10mL反应瓶,加入500mg底物麦斯明,加入4mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M),调节pH至6.0。再向反应瓶中加入2.5mg NADP和900mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入10mg葡萄糖脱氢酶和50mg亚胺还原酶突变体酶粉,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应24h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到 900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。取反应液500μL,调pH11以上,加1000μL正己烷萃取,取正己烷层过膜后供正相HPLC分析手性。
SEQ ID NO:1及活性最高的三个突变体转化率及手性结果如表5所示。
表5
酶 | 转化率% | ee% |
SEQ ID NO:1 | 8.9 | 95.6 |
SEQ ID NO:37 | 99.9 | 99.6 |
SEQ ID NO:47 | 99.8 | 99.9 |
SEQ ID NO:53 | 95.5 | 99.7 |
实施例8 表2中标为“+++++”的亚胺还原酶突变体在制备S-(3-吡咯烷-2-基)吡啶中的应用
取10mL反应瓶,加入1000mg底物麦斯明,加入4mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M),调节pH至6.0。再向反应瓶中加入5mg NADP和1800mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入10mg葡萄糖脱氢酶和50mg亚胺还原酶突变体酶粉,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应16h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。取反应液500μL,调pH11以上,加1000μL正己烷萃取,取正己烷层过膜后供正相HPLC分析手性。
SEQ ID NO:37及活性最高的三个突变体转化率及手性结果如表 6所示。
表6
酶 | 转化率% | ee% |
SEQ ID NO:37 | 46.8 | 99.7 |
SEQ ID NO:61 | 99.3 | 99.8 |
SEQ ID NO:65 | 99.5 | 99.7 |
SEQ ID NO:71 | 99.9 | 99.6 |
实施例9 表2中标为“++++++”的亚胺还原酶突变体在制备S-(3-吡咯烷-2-基)吡啶中的应用
取20mL反应瓶,加入3g底物麦斯明,加入7mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M),调节pH至6.0。再向反应瓶中加入10mg NADP和5.4g葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入20mg葡萄糖脱氢酶和100mg亚胺还原酶突变体酶粉,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应16h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。取反应液500μL,调pH11以上,加1000μL正己烷萃取,取正己烷层过膜后供正相HPLC分析手性。
SEQ ID NO:37及活性高突变体转化率及手性结果如表7所示。
表7
酶 | 转化率% | ee% |
SEQ ID NO:37 | 33.3 | 99.8 |
SEQ ID NO:81 | 99.1 | 99.9 |
SEQ ID NO:85 | 99.6 | 99.6 |
SEQ ID NO:95 | 99.9 | 99.9 |
SEQ ID NO:133 | 99.9 | 100 |
实施例10 以4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮为底物筛选表2中亚胺还原酶突变体
取5mL离心管,加入30mg底物4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,加入2mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M)。再向反应瓶中加入0.3mg NADP和50mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中分别加入3mg葡萄糖脱氢酶和30mg亚胺还原酶突变体酶粉,混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应24h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析,以(S)-尼古丁的面积比为转化率。对转化率高的样品分别取反应液1mL进行乙酸乙酯萃取,用于ee值检测。
SEQ ID NO:1及活性较高的部分突变体转化率及手性结果如表8所示。
表8
酶 | 转化率% | ee% |
SEQ ID NO:1 | 50.8 | 98.8 |
SEQ ID NO:23 | 98.1 | 99.3 |
SEQ ID NO:25 | 99.7 | 99.8 |
SEQ ID NO:27 | 99.7 | 99.9 |
SEQ ID NO:37 | 100 | 100 |
SEQ ID NO:43 | 99.7 | 99.4 |
SEQ ID NO:45 | 99.1 | 99.5 |
SEQ ID NO:47 | 100 | 99.8 |
SEQ ID NO:61 | 100 | 100 |
SEQ ID NO:65 | 99.8 | 99.6 |
SEQ ID NO:73 | 99.7 | 99.8 |
SEQ ID NO:85 | 99.9 | 100 |
实施例11 SEQ ID NO:37所示亚胺还原酶突变体在(S)-尼古丁制备中的应用
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g 4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,调节pH至7.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖,搅拌至完全溶解。,0.04g葡萄糖脱氢酶和0.008g NADP盐,搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中,升温至30℃,以300r/min搅拌反应16h。取样检测转化率99%,终止反应,过滤,滤液用氢氧化钠溶液调节至pH=10后用甲基叔丁基醚萃取,无水硫酸钠干燥,浓缩后得(S)-尼古丁2.6g。产品纯度99%,光学纯度100%。
对制备得到的(S)-尼古丁进行核磁氢谱表征,数据为:
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H,dt),7.24-7.27(1H,m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m)。表明(S)-尼古丁被成功合成。
实施例12 SEQ ID NO:47所示亚胺还原酶突变体在(S)-尼古丁制备中的应用
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g 4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,调节pH至7.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖,搅拌至完全溶解。在另一个50mL烧瓶中加入10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,0.3g SEQ ID NO:53所示亚胺还原酶,0.04g葡萄糖脱氢酶和0.008g NADP盐,搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中,升温至30℃,以300r/min搅拌反应16h。取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析,以(S)-尼古丁的面积比为转化率。取反应液1mL进行乙酸乙酯萃取,用于ee值检测。转化率99.5%,ee值99.6%。
实施例13 SEQ ID NO:61所示亚胺还原酶突变体在(S)-尼古丁制备中的应用
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g 4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,调节pH至7.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖,搅拌至完全溶解。在另一个50mL烧瓶中加入10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,0.3g SEQ ID NO:61所示亚胺还原酶,0.04g葡萄糖脱氢酶和0.008g NADP盐,搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中,升温至30℃,以300r/min搅拌反应16h。取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析,以(S)-尼古丁的 面积比为转化率。取反应液1mL进行乙酸乙酯萃取,用于ee值检测。转化率93.2%,ee值99.7%。
实施例14 SEQ ID NO:85所示亚胺还原酶突变体在(S)-尼古丁制备中的应用
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g 4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,加入20mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,调节pH至7.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖,搅拌至完全溶解。在另一个50mL烧瓶中加入10mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,0.3g SEQ ID NO:85所示亚胺还原酶,0.04g葡萄糖脱氢酶和0.008g NADP盐,搅拌至完全溶解。然后将第二个烧瓶中的溶液缓慢加入第一个烧瓶中,升温至30℃,以300r/min搅拌反应16h。取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析,以(S)-尼古丁的面积比为转化率。取反应液1mL进行乙酸乙酯萃取,用于ee值检测。转化率100%,ee值99.8%。
实施例15 亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶粉制备
通过带有限制性内切酶位点的引物(见下表)将葡萄糖脱氢酶基因从pET30a-GDH(序列见SEQ ID NO:171)载体上扩增下来。分别用限制性内切酶BamHI和XhoI对带有亚胺还原酶基因片段的pET30a载体和扩增的葡萄糖脱氢酶基因片段进行双酶切。胶回收酶切片段,并用T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得同时含有亚胺还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组菌(质粒示意图见图9)。
表9 葡萄糖脱氢酶扩增引物
将上述重组菌接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃下培养过夜;取1mL菌液接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,置于37℃下培养3h,然后加入50μL 1M IPTG,25℃下诱导16小时;离心(4000rpm,4℃,10min)收集菌体,加入4倍体积的PBS缓冲液(pH=7.0)重悬,重悬后对细胞进行超声破碎,再将溶液进行冷冻干燥,获得亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶粉。
实施例16 亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶粉在S-(3-吡咯烷-2-基)吡啶制备中的应用
取10mL反应瓶,加入750mg底物麦斯明,加入4mL磷酸盐缓冲液(pH6.0 0.1M),调节pH至6.0。再向反应瓶中加入5mg NADP和1200mg葡萄糖,搅拌至完全溶解,再向其中加入共表达酶粉(此处亚胺还原酶为SEQ ID NO:37所示突变酶,共表达酶的核酸序列为SEQ ID NO:173所示),混匀并升温至25℃,以300r/min搅拌反应16h。反应结束后,分别取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析。取反应液500μL, 调pH11以上,加1000μL正己烷萃取,取正己烷层过膜后供正相HPLC分析手性。转化率99.6%,ee值99.8%。
实施例17 亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶粉在(S)-尼古丁制备中的应用
向50mL三口圆底烧瓶中加入4.5g 4-(甲胺基)-1-(吡啶-3-基)丁酮,加入30mL 0.1M的磷酸盐缓冲液,调节pH至7.0。再向反应瓶中加入4.8g葡萄糖和0.008g NADP盐,搅拌至完全溶解。直接加入0.3g共表达酶粉(此处亚胺还原酶为SEQ ID NO:37所示突变酶,共表达酶的核酸序列为SEQ ID NO:173所示),搅拌至完全溶解,升温至30℃,以300r/min搅拌反应16h。取反应液100μL加入到900μL乙腈中充分振荡,使用0.22μm过滤膜过滤,进行HPLC分析,以(S)-尼古丁的面积比为转化率。取反应液1mL进行乙酸乙酯萃取,用于ee值检测。转化率99.6%,ee值99.8%。
实施例18 用(S)-去甲烟碱制备(S)-尼古丁
将实施例5-9或16制备的(S)-去甲烟碱制备(S)-尼古丁。
向三个500mL三口瓶中均加入使用实施例16方法制备的107g(S)-去甲烟碱,80g 37%甲醛溶液,升温到75℃。滴加60g 85%甲酸溶液,滴加完毕后,保温反应24h。反应完成后,加入氢氧化钠,调节pH=12。水相用甲叔醚萃取,合并萃取液,浓缩,减压蒸馏,得无色液体80g,即(S)-尼古丁。
对所得产物进行核磁氢谱表征,核磁数据结果为:
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.54(1H,d),8.50(1H,dd),7.70(1H, dt),7.24-7.27(1H,m),3.22-3.27(1H,m),3.08(1H,t),2.27-2.34(1H,m),2.17-2.24(1H,m),2.16(3H,m),1.91-2.02(1H,m),1.79-1.87(1H,m),1.68-1.76(1H,m),表明(S)-尼古丁被成功合成。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (17)
- 亚胺还原酶突变体,其特征在于:与氨基酸序列SEQ ID NO:1相比,存在残基差异包括V171、A172、Y230中的一个或多个。
- 根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体,其特征在于:所述残基差异包括V171Y/N/A/S、A172V/F、Y230G/A/T中的一个或多个。根据权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体,其特征在于:亚胺还原酶突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105、107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141
- SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:167。
- 一种制备(S)-尼古丁的方法,其特征在于:在合适的条件下,如权利要求1至3任意一项所述的亚胺还原酶突变体催化底物I为化合物III(S)-去甲烟碱,化合物III(S)-去甲烟碱经甲基化 得到(S)-尼古丁
- 根据权利要求4所述的制备(S)-尼古丁的方法,其特征在于:将底物I、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、缓冲液与亚胺还原酶混合后,反应得到化合物III(S)-去甲烟碱,然后将化合物III(S)-去甲烟碱甲基化得到(S)-尼古丁。
- 一种制备(S)-尼古丁的方法,其特征在于:在合适的条件下,如权利要求1至3任意一项所述的亚胺还原酶突变体催化底物II得到(S)-尼古丁,
- 根据权利要求6所述的制备(S)-尼古丁的方法,其特征在于:底物II环化后经亚胺还原酶的催化得到(S)-尼古丁;或底物II的盐经脱盐、环化经亚胺还原酶的催化得到(S)-尼古丁;所述底物II的盐包括盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、二氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐。
- 一种核酸,其特征在于:所述核酸可以编码权利要求1至3中任一项所述的亚胺还原酶突变体。
- 一种表达载体,其特征在于:包括权利要求8的核酸。
- 一种细胞,其特征在于:包括权利要求8的核酸或权利要求9的载体。
- 一种如权利要求1至3中任意一项的亚胺还原酶突变体的生产方法,其特征在于培养权利要求1至3中所述的细胞得到所述的亚胺还原酶突变体。
- 如权利要求11所述的生产方法,其特征在于所述的亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达。
- 如权利要求12所述的生产方法,其特征在于:用同时含有亚胺还原酶突变体基因与葡萄糖脱氢酶基因的细胞生产共表达酶。
- 如权利要求13所述的生产方法,其特征在于:通过带有限制性内切酶位点的引物将葡萄糖脱氢酶基因从载体上扩增下来,分别用限制性内切酶BamHI和XhoI对带有亚胺还原酶基因片段的载体和扩增的葡萄糖脱氢酶基因片段进行双酶切,胶回收酶切片段,并用T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,获得同时含有亚胺还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组菌,将上述重组菌培养,然后诱导、离心收集菌体、重悬,重悬后对细胞进行超声破碎,再将破碎后溶液进行冷冻干燥,获得亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶粉。
- 通过权利要求11-14任意一项所述的生产方法制备得到的亚胺还原酶突变体或者亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶。
- 如权利要求15所述的共表达酶的应用,其特征在于:在合适条件下,亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达酶催化底物I 为化合物III(S)-去甲烟碱,化合物III(S)-去甲烟碱经甲基化得到(S)-尼古丁
- 一种如权利要求15所述的共表达酶的应用,其特征在于:在合适条件下,亚胺还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶共表达酶催化底物II为(S)-尼古丁,
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