CN118126992A - 一种2-脱氧-d-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种2‑脱氧‑D‑核糖‑5‑磷酸醛缩酶突变体及其应用。本发明研究发现一种源自嗜热古菌的野生型醛缩酶在催化他汀类药物手性侧链合成中存在中间体限速的问题。经过半理性设计和迭代突变后，获得一系列突变体能够提高中间体向目标产物转化的效率，解决了野生型酶在反应中出现大量中间体积累的问题，打通了反应中的限速步骤。以200mM乙醛和100mM氯乙醛为合成底物，最优突变体的转化率可达到78.09％，与野生型酶相比提高44倍，为合成他汀药物高效提供了手性侧链。
Description
技术领域
本发明涉及一种2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
他汀类药物(Statins)是目前广泛使用的一类降血脂药物，通过抑制内源性胆固醇合成步骤中的限速酶——羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，从而减少低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的合成，临床上被用于治疗动脉粥样硬化，有效降低冠心病的死亡率(Istvan E S and Deisenhofer J,Science,2001,292(5519):1160-4)。目前常用于临床的他汀类药物如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等均为人工合成他汀。
他汀类药物发挥作用的关键药效团是位于其侧链上的手性双羟基结构，也是他汀类药物合成中的重点和难点，目前的合成方法有化学法和酶法。化学方法合成手性侧链需要依次合成两个手性中心，并且从四个异构体混合物中拆分获得目标对映体(Bartmann Wand Beck G,Med.Chem,1986,27(39):4709-4712)，反应过程繁琐且拆分难度大，同时也导致产率低下。酶法合成相较于化学法拥有立体选择性高、一锅反应条件简单、反应条件温和等优势，尤其是高度的立体选择性，很好地满足了他汀类药物手性侧链双手性中心的要求。使用2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)催化乙醛和氯乙醛的顺序羟醛缩合获得(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧吡喃己糖(CTeHP)，然后区域选择性氧化得到(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯(CTeHL)，是制备双羟基他汀药物手性侧链的重要方法。
2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.4；DERA)属于I型醛缩酶，能够可逆催化醛酮类亲核供体和亲电受体发生羟醛反应，生成碳碳单键，且不依赖任何辅因子(RouvinenJ and Andberg M,Appl Microbiol Biotechnol,2021,105(16-17):6215-6228)。DERA也是唯一能够接受醛类同时作为供体和受体进行羟醛反应的醛缩酶，并且产物也是醛类。第一轮反应的醛类产物可以作为受体参与到第二轮反应中去，最终经历两轮反应，将碳骨架延长两个2C单位，形成了两个手性中心。因此，相较于其他酶类，DERA在他汀类药物手性侧链的合成中具有不可比拟的优势。
但在，DERA的实际运用中，存在催化效率低下，在高浓度底物中快速失活等限制性问题。以E.coli来源的DERAEco为例，在300mM乙醛中的酶活半衰期仅有25min，2h后完全失活(Ohshida T and Hayashi J,Protein Expr Purif,2016,126:62-68)。目前，研究发现DERA醛失活过程发生在羟醛反应中，生成的3-羟基丁醛中间体脱去羟基形成丁烯醛，其作为迈克尔受体，与DERA上一个高度保守的半胱氨酸残基侧链发生迈克尔加合反应，不可逆地将中间体共价连接到酶上使DERA失活。
发明内容
本发明提供了一种可以高效合成他汀类药物手性侧链前体的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体。
本发明提供了一种2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体，所述2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)来源于超嗜热古菌Pyrobaculum aerophilum(DERAPae)，其在100℃条件下孵育10min仍能保留90％以上的活性，优秀的稳定性使得其拥有对高浓度醛类底物的极高耐受性，在25℃、300mM乙醛中孵育20h后剩余活性仍有50％左右。
本发明在对野生型DERAPae合成他汀类药物手性侧链的活性测试中，发现反应过程中大部分中间体积累无法顺利转化为目标产物CTeHP这是限制DERAPae的反应活性提高的决定性因素。
本发明所述突变体是将野生型氨基酸序列的一个或多个位点进行突变，包括一个或多个位点的缺失、添加或取代。取代突变可以是同一氨基酸家族内的保守取代，也可以是跨氨基酸家族的非保守取代，如苏氨酸取代丝氨酸为极性氨基酸家族内的保守取代，酪氨酸取代苯丙氨酸为从极性氨基酸家族到非极性氨基酸家族的非保守取代。缺失和添加是指在保证突变位点前后不发生移码突变的前提下，对突变位点进行单个或多个氨基酸的同时删除或插入，也可以是删除一段氨基酸序列或插入一段异源序列，或是使用一段异源序列对突变序列进行替换。
如上所述突变体相较于野生型提高了合成他汀类药物手性侧链的活性，在一些实施例中，所述突变提高酶活性的方式包括但不限于提高kcat、降低KM、提高kcat/KM和/或提高Vmax。
在一种实施方式中，所述突变体相对于野生型酶DERAPae，将其第147位编码丝氨酸的密码子TCT突变为编码苏氨酸的密码子ACT，获得突变体S147T。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第151位编码苯丙氨酸的密码子TTT突变为编码酪氨酸的密码子TAT，获得突变体F151Y。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第147位编码丝氨酸的密码子TCT突变为编码苏氨酸的密码子ACT，第151位编码苯丙氨酸的密码子TTT突变为编码缬氨酸的密码子GTT，获得突变体S147T+F151V。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第147位编码丝氨酸的密码子TCT突变为编码苏氨酸的密码子ACT，第187位编码缬氨酸的密码子GTA突变为编码半胱氨酸的密码子TGT，获得突变体S147T+V187C。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第147位编码丝氨酸的密码子TCT突变为编码苏氨酸的密码子ACT，第61位编码苯丙氨酸的密码子TTC突变为编码亮氨酸的密码子CTG，获得突变体S147T+F61L。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第147位编码丝氨酸的密码子TCT突变为编码苏氨酸的密码子ACT，第174位编码异亮氨酸的密码子ATC突变为编码缬氨酸的密码子GTT，获得突变体S147T+I174V。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第147位编码丝氨酸的密码子TCT突变为编码苏氨酸的密码子ACT，第174位编码异亮氨酸的密码子ATC突变为编码缬氨酸的密码子GTT，第187位编码缬氨酸的密码子GTA突变为编码异亮氨酸的密码子CTG，获得突变体S147T+I174V+V187I。
在一种实施方式中，所述突变体S147T、F151Y、S147T+F151V、S147T+V187C、S147T+F61L、S147T+I174V、S147T+I174V+V187I的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15所示。
本发明提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，编码所述突变体S147T、F151Y、S147T+F151V、S147T+V187C、S147T+F61L、S147T+I174V、S147T+I174V+V187I的基因序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16所示。
另外地，在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型，将其第152-170位序列进行的片段缺失、添加或取代。例如，在一种实施方式中，所述突变体将其161-170位氨基酸残基进行缺失突变；在一种实施方式中，所述突变体将其153-160位氨基酸残基进行缺失突变；在一种实施方式中，所述突变体将其152-166位氨基酸残基进行替换，将152-166位氨基酸片段“AEEAYAARQGNPVHS”替换为异源片段“SGGGA”。因此，所述突变体可以包括第152-170位内长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个连续氨基酸残基的缺失、添加或取代。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.3。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.3的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.5。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.5的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.7。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.7的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.9。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.9的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.11。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.11的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.13。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.11的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述DERA突变体包括SEQ ID NO.15。在一种实施方式中，所述DERA突变体与SEQ ID NO.11的变体序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列一致性。
在一种实施方式中，所述突变体相对于DERAPae野生型提高了合成他汀类药物手性侧链的活性，使得所述突变体的活性至少为野生型活性的约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％、约500％、约550％、约600％、约650％、约700％、约750％、约800％、约850％、约900％、约950％、约1000％、约1100％、约1200％、约1300％、约1400％、约1500％、约1600％、约1700％、约1800％、约1900％、约2000％、约2250％、约2500％、约2750％、约3000％、约3250％、约3500％、约3750％、约4000％、约4250％、约4500％、约4750％或约5000％或更多。
本发明提供了含有所述基因的载体。所述表达载体可以为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
在一种实施方式中，所述载体包括但不限于于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
优选地，所述载体为pET28a(+)。
本发明提供了一种获得所述2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体的方法，所述方法包括步骤如下：
(1)以超嗜热古菌Pyrobaculum aerophilum来源的野生型2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的氨基酸序列为突变模板，确定突变位点，设计定点突变的突变引物，进行定点突变，构建含突变体的重组质粒载体；
(2)将突变重组质粒转化进感受态细胞，构建突变体转化子；
(3)培养后挑选阳性转化子进行酶活测定和序列测定。
所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞。
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。本发明还提供了所述的突变体、所述的突变体的基因或者表达载体在制备他汀类药物手性侧链前体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧吡喃己糖、双羟基手性侧链或者他汀类药物中的应用。
所述他汀类药物选自阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀。
本发明的有益效果：
(1)本发明以超嗜热古菌Pyrobaculum aerophilum来源的野生型2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶DERAPae为改造对象，在保证其对高浓度底物高度耐受性的前提下，进行半理性设计和迭代突变，构建得到的突变体极大地提高了DERAPae的转化效率，解决了野生型酶在反应中出现大量中间体积累，无法顺利转化为产物的问题，解决了DERAPae在反应中的限速步骤，产率较野生型提高44倍。
(2)本发明构建的DERA突变体，无需额外的破菌和纯化操作，全细胞状态下即可用于催化合成他汀类药物手性中间体，避免破菌和纯化过程中造成的酶损失，操作简单，更适合工业化应用。
(3)本发明构建的突变体表现出较好的选择性，产物中相对单一，易于分离纯化。
附图说明
图1 DERAPae突变体在重组菌中诱导表达后的全细胞、上清液和沉淀中蛋白SDS-PAGE电泳图。
图2 DERAPae突变体催化合成产物CTeHP的质谱图。
图3 DERAPae突变体的产量及产率对比图。
具体实施方式
实施例1：DERAPae单位点突变体的构建
从NCBI获取Pyrobaculum aerophilum来源的野生型2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶编码基因序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成并进行了密码子优化。将合成基因片段连接至pET28a(+)质粒的多克隆酶切位点处，以此为模板，设计DERAPae-S147T和DERAPae-F151Y的相应位点突变引物，通过全质粒PCR进行突变体构建。
单突变体的引物序列如下：
DERAPae-S147T正向引物序列：
5’-ATCAAAACTTCCACGGGTTTTGCAGAAGAGG-3’。
DERAPae-S147T反向引物序列：
5’-CGTGGAAGTTTTGATAAAGTGCGCACCCGCCTCC-3’。
DERAPae-F151Y正向引物序列：
5’-CACGGGTTATGCAGAAGAGGCGTACGCAGC-3’。
DERAPae-F151Y反向引物序列：
5’-CTGCATAACCCGTGGAAGATTTGATAAAGTGC-3’。
设置PCR扩增体系为：纯水8.5μL、2×max buffer 12.5μL、正向引物和反向引物(浓度10μM)各1μL、dNTPmix 0.5μL、模板质粒1μL、Phanta max高保真酶0.5μL，总体系为25μL。
设置PCR反应程序为：95℃变性预变性30s，95℃变性15s，退火15s(退火时间根据两条引物Tm值的均值减5℃得到)，72℃延伸3min，共循环30次，最后在72℃彻底延伸5min后结束程序。
向PCR扩增产物中加入DpnⅠ，在37℃下恒温消化3h，除去模板质粒。消化体系为：20μL PCR扩增产物，0.5μL DpnⅠ。
向消化产物中加入重组酶进行重组反应，在37℃下精确孵育30min，立即置于冰上冷却，以备后续转化使用。重组反应体系为：DpnⅠ消化产物120ng、5×CEⅡbuffer 2μL、ExnaseⅡ1μL、纯水补足10μL反应体系。
将消化重组后的质粒通过化转的方法导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，化学转化法具体操作如下：
(1)取10μL重组质粒加入到预先置于冰上化开的100μL BL21(DE3)感受态细胞中；
(2)冰浴30min；
(3)42℃水浴热激90s，立刻冰浴3min；
(4)在超净台内加入800μL无抗LB液体培养基，置于37℃，220rpm摇床培养45min；
(5)5000rpm离心1min沉淀菌体，弃去600ul上清，用剩余液体重悬菌体后吸取100μL涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温培养12h。
挑取平板上的转化子至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床培养12h，提取质粒后进行测序鉴定，获得目标突变体DERAPae-S147T和DERAPae-F151Y。
实施例2：DERAPae双位点突变体的构建
以获得的单位点突变体DERAPae-S147T的质粒为突变模板，设计相应的突变引物，通过全质粒PCR进行双位点突变体构建。
双位点突变体的引物序列如下：
DERAPae-S147T+F61L正向引物序列：
5’-TGCCGACTTCCCGCTGGGCGCGCTGCCGACCGCA-3’。
DERAPae-S147T+F61L反向引物序列：
5’-CAGCGGGAAGTCGGCAACGACACACAGTTTC-3’。
DERAPae-S147T+F151Y正向引物序列：
5’-CACGGGTTATGCAGAAGAGGCGTACGCAG-3’。
DERAPae-S147T+F151Y反向引物序列：
5’-CTGCATAACCCGTGGAAGTTTTGATAAAGTGC-3’。
PCR扩增体系、反应程序及后续操作具体见实施例1相应步骤。获得目标突变体DERAPae-S147T+F61L和DERAPae-S147T+F151Y。
实施例3：DERAPae片段缺失和异源序列替换突变体的构建
通过多重序列比对确定DERAPae第152-170位的长loop区明显区别于其他野生型DERA，可能对酶的结构功能存在特殊意义。以获得的单位点突变体DERAPae-S147T的质粒为模板，设计相应的缺失突变和替换突变引物，分别将其161-170位氨基酸残基进行缺失突变，将其153-160位氨基酸残基进行缺失突变，将其152-166位氨基酸残基替换为异源片段“SGGGA”，通过全质粒PCR进行突变体的构建。
片段缺失突变体的引物序列如下：
DERAPae-S147T+deloop正向引物序列：
5’-TACGCAGCGCGTCAAGCGGCGGCCATCGCCCGC-3’。
DERAPae-S147T+deloop反向引物序列：
5’-CGCTTGACGCGCTGCGTACGCCTCTTCTGCAAA-3’。
DERAPae-S147T+deloopα正向引物序列：
5’-GGTTTTGCAGGTAACCCAGTGCATAGCACC-3’。
DERAPae-S147T+deloopα反向引物序列：
5’-TGGGTTACCTGCAAAACCCGTGGAAGATTTGAT-3’。
异源序列替换突变体的引物序列如下：
DERAPae-S147T+evrloop正向引物序列：
5’-AGCGGTGGCGGTGCGACCCCGGAGCGCGCG-3’。
DERAPae-S147T+evrloop反向引物序列：
5’-CGCACCGCCACCGCTAAAACCCGTGGAAGTTTTGATAAAGTGC-3’。
PCR扩增体系、反应程序及后续操作具体见实施例1相应步骤。获得目标突变体DERAPae-S147T+deloop、DERAPae-S147T+deloopα、DERAPae-S147T+evrloop。
实施例4：DERAPae定点饱和突变和筛选
以单位点突变体DERAPae-S147T的质粒为突变模板，在第151位、第174位、第187位设计相应的饱和突变引物。突变引物中的简并密码子使用NDT，能覆盖12种氨基酸(Phe、Leu、Ile、Val、Tyr、His、Asn、Asp、Cys、Arg、Ser、Gly)，包含极性和非极性氨基酸、芳香族和脂肪族氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸，减少了对性质相似氨基酸重复筛选的工作量，理论上使用NDT进行单位点饱和突变，仅需筛选34个转化子就能覆盖95％的突变可能性。达到相同覆盖率，NNK简并密码子需要筛选94个转化子。
定点饱和突变的引物序列如下：
第151位的正向引物序列：
5’-CACGGGTNDTGCAGAAGAGGCGTACGCAG-3’。
第151位的反向引物序列：
5’-CTGCAHNACCCGTGGAAGTTTTGATAAAGTGC-3’。
第174位的正向引物序列：
5’-GCGCGCGGCGGCCNDTGCCCGCTACATCAAAGAAAAAGG-3’。
第174位的反向引物序列：
5’-AHNGGCCGCCGCGCGCTCCGGGGTGCTATG-3’。
第187位的正向引物序列：
5’-GTTTGGGCNDTAAGATGGCAGGCGGTATTCG-3’。
第187位的反向引物序列：
5’-CATCTTAHNGCCCAAACGATAACCTTTTTCTTTG-3’。
定点饱和突变的PCR扩增体系、反应程序及后续操作具体见实施例1相应步骤。使用DNS显色法对获得的混合转化子的反应活性进行筛选，DNS法筛选转化子操作如下：
(1)向LB液体培养基中加入终浓度为50μg/mL卡那霉素，分装到1号96孔深孔板中，每孔200μL；
(2)挑取转化子，接入1号96孔深孔板，贴上透气封板膜，置于37℃摇板培养8h，作为种子液；
(3)向TB液体培养基中加入终浓度为50μg/mL卡那霉素和终浓度为0.2mM IPTG，分装到2号96孔深孔板中，每孔100μL；
(4)转接1号板的100μL种子液到2号板的对应深孔内，贴上透气封板膜，置于25℃摇板培养16h；
(5)将96孔深孔板置于5000rpm离心10min收菌，吸去上清，加入200μL PBS缓冲液(pH 7.5)重悬清洗菌体，再次离心，吸去上清；
(5)菌体加入100μL PBS缓冲液(pH 7.5)重悬，加入200mM乙醛和100mM氯乙醛，置于25℃下震荡反应2h；
(6)离心沉淀菌体，并在冰上冷却，每孔取50μL上清加入到PCR八联管中，加入100μL DNS试剂，煮沸反应5min，稀释后取样使用酶标仪检测。
对一轮突变筛选所得的正向突变体继续作为突变模板进行其他位点的迭代突变，获得多位点取代突变体。对筛选获得的正向突变体提取质粒后进行测序鉴定，获得突变体DERAPae-S147T+F151V、DERAPae-S147T+V187C、DERAPae-S147T+I174V、DERAPae-S147T+I174V+V187I。
实施例5：醛缩酶突变体的发酵表达
将实施例1-4获得的DERAPae突变体重组表达菌株在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上划线，37℃恒温箱培养12h进行菌种活化。挑取单菌落接入5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体试管中，置于37℃，220rpm摇床培养12h获得种子液。将种子液以2％的体积比接入200mL含50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，置于37℃，220rpm摇床培养2h左右至OD600达到0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，置于25℃，220rpm摇床培养16h进行诱导表达。
发酵液通过4℃，6000rpm离心10min沉淀菌体，弃去上清，菌体用4℃保存的PBS缓冲液(pH 7.5)重悬洗涤一次，再次离心沉淀后得到DERA突变体诱导表达菌体，称重得菌体湿重。
菌体用PBS缓冲液(pH 7.5)重悬后超声破碎，在4℃，15000rpm离心10min获得上清和沉淀。取上清、沉淀和全细胞分别加入Protein Loading Buffer制样，进行SDS-PAGE蛋白电泳。以S147T+F61L为例，SDS-PAGE蛋白电泳结果如图1所示。
配制LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，置于121℃灭菌20min获得。
配制TB培养基：甘油4mL/L、胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、磷酸二氢钾2.31g/L、三水合磷酸氢二钾16.43g/L，置于121℃灭菌20min获得。
配制PBS缓冲液：氯化钠8g/L、氯化钾200mg/L、十二水合磷酸氢二钠3.63g/L、磷酸二氢钾240mg/L，搅拌溶解后调节pH至7.5，定容，抽滤过0.22μm滤膜。
实施例6：利用DERAPae突变体制备他汀类药物手性中间体
将按照实施例5获得的DERAPae突变体诱导表达菌体不经额外处理，加入10倍体积的PBS缓冲液(pH 7.5)重悬，加入200mM乙醛和100mM氯乙醛作为反应底物，置于25℃，190rpm震荡反应2h。
反应结束后离心除去菌体，用1.5倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，得到淡黄色油状粗产物。
实施例7：利用气相色谱-质谱联用进行产物分析
于实施例6中获得的粗产物使用气质联用进行检测。使用HP-5气相色谱柱，上样量1μL，分流上样(分流比100:1)，进样口温度200℃。温度程序设置：初始温度100℃保持2min，10℃/min梯度升温至200℃，并保持3min，以40℃/min降温至100℃。检测器温度设置为250℃，氢气流速30mL/min，空气流速300mLmin，氮气流速25mL/min。产物CTeHP在8.1min左右出峰。结果显示，实施例1-4制得的突变体均能够制得CTeHP，CTeHP的质谱图如图2所示。
实施例8：醛缩酶突变体的转化率比较
利用CTeHP纯品配制若干浓度标准溶液，绘制标准曲线进行反应产物定量。标曲回归方程为y＝424259x–23382，R2＝0.9995。计算实施例6各DERAPae突变体催化合成CTeHP的转化率：
转化率ω％＝(产物浓度×产物溶液体积)/理论产量×100％
结果如表1和图3所示。结果显示突变体S147T+F61L拥有最高的转化率，达78.09％，大约是野生型的44倍，相比单突变体S147T提高了约8倍。F151Y作为单位点突变呈现出活性提升，但与S147T组合后却造成活性降低，对F151位点做饱和突变筛选获得S147T+F151V正向突变体，说明第151位和第147位可能存在协同作用。
表1
| DERA基因型 | 转化率 | 相对活性 |
| pae-WT | 1.77％ | 100％ |
| S147T | 9.64％ | 545％ |
| F151Y | 6.40％ | 362％ |
| S147T+F61L | 78.09％ | 4414％ |
| S147T+F151Y | 8.83％ | 499％ |
| S147T+deloop | 0.50％ | 28％ |
| S147T+deloopα | 0.97％ | 55％ |
| S147T+evrloop | 7.53％ | 426％ |
| S147T+F151V | 18.73％ | 1059％ |
| S147T+V187C | 11.86％ | 671％ |
| S147T+I174V | 6.48％ | 366％ |
| S147T+I174V+V187I | 8.24％ | 466％ |
Claims (10)
1.一种2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体，其特征在于所述突变体具有SEQ IDNO.1所示的野生型DERA酶的氨基酸序列的第61位、第147位、第151位、第174位、第187位中的一个或多个氨基酸突变，和/或第152-166位氨基酸片段的替换。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体选自F61L、S147T、F151Y、F151V、V187C中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体具有如SEQ ID NO.1所示的野生型DERA酶的氨基酸序列的第61位、第147位、第151位、第174位、第187位中的两个或三个氨基酸突变。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体具有如下突变：S147T、F151Y、S147T+F151V、S147T+V187C、S147T+F61L、S147T+I174V、S147T+I174V+V187I。
5.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体为异源序列替换突变体，SEQID NO.1所示的野生型DERA酶的氨基酸序列的第152-166位氨基酸片段AEEAYAARQGNPVHS替换为异源片段SGGGA。
6.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15所示。
7.编码权利要求1-6任一项所述的突变体的基因。
8.一种表达权利要求1-6任一项所述的突变体的表达载体，其特征在于包含权利要求7所述的突变体的基因。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
10.权利要求1-6任一项所述的突变体或权利要求7所述的突变体的基因或者权利要求8或9所述的表达载体在制备他汀类药物手性侧链前体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧吡喃己糖、双羟基手性侧链或者他汀类药物中的应用。
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